CN105062895B - 一种高产胞外黄色素的红曲霉菌株及其选育方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高产胞外黄色素的红曲霉菌株及其选育方法与应用。该红曲霉菌株的名称为红色红曲霉(Monascus ruber)WQ15，保藏编号为CGMCC No.10910，于2015年7月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该高产胞外黄色素的红曲霉菌株通过出发菌株进行紫外诱变选育得到。通过常规液态发酵，该高产胞外黄色素的红曲霉菌株的胞外黄色素色阶比原始菌株提高了72％；在补加300g/L葡萄糖发酵时，该高产胞外黄色素的红曲霉菌株的胞外黄色素色阶比原始菌株提高了7.04倍。因此，可将其用于生产胞外黄色素。

Description

一种高产胞外黄色素的红曲霉菌株及其选育方法与应用

技术领域

本发明属于微生物菌种选育的技术领域，特别涉及一种高产胞外黄色素的红曲霉菌株及其选育方法与应用

背景技术

红曲霉菌，作为一种丝状真菌，属于真菌界、子囊菌门、子囊菌纲、散囊菌目、红曲科。红曲色素是由红曲霉菌次级代谢产生的一系列聚酮类化合物的天然色素，在中国、韩国和日本一直被作为食品添加剂广泛用于饮料、酱、食用油、面包、糕点等领域，已有上千年历史。目前商品用红曲色素一般为混合色素，主要分为红、橙、黄三大类。由于红曲霉液态发酵的红曲色素主要是胞内色素，这些色素易溶于乙醇、丙酮等极性较大的有机溶液，都是非水溶性的色素，因此在食品应用方面受到一定的限制。

近年来，除了作为食用着色剂以外，有研究报道两种红曲黄色素，包括红曲素(monascin)和安卡红曲黄素(ankaflavin)，是降脂的有效成分，能显著降低血清TC、TG、低密度脂蛋白和胆固醇的水平；红曲黄色素monaphilone A和monaphilone B对人体喉癌细胞株(HEp-2)、人结肠癌细胞株(WiDr)有抗增殖作用，且在一定剂量下(70uM)对人肺部成纤维细胞系无明显毒性(J Agric Food Chem,2010,58(14):8211-8216.)，应用市场巨大。但目前红曲黄色素绝大部分都是胞内脂溶性黄色素，生产工艺较复杂，且不利于在水溶性场合使用。生产中通常采用化学转化方法，改变其结构及发色性能成为水溶性色素，但是严格来说，转化后成为非天然色素，其使用受到了一定的质疑和限制。故选育一种高产胞外黄色素的红曲霉菌株对天然胞外红曲黄色素的生产及应用具有直接现实的重要意义和价值。

微生物对生存条件变化的适应能力是菌株选育的很好途径，外界环境的变化，能使微生物群体特性发生相应的变异。紫外诱变是传统的微生物菌种选育方法，其主要生物学效应是由于DNA变化而造成的，DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更敏感。紫外线引起DNA结构变化，使得DNA链的断裂、碱基破坏，最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。紫外线的波长一般在200-380nm之间，但最有效的诱变波长是252-265nm，通过对红曲生产菌株的紫外诱变，改变生产菌株的生理性状，从而筛选高产红曲胞外黄色素的生产菌株，是一种筛选改良菌种有效的技术手段。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现在菌种的缺点与不足，提供一种高产胞外黄色素的红曲霉菌株。

本发明的另一目的在于提供所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株的选育方法。

本发明的再一目的在于提供所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高产胞外黄色素的红曲霉菌株，名称为红色红曲霉(Monascus ruber)WQ15，保藏编号为CGMCC No.10910，于2015年7月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株的形态如下：在PDA平板上培养7天，菌落形态较大，直径30.8～31.8mm，菌落呈黄褐色，背面呈橙黄色；菌落边缘完整，圆润；中心凸起成丘陵状，无辐射裂纹，有白色绒毛状气生菌丝生长；周围光滑发亮，无油滴状物质；菌丝光滑，透明无色，有隔；分生孢子呈球形或倒梨，单生或成链；闭囊壳较大，球形，囊内孢子可见，椭圆形。

所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株的选育方法，包含以下步骤：

(1)孢子悬浮液制备：出发菌株接种于PDA培养基斜面上，在28～30℃培养2～3d后，用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

(2)紫外诱变：将步骤(1)得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，在15W紫外灯垂直距离下30cm放置，同时磁力搅拌照射一定时间，进行紫外诱变；

(3)平板分离筛选：接着将步骤(2)诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA平板，28～30℃恒温避光倒置培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经反复分离纯化得到较纯的诱变菌株；

(4)发酵选育：

①种子液的制备：将步骤(3)纯化后得到的诱变菌株接种于灭菌的种子培养基中进行培养增殖，每50mL种子培养基接种3～5个培养4-7天的单菌落，150～200rpm培养28～32h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液；

②发酵培养及高糖纯化：将种子液按8％接种量(V/V)接种到25mL发酵培养基中，发酵培养2～4天，然后加入葡萄糖直至糖浓度达到300g/L以上，再培养直至10～16天，离心、抽滤，得到含胞外红曲色素的上清液，检测胞外色素的色价和色调，得到高产胞外黄色素的红曲霉菌株。

步骤(1)中所述的去除菌丝优选为通过4层无菌擦镜纸滤去菌丝。

步骤(1)中所述的含有孢子的悬浮液中孢子的浓度优选为1×10⁵个/mL。

步骤(1)中所述的出发菌株优选为红曲霉菌株Monascus ruber GIM3.240。

步骤(3)中所述的菌落形态包括菌落大小、颜色和气生菌丝等。

步骤(3)中所述的纯化的操作如下：将菌落划线于PDA平板上培养，直至从同一菌落上划出来得到的菌落形态类似。

所述的PDA培养基的组成为：马铃薯浸粉0.06g，葡萄糖0.4g，琼脂粉0.3g，用蒸馏水定容至20mL，pH自然。

步骤(4)中所述的种子培养基的组成为：葡萄糖1g，酵母浸粉0.15g，鱼粉蛋白胨0.5g，KCl 0.025g，KH₂PO₄0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.5mg，用蒸馏水定容至50mL，pH自然。

步骤(4)中所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖1.25g，(NH₄)₂SO₄0.125g，KH₂PO₄0.125g，MgSO₄·7H₂O 0.0125g，KCl 0.0125g，FeSO₄·7H₂O 0.25mg，ZnSO₄·7H₂O0.25mg，MnSO₄·H₂O 0.75mg，用蒸馏水定容至25mL，pH自然。

所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株特别适合用于生产红曲黄色素。

所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株用于生产红曲黄色素，优选包括如下步骤：

I、将所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株接种于发酵培养基中，进行好氧发酵，使得红曲霉菌处于对数生长期或稳定期；

II、接着补加碳源，该碳源在发酵培养基中的浓度为至少60g/L，继续好氧发酵；

III、将发酵好的发酵液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性红曲黄色素。

步骤(I)中所述的基本发酵培养基的组成如下：每100mL基本发酵培养基中，含葡萄糖5g、(NH₄)₂SO₄0.5g、KH₂PO₄0.5g、KCl 0.05g、MgSO₄·7H₂O0.05g、FeSO₄·7H₂O 1.0mg、ZnSO₄·7H₂O 1.0mg、MnSO₄·H₂O 3.0mg，用蒸馏水定容至100ml，pH自然。

步骤(I)中所述的红曲霉菌株在接种于发酵培养基时，优选为将红曲霉菌进行活化、扩大培养后再接种入发酵培养基中。

所述的活化为常规的手段，如将红曲霉菌种划线于平板中进行培养。

所述的扩大培养为常规的手段，具体操作如下：从活化好的红曲霉菌从平板上接种于种子培养基中进行培养增殖，每50mL种子培养基接种3～5个培养4-7天的单菌落、27～34℃、150～250rpm培养24～32h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液。

所述的扩大培养的步骤更优选如下：将活化好的红曲霉菌从平板上接种于种子培养基中进行培养增殖，每50mL培养基接种3～5个培养6天的单菌落、30℃、180rpm培养28h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液。

所述的种子培养基的组成如下：每100mL种子培养基中含葡萄糖2g，酵母浸粉0.3g，鱼粉蛋白胨1.0g，KCl 0.05g，KH₂PO₄0.4g，FeSO₄·7H₂O 1.0mg，用蒸馏水定容至100mL，pH自然。

步骤(I)中所述的好氧发酵的时间如下：当红曲霉菌的接种量为体积百分比5～10％时，好氧发酵的时间为2～4天；优选为接种量为体积百分比8％时，好氧发酵的时间为3天。

步骤(I)、(II)中所述的好氧发酵的条件为：27～34℃、150～250rpm振荡培养；更优选为30℃、180rpm振荡培养。

步骤(II)中所述的碳源在发酵培养基中的浓度优选为60～300g/L。

步骤(II)中所述的碳源优选为葡萄糖、蔗糖和甘油中的至少一种。

步骤(II)中所述的好氧发酵时间为6～16天。

步骤(III)中所述的固液分离的方法优选为离心。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的高产胞外黄色素红曲霉菌株，其胞外黄色素的色阶达到25.20AU₃₅₀/mL，比原始菌株提高了72％；补加50g/L葡萄糖发酵时，该高产胞外黄色素红曲霉菌株的胞外黄色素色阶达到80.40AU₃₅₀/mL，比原始菌株提高了3.79倍；补加300g/L葡萄糖发酵时，该高产胞外黄色素红曲霉菌株的胞外黄色素色阶达到134.90AU₃₅₀/mL，比原始菌株提高了7.04倍。

(2)本发明提供的选育方法培育条件温和、操作简单、投入少、易掌握。

附图说明

图1是红色红曲霉(Monascus ruber)WQ15的细胞与菌落形态图；其中，图(a)为菌落图；图(b)为放大400倍的光学显微镜观察图。

图2是突变菌株和原始菌株常规发酵红曲胞外色素的检测结果图。

图3是突变菌株和原始菌株补料发酵(50g/L葡萄糖)红曲胞外色素的检测结果图。

图4是突变菌株和原始菌株补料发酵(300g/L葡萄糖)红曲胞外色素的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 高产胞外黄色素的红曲霉菌株的获取

(1)孢子悬浮液制备：将原始红曲菌株(Monascus ruber GIM3.240，购于广东省微生物菌种保藏中心)接种于PDA斜面上，在30℃培养3d后，用5mL生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，4层无菌擦镜纸滤去菌丝，制成含孢子1×10⁵个/mL悬浮液。

(2)紫外诱变：每个直径为7cm的培养皿装入步骤(1)制备的悬浮液3mL；将该培养皿放在15W紫外灯垂直距离下30cm，并在磁力搅拌下照射5min，进行紫外照射诱变。

(3)平板分离筛选：取诱变后的菌液0.5mL，加入4.5mL的无菌水稀释，然后取适量涂布于PDA平板(马铃薯浸粉0.06g，葡萄糖0.4g，琼脂粉0.3g，用蒸馏水定容至20mL，pH自然)中，30℃恒温避光倒置培养48h，待长出菌落后，挑选出菌落形态(包括菌落大小、颜色、气生菌丝)发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经反复分离纯化得到较纯的诱变菌株，于4℃保藏。

(4)发酵选育：取步骤(3)分离纯化的诱变菌株，进行发酵实验，即诱变菌株接种于种子培养基中进行培养增殖，每50mL种子培养基(葡萄糖1g，酵母浸粉0.15g，鱼粉蛋白胨0.5g，KCl 0.025g，KH₂PO₄0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.5mg，用蒸馏水定容至50mL，pH自然))接种5个培养6天的单菌落，置于摇床控制180rpm培养30h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液；将种子液按8％接种量(V/V)接种到25mL发酵培养基(葡萄糖1.25g，(NH₄)₂SO₄0.125g，KH₂PO₄0.125g，MgSO₄·7H₂O 0.0125g，KCl 0.0125g，FeSO₄·7H₂O 0.25mg，ZnSO₄·7H₂O0.25mg，MnSO₄·H₂O 0.75mg，用蒸馏水定容至25mL，pH自然)中，在摇床条件下控制180rpm、30℃发酵培养6天后，然后将发酵液离心、抽滤，得到含胞外红曲色素的上清液，通过检测胞外色素的色价和色调，将高产菌经多次传代培养验证，选育出能够高产胞外黄色素的红曲霉菌株。

经过选育，得到一株高产胞外黄色素的红曲霉菌株，其具有如下特点：在PDA平板上培养7天，菌落形态较大，直径30.8-31.8mm，菌落呈黄褐色，背面呈橙黄色，菌落边缘完整，圆润，中心凸起成丘陵状，无辐射裂纹，有白色绒毛状气生菌丝生长，周围光滑发亮，无油滴状物质，如图1(a)所示；菌丝光滑，透明无色，有隔；分生孢子呈球形或倒梨，单生或成链；闭囊壳较大，球形，囊内孢子可见，椭圆形，图1(b)所示。将其命名为红色红曲霉(Monascus ruber)WQ15，于2015年7月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10910。

实施例2 利用高产胞外黄色素的红曲霉菌株按常规方法制备红曲黄色素

(1)种子液的制备：将划线于PDA平板上的原始菌株(Monascus ruber GIM3.240)和突变菌株(Monascus ruber WQ15)平板种子分别接种于灭菌的50mL种子培养基(葡萄糖1g，酵母浸粉0.15g，鱼粉蛋白胨0.5g，KCl 0.025g，KH₂PO₄0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.5mg，用蒸馏水定容至50mL，pH自然)中进行培养增殖，接种量为5个培养6天的单菌落，置于摇床控制180rpm培养30h，使种子培养基有成熟的孢子，得到种子液。

(2)发酵培养：将种子液按8％接种量(V/V)接种到25mL基本发酵培养液(葡萄糖1.25g，(NH₄)₂SO₄0.125g，KH₂PO₄0.125g，MgSO₄·7H₂O 0.0125g，KCl 0.0125g，FeSO₄·7H₂O0.25mg，ZnSO₄·7H₂O 0.25mg，MnSO₄·H₂O 0.75mg，用蒸馏水定容至25mL，pH自然)中，在摇床条件下控制180rpm、30℃发酵培养6天，然后将发酵液离心、抽滤，得到含胞外红曲色素的上清液，测定胞外发酵液色价和色调。

(3)色价及色调的测定方法：取25mL发酵液在8000rpm转速下离心10min、取上清液抽滤，使用分光光度计检测抽滤后所得滤液的黄、橙、红色素的色价(即吸收波长为350、470、510nm处的吸光度值)以及胞外黄色素的色调(AU₃₅₀/AU₅₁₀)。

结果如图2所示，突变菌株发酵胞外液用紫外分光光度计测定350、470、510nm处的吸光度分别为25.20、2.12、0.56AU/mL，得到胞外红曲黄色调为45.00(AU₃₅₀/AU₅₁₀)；原始菌株发酵胞外液用紫外分光光度计测定350、470、510nm处的吸光度分别为14.62、1.35、0.47AU/mL，得到胞外红曲黄色调为31.11(AU₃₅₀/AU₅₁₀)。可见突变菌株胞外黄色素色阶是原始菌株的1.72倍，且胞外红曲黄色调提高了0.45倍。

实施例3 利用高产胞外黄色素的红曲霉菌株按补料方法制备红曲黄色素

将高产胞外黄色素红曲霉菌株Monascus ruber WQ15和原始菌株Monascus ruberGIM3.240，按照实施例2的方法进行发酵培养，与实施例2所不同的是在发酵第三天后，补加1.25g葡萄糖，致使发酵培养基中葡萄糖浓度升至60g/L左右，继续发酵培养到6天，按照实施例2的方法测定胞外发酵液色价、色调。

结果如图3所示，突变菌株发酵胞外液用紫外分光光度计测定350、470、510nm处的吸光度分别为80.40、4.14、1.00AU/mL，得到发酵胞外红曲黄色调为80.40(AU₃₅₀/AU₅₁₀)；原始菌株发酵胞外液用紫外分光光度计测定350、470、510nm处的吸光度分别为16.8、1.93、0.64AU/mL，得到胞外红曲黄色调为26.25(AU₃₅₀/AU₅₁₀)。可见，突变菌株胞外黄色素色阶是原始菌株的4.79倍，且胞外红曲黄色调提高了2.06倍。

实施例4 利用高产胞外黄色素的红曲霉菌株按补料方法制备红曲黄色素

将高产胞外黄色素红曲霉菌株Monascus ruber WQ15和原始菌株Monascus ruberGIM3.240，按照实施例2的方法进行发酵培养，与实施例2所不同的是在发酵第三天后，补加7.5g的葡萄糖，使发酵培养基中葡萄糖浓度升高至310g/L左右，继续培养到15天，按照实施例2的方法测定胞外发酵液色价、色调。

结果如图4所示，突变菌株发酵胞外液用紫外分光光度计测定350、470、510nm处的吸光度分别为134.90、6.52、1.15AU/mL，得到发酵胞外红曲黄色调为117.30(AU₃₅₀/AU₅₁₀)；原始菌株发酵胞外液用紫外分光光度计测定350、470、510nm处的吸光度分别为16.77、2.86、1.2AU/mL，得到胞外红曲黄色调为13.98(AU₃₅₀/AU₅₁₀)。可见，突变菌株胞外黄色素色阶是原始菌株的8.04倍，且胞外红曲黄色调提高了7.39倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种高产胞外黄色素的红曲霉菌株，其特征在于：所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株的名称为红色红曲霉（Monascus ruber）WQ15，保藏编号为 CGMCC No. 10910，于2015年7月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株在生产红曲黄色素中的应用。

3.根据权利要求2所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株在生产红曲黄色素中的应用，其特征在于包括如下步骤：

I、将所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株接种于发酵培养基中，进行好氧发酵，使得红曲霉菌处于对数生长期或稳定期；

II、接着补加碳源，该碳源在发酵培养基中的浓度为至少60 g/L，继续好氧发酵；

III、将发酵好的发酵液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性红曲黄色素。

4.根据权利要求3所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株在生产红曲黄色素中的应用，其特征在于：步骤（I）中所述的发酵培养基的组成如下：每100mL基本发酵培养基中，含葡萄糖5 g、（NH₄）₂SO₄ 0.5 g、KH₂PO₄ 0.5 g、KCl 0.05 g MgSO₄·7H₂O 0.05 g、FeSO₄·7H₂O1.0mg、ZnSO₄·7H₂O 1.0 mg、MnSO₄·H₂O 3.0 mg，用蒸馏水定容至100ml，pH 自然。

5.根据权利要求3所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株在生产红曲黄色素中的应用，其特征在于：步骤（I）中所述的红曲霉菌株在接种于发酵培养基时，是将红曲霉菌进行活化、扩大培养后再接种入发酵培养基中。

6.根据权利要求3所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株在生产红曲黄色素中的应用，其特征在于：

步骤（I）中所述的好氧发酵的时间如下：当红曲霉菌的接种量为体积百分比5～10%时，好氧发酵的时间为2～4天；

步骤（I）、（II）中所述的好氧发酵的条件为：27～34℃、150～250rpm振荡培养；

步骤（II）中所述的碳源在发酵培养基中的浓度为60～300 g/L；

步骤（II）中所述的碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油或同类碳源中的至少一种；

步骤（II）中所述的好氧发酵时间为6～16天；

步骤（III）中所述的固液分离的方法为离心。

7.根据权利要求6所述高产胞外黄色素的红曲霉菌株在生产红曲黄色素中的应用，其特征在于：

步骤（I）中所述的好氧发酵的时间如下：当红曲霉菌的接种量为体积百分比8%时，好氧发酵的时间为3天；

步骤（I）、（II）中所述的好氧发酵的条件为：30℃、180rpm振荡培养。