CN109825444A - 一种提高红曲黄酒食品安全的菌株及其酿造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品酿造技术领域，具体涉及一种提高红曲黄酒食品安全的菌株及其酿造方法。本发明提供了一种桔霉素合成能力低、产淀粉酶活性高的菌株——紫色红曲菌CGMCC No.16790，采用该菌株纯种发酵制备液体曲，结合活性干酿酒酵母进行红曲黄酒的酿造，极大地减少了酿造过程中的其它未知微生物，提高酿造红曲黄酒的食品安全，所制得的红曲黄酒颜色橙红、营养丰富、风味良好。
Description
技术领域
本发明属于食品酿造技术领域，具体涉及一种提高红曲黄酒食品安全的菌株及其酿造方法。
背景技术
黄酒是中国历史最久远的酿造酒，也是世界三大酿造酒(黄酒、葡萄酒和啤酒)之一。黄酒酿造是一个开发的发酵过程，酿造过程参与的微生物来自于酒曲、原料、发酵容器及空气等，存在伞枝犁头霉、烟曲霉、糖多胞菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、高温放线菌和肠杆菌等（陆健，曹钰，方华，李旺军，谢广发，邹慧君，胡志明. 绍兴黄酒麦曲中真菌的初步研究.食品与生物技术学报，2008,2（2）：78-83；刘芸雅，毛健，孟祥勇，牟穰，姬中伟，冯东阳，巩丹.绍兴黄酒麦曲及发酵过程中细菌群落结构分析.中国食品学报，2017,17（1）:201-207）微生物种类多样而且多变，在完成黄酒产品发酵的同时，也存在着明显的食品安全风险。
红曲黄酒是浙江及福建部分地区采用红曲酿造的特色黄酒，红曲中富含洛伐他汀、γ-氨基丁酸等对人体有益的活性物质，采用红曲制备的产品具有良好的保健功效。专利CN 104059831公开了一种富含洛伐他汀的发酵型红曲黄酒及其生产方法；专利CN102885303公开了一种高含量r-氨基丁酸青稞红曲及其制备方法。但是普通红曲菌在生长代谢过程中会产生桔霉素，动物实验表明桔霉素具有显著的肾脏毒性，许赣荣等从中国各地收集了36个红曲样品，检测了其中的桔霉素，发现35样品中含有桔霉素（许赣荣，卢晨，穆晓青，陈记亮，陈蕴，吴燕萍，顾玉梅，吴苗叶. 部分红曲霉菌株产桔霉素的研究.无锡轻工大学学报，2000,19（1）：58-61）。因此，选育不产桔霉素、但淀粉酶活性高的红曲菌菌株，制备纯种液体曲酿造红曲黄酒，可以有效地提高红曲黄酒的食品安全。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种提高红曲黄酒食品安全的菌株及其酿造方法。
本发明所采取的技术方案如下：一种提高红曲黄酒食品安全的菌株，其保藏编号为：CGMCC No. 16790，紫色红曲菌Monascus purpureus。
上述菌种于2018年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的菌株名称是：WZ-37；分类命名是紫色红曲菌(Monascus purpureus)；保藏编号为：CGMCC No. 16790。
一种提高红曲黄酒食品安全的红曲，通过以下过程制备：将上述的提高红曲黄酒食品安全的菌株接种到种子培养液中摇床培养72小时，转速180rpm，温度30℃，将培养好的种子液按10%体积百分比的接种量转种于发酵培养液中，置于摇床培养，转速180rpm，温度30℃，培养96小时后放瓶，得到富含淀粉酶的液体红曲。
现有市场上常使用的红曲，其内含有多种菌种，复杂、多样且不可控，故本发明提供了一种红曲，其中只含有一种菌株，该菌种产淀粉酶活性较高，足以满足酿造黄酒所需要的条件，且桔霉素合成能力低，在制造红曲以及黄酒酿造过程中，基本不会合成桔霉素，所酿造的黄酒中通过现有桔霉素检测的方法检测并无桔霉素。
一种红曲黄酒的酿造方法，包括以下步骤：
（1）纯种液体红曲的制备：将上述的提高红曲黄酒食品安全的菌株接种到种子培养液中摇床培养72小时，转速180rpm，温度30℃，将培养好的种子液按10%体积百分比的接种量转种于发酵培养液中，置于摇床培养，转速180rpm，温度30℃，培养96小时后放瓶，得到富含淀粉酶的液体红曲；
（2）将大米浸泡、蒸熟、冷却，在灭菌容器中按3:1-1:3的比例加入米饭和富含淀粉酶的液体红曲，再加入0.05%的活性干酿酒酵母，纱布封口，28℃发酵10-20天，经过滤、灭菌、陈酿，获得红曲黄酒。
所述的发酵培养液为8-15%的木薯粉、糙米粉、粳米粉、糯米粉或小麦粉。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种桔霉素合成能力低、产淀粉酶活性高的菌株——紫色红曲菌CGMCC No.16790，采用该菌株纯种发酵制备液体曲，结合活性干酿酒酵母进行红曲黄酒的酿造，极大地减少了酿造过程中的其它未知微生物，提高酿造红曲黄酒的食品安全，所制得的红曲黄酒颜色橙红、营养丰富、风味良好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为采用MEGA7.0软件，邻位连接法显示菌株CGMCC No. 16790与GeneBank数据库中相关种的18S rDNA序列系统发育树。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
斜面培养基(g/L)：土豆 200（煮汁），葡萄糖 20，琼脂20，pH自然；
种子培养基（g/L）：黄豆芽 200（煮汁），葡萄糖 20，pH自然；
发酵培养基（g/L）：大米粉 150，pH自然。
实施例1 菌种的获得
（1）、出发菌株
紫色红曲菌(Monascus purpureus)，从温州地区收集的黄酒酿造用红曲中分离获得。
（2）、菌种的培养过程
将出发菌株红曲菌接种于斜面培养基，30℃培养红曲霉至孢子成熟，用无菌生理盐水洗下孢子，转入带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，充分打散孢子，制备孢子悬浮液。
（3）、紫外诱变
将孢子悬浮液分装至无菌培养皿中，将孢子悬液置于波长254nm、功率为40W的紫外灯下照射，进行诱变处理。处理后梯度稀释，并涂布于斜面培养基，于30℃培养3天。
（4）、NTG诱变处理
在孢子悬液中加入2mg/mL的NTG，于30℃摇床上振荡处理20-60分钟，取样梯度稀释涂布平板分离斜面，于30℃培养3天。
（5）、摇瓶筛选
将经选育处理得到的单菌落接种于斜面培养基，30℃培养3天，再接种于种子培养基和发酵培养基30℃培养，分析糖化酶酶活和桔霉素含量。取糖化酶酶活力高而且桔霉素含量低（或不含桔霉素）的菌株，经过平板分离后和发酵培养验证后，提交保藏，其微生物菌种保藏号为CGMCC No.16790，菌种选育系谱见图1。
（6）、糖化酶活力测定
将发酵液8000 r/min离心10 min，取上清液采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖化酶活力。糖化酶活力定义：1 mL 酶液在40 ℃、pH 5.6的条件下，1 h 水解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖，为1个酶活力单位（U/mL）。
（7）、桔霉素含量的测定
将发酵液8000 r/min离心10 min，取上清液用0.45μm滤膜过滤。采用HPLC进行测定，液相色谱条件： C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；荧光检测器的激发波长为λex＝331 nm，发射波长λem＝500 nm；流动相为V（乙腈）∶V（水）＝35∶65，磷酸调节pH 2.5；柱温28 ℃；流速1.2 mL/min；进样量20 μL（具体方法参照：岳建明，杨强，肖潇，等. 铵盐对紫色红曲霉合成代谢红曲色素及桔霉素的影响. 食品科学，2016,37（5）:102-107）。
实施例2 紫色红曲菌CGMCC No. 16790的形态特征
在PDA培养基培养5-10天，形态特征为菌丝体初期无色，渐变为红色，并使培养基变成紫红色。菌丝体大量分枝，含橙紫红色颗粒，在分枝的顶端产生单个或成串的分生孢子，孢子呈球形或椭圆形，（6.5μm-10.5μm）×（7μm~9μm），闭囊壳橙红色，近球形，含有多数子囊，子囊内含8个孢子，直径25μm-75μm，子囊孢子卵形或近球形，光滑，透明，无色或漆红色，（5.5μm-6μm）×（3.5μm-5μm），说明该菌株是紫色红曲菌Monascus purpureus。
实施例3紫色红曲菌CGMCC No. 16790菌种18SrDNA鉴定
提取紫色红曲菌CGMCC No. 16790的基因组DNA，进行18S rDNA 分析。
设计引物，正向引物：5’- GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，和反向引物5’-GCATCACA-GACCTGTTATTGCCTC-3’；进行PCR 扩增，PCR 反应体系组成如下表：
PCR 条件如下表所示：
对PCR产物进行DNA 测序，与NCBI Genbank 数据库中的18S rDNA 进行序列比对，结果见图1。由此可见，紫色红曲菌CGMCC No. 16790菌株与Monascus purpureus的18SrDNA 相同，可以鉴定为紫色红曲菌。
实施例4 摇瓶的发酵培养
将紫色红曲菌CGMCC No. 16790接种于斜面培养基中，30℃培养3天。将斜面菌体接种于含100ml 种子培养液的250ml三角摇瓶中，置于摇床培养72小时，转速180rpm，温度30℃。将培养好的种子液按10%(v/v) 接种量转种于含150ml 发酵培养液的500ml三角摇瓶中，置于摇床培养，转速180rpm，温度30℃。培养96小时后放瓶，检测糖化酶酶活为116.7U/ml，桔霉素未检出。
实施例5黄酒的酿造
1、纯种液体红曲的制备：将紫色红曲菌CGMCC No. 16790在PDA斜面培养基上活化3天，然后接入种子培养基中摇床培养72小时，转速180rpm，温度30℃。将培养好的种子液按10%(v/v) 接种量转种于发酵培养液中摇床培养，转速180rpm，温度30℃，培养96小时，得到富含淀粉酶的液体红曲；
2、黄酒的酿造：将大米浸泡、蒸熟、冷却，在经灭菌的三角瓶中按3:1的比例加入米饭和富含淀粉酶的液体红曲，再加入0.05%的活性干酿酒酵母，纱布封口，28℃发酵20天，经过滤、灭菌、陈酿，获得风味良好的红曲黄酒，桔霉素未检出。
实施例6黄酒的酿造
1、纯种液体红曲的制备，同实施例5；
2、黄酒的酿造：将大米浸泡、蒸熟、冷却，在经灭菌的三角瓶中按2:1的比例加入米饭和富含淀粉酶的液体红曲，再加入0.05%的活性干酿酒酵母，纱布封口，28℃发酵15天，经过滤、灭菌、陈酿，获得风味良好的红曲黄酒，桔霉素未检出。
实施例7黄酒的酿造
1、纯种液体红曲的制备，同实施例5；
2、黄酒的酿造：将大米浸泡、蒸熟、冷却，在经灭菌的三角瓶中按1:3的比例加入米饭和富含淀粉酶的液体红曲，再加入0.05%的活性干酿酒酵母，纱布封口，28℃发酵10天，经过滤、灭菌、陈酿，获得风味良好的红曲黄酒，桔霉素未检出。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (4)
1.一种提高红曲黄酒食品安全的菌株，其特征在于：其保藏编号为：CGMCC No. 16790，紫色红曲菌Monascus purpureus。
2.一种提高红曲黄酒食品安全的红曲，其特征在于，通过以下过程制备：将权利要求1所述的提高红曲黄酒安全的菌株接种到种子培养液中摇床培养72小时，转速180rpm，温度30℃，将培养好的种子液按10%体积百分比的接种量转种于发酵培养液中，置于摇床培养，转速180rpm，温度30℃，培养96小时后放瓶，得到富含淀粉酶的液体红曲。
3.一种红曲黄酒的酿造方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）纯种液体红曲的制备：将权利要求1所述的提高红曲黄酒安全的菌株接种到种子培养液中摇床培养72小时，转速180rpm，温度30℃，将培养好的种子液按10%体积百分比的接种量转种于发酵培养液中，置于摇床培养，转速180rpm，温度30℃，培养96小时后放瓶，得到富含淀粉酶的液体红曲；
（2）将大米浸泡、蒸熟、冷却，在灭菌容器中按3:1-1:3的比例加入米饭和富含淀粉酶的液体红曲，再加入0.05%的活性干酿酒酵母，纱布封口，28℃发酵10-20天，经过滤、灭菌、陈酿，获得红曲黄酒。
4.根据权利要求3所述的红曲黄酒的酿造方法，其特征在于：所述的发酵培养液为8-15%的木薯粉、糙米粉、粳米粉、糯米粉或小麦粉。
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