CN104087511A - 一株总状毛霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

针对湖南特色的不同来源的发酵豆制品（豆豉、豆酱、腐乳等），采用常规分离的方法，获得一种包含总状毛霉(Mucor racemosus)的分离筛选鉴定，其中所述菌株已于2014年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.8700。该菌适合用于湖南特定环境的发酵豆制品的生产，缩短发酵时间、提高其产品的营养成份和其生产效率，确保产品生产过程的可控性，降低了产品风险。

Description

一株总状毛霉菌及其应用

所属技术领域

本发明属于食品发酵领域，涉及了一种适合腐乳、豆豉生产的毛霉菌的筛选与应用，更具体地说是涉及了一种利用所筛选新毛霉菌进行发酵加工方法。 

背景技术

毛霉菌(Mucor sp.)又叫黑霉、长毛霉，是接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属，在低(中)温、高湿度以及通风良好的条件下生长良好。菌丝无隔、多核、分枝状，在培养基质内能广泛蔓延，气生菌丝非常发达，无假根或匍匐菌丝，不产生定形菌落。腐生，广泛分布于酒曲、植物残体、腐败有机物、动物粪便和土壤中。菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。毛霉菌丝初期白色，后灰白色至黑色，这说明孢子囊大量成熟。毛霉菌丝体生产速度较快。以孢囊孢子和接合孢子繁殖，各分枝顶端着生球形孢子囊，内有形状各异的囊轴，但无囊托。囊内产大量球形、椭圆形、壁薄、光滑的孢囊孢子。孢子成熟后孢子囊即破裂并释放孢子。有性生殖借异宗配合或同宗配合，形成一个接合孢子，某些种产生厚垣孢子。毛霉的用途很广，毛霉能够分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等，是生产上述酶类的主要菌种。常用的毛霉主要有鲁氏毛霉和总状毛霉。毛霉菌在食品工业中应用广泛，如利用其产生淀粉酶制曲、酿酒；利用其分泌蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等。腐乳是豆腐坯经毛霉菌培养发酵而成。天然毛霉菌生长要求温度较低，其最适生长温度为l6℃左右，传统腐乳生产一般只能在冬春季低温条件下进行，温度高于25℃时，毛霉菌生长很差或不生长，故高温季节腐乳生产受到限制。虽然有些厂家在夏季选用耐高温根霉菌酿制腐乳，但根霉菌丝稀琉，颜色浅灰，长有黑色孢子囊，且蛋白酶活力、肽酶活力比毛霉菌低得多。因此，用根霉菌生产的腐乳，其形状、色泽、风味和理化指标均不及毛霉腐乳。 

公开号为CN1435118A的中国专利介绍了一株总状毛霉菌株及利用其生产豆腐乳的工艺，从四川地区特色的毛霉型豆豉中分离得到了用具有自主知产权的专利毛霉MHC-7菌种(CCTCC NO：M201026的总状毛霉M.H.C－7，Mucor  racemosus var.chinensis M.H.C-7)，生产的毛霉三级菌种已实现常年生产，解决了腐乳只能季节性生产的问题，为我国腐乳生产做出了极其重要的贡献，为高温地区解决了腐乳生产不能用毛霉菌的困境。 

公开号为CN102816703A的中国专利介绍了一种五通桥黄色毛霉及豆腐乳的生产方法，利用保藏号为CCTCC NO：M2012075的五通桥黄色毛霉Mucor flavus Bain.可全年生产豆腐乳，且制得的豆腐乳色泽乳黄亮丽、风味醇厚、古朴、独特，鲜香可口、营养丰富、氨基酸含量高，具有良好的市场应用前景。 

中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)的65种毛霉菌中，65种毛霉菌可以用于腐乳生产的有19种标注可以用于腐乳或者豆豉生产，代表种如总状毛霉CICC3039(M.racemosus)上海工业微生物研究所从金培松分离中分离得到可以用于腐乳生产、上海工业微生物研究所分离可用于腐乳生产的雅致放射性毛霉CICC3118、中国食品发酵工业研究院分离得到的五通桥毛霉CICC3109、普雷恩毛霉等。中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)公开的毛霉菌有309种，可以用于腐乳或者豆豉生产的仅有1种，主要代表属有黄海化学工业研究社五通桥毛霉(3.00025)。 

综上所述，针对利用毛霉进行腐乳发酵的研究较多，主要以解决生产过程中的发酵条件为主，对利用毛霉发酵黄豆所带来的营养成份变化关注度不高，而且各个地域不同，分离得到的毛霉菌有差异，形成以地方特色为主的腐乳豆豉产品。 

发明内容

本发明的目的就是针对湖南特色的不同来源的发酵豆制品(豆豉、豆酱、腐乳等)，采用常规分离的方法，得到了既可以发酵腐乳又能够生产豆豉的一种特色的毛霉菌资源，将分离得到的微生物经过鉴定用于适合湖南特定环境的发酵豆制品的生产，缩短发酵时间、提高其产品的营养成份和其生产效率，确保产品生产过程的可控性，降低了产品风险。 

因此，本发明第一个发明目的是提供一种包含总状毛霉(Mucor racemosus)的分离筛选鉴定，其中所述菌株已于2014年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.8700，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

其中，所述的总状毛霉的筛选过程：从湖南本地不同地域民间收集的腐乳、 豆豉的传统自然发酵的样品，采用选择性的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，通过分泌蛋白酶的能力为主要指标进行选择，得到产蛋白酶活力较高的菌株，委托中科院微生物所进行菌种鉴定，其rRNA基因序列的ITS1-5.8S-ITS2区序列测定结果见序列1。选育菌种的培养特征、显微特征、rRNA基因序列等数据分析其鉴定结论为总状毛霉(Mucor racemosus)，平皿生长可布满培养基，菌丝为薄棉絮状，浅黄褐色(图1)；孢囊具有短的、稀疏的假轴状分枝，孢子囊直径在20-100μm(图2)，囊轴近卵形，17-60*10-45μm(图3)，孢囊孢子近球形、宽椭圆形，单个无色，聚集在孢囊中呈灰褐色，5-8.5*4-7μm(图4)。结合孢子未见，厚垣孢子形状、大小不一致，无色或者浅黄色(图4)。 

在一个具体实施方案中，所述的总状毛霉还包括：该菌培养基质及该菌代谢产物。 

本发明第二个发明目的是总状毛霉在腐乳、豆豉生产及其产品加工中用于快速发酵的用途。 

其中所述的用途包括：用总状毛霉发酵剂(固态制剂/液体制剂)直接接种熟化黄豆的发酵工艺。 

该总状毛霉菌株的斜面培养：配制PDA斜面培养基，成分为马铃薯200克葡萄糖20克，琼脂10～14克，加水配制1000mL，自然PH，常规灭菌，冷却接种，放入28℃培养箱中培养48h，保存备用。 

该总状毛霉菌的扩大液体培养：麸皮液体培养基，成分为麦麸100克，红糖30克，琼脂12克，酵母12克，加水配制1000mL，自然PH，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，用接种扩大培养的毛霉孢子，28℃，培养24h进行扣瓶后，继续培养48h。 

在一个具体实施方案中，使用上述的总状毛霉发酵剂(固体粉剂)适量无菌水稀释喷雾接种煮熟的黄豆发酵工艺，可快速发酵黄豆，与传统发酵工艺比较，可以缩短发酵周期一半以上，同时减少了污染机会，保证发酵的成功率。 

其中，用总状毛霉发酵液拌料(黄豆)发酵工艺：采用总状毛霉(固体粉剂)，每克含孢子数量1×10⁹cfu以上，先用无菌水将粉剂稀释，喷雾接种在煮熟的已经冷却至室温的黄豆上，接种后进行发酵。采用总状毛霉采用PDA液体发酵制成液体发酵剂，每毫升含微生物数量1×10⁷cfu以上，将发酵液按照比例与煮熟 黄豆搅拌拌匀，进行发酵。用量是每100kg黄豆用总状毛霉0.5kg(L)～1.0kg(L)(注：液体培养液为L)。 

另外，使用总状毛霉发酵液，发酵周期缩短至2-3天，减少杂菌污染机会。 

选育的菌株所发酵成的豆豉经高效液相色谱柱分析,结果表明由于其酶系丰富，蛋白酶活力强，故能将原料大豆的大分子蛋白质全部酶解为较小分子量的胨、肽等易被人体吸收利用的形式存在，氨基酸态氮含量比传统发酵的高60％，风味好。 

在一个具体实施方案中，所述的微生物鉴定结果还包括：该菌脂肪酸组成和G+C的组成。 

本发明另一个发明目的是纯种菌株在发酵腐乳和豆豉生产的应用。 

其中所述的应用包括：微生物扩大培养机制；发酵管理；产品开发管理及质量控制。 

在一个具体实施方案中，使用扩大培养的毛霉菌种发酵，接种用量在0.5％-1.0％(W/W，蒸煮熟的黄豆或豆腐)，加水量为黄豆或豆腐重量的2-3％(V/W)，洗脱孢子后用灭菌纱布过滤，用消毒的喷雾器进行接种。前发酵时间由传统的7-15d缩短为2-4d，控制发酵温度25-32℃，湿度在85-95％之间。毛霉生长速度快，前期发白，气生菌丝发达，后期变褐微发黄，可以达到2-5cm，能够对豆腐和豆粒形成完整的包裹膜，蛋白酶活力达到780单位/克干基，活力较高。 

其中，菌种扩大培养工艺为：采用试管纯种接入已经灭菌的麸皮培养基中，培养时间24h后进行扣瓶，菌丝微白，气生菌丝较短，再培养24h后，气生菌丝达到2-4cm，再培养24h后菌丝稍微发黄，孢子数量在10⁸cfu/g湿基。无白斑，无异味，手感较为干爽，不黏手，有霉的清香，无氨味等邪杂味。 

在另一个具体实施方案中，采用发酵好的毛坯(豆腐毛坯或黄豆毛坯)直接加入6-8％的食盐浓度，加入辣椒面(腐乳用0.5％，W/W)、白酒(50V/V，2％，V/W)、生姜(豆豉用3％，W/W，腐乳不用生姜)，装坛密封进行厌氧发酵，发酵时间在15-20d完成后发酵，氨基酸态氮达到0.5％以上，酸度在1.0％以内，有腐乳和湖南特色豆豉特有的香气和滋味。 

技术效果 

1、获得适合湖南特定豆制品发酵环境的总状毛霉，缩短发酵时间、提高其产品的营养成份和其生产效率，确保产品生产过程的可控性，降低了产品风险。 

2、该菌适应于低盐发酵，发酵过程中食盐的含量不超过8％，减少了食盐浓度过高对酶系的抑制作用，极大的缩短后发酵的时间，提高生产效率，减少生物胺的形成，确保了产品质量稳定与安全，减轻了企业的资金压力。 

具体实施方案

实施例1：毛霉菌的筛选 

从各地采集自然发酵的腐乳、豆豉样品，采用不同的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行蛋白酶分泌能力实验和生存温度较高(25-35℃之间)，得到毛霉菌株，进行菌种鉴定。 

优良菌株分离筛选： 

(1)单菌分离：样品来源于自然生霉的腐乳毛坯、腊八豆曲或浏阳豆豉曲样品，采用稀释平皿法和单孢子分离方法，在马铃薯琼脂平板上培养。选取生长速度快、菌丝致密发达、孢子量多的菌落，继续进行多次点种培养，直到纯化为止。然后用接种到PDA平皿上待长出单菌落移接斜面。 

(2)干酪素培养基初筛：采用透明圈法。将上述得到的纯种毛霉菌接入灭菌的麸皮培养基上培养72h，加入0.5％无菌盐水的浸泡毛霉麸曲过滤得到粗提液(酶液)。取在直径9cm无菌培养皿注入15mL-20mL干酪素琼脂培养基，凝固成平板。取直径10mm灭菌滤纸片，放入酶液中浸泡1h。取出凉干，贴在干酪素琼脂平板上。每个平皿贴4块滤纸片，每个处理4次重复。置40℃下保温6h，测定透明圈直径，选取透明圈直径较大的菌株进行复筛。 

(3)三角瓶复筛：取毛霉PDA琼脂平板菌种一小块，接入三角瓶麸皮培养基中，于25℃培养4d，提取酶液，测定蛋白酶活力。 

(4)酶液制备：称取5g培养好的毛霉麸曲，置于250mL三角瓶中，加入0.5％灭菌盐水100mL，捣碎培养物，在40℃水浴中，不断搅拌，浸提1h，用滤纸过滤，取滤液测酶活力。 

(5)蛋白酶活力测定：用福林法测定中性蛋白酶活力。 

实施例2：总状毛霉的生理生化特征及其保藏 

将筛选的菌株于2014年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.8700。 

选育菌种的培养特征、显微特征、rRNA基因序列等数据分析其鉴定结论为总状毛霉(Mucor racemosus)，平皿生长可布满培养基，菌丝为薄棉絮状，浅黄褐色(图1)；孢囊具有短的、稀疏的假轴状分枝，孢子囊直径在20-100μm，囊轴近卵形，17-60*10-45μm，孢囊孢子近球形、宽椭圆形，单个无色，聚集在孢囊中呈灰褐色，5-8.5*4-7μm。结合孢子未见，厚垣孢子形状、大小不一致，无色或者浅黄色。 

实施例3：毛霉发酵剂的制备 

(1)菌株的培养 

配制PDA斜面培养基，接种，放入28℃培养箱中培养48h，保存备用。 

(2)扩大培养 

麸皮培养基灭菌前分装三角瓶(500mL瓶、装50g)，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，用接种扩大培养的毛霉孢子，28℃，培养24h进行扣瓶后。继续培养48h。 

(3)毛霉在腐乳表面生长情况见表1。 

表1毛霉在豆腐表面生长情况表 

(4)该菌种的菌体脂肪酸检测。 

使用美国MIDI(Microbial Identification)公司Sherolock全自动细菌鉴定系统对送检菌株进行菌体脂肪酸成分分析。溶液Ⅰ：45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水；溶液Ⅱ：190mL浓盐酸，275mL甲醇溶于135mL蒸馏水；溶 液Ⅲ：200mL正己烷与200mL甲基叔丁醚混合均匀；溶液Ⅳ：10.8g氢氧化钠溶于900mL蒸馏水；溶液Ⅴ：饱和氢氧化钠溶液。 

脂肪酸提取方法：用接种环从培养基表面刮取适量细菌培养物。置于8mL螺口玻璃管中，加入1mL溶液Ⅰ，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5-10s，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min。待样品管冷却后，加入2ml溶液Ⅱ，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏。在冷却样品管中加入1.25mL溶液Ⅲ，快速振荡10min左右，弃去下层水相。在剩余有机相中加入3mL溶液Ⅳ和几滴溶液Ⅴ，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。 

脂肪酸色谱分析条件：采用HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HP CHEMSTATION ver A5.05)；色谱柱为UItra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每分钟5℃升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5mL/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2μL；检测器温度300℃，氢气流速30mL/min，空气流速216mL/min，补充气(氮气)流速30mL/min，检测结果见表2。 

表2毛霉菌菌丝脂肪酸含量表 

(5)该菌种rRNA基因的ITS1-5.8S-ITS2区序列测定方法：参照王东等人， 不同产地山药rDNA ITS区序列的比较[J]，时珍国医国药,2007(18)1:54-55。 

PCR扩增引物序列为： 

SEQ ID No：1	5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3
		SEQ ID No：2	5-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGC-3

相关引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。 

对该菌的DNA，使用ABI 9700型PCR仪，进行生物学实验操作。 

PCR的反应体系为： 

以上试剂，除细菌DNA、超纯水、引物外，均来自于美国Sequenom公司。 

(2)PCR的循环参数为：95℃，4min，1个循环，95℃，20s，56℃，30s，72℃，60s，45个循环，72℃，3min，1个循环。经PCR扩增获得PCR产物，通过生工生物工程(上海)有限公司进行测序。 

该菌种其rRNA基因序列的ITS1-5.8S-ITS2区序列测定结果(SEQ ID No：3)： 

GCCGTTTGCATCTTAGTATCCGCTGATTTAGATCAATTTAAAAGAGATTTATTTGGGAGGCCCCATCAAGTCAATTACAAGAGCTTTCCTTTATATTAAAAAAAAGTTCAGGCATTTAAACAAGTTCAGGCCTTAGTAAATTTCAGGGATTTCAAGATCTATACAGATCGAGAGGCCCCCAATAATCCTATACAACAAAAGTTGGATAGAGGGTTTGTTTTGATACTGAAACAGGCGTGCTCATTGGAATACCAATGAGCGCAAGTTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTGTTTTATAGATTTTTTAGGTCTATGTTACAATATTAATTCTGAATTCATTTGGTAAATAATAATAGGATACCAGGCCTAAACCTGATTATGACTCGGTTAACATTTCCAATGTCTATCCTTATAACATTGGAACATCCCTCAAATGTCAAATAATAATACAGTTCACAGTAAATAGATAATAATGGACAAGCCAAGATTATTGATTATTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTTACCTTCCA。

序列表

Claims (8)

1.本发明第一个发明目的是提供一种包含总状毛霉(Mucor racemosus)的分离筛选鉴定，其中所述菌株已于2014年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.8700。

2.根据权利要求1的方法，总状毛霉还包括：该菌培养基质及该菌代谢产物。

3.根据权利要求1的方法，总状毛霉在腐乳、豆豉生产及其产品加工中用于快速发酵的用途。

4.根据权利要求3的方法，其中所述总状毛霉用途包括：用总状毛霉发酵剂，包括固态制剂和液体制剂，直接接种熟化黄豆的发酵工艺。

5.根据权利要求1的方法，总状毛霉纯种菌株在发酵腐乳和豆豉生产的应用。

6.根据权利要求5的方法，其中所述总状毛霉应用包括：微生物扩大培养机制；发酵管理；产品开发管理及质量控制。

7.根据权利要求5的方法，使用扩大培养的毛霉菌种发酵，接种用量kg为蒸煮熟的黄豆或豆腐重量kg的0.5%-1.0%，加水体积L为黄豆或豆腐重量kg的2-3%，洗脱孢子后用灭菌纱布过滤，用消毒的喷雾器进行接种，前发酵时间由传统的7-15d缩短为2-4d，控制发酵温度25-32℃，湿度在85-95%之间。毛霉生长速度快，前期发白，气生菌丝发达，后期变褐微发黄，可以达到2-5cm，能够对豆腐和豆粒形成完整的包裹膜，蛋白酶活力达到780单位/克干基，活力较高。

8.根据权利要求5的方法，采用发酵好的豆腐毛坯或黄豆毛坯直接加入6-8%的食盐浓度，加入辣椒面（腐乳用0.5%，W/W）、白酒（50V/V，2%，V/W）、生姜（豆豉用3%，W/W，腐乳不用生姜），装坛密封进行厌氧发酵，发酵时间在15-20d完成后发酵，氨基酸态氮达到0.5%以上，酸度在1.0%以内，有腐乳和湖南特色豆豉特有的香气和滋味。