CN109082384B - 一种高产芳樟醇及乙酸芳樟酯的总状毛霉及其应用 - Google Patents

一种高产芳樟醇及乙酸芳樟酯的总状毛霉及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产芳樟醇及乙酸芳樟酯的总状毛霉及其应用，属于微生物领域。本发明的总状毛霉(Mucor racemosus)CGMCC No.15264产芳樟醇和乙酸芳樟酯的能力高，后发酵90天可产9645.14μg/kg芳樟醇和1228.05μg/kg乙酸芳樟酯，二者均赋予了油腐乳花香和果香；本发明提供的总状毛霉(Mucor racemosus)CGMCC No.15264利于对豆腐坯的包裹以保证腐乳的良好外形，且能够有效地提高油腐乳中芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量，且利于提高油腐乳的香气感官特性。

Description

一种高产芳樟醇及乙酸芳樟酯的总状毛霉及其应用
技术领域
本发明涉及一种高产芳樟醇及乙酸芳樟酯的总状毛霉及其应用，属于微生物领域。
背景技术
腐乳是利用微生物发酵的方法改变植物蛋白风味的大豆发酵制品，它以独特的工艺、细腻的品质、丰富的营养及鲜香可口的风味深受广大群众的喜欢。
云南牟定地区特殊的地理气候条件使得该地区形成了利于油腐乳发酵的独特微生物菌群，使得所生产的油腐乳品质优异而具有浓郁的花香和果香。但是云南牟定地区的油腐乳生产采用自然发酵，杂菌污染严重，产品香气不稳定。
芳樟醇阈值较小，对腐乳的香气贡献大，赋予其花香的香气特征。崔晓红等人研究表明(混合菌种发酵红豆腐特征香气成分的鉴定[J].食品与发酵工业，2017，43(2)：185-190)：红腐乳中芳樟醇的含量为738.24μg/kg，其对红腐乳的香气具有重大贡献。程昌泽在“腐乳毛霉的分离、鉴定、发酵性能及其菌丝自溶性研究”中提到：腐乳中毛霉或酵母菌等微生物的协同代谢产生的有机酸和酒精形成各种酯类，构成腐乳的特殊香气(学位论文.贵阳：贵州大学，2008)
发明内容
为了解决目前存在的问题，本发明立足于自然发酵油腐乳的关键问题，提取、分离和纯化菌种，得到一种高产芳樟酯和乙酸芳樟酯的总状毛霉，将其应用于油腐乳发酵中，以提高芳樟酯和乙酸芳樟酯的含量并增强产品的花香和果香。
本发明的第一个目的在于提供一种高产芳樟醇及乙酸芳樟酯的总状毛霉，该总状毛霉于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15264，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个目的是提供一种含有总状毛霉CGMCC No.15264的菌剂。
本发明的第三个目的是提供一种总状毛霉CGMCC No.15264在制备油腐乳中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种总状毛霉CGMCC No.15264在制备大豆发酵制品中的应用。
可选的，所述大豆发酵制品包括豆酱、酱油、豆豉。
本发明的第五个目的是提供一种含有总状毛霉CGMCC No.15264的菌剂在制备油腐乳中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种含有总状毛霉CGMCC No.15264的菌剂在制备大豆发酵制品中的应用。
可选的，所述大豆发酵制品包括豆酱、酱油、豆豉。
本发明有益效果是：
本发明的总状毛霉(Mucor racemosus)CGMCC No.15264产芳樟醇和乙酸芳樟酯的能力高，后发酵90天可产9645.14μg/kg芳樟醇和1228.05μg/kg乙酸芳樟酯，二者均赋予了油腐乳花香和果香；本发明提供的总状毛霉(Mucor racemosus)CGMCC No.15264利于对豆腐坯的包裹以保证腐乳的良好外形，且能够有效地提高油腐乳中芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量，且利于提高油腐乳的香气感官特性。
生物材料保藏信息：
总状毛霉Mucor racemosus，于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15264，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明总状毛霉(Mucor racemosus)和生产用总状毛霉在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上的菌落形态；
图2为本发明总状毛霉(Mucor racemosus)CGMCC No.15264在发酵过程中芳樟酯的含量变化；
图3为本发明总状毛霉(Mucor racemosus)CGMCC No.15264在发酵过程中乙酸芳樟酯的含量变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一：总状毛霉CGMCC No.15264的菌种分离鉴定方法
(1)获得合适的稀释梯度并培养
从云南省楚雄州牟定自然发酵的油腐乳中称取25g，加入到装有225mL无菌水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min；然后依次取1mL菌液稀释在9mL无菌水中，将样品匀液(液体样品可包括原液)进行10倍递增稀释，使该样品浓度梯度稀释至10-5，取4个稀释度为102-105的样品匀液(液体样品包括原液)，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液至2个无菌培养皿内，及时将15-20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基倾注培养皿，并轻轻地转动培养皿使其混合均匀，待琼脂凝固后，将培养皿倒置，28℃±1℃培养3d。
(2)分离纯化
用点接法，挑选典型单菌落，重复这种培养挑选操作后得到优良性状的菌株。
(3)DNA的提取
1)在酒精灯火焰旁取培养基上的菌株于研钵，液氮研磨。
2)将研磨好的菌转移至1.5mL离心管中，标记菌株名称，加入0.6mL TE(pH 8.0)，用移液枪吸打均匀，使菌体充分悬浮。
3)加入250μL 10％SDS，轻轻倒转混匀。
4)加入3μL蛋白酶K(20ng/μL)，轻轻混匀，37℃水浴1h。
5)加入150μL 5mol/L NaCl，轻轻混匀。
6)加入150μL 2％CTAB，轻轻混匀，65℃水浴20min。
7)12000rpm常温离心20min。
8)小心吸取上清至新的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置30min,12000rpm下4℃离心10min。
9)吸掉上清，在吸水纸上空干液体，加入750μL 70％乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，12000rpm下4℃离心2min。
10)每管加入30μL纯化水溶解沉淀(水中加Rnase，终浓度10ng/μL)，用手轻弹管壁，4℃溶解过夜。
(4)DNA的电泳检测
用1％琼脂糖凝胶和100V电压检测，样品上样量为3μL，Marker条带组成：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp；750bp条带浓度为60ng/3μL。
(5)PCR扩增
18s引物序列:
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO:1)；
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO:2)；
反应体系如表1，反应条件如表2：
表1：反应体系
Figure BDA0001770680140000041
表2：反应条件：
Figure BDA0001770680140000042
(6)上机测序，输出峰图
(7)ITS序列分析鉴定
根据华大基因科技股份有限公司武汉分公司给出的测序报告，结合BLAST分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)将所分离的毛霉ITS序列(SEQ ID NO:3)与GenBank/EMBL/DDBJ)数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，经分析鉴定为总状毛霉(Mucor racemosus)CGMCC No.15264。总状毛霉CGMCC No.15264菌落为白色大菌落，菌落边缘呈绒毛状，表面干燥；菌丝形态特征：菌丝无假根，菌丝均无横隔，孢囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，单轴分枝，全部顶生孢子囊；孢子囊大，椭球形，含孢子甚多孢子；孢子近似圆形，大小为3-6μm。
实施例二总状毛霉CGMCC No.15264发酵油腐乳
(1)GC-MS测定油腐乳发酵过程中芳樟醇及乙酸芳樟酯的含量
色谱条件为：Rtx-WAX毛细管柱；柱子规格：30m×0.25μm×0.25mm，进口温度为230℃，柱流速1mL/min，载气为氦气；程序升温：起始温度45℃(保持1min)，以5℃/min升至185℃(保持1min)，10℃/min升至240℃(保持8min)。
质谱条件为：离子化方式EI，电子能量为70eV，离子源温度230℃，接口温度240℃，质荷比30-440。
(2)油腐乳的发酵
1)总状毛霉CGMCC No.15264孢子悬浮液的制备：将-80℃保存的本发明总状毛霉CGMCC No.15264接种于PDA培养基上，在28℃下培养3天，传代培养3次。取霉菌孢子制成105个/mL的孢子悬浮液(采用光学显微镜计数)，以1:100的比例接种至PDA的液体培养基中，在28℃下培养4天；采用无菌的0.85％生理盐水将孢子悬浮液稀释为105个/mL。
2)酸豆腐的制备：选择干燥、颗粒饱满的新鲜大豆，除去杂质，加水量为大豆体积的2-3倍浸泡12小时；浸泡后的大豆沥水后洗净，将洗净的大豆另加净水碾碎，豆水比为1:8-1:10，磨浆过滤，收集豆浆；原豆浆进行加热至沸腾并保持5-10min。待豆浆冷却至58℃左右，将乳酸菌接种至豆浆中凝胶4小时，先将制成的大豆凝乳搅拌打碎，然后倒入豆腐成型槽中，压制成型。将豆腐切成3.5cm×3.5cm×2.0cm备用。
3)油腐乳的前发酵：将105个/mL总状毛霉CGMCC No.15264孢子悬浮液喷洒至豆腐上，在25℃、相对湿度为90％左右的环境中培菌3天。
4)晾晒、盐渍：晾晒12小时，再加入5％盐盐渍12小时，去除15％左右的水分。
5)油腐乳的后发酵：将辣椒、花椒等调料与腐乳坯混合均匀，取12块放入玻璃瓶中，加入100mL菜籽油，后发酵90天。
分别在前发酵0天、前发酵4天、晾晒、盐渍、后发酵0天、后发酵30天、后发酵90天取2瓶样品，测其挥发性风味物质含量变化。
(3)油腐乳发酵过程中芳樟醇及乙酸芳樟酯的含量变化
油腐乳发酵过程中芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量变化分别见图1和图2。随着发酵时间的延长，芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量逐渐增加；在后发酵90天后，总状毛霉CGMCCNo.15264发酵油腐乳中芳樟醇的含量为96454μg/kg，而生产用总状毛霉的为3951μg/kg；总状毛霉CGMCC No.15264发酵油腐乳中乙酸芳樟酯的含量1228μg/kg，而生产用总状毛霉的为322μg/kg。
上述生产用总状毛霉，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC40491。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高产芳樟醇及乙酸芳樟酯的总状毛霉及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
ttcccgtagg gtgacctgcg gaaggatcat taaatatatc aataatcttg gcttgtccat 60
tattatctat ttactgtgaa ctgtattatt atttgacatt tgagggatgt tccaatgtta 120
taaggataga cattggaaat gttaaccgag tcataatcag gtttaggcct ggtatcctat 180
tattatttac caaatgaatt cagaattaat attgtaacat agacctaaaa aatctataaa 240
acaactttta acaacggatc tcttggttct cgcatcgatg aagaacgtag caaagtgcga 300
taactagtgt gaattgcata ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcaa cttgcgctca 360
ttggtattcc aatgagcacg cctgtttcag tatcaaaaca aaccctctat ccaacttttg 420
ttgtatagga ttattggggg cctctcgatc tgtatagatc ttgaaatccc tgaaatttac 480
taaggcctga acttgtttaa atgcctgaac ttttttttaa tataaaggaa agctcttgta 540
attgactttg atggggcctc ccaaataaat cttttttaaa tttgatctga aatcaggcgg 600
gattacccgc tgaacttaag cata 624

Claims (8)

1.一种高产芳樟醇及乙酸芳樟酯的总状毛霉(Mucor racemosus)，其特征在于，所述总状毛霉于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15264，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.含有权利要求1所述的总状毛霉的菌剂。
3.权利要求1所述的总状毛霉在制备油腐乳中的应用。
4.权利要求1所述的总状毛霉在制备大豆发酵制品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述大豆发酵制品为豆酱、酱油、豆豉。
6.权利要求2所述的菌剂在制备油腐乳中的应用。
7.权利要求2所述的菌剂在制备大豆发酵制品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述大豆发酵制品为豆酱、酱油、豆豉。
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