CN103571764B - 一种高产中链脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株高产中链脂肪酸乙酯酿酒酵母工程菌，是选用强启动子PGK1过表达编码醇己酰基转移酶的EHT1基因，同时敲除外源脂肪酸活化酶基因FAA1实现的，保藏号为CGMCC No.7937。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下，与亲本菌株相比：模拟玉米原料液态白酒发酵15天后，己酸乙酯含量可以提高到2.23mg/L，为原菌的2.75倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量分别提高了52%和62%。发酵30天后，己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了120%、16.2%和16.7%。模拟高粱原料固态白酒发酵15天后，己酸乙酯的含量可以提高到2.83mg/L，为原菌的2.8倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了43.3%和40.9%。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种高产中链脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌及其构建方法。
背景技术
酯香物质是饮料酒中主要的风味物质，是酒芳香的主要担体，提高酒中酯香物质的含量可以增进酒类的风味，改善饮料酒的品质。以己酸乙酯为主的脂肪酸乙酯是浓香型白酒的主体香，赋予了饮料酒重要的酯香（水果香）。国内普通白酒和黄酒是以纯种培养的酿酒酵母为主进行发酵的，其特点是发酵周期短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较差。而高档饮料酒（白酒、黄酒）中酯香物质含量较高的主要原因是采用自然网罗微生物制曲发酵，通过自然制曲网罗的产酯能力较强的汉逊酵母和假丝酵母以及提供产酯前体物的乳酸菌、己酸菌和霉菌等生香微生物来提高酒中各种酯的含量，而这些野生菌群的存在严重影响了原料出酒率，其酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致了我国高档白酒耗粮高、生产周期长、效率低、成本高。
如何提高饮料酒中酯香物质的含量，能否让酿酒酵母大量分泌己酸乙酯和酯化己酸和乙醇合成己酸乙酯，是一个长期困扰我国饮料酒业界的问题。目前提高普通白酒己酸乙酯含量的主要方法有如下三种：一是固液结合法，用液态法生产酒基，用固态法的酒糟、酒尾或成品酒来提高质量；二是调香法，用天然香料调制或用纯化学药品按某一名酒的香味成分组成来进行调香；三是全液法，在发酵醪中加入产香微生物，己酸菌发酵液或将己酸发酵液经化学，生物法酯化后，再加到发酵醪中。这些提高酒中己酸乙酯含量的方法大多是从工艺水平上进行的，虽然酯香物质含量有一定提高，但酒质与高档名酒相差仍很大，特别是化学品的添加存在安全隐患。
研究表明，酯类是在酵母代谢时在酵母内合成的，形成的酯部分通过细胞扩散到发酵醪液中，构成饮料酒的香气成分。中链脂肪酸乙酯类，如己酸乙酯（苹果香气），辛酸乙酯（酸苹果香气）和癸酸乙酯（花香），相比乙酸酯类虽然含量较少，仍然是酒中重要的风味活性酯。
参与中链脂肪酸乙酯合成的酶主要是己酰基转移酶（AATase），该酶催化乙醇和己酰基辅酶A形成中链脂肪酸酸乙酯。该酶是一种巯基酶，在酿酒酵母中存在三种同功酶形式，分别由EHT1，EEB1和YMR210w编码。而由FAA1基因编码的脂肪酸激活酶合成的长链酰基CoA抑制了乙酰基羧化酶的作用，当合成中链脂肪酸的重要酶乙酰基羧化酶收到抑制后，合成中链脂肪酸乙酯（如己酸乙酯）前体的中链脂肪酸（如己酸）就受到影响。从而导致了己酸乙酯等中链脂肪酸乙酯的生成受到抑制。而国内还没有己酰基转移酶和脂肪酸激活酶及其编码基因对饮料酒风味和品质影响的相关研究。
发明内容
本发明的目的是解决酿酒酵母自身产酯能力较低的问题，提供一种高产中链脂肪酸乙酯 的酿酒酵母工程菌株及其构建方法。
为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
本发明提供的高产中链脂肪酸乙酯酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），具体为EY15，已于2013年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏号为CGMCC No.7937，分类命名：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。模拟玉米原料液态白酒发酵后，本发明菌株与亲本菌株相比，发酵15天后，己酸乙酯含量为原菌的2.75倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量分别提高了52%和62%；发酵30天后，己酸乙酯含量为原菌的2.5倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了16.2%和16.7%。模拟高粱原料固态白酒发酵15天后，己酸乙酯含量为原菌的2.8倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了43.3%和40.9%。
本发明所述高产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌的构建方法，是通过用强启动子过表达醇己酰基转移酶基因，并同时敲除外源脂肪酸活化酶基因来实现。
所述过表达醇己酰基转移酶基因替换外源脂肪酸活化酶基因。
所述过表达醇己酰基转移酶基因为EHT1，所述外源脂肪酸活化酶基因为FAA1。
本发明高产中链脂肪酸乙酯酿酒酵母基因工程菌的构建方法具体包括如下步骤：
1）将通过PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码醇己酰基转移酶EHT1基因插入到pPGK1质粒上的启动子PGK1p和终止子PGK1T之间，得到质粒pUC-PE；
2）将通过PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码脂肪酸激活酶FAA1基因的同源片段FA和FB分别连接到质粒pUC19上，得到质粒pUC-FAB；
3）将来源于质粒pUG6上的loxP-KanMX-loxP基因片段连到质粒pUC-FAB上，得到质粒pUC-FABK；
4）将pUC-PGK1-EHT1质粒上的启动子PGK1p-EHT1-PGK1T基因酶切下来后再与pUC-FABK质粒连接得到质粒pUC-APEKB；
5）将通过PCR方法获得的来源于构建的质粒pUC-APEKB的APEKB重组盒，用醋酸锂转化法分别将其重组入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生孢分离获得的a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株，将a型和α型基因工程单倍体融合，得到酿酒酵母基因工程菌。
本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述高产脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌的基因序列，该基因序列是以E-S和B-X为引物，以所述高产脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列，如序列表1所示。
模拟玉米原料液态白酒发酵：将酵母菌EY15接入4mL8°Brix玉米水解液中，30℃过夜静置培养24h；将菌液全部转至36mL12°Brix玉米水解液中，30℃静置培养16h。取60g玉米面，按1:3的料水比加入65～70℃的水，放置20min；加耐高温α-淀粉酶（2万U）30μL,混匀后升温到85～90℃后，液化90min，糊化醪冷却到55～60℃，加入糖化酶(200U)90μL及营养盐1mL，糖化20min，之后加酸性蛋白酶1.2mL,20min后冷却到30℃，接种，30℃发酵15天。对发酵液进行分析，包括失重、酒度、残糖和GC-MS测定香气成分含量。（玉米水解液制备方法:称取1500g玉米粉，加入4500mL65～70℃的水，放置20min，是玉米颗粒 充分吸水膨胀，加入α-淀粉酶（2万U）900μL，液化90min，糊化醪冷却到55～60℃，加入糖化酶(200U)3mL，糖化20h，将糖化液用滤布过滤得到澄清滤液，pH自然，煮沸灭菌10min，即可制得。）
模拟高粱原料固态白酒发酵：称取50g高粱，95～98℃浸泡3～4h，充分吸水无硬心，常压蒸煮30min左右，颗粒均匀、内心无白，摊晾降温至30℃，拌曲5g，培菌糖化24h后，按5%接菌量接菌EY15发酵。
GC-MS分析：发酵液经蒸馏后，取8mL样品，加入3g NaCl，平衡10min，用50/30μm的萃取头，萃取45min，经上述固相微萃取前处理后，采用气相质谱法测定。内标物为乙酸正戊酯。气相色谱仪为Agilent7890C；质谱仪为Agilent5975C色谱柱HP5柱30m×320μm×20μm，配四级杆MS检测器。载气为高纯氦气，流速2.0mL/min。起始柱温为40℃保持3min，以6℃/min的升温速度升至240℃，保持10min。检测器温度为250℃，进样口温度为230℃，分流比为10:1。
有益效果：
本发明选用强启动子PGK1过表达编码醇己酰基转移酶的EHT1基因并敲除外源脂肪酸活化酶，获得了高产乙酸酯酿酒酵母工程菌（Saccharomyces cerevisiae）EY-15，保藏号为CGMCC No.7937。
本发明所获得的高产脂肪酸乙酯酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)EY15（CGMCC No.7937）与初始的酿酒酵母菌AY15相比：该酿酒酵母在其他发酵性能不受影响的情况下，模拟玉米原料液态白酒发酵后，转化子菌株与亲本菌株相比，发酵15天后，己酸乙酯含量提高1.75倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量分别提高了52%和62%；发酵30天后，己酸乙酯含量提高1.5倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了16.2%和16.7%。模拟高粱原料固态白酒发酵15天后，己酸乙酯提高了1.8倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了43.3%和40.9%。
附图说明
图1重组质粒pUC-APEKB的构建流程示意图；
图2构建重组质粒pUC-APEKB的酶切和PCR验证电泳图；
图3重组质粒pUC-APEKB与酵母基因组的同源重组示意图；
图4重组酿酒酵母单倍体的验证，其中（A）为a型重组单倍体验证结果；（B）为α型重组单倍体验证结果；
图5重组酿酒酵母菌基因工程菌的PCR验证凝胶电泳图；
图6高产脂肪酸乙酯酿酒酵母工程菌的构建路线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的酿酒酵母双倍体菌体是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。
实施例1：高产己酸乙酯酿酒酵母基因工程菌的构建
(1)基因工程菌株的构建
1）pUC-APEKB质粒的构建
以pUC-19为基础质粒构建同源重组质粒pUC-APEKB，构建流程如图1所示，以AY15的单倍体a8或α5为模板PCR扩增得到411bp的上游同源臂FA和409bp的下游同源臂FB，分别通过EcoRI/KpnI和PstI/HindIII双酶切连入pUC-19中得到质粒pUC-FAB。以AY15的单倍体a8或α5为模板PCR扩增得到1356bp的醇己酰基转移酶基因EHT1，通过XhoI单酶切插入到pPGK1质粒上的启动子PGK1p和终止子PGK1T之间，得到质粒pPGK1-E；以pPGK1-E质粒为模板，PCR扩增得到3145bp的PGK1p-EHT1-PGK1T片段。用BamHI分别单酶切PGK1p-EHT1-PGK1T片段和质粒pUC-FAB，用Solution I连接酶连接，构成质粒pUC-FAPEB；用以pUG6为模板PCR扩增获得1613bp的KanMX基因，Kpn I分别酶切KanMX基因和质粒pUC-FAPEB，用Solution I连接酶连接，构成重组质粒pUC-FAPEKB；整个过程所用引物的序列如表1。
表1PCR引物
图2为质粒pUC-FAPEB的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA Ladder Marker；泳道1-2为以受体菌基因组为模板PCR扩增到的411bp上同源臂片断FA和409bp下同源臂FB；泳道3为以质粒pUC-FAB为模板PCR扩增到的820bp FA-FB片段；泳道4为受体菌基因组PCR扩增到的1356bp EHT1；泳道5为pUC-FAPEB质粒PCR扩增到的1356bp EHT1；泳道6为以pUC-FAPEB质粒为模板PCR扩增到的2868bp PGK1P-EHT1片段；泳道7为以pUC-FAPEB质粒为模板PCR扩增得到的1633bp EHT1-PGK1T片段；泳道8为以pUC-FAPEB质粒为模板PCR扩增得到的3145bp PGK1P-EHT1-PGK1T片段；泳道9为pUG6质粒PCR扩增1613bp Kan；泳道10为pUC-FAPEB质粒PCR扩增1613bp Kan；泳道11为以pUC-FAPEB质粒为模板，PCR扩增得到的5611bp FA-KanMX-PGK1P-EHT1-PGK1T-FB同源片段；
2）重组酿酒酵母单倍体的构建
以重组质粒pUC-FAPEKB为模板，PCR扩增获得长达5611bp重组盒FA-KanMX-PGK1p-EHT1-PGK1T-FB，用醋酸锂转化法分别将其转化入酿酒酵母AY15生孢分离获得的a型和α型单倍体中，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株。同源重组过程如图3所示。
重组酿酒酵母单倍体的验证：
根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，分别以生长较好的a型和α型单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。
分别以引物F-S/K-S和E-X/B-X进行上、下游定点PCR验证，其中上游引物F-S/K-S的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小约900bp左右的特异性条带，其大小与预期相当；下游引物E-X/B-X的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小约2200bp左右的特异性条带，其大小与预期相当，说明重组盒FA-KanMX-PGK1p-EHT1-PGK1T-FB片段已成功重组到酿酒酵母单倍体基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图4所示，其中（A）为a型重组单倍体验证结果；（B）为α型重组单倍体验证结果。
图4中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中（A）中泳道1和3为受体菌a型单倍体的阴性对照；泳道2和4分别为a型重组单倍体上、下游定点验证PCR产物；（B）中泳道1和3为受体菌a型单倍体的阴性对照；泳道2和4分别为a型重组单倍体上、下游定点验证PCR产物；
3）重组酿酒酵母基因工程菌的构建
将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选重组酿酒酵母基因工程菌（双倍体）。
重组酿酒酵母基因工程菌的验证：
提取重组酿酒酵母基因工程菌的基因组并以其为模板，以引物F-S/K-S和E-X/B-X进行上、下游定点PCR验证。其中上游引物F-S/K-S的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小约900bp左右的特异性条带，其大小与预期相当；下游引物E-X/B-X的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小约2200bp左右的特异性条带，其大小与预期相当，说明重组盒FA-KanMX-PGK1p-EHT1-PGK1T-FB片段已成功重组到酿酒酵母单倍体基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图5所示。
图5中M为5000bp DNA Ladder Marker，泳道1和3为受体菌PCR阴性对照；泳道2和4为重组工程菌PCR产物。图6.高产脂肪酸乙酯酿酒酵母工程菌的构建路线图；
(2)基因工程菌株的特异性序列
获得的基因工程菌株EY15染色体中含有一段特异性序列,可通过PCR扩增测序后进行菌株鉴定。
特异性片段扩增引物序列为：
E-X：5’-GGATCCTCTAACTGATCTAT-3’
B-X：5’-GGCTGTTGGCTGACCGAGAC-3’
该特异性片段的基因序列见序列表1。
实施例2：模拟玉米原料液态白酒发酵实验
1）发酵工艺路线：
玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→接菌→发酵→蒸酒→测定指标
2）工艺条件：浸泡条件：60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20min发酵条件：30℃，15天。蒸酒时取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL酒样。
3）配料：玉米粉：60g；加水180mL；耐高温α-淀粉酶：30μL；糖化酶：90μL；酸性蛋白酶：1.2mL；营养盐：1mL；接种量：7.5%；
按上述模拟工艺对酿酒酵母工程菌a8-1、α5-1、EY15和出发菌株a8、α5、AY15分别进行玉米原料液态白酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精体积分数以及主要香气成分含量。以发酵能力、残糖浓度和产物生成量表征其综合性能，结果见表2。
表2玉米原料液态白酒发酵的发酵性能
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
表2表明：本发明所获得的酿酒酵母工程菌与初始的原菌相比，模拟玉米原料液态白酒发酵实验时，发酵性能没有太大变化。
表3玉米原料液态白酒发酵的风味物质
表3表明：本发明所获得的酿酒酵母工程菌与初始的原菌相比，模拟玉米原料液态白酒发酵实验时，高级醇类的正丙醇、异戊醇和异丁醇含量没有变化，酯类的乙酸乙酯也几乎没有变化。但单倍体a8-1、α-5-1和EY15的己酸乙酯含量分别为原菌的1.8、3.1和2.75倍，辛酸乙酯含量分别提高了30%、50%和52%，癸酸乙酯含量分别提高了70%、46%和61%。其中，发酵延长至30天时，工程菌的α5-1己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量达到15.23mg/L、1.83mg/L和2.86mg/L，分别较原菌提高了120%、16.2%和16.7%。
实施例3：固态大曲白酒发酵实验
1）发酵工艺路线：
高粱→浸泡→蒸煮→摊晾→拌曲→培菌糖化24h→接菌→发酵→蒸馏
2）工艺条件：浸泡条件：95～98℃，充分吸水无硬心；蒸煮条件：常压蒸30min左右，颗粒均匀、内心无白。发酵条件：30℃，15天。蒸酒条件：100g酒糟，加100mL水，蒸出 100mL酒样。
3）配料：高粱50g；大曲5g；接种量：5%；
按上述模拟工艺对酿酒酵母工程菌a8-1、α5-1、EY15和出发菌株a8、α5、AY15分别进行固态大曲白酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精体积分数以及主要香气成分含量。以发酵能力、残糖浓度和产物生成量表征其综合性能，结果见表4。
表4固态大曲白酒发酵的发酵性能和香味物质
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
表4表明：本发明所获得的酿酒酵母工程菌与初始的原菌相比，模拟高粱原料固态白酒发酵实验时，发酵性能没有太大变化。
表5高粱原料固态白酒发酵的酯类物质
表5表明：本发明所获得的酿酒酵母工程菌与初始的原菌相比，模拟高粱原料固态白酒发酵实验时，高级醇类的正丙醇、异戊醇和异丁醇含量没有变化，酯类的乙酸乙酯和庚酸乙酯没有变化。但单倍体a8-1、α-5-1和EY15的己酸乙酯含量分别为原菌的2.1、3.0和2.8倍，辛酸乙酯含量分别提高了39.0%、37.5%和43.3%，癸酸乙酯含量分别提高了32.9%、28.4%和40.9%。
Claims (2)
1.一株生产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌，具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EY15，保藏号为CGMCC No.7937。
2.一种生产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过用强启动子过表达醇己酰基转移酶基因，并同时敲除外源脂肪酸活化酶基因来实现；
所述过表达醇己酰基转移酶基因为EHT1，所述外源脂肪酸活化酶基因为FAA1；
所述过表达醇己酰基转移酶基因替换外源脂肪酸活化酶基因；
所述方法包括以下步骤：
(1)将通过PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码醇己酰基转移酶EHT1基因插入到pPGK1质粒上的启动子PGK1p和终止子PGK1T之间，得到质粒pUC-PE；
(2)将通过PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码脂肪酸激活酶FAA1基因的同源片段FA和FB分别连接到质粒pUC19上，片段FA插入位置在片段FB上游，得到质粒pUC-FAB；
(3)将来源于质粒pUG6上的loxP-KanMX-loxP基因片段连到质粒pUC-FAB上，插入位置在上述FA和FB之间，得到质粒pUC-FABK；
(4)将pUC-PE质粒上的启动子PGK1p-EHT1-PGK1T基因酶切下来后再与pUC-FABK质粒连接，插入位置在上述KanMX片段和FB之间，得到质粒pUC-APEKB；
(5)将通过PCR方法获得的来源于构建的质粒pUC-APEKB的APEKB重组盒，用醋酸锂转化法分别将其重组入酿酒酵母生孢分离获得的a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株，将a型和α型基因工程单倍体融合，得到酿酒酵母基因工程菌。
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