CN104152363A - 一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适合高糖面团发酵的面包酵母菌株及其构建方法。本发明提供的面包酵母菌株通过敲除出发菌株中的蔗糖酶编码基因SUC2来获得。所述面包酵母菌株，高糖面团发酵能力较亲本菌株明显提高，高糖面团发酵2h CO₂产生量为925mL，与亲本菌株相比，发酵力提高了16.35％，发酵时间缩短12min，解决了甜面包制作过程中的技术障碍和质量缺陷，并且选育得到的面包酵母菌种对发酵设备及条件没有任何特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而具有广泛的应用前景。

Description

一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株及其构建方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别是一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

面包酵母是面包生产过程中重要的微生物发酵剂和疏松剂，同时也是一种生物营养剂，可以增加面团的营养成分。通常情况下，面包酵母被分成两类：一类用于不加糖或糖含量在7％以下的面团中，为低糖面包酵母；另一类用于高糖面团发酵中，为高糖面包酵母。高糖面包酵母主要用于甜面包的制作过程中，甜面包在我国习惯上称为点心面包，其入口香甜而松软，面包内质和外观均质地细腻、组织均匀，形状上花色品种繁多，外观漂亮诱人，给人以美得享受，特别是各种包馅的甜面包更是风格迥异，能满足不同消费者的饮食需求。但是，甜面包的制作，除添加面粉、酵母、盐和水外，还需加入大量的蔗糖(用量高达15％～30％)，此时普通面包酵母的发酵速度就不可避免地受到抑制。一般工业制作上，为了解决这个问题，通常采用加大酵母用量的方法，这无疑会带来一定的负面影响，如面包酵母味较重，生产成本较高等。因此为了保持面包的风味、降低甜面包的制作成本，研究面包酵母对高糖的耐受性具有重要的实际指导意义。

高糖面团中主要可发酵性碳源是蔗糖，其含量可高达25％，由于SUC基因家族的存在，使得酵母可以在以蔗糖为唯一碳源的培养基中生长。但是，在高糖面团中，蔗糖酶SUC基因家族水解蔗糖的速度比酵母利用己糖的速度快300多倍，致使细胞在短时间内大量积累由蔗糖酶水解但未被利用的己糖，进而导致酵母周围环境形成较高的渗透压，直接影响细胞的活性，同时过量的葡萄糖积累会引起葡萄糖效应，从而抑制酵母的生长速度和发酵性能，出现面团产气量低、发酵速度缓慢等现象。因此，为了减轻渗透压的抑制作用以及葡萄糖效应，可以通过降低蔗糖转换酶活力来实现，从而提高面包酵母高糖环境下的耐受性。

作为SUC基因家族的一员，蔗糖转换酶基因(SUC2)位于酵母的第Ⅸ条染色体的末端，全长2.7kb，SUC2基因可以编码两种不同形式的蔗糖转换酶：一种存在于胞内的非糖基化形式的转换酶；另一种是分泌型的糖基化形式的转换酶。在蔗糖转换酶的作用下蔗糖水解生成D-葡萄糖和D-果糖，随后葡萄糖和果糖进入糖酵解途径以供酵母利用。

然而，目前对于面包酵母菌株中蔗糖转换酶基因SUC2的研究报道很少，尤其是在选育适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的研究更是空白，因此，本发明通过缺失面包酵母菌株中蔗糖转换酶基因SUC2来选育适合高糖面团发酵的面包酵母菌株，可以提高酵母菌株在高糖面团中的发酵力，同时满足了甜面包制作过程中对酵母的较高要求。

发明内容：

本发明所解决的技术问题之一是提供一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株。

所述面包酵母，是通过敲除酵母出发菌株中编码蔗糖转换酶的SUC2基因全序列来获得。

所述SUC2基因其Gene ID为：854644，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述酵母出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。

本发明所解决的另一个技术问题是提供一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)将含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重组质粒；

(2)以重组质粒为模板扩增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株的a型和α型单倍体菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(3)将pGAPza质粒导入所述重组后的基因工程单倍体菌株中，纯化并融合后得到所述基因工程菌。

具体如下：

(1)重组质粒的构建

①以面包酵母CICC32253总DNA为模板，PCR扩增出SUC2基因的上、下游序列；

②以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；

③将步骤(1)-①和(1)-②获得的PCR产物依次连接到含有Amp抗性的pUC19质粒载体上，获得重组质粒；

(2)SUC2基因的敲除

①以步骤(1)中的重组质粒为模板，扩增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段；

②用醋酸锂转化法将(2)-①中的重组片段转化入出发菌株的a型和α型菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(3)KanMX抗性基因的去除

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤(2)-②中的基因工程单倍体菌株中，

②用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEPD平板上生长而在G418平板上不生长的基因工程单倍体菌株；

(4)pGAPza质粒丢失

将步骤(3)-②中挑选的a型和α型基因工程单倍体菌株于YEPD液体培养基中进行传代培养，选取第一代及第十代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证pGAPza质粒是否丢失。

(5)获得基因工程菌

将步骤(4)中验证得到的pGAPza质粒丢失的a型和α型单倍体酵母突变株经纯化后进行融合，筛选双倍体即得到所述基因工程菌。

所述面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253，是一株保存于中国工业微生物菌种保藏中心的菌株，公众可通过购买获得。

所述重组菌株可通过上述方法构建获得，这些方法已有许多文献报道，如JosephSambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。也可用本领域已知的其它方法来构建基因突变的酵母菌株。

这种通过敲除基因获得的菌株不易产生回复突变，菌株的稳定性比利用点突变、诱变等方法构建的菌株稳定性更高，更有利于工业化应用。

本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的基因序列，该基因序列是以所述适合高糖面团发酵的面包酵母菌株基因组为模板扩增的特异性片段，其序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

本发明所述面包酵母菌株在其它发酵性能不受影响的情况下，高糖面团中具有较好发酵性能，与亲本菌株相比，在高糖面团发酵时2小时产气增加130mL，发酵时间缩短12min，蔗糖酶酶活降低了40.95％。

本发明的优点和积极效果：

1、本发明选育的面包酵母菌株所敲除的蔗糖酶编码基因为100％缺失，不易产生回复突变，并且重组菌株中的KanMX抗性基因已经敲除，保证了菌株及发酵产品的安全性；

2、本发明选育的适合高糖面团发酵的面包酵母菌株是通过降低蔗糖转换酶酶活，降低了高糖面团发酵时的渗透压抑制和葡萄糖效应，能够加速高糖面团的发酵速度，而其它发酵性能没有明显变化，对促进我国甜面包的的推广应用具有重要意义。

3、本发明所述的适合高糖面团发酵的面包酵母菌株是通过缺失蔗糖转换酶编码基因SUC2获得，为SUC2基因的应用研究开辟了新的领域。

4、筛选得到的工程菌株对发酵设备及条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而具有广泛的市场应用前景。

附图说明：

图1为重组菌株BS-1构建的技术路线图

图2为pUC-AKB质粒构建过程

图3为pUC-AKB重组质粒酶切验证图

a中M为DNA maker泳道1为BamHI和PstI双酶切pUC-B质粒

泳道2为BamHI和PstI双酶切pUC-19质粒泳道3为BamHI和PstI双酶切SB片段

b中M为DNA maker泳道1为EcoRI和KpnI双酶切pUC-B质粒

泳道2为EcoRI-KpnI双酶切SA片段泳道3为EcoRI和KpnI双酶切pUC-AB质粒

c中M为DNA maker泳道1为KpnI和BamHI双酶切KanMX片段

泳道2为KpnI和BamHI pUC-AB质粒泳道3为KpnI和BamHI双酶切pUC-AKB质粒

图4为基因盒SA-KanMX-SB片段与酵母基因组重组过程

图5重组单倍体验证图

其中M为DNA Marker；

泳道1为以单倍体亲本基因组为模板，Y-U和Y-K-D为引物进行PCR扩增的产物；

泳道2为以重组单倍体基因组为模板，Y-U和Y-K-D为引物进行PCR扩增的产物；

泳道3为以单倍体亲本基因组为模板，Y-K-U和Y-D为引物进行PCR扩增的产物；

泳道4为以重组单倍体基因组为模板，Y-K-U和Y-D为引物进行PCR扩增的产物；

图6KanMX抗性基因剔除PCR验证

其中M为DNA Marker；

泳道1为以重组菌株单倍体基因组为模板，K1和K2为引物进行PCR扩增的产物；

泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组菌株单倍体基因组为模板，K1和K2为引物进行PCR扩增的产物；

图7pGAPza质粒丢失PCR验证

其中M为DNA Marker；

泳道1为以去除KanMX抗性基因的重组单倍体菌株的第一代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；

泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组单倍体菌株的第十代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明的一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株及其构建方法。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的构建

重组菌株的构建流程如图1所示。

双倍体出发菌株CICC32253经过单倍体化生成a型和α型单倍体菌株70a和24α，通过两次同源重组的方法构建重组单倍体菌株，去除KanMX抗性基因并杂交该单倍体菌株，生成双倍体重组菌株BS-1。

(1)重组质粒pUC-AKB的构建

重组质粒pUC-AKB的构建流程如图2所示.

①以酵母出发菌株CICC32253总DNA为模板，PCR扩增出SUC2基因的下游序列SB；

上游引物SB1：CGGGATCCACCCACAATCGTAATGTAGTTGC(SEQ ID NO:3)

下游引物SB2：AACTGCAGTCCATTATTGTTTTTCCGCCTTCTG(SEQ ID NO:4)

划线部分为酶切位点；

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；58℃1min；72℃30s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

PCR反应体系(20μL)

PCR buffer

dNTP

上、下游引物

模板

Taq酶

DdH2O

总体积

2.0μL

1.5μL

各1.0μL

1.0μL

0.5μL

13.0μL

20.0μL

将PCR产物连接到含有Amp抗性的pUC19质粒载体上，获得重组质粒pUC-B。

②以酵母出发菌株CICC32253总DNA为模板，PCR扩增出SUC2基因的上游序列SA；

上游引物SA1：CGGAATTCATTTACCGTATGGGAGTT(SEQ ID NO:5)

下游引物SA2：GGGGTACCTTTCAGGAGGAAGGATT(SEQ ID NO:6)

划线部分为酶切位点

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；63℃1min；72℃30s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

将PCR产物连接到重组质粒pUC-B上，得到重组质粒pUC-AB。

③以pUC6质粒为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；

上游引物K1：GGGGTACCCAGCTGAAGCTTCGTACGC(SEQ ID NO:7)

下游引物K2：CGGGATCCGCATAGGCCA CTAGTGGATC TG(SEQ ID NO:8)

划线部分为酶切位点

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃90s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

将PCR产物连接到重组质粒pUC-AB上，得到重组质粒pUC-AKB，图3为重组质粒酶切验证图。

(2)SUC2基因的敲除

基因盒SA-KanMX-SB片段与酵母基因组重组过程如图4所示。

以重组质粒pUC-AKB为模板，PCR扩增获得重组基因盒SA-KanMX-SB片段。通过醋酸锂转化的方法将重组基因盒导入面包酵母出发菌株CICC32253的a型和α型单倍体菌——70a和24α中，转化后通过G418抗性筛选重组子，通过SA和SB片段与酵母染色体上SUC2基因两侧的同源序列同源重组，从而整合到酵母染色体上并随染色体一起复制，KanMX片段同源重组替换了酵母染色体上的SUC2基因，从而实现SUC2基因的完全敲除，得到a型和α型单倍体重组菌株ΔSUC2-a和ΔSUC2–α，图5为重组单倍体验证图。

(3)抗性基因KanMX的去除

采用Cre-LoxP报告基因挽救系统来剔除KanMX抗性基因，具体实施方法如下：

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒导入ΔSUC2-a和ΔSUC2-α工程菌株中，并用Zeocin抗性浓度为500mg/mL的YEPD平板筛选转化子,避光培养2-3天；

②将带有pGAPza质粒的转化子在半乳糖培养基中诱导表达5h左右，梯度稀释后取适量菌液涂布于YEPD平板，培养1-2天；

③挑取步骤②中长出的单菌落对应点接到无G418的YEPD平板和含有300μg/mL G418的YEPD平板上，30℃培养2-3d；

④挑取上述步骤③中在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不能生长的单菌落进行提基因组，同时提取单倍体重组菌株ΔSUC2-a与ΔSUC2-α菌株基因组；

⑤以步骤④提取的基因组为模板，进行PCR扩增，所用引物如前实施例1：适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的构建中的(1)重组质粒pUC-AKB的构建过程中的K1和K2，PCR条件如下：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃90s，25个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，以单倍体重组菌株ΔSUC2-a与ΔSUC2-α基因组为模板扩增出约1600bp的条带，而步骤③中在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不能生长的单菌落基因组不能扩增出1600bp的条带，证明KanMX抗性基因去除成功，验证图如图6；

(4)pGAPza质粒的丢失

①将去除KanMX抗性基因的菌株于YEPD培养基中进行以丢失其导入的pGAPza质粒，传代10次；

②选取去除KanMX抗性基因的菌株的第一代和第十代提取酵母质粒，然后利用提取质粒为模板，利用Z-U和Z-D引物进行PCR扩增，PCR反应条件如下：95℃5min；94℃45s；62℃1min；72℃80s，25个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，第一代酵母质粒上可以扩增出1200bp左右大小的Zeocin抗性基因片段，而从第十代酵母质粒上则扩增不出，证明突变株中的pGAPza质粒已丢失，进而得到去除KanMX抗性基因同时丢失pGAPza质粒的单倍体重组菌株，验证图如图7。

Z-U：5′-ATCGTCGACCCCACACACCATAGCTTCA-3′(SEQ ID NO:9)

Z-D：5′-GCGGTCGACAGCTTGCAAATTAAAGCCTT-3′(SEQ ID NO:10)

(5)重组菌株的获得

将步骤(4)得到的去除KanMX抗性基因同时丢失pGAPza质粒的单倍体重组菌株进行融合，筛选双倍体，即得双倍体重组菌株BS-1。

将重组菌株进行PCR验证，即以去除KanMX抗性基因的双倍体重组菌株的基因组为模板扩增片段，可得到1585bp的特异性条带，出发菌株不能扩增得到该片段，而是扩增出约3060bp的片段。结果表明，在酵母细胞中实现了SUC2基因的全部缺失。

(6)基因工程菌株的特异性序列

获得的重组基因工程菌株BS-1中染色体中含有一段特异性序列，可通过PCR扩增测序后进行菌株鉴定。

特异性片段扩增的引物序列为：

Y-U:5′-GGCTTAGCATCCACACGTCAC-3′(SEQ ID NO:11)

Y-D:5′-CTATCACGGTGTCCATGTAAGAGG-3′(SEQ ID NO:12)

特异性片段的基因序列见序列表1SEQ ID NO:2。

实施例2：适合高糖面团发酵的面包酵母菌株发酵实验

(1)转化子与单倍体亲本的发酵实验

将单倍体亲本70a和24α及其对应的重组单倍体菌株同时进行高糖面团发酵，鲜酵母9g、NaCl2.8g、蔗糖44.8g，将蔗糖、NaCl和鲜酵母分别用100mL和30mL的30℃蒸馏水溶解，混匀倒入280g面粉中(下同)，测定菌株发酵性能及蔗糖酶酶活，结果见表1。结果显示，单倍体亲本70a在面团发酵中2h CO₂产生量为645mL，蔗糖酶酶活为40.83U/g干酵母；其对应的重组单倍体在面团发酵中2hCO₂产生量为725mL，蔗糖酶酶活为30.66U/g干酵母，即重组单倍体ΔSUC2-a的面团发酵2hCO₂产生量比单倍体亲本70a增加80mL，蔗糖酶酶活降低24.92％。单倍体亲本24α在面团发酵中2h CO₂产生量为750mL，蔗糖酶酶活为38.81U/g干酵母，其对应的重组单倍体在面团发酵中2h CO₂产生量为860mL，蔗糖酶酶活为29.92U/g干酵母，即重组单倍体ΔSUC2-α的面团发酵2h CO₂产生量比单倍体亲本24α增加125mL，蔗糖酶酶活降低22.91％。由结果看出，SUC2基因完全缺失可以降低蔗糖酶的酶活，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖的速度减慢，从而降低由于己糖大量积累引起的酵母细胞外渗透压升高和由葡萄糖积累引起的葡萄糖效应，进而提高酵母面团的产气量和发酵速度，缩短发酵时间。

表1 单倍体菌株面团发酵力及蔗糖酶酶活

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

(2)双倍体重组菌和双倍体亲本的发酵实验

将去除KanMX抗性基因的单倍体重组菌株ΔSUC2-a与ΔSUC2-α杂交，得到双倍体重组菌株BS-1。将双倍体重组菌株BS-1与双倍体亲本进行高糖面团发酵，测定菌株的发酵性能及蔗糖酶酶活，结果见表2。由表2可知，亲本CICC32253高糖面团发酵中2hCO₂产生量为795mL，蔗糖酶酶活为34.70U/干酵母，双倍体重组菌株的高糖面团发酵中2hCO₂产生量为925mL，蔗糖酶酶活为20.49U/干酵母，即双倍体重组菌株比双倍体亲本BY-6的高糖面团发酵中2hCO₂产生量增加130mL，蔗糖酶酶活降低了40.95％。

表2 双倍体菌株面团发酵力及蔗糖酶酶活

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

Claims (9)

1.一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株，是对酵母出发菌株进行基因工程改造所得，其特征在于，所述基因工程改造为敲除酵母出发菌株中编码蔗糖转换酶的SUC2基因全序列。

2.如权利要求1所述的一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。

3.如权利要求1或2所述的一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株，其特征在于，所述SUC2基因其Gene ID为：854644，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

4.一种构建权利要求1所述的面包酵母菌株的方法，包括如下步骤：

(1)将含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重组质粒；

(2)以重组质粒为模板扩增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株的a型和α型单倍体菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(3)将pGAPza质粒导入所述重组后的基因工程单倍体菌株中，纯化并融合后得到所述基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的一种面包酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。

6.根据权利要求4或5所述的一种面包酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)重组质粒的构建

①以面包酵母CICC32253总DNA为模板，PCR扩增出SUC2基因的上、下游序列；

②以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；

③将步骤(1)-①和(1)-②获得的PCR产物依次连接到质粒载体上，获得重组质粒；

(2)SUC2基因的敲除

①以步骤(1)中获得的重组质粒为模板，扩增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段；

②用醋酸锂转化法将(2)-①中的重组片段转化入出发菌株的a型和α型菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(3)KanMX抗性基因的去除

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤(2)-②中的基因工程单倍体菌株中；

②用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEPD平板上生长而在G418平板上不生长的基因工程单倍体菌株；

(4)pGAPza质粒丢失

将步骤(3)-②中挑选的a型和α型基因工程单倍体菌株于YEPD液体培养基中进行传代培养，选取第一代及第十代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证pGAPza质粒是否丢失；

(5)获得基因工程菌

将步骤(4)中验证得到的pGAPza质粒丢失的a型和α型单倍体酵母突变株经纯化后进行融合，筛选双倍体即得到所述基因工程菌。

7.根据权利要求4或5所述的一种面包酵母菌株的构建方法，其特征在于：用于构建所述重组质粒的载体为含有Amp抗性的pUC19质粒。

8.权利要求1或2所述的一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株在面包发酵中的应用。

9.一种检测如权利要求1所述面包酵母菌株的方法，其特征在于，以重组菌株的总DNA为模板，通过引物对：

上游引物：5’-GGCTTAGCATCCACACGTCAC-3’

下游引物：5’-CTATCACGGTGTCCATGTAAGAGG-3’

进行PCR扩增，可获得一条长度为1585bp的特异性条带，所述特异性条带核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。