CN1883299A - 具有低糊化温度的玉米在制备发酵产品中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种由含有低糊化温度淀粉的玉米、特别是由源自隐性糖－2等位基因纯合或杂合的蜡质玉米植物的玉米制备发酵产品的方法，所述发酵产品如乙醇和柠檬酸。
Description
本申请要求在先申请US60/692,999的优先权。
发明背景
本发明涉及一种经改进的制备发酵产品的方法，该发酵产品以含有低糊化(gelatinzation)温度的淀粉的玉米为原料。
种植玉米出于许多理由，包括其可用于食品和工业。乙醇(乙醇、谷物醇，EtOH)是一种澄清、无色的液体，具有独特的、令人愉快的气味，可用做汽车燃料以控制污染。传统的，玉米与其它农作物如糖甜菜和糖甘蔗共同使用，用于制备乙醇。
传统上使用两种方法之一加工玉米。湿磨方法包括在加工前浸泡或浸渍玉米以回收油，留下玉米粉。在干磨方法中，整粒研磨并且随后加入水以形成糊。在用玉米制备乙醇的任何方法中，都要用酶来处理所述的粉或糊以将玉米中的淀粉转化为糖。然后用酵母发酵经酶处理后的糊或粉。酵母将糖转化成乙醇和二氧化碳。一旦乙醇和二氧化碳被分离，如通过蒸馏，可加工余下的未发酵的玉米，以回收其它的营养成份，也可以加工成动物饲料。
研究人员不断地寻找更好的玉米基原料及制备高级乙醇的有效方法。现在令人惊奇地发现，含有低糊化温度淀粉的玉米可以更有效、节能的用作制备发酵产品的原料。
发明概述
本发明提供一种由含有低糊化温度淀粉的玉米制备发酵产品的方法，该发酵产品如乙醇、柠檬酸、丁醇和氢。该方法包括将玉米与可发酵碳源的微生物混合以生产发酵产品。
本文中所用的糊化温度是指使用差示扫描量热法，通过实施例部分的实施例1所述的方法测量的起始糊化温度(T0)。
除非另有说明，本文中使用的所有科技术语和缩写的含义与本领域普通技术人员常规理解的含义相同。下文中描述了适用于本发明的方法和材料，但这些方法和材料不构成对本发明的限制。可以理解地，也可以使用类似或等同的其他方法和材料来实施本发明。通过以下关于本发明的技术方案及权利要求的描述，本发明的附加特征及有益效果将更明晰。
发明详述
由多种品种玉米植物收获的玉米种籽或粒(以下称玉米粒)均可用于本发明。这些玉米植物的品种是如杂种、近交、转基因植物、基因改良植物或特定种群。在一实施方案中，玉米来自蜡质玉米植物，该玉米植物的胚乳组织是隐性糖-2等位基因杂合的(一剂量(dose)或两剂量)。在另一实施方案中，玉米来自蜡质玉米植物，该玉米植物的胚乳组织具有纯合隐性糖-2等位基因的。其它实施例中的玉米是来自其胚乳组织是隐性糖-2等位基因、dull-糖2、dull-糖2-蜡质、直链淀粉extender-dull-蜡质、直链淀粉extender-糖2及其组合纯合的玉米植物。所有这些品种均是本领域已知的，并且用于产生这些基因型玉米植物的玉米或种籽也是商业上可获得的。
蜡质基因型(称为wx)是本领域公知的，蜡质基因位于玉米第9号染色体的59位(参见M.G..Nueffer，L.Jones，and M.Zuber，“The Mutants of Maize”(CropScience Society of America，Madison，WI，1968)，第72-73页)。蜡质基因型使玉米植物能够产生主要或全部由支链淀粉组成的淀粉，蜡质基因型胚乳的表型或物理表现是不透明的、具有硬的蜡质质地。具体而言，蜡质基因型是那些其中存在粒状结合淀粉合酶(GBSS)的突变体。常规的蜡质玉米出于许多目的而被种植，并且是可商购的。
已知糖-2基因型(称为su2)可改变玉米胚乳的碳水化合物组成，并且糖-2基因位于第6号染色体(lbid)的(57)位。蜡质糖-2基因类型的双稳性突变体也是已知的。其胚乳为糖-2等位基因纯合的蜡质玉米在文献中有述，所述文献包括US4,428,972和4,615,888并且可以从National Starch and Chemical Company商购。
植物的基因型也可以通过易位、倒位、转化由基因或染色体工程及其它方法来得到，由此得到本发明的淀粉的特性。另外，取自由上述基因组成的人工突变体和变异体生成的植物的淀粉也可以用于本发明，所述突变体和变异体可以通过已知的突变繁殖的标准方法来产生。
用于提取淀粉的植物的基因型可以通过标准繁殖技术得到。为了用通常的手段得到玉米中wxsu2基因型的双隐性突变体，可以例如使蜡质突变体(wx)和糖-2突变体(su2)杂交，并且随后使第一代单杂交体(Wx wx Su2 su2)自体授粉理论上可从分离的谷穗以15∶1的比例回收双突变体。用于本发明的淀粉可以以近交系获得，但更理想的是淀粉得自于杂种，所述杂种源自含有wxsu2双突变体的近交繁殖体，一般是为了获得较高的产量等因素。其胚乳具有一剂量隐性糖-2等位基因的玉米植物的田间生产可以通过使具有显性糖-2等位基因的雌性蜡质玉米植物与具有隐性糖-2等位基因的雄性蜡质玉米植物在纯合的条件下杂交来实施。典型的种植排列为一列雄性对7列雌性。通过本领域已知的各种手段如细胞质或遗传手段将雌性列去雄或使雄性不育。其胚乳具有两剂量隐性糖-2等位基因的玉米植物的田间生产可以通过使糖-2等位基因纯合隐性的雌性蜡质玉米植物和具有显性糖-2等位基因的雄性蜡质玉米植物杂交来实施。种植排列和使雌性植物雄性不育与一剂量生产类似。
用于本发明的玉米必须含有低糊化温度淀粉。在一个实施方案中，该糊化温度低于约60℃，在第二个实施方案中，该温度低于约55℃和在第三个实施方案中，该温度低于约50℃。
制备乙醇和其它发酵产品的方法是本领域公知的。通常乙醇是由含有可发酵的糖或可转化为糖的组份的玉米粉或糊制成的。在一常规方法中，粉或糊在葡糖淀粉酶的存在下被糖化以得到水解淀粉和糖，和被酵母发酵得到乙醇。然后回收乙醇。玉米粉或糊在糖化前可以用α-淀粉酶液化。可以将蛋白酶在糖化过程中加至经液化的糊中和/或在发酵过程中加至水解淀粉和糖中以使酵母在更高的干固体糊水平下进行酒精发酵。
玉米可以整粒使用；即该粒是未分解成其组成部分，如壳，胚乳、顶盖(tipcap)、果皮(pericarp)和胚芽的方式使用，也可以以本领域已知的其相分离状态使用。然而，必须剩余有足够发酵的淀粉，例如通过使用锤磨机或辗压机，可以将整粒玉米研磨、破碎、碎裂、压片或磨碎。在一实施方案中，经溶剂萃取的玉米粉被用于发酵产品的制备。在另一实施例中，玉米糊用于发酵产品。各种玉米和/或各种组成部分的混合物也可以被用于制备发酵产品。
液化通常是通过将水加至玉米，和使用碱如钙土(lime)将pH调至约6，然后加入α-淀粉酶使淀粉液化来实现。还可以加入氮酵母营养物。可注入蒸汽以将玉米加热至约88-120℃以糊化和消毒淀粉。然后将淀粉保持在所用的将淀粉转化成复合糖的淀粉酶的有效温度，通常63-95℃约2-4小时。玉米组分通常约30wt％，但也可以更高的量。
然后通常在糖化前将玉米冷却至葡糖淀粉酶的活性有效的温度，如约60℃。例如通过使用硫酸，和加入葡糖淀粉酶将pH调节至对酶活性有效的pH，例如约4.4。可选择地加入支链淀粉酶以水解1，6-键。糖化通常在6小时内完成。可选择地，液化和糖化可同时完成。
然后将玉米常规冷却至对酵母发酵有效的温度，如32℃。在保持温度和pH下，发酵一般进行约46-50小时。
通过本发明制备的发酵产品可以是本领域已知的任何发酵产品，包括但不限于乙醇、柠檬酸、丁醇、氢、乳酸、维生素、和可溶性糖。在一实施方案中，得到的发酵产品为乙醇，在另一方案中得到的发酵产品为柠檬酸。
通常，发酵后，通过蒸馏和脱水回收乙醇以使回收的乙醇具有大于99.9％的纯度。可以加入少量的汽油以使乙醇变性。
培养所述或其它微生物的营养物包括，例如backset，酵母提取物，玉米浸液、淀粉、葡萄糖、乙醇、酮、和氮源：蛋白胨、大豆粉、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、经提取的玉米粉或尿素。各种盐如NaCl和硫酸铵，和痕量无素也可被包含在微生物的培养基中。在糖化过程中和/或在发酵过程中的水解的淀粉和糖中加入一些其它的酶也是有利的。这些酶的例子是纤维素酶、半纤维素酶、磷酸酶、外源和内源葡聚糖酶和木聚糖酶。
下面的实施方案是为了进一步说明本发明，并不构成对本发明的限制。
1.在由玉米制备发酵产品的方法中，其中玉米与能够发酵碳源的微生物混合以产生发酵产品，改进之处在于包括使用含有糊化温度低于约60℃的淀粉的玉米。
2.实施方案1的方法，其中玉米是来自其胚乳具有纯合隐性的等位基因的蜡质玉米植物，所述等位基因选自糖2、糖2-蜡质、dull-糖2、dull-糖2-蜡质、直链淀粉extender-dull-蜡质，直链淀粉extender-糖2，及其组合。
3.实施方案2的方法，其中玉米来自其胚乳具有纯合隐性糖-2等位基因的蜡质玉米植物。
4.实施方案1的方法，其中玉米是来自其胚乳具有杂合隐性一剂量糖-2等位基因的蜡质玉米植物。
5.实施方案1的方法，其中玉米是来自其胚乳具有两剂量杂合隐性糖-2等位基因的蜡质玉米植物。
6.实施方案1的方法，其中淀粉的糊化温度低于约55℃。
7.实施方案1的方法，其中淀粉的糊化温度低于约50°。
8.实施方案1的方法，其中发酵产品选自乙醇、柠檬酸、丁醇、氢、乳酸、维生素和可溶性糖。
9.实施方案8的方法，其中发酵产品是乙醇。
10.实施方案8的方法，其中发酵产品是柠檬酸。
实施例
以下实施例是为了进一步说明本发明，并不构成对本发明的限制。所用的所有百分数均基于重量/重量。
实施例1-各种玉米淀粉的糊化
用差示扫描量热法检测具有0-3次隐性糖-2基因的蜡质淀粉的糊化特征。称取10g淀粉置于不锈钢盘中，以1份淀粉对2份水的比例加入水。然后将试样从30℃加热至102℃，加热速率为10℃/分钟。结果示于下表1中。
表1
| 糊化数据 | ||||
| 次数 | 起始T(℃) | 峰T(℃) | Offset T(℃) | Delta H(J/g) |
| 0 | 65.5 | 73.3 | 88.0 | 16.72 |
| 1 | 60.9 | 68.8 | 84.5 | 14.98 |
| 2 | 57.8 | 66.4 | 84.5 | 14.11 |
| 3 | 49.1 | 56.6 | 77.3 | 11.31 |
实施例2-各种淀粉的DSC特征
Inouchi等(Starke 43(12)S468-472(1991)在它们的文章“DSC Characteristics ofGelatinization of Starches of Single-，Double-，and triple-Mutants and Their NormalCounterpart in the inbred Oh43 Maize(Zea Mays.L)Background”中表征了各种淀粉。称取淀粉置于铝盘，并以1份淀粉对2份水的比例加入蒸馏水。然后将以2℃/分钟的加热速率加热。结果示于下表2中。
表2
| 糊化数据 | ||||
| 基因型 | 起始T(℃) | 峰T(℃) | Offset T(℃) | Delte H(cal/g) |
| Dent | 61 | 66 | 72 | 3.6 |
| wx | 62 | 69 | 81 | 4.6 |
| ae | 65 | 83 | 94 | --- |
| du | 64 | 68 | 75 | 3.4 |
| su2 | 45 | 53 | 62 | 1.2 |
| du wx | 63 | 72 | 82 | 4.0 |
| su2 wx | 43 | 49 | 59 | 1.7 |
| ae wx o | 69 | 78 | 92 | 4.0 |
| du su2 | 47 | 53 | 64 | 0.9 |
| du su2 wx | 42 | 48 | 55 | 1.8 |
| ae du | 60 | 68 | 77 | 2.4 |
| ae du wx | 50 | 70 | 76 | 3.4 |
| ae su2 | 51 | 87 | 1.7 | |
实施例3-用粉制备乙醇
a.将由源自于蜡质玉米植物的玉米的玉米粉(45g)置于125ml烧瓶中，所述蜡质玉米植物具有纯合隐性糖-2等位基因的。以1g/L加入酵母提取物以确保氮不受限。用10％的来自过夜酵母培养物的接种物(酿酒酵母的一种典型Altech乙醇酵母)接种培养物，并且在125rpm旋转摇床上在30℃下温育42小时。通过HPLC控制葡萄糖消耗和乙醇生成。
b.用由源自蜡质玉米植物的玉米的玉米粉重复实施例3a，所述蜡质玉米植物是隐性糖-2等位基因(一剂量)杂合的。
c.用由源自蜡质玉米植物的玉米的玉米粉重复实施例3a，所述蜡质玉米植物是隐性糖-2等位基因(两剂量)杂合的。
乙醇生产类似于通过利用蜡质和臼齿玉米生长的酵母进行的乙醇生产，但输入的能量更少。实施例2a所需的能量输入最少。
实施例4-用粉制备乙醇
a.研磨源自蜡质玉米植物的整玉米粒，所述蜡质玉米植物具有纯合隐性糖-2等位基因的并且是商购的。液化是将1740gm玉米粉加至4500ml自来水中。向此浆液中加入0.99gmCaCl2·2H2O。然后将该浆液置于68℃下，及将pH调节至6.2-6.4。然后，在不断搅拌的同时，将0.6ml酶Taka-Therm.RTM.II加至该浆液然后在68℃下温育1小时。酶Taka-Therm.RTM.II是一种液态热稳定细菌(地衣芽胞杆菌变种)α-淀粉酶，可购自Solvay Enzymes，Inc.。在温育中未观察至明显的糊化。然后将该浆液置于加热板上并在搅拌下加热至沸腾。使该浆液沸腾5分钟，然后置于90℃的水中温育2小时。沸腾后将1.2ml Taka-Therm.RTM.II酶加至该浆液。将该浆液冷却至25℃，并且用25％H2SO4将pH调至4.6-4.8。用自来水将固体含量(DS)调至20-21％。
将450gm步骤a(液化)得到的液体玉米粉加至500ml锥形瓶中使糖化和发酵同时进行。酶的大致量为：0.25ml distillase L-200和0.3ml 2％酸性真菌蛋白酶溶液与0.8gm Fleishman’s面包酵母(7gm箔包装)一起被加至玉米粉。在旋转烧瓶以混合酵母前，使干酵母水合10分钟。然后用Parafilm盖好烧瓶并置于36℃水中发酵24小时。然后回收乙醇。
b.用由源自蜡质玉米植物的玉米得到的玉米粉重复实施例4a，所述蜡质玉米植物是隐性糖-2等位基因(一剂量)杂合的。
c.用由源自蜡质玉米植物的玉米得到的玉米粉重复实施例4a，所述蜡质玉米植物是隐性糖-2等位基因(两剂量)杂合的。
乙醇生产类似于通过在蜡质和臼齿玉米生长的酶母进行的乙醇生产，但能量输入减少。实施例4a的能量输入最少。
实施例5-柠檬酸的制备
a.经溶剂萃取的玉米粉含有丰富的可发酵淀粉，所述玉米粉是由源自蜡质玉米植物的玉米制备的，该蜡质玉米植物具有纯合隐性糖-2等位基因的。将可溶糖转化成适于发酵的糖的一种方法是水解淀粉分子。可以将玉米粉中的淀粉和蛋白转化成适于发酵的单糖的酶包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶(如木聚糖酶)、酯酶(如ferulase，乙酰酯酶)和木质素酶(ligninase)。用Retsch磨将玉米粉研磨至可通过1mm筛，及取300g与700ml含有0.5mlα淀粉酶的100℃的水混合并置于密封容器中。用碱将pH调至5.9和搅拌45分钟，及额外地加入α-淀粉酶。再经过45分钟的温育后，用酸将pH调至4.5。加入0.5ml葡糖淀粉酶(Optimax 7525)和0.5g蛋白酶(真菌蛋白酶5000)并在62℃下温育约24小时。整个过程使用有机酸柱(Aminex HPX-87H离子分离柱，300mm×7.8mm，BioRad)，通过HPLC(Waters 2690分离器)控制淀粉的水解程度。
一旦淀粉经过了合适的酶处理，用常规已知的方法将溶液过滤和脱矿质。在浸罐发酵容器中用脱矿质水使得到的糖的固体含量为约120mg/l。浸罐方法也被称为深层发酵。在该方法中向罐提供无菌空气、营养成份和碳源、(经水解的淀粉)、和接种黑曲霉孢子。真菌孢子的浓度为约100个孢子/升培养液，其对应于10g-15g孢子/m3的浓度将真菌孢子加至营养液中，并通过真菌来实现柠檬酸的生成。黑曲霉菌株的实例是US2,492,667所述的ATCC1015和US5,081,025中所述的DSM5484。
经此接种后的肉汤培养基的温育可以在已知的制备柠檬酸的条件下进行，如连续充气和温度控制。在发酵过程中，温度保持在约32℃，用柠檬酸钠将pH保持在约2-3，和加入无菌空气以保持约50％的溶解氧含量。进行发酵直至发酵肉汤培养基的还原糖含量达到约1g/L，这可能需要数天来实现。两种主要分离方法可用于回收柠檬酸，石灰-硫酸(Lime-Sulfuric Acid)方法和液体萃取方法。石灰-硫酸方法是通常使用的，并且是硫酸制备领域的技术人员所熟知的。用由源自蜡质玉米植物的玉米粉重复实施例5a，所述蜡质玉米植物是隐性糖-2等位基因(一剂量)杂合的。
用由源自蜡质玉米植物的玉米粉重复实施例5a，所述蜡质玉米植物是隐性糖-2等位基因(两剂量)杂合的。
Claims (10)
1.由玉米制备发酵产品的方法，其中玉米与可发酵碳源的微生物混合以产生发酵产品，改进之处在于包括使用含有糊化温度低于约60℃的淀粉的玉米。
2.如权利要求1所述的方法，其中玉米是源自其胚乳具有纯合隐性等位基因的玉米植物，所述等位基因选自糖2、糖2-蜡质、dull-糖2、dull-糖2-蜡质、直链淀粉extender-dull-蜡质、直链淀粉extender-糖2及其组合。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中玉米源自其胚乳具有纯合隐性糖-2等位基因的蜡质玉米植物。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中玉米源自其胚乳具有一剂量杂合隐性糖-2等位基因的蜡质玉米植物。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中玉米源自其胚乳具有两剂量杂合隐性糖-2等位基因的蜡质玉米植物。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述淀粉的特征在于糊化温度低于约55°。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述淀粉的特征在于糊化温度低于约50℃。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述发酵产品选自乙醇、柠檬酸、丁醇、氢、乳酸、维生素和可溶性糖。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述发酵产品是乙醇。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述发酵产品是柠檬酸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20090313 Address after: Holland Arnhem Applicant after: Brunob II. B. V. Address before: Delaware Applicant before: National Starch & Chemical Investment Holding Corp |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BRUNOBU II AUGUSTUS CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: NAT STARCH CHEM INVEST Effective date: 20090313 |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20061227 |