CN107460137A - 一种发酵菊糖产低聚果糖的酿酒酵母及其构建方法与应用 - Google Patents

一种发酵菊糖产低聚果糖的酿酒酵母及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发酵菊糖产低聚果糖的酿酒酵母及其构建方法与应用。发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母为JZHΔS‑TSC，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.10518，保藏日期为2015年2月4日。本发明所得菌株在40℃条件下发酵200g/L菊糖，可产生180g/L的低聚果糖,转化率为0.9g低聚果糖每克菊糖,产率达到7.5g/L/h。使用该菌株产高纯度低聚果糖，对发酵条件及设备要求低，具有很好的工业化前景。

Description

一种发酵菊糖产低聚果糖的酿酒酵母及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发酵菊糖产低聚果糖的酿酒酵母及其构建方法与应用。
背景技术
低聚果糖(FOS)又称寡果糖、蔗果三糖族低聚糖等，分子式为G-F-Fn(G为葡萄糖，F为果糖，n＝1～4)，是蔗糖分子上以β-2,1糖苷键结合数个D-果糖所形成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖及其混合物的总称。低聚果糖不能被人体或口腔微生物消化吸收，能够被肠道微生物利用，选择性增殖肠道双歧杆菌和乳酸杆菌。低聚果糖属于益生元(Prebiotics)，具有调节肠道菌群、促进钙的吸收、调节血脂、增强免疫、抗龋齿等生理活性，在食品、医药领域具有重要应用价值。
目前，低聚果糖的生产主要以蔗糖为原料通过酶法合成，该法合成低聚果糖的最大理论得率在0.55至0.60克低聚果糖每克蔗糖之间(Nishizawa K,Nakajima M,Nabetani H.Kinetic study on transfructosylation by L-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC20611and availability of a membrane reactor for fructooligosaccharide production.Food Science and Technology Research,2001,7:39–44)。生产高纯度低聚果糖(>90％)需要经过纯化，明显增加生产成本。除蔗糖外，菊糖也是生产低聚果糖的原料。BENEO公司以菊糖为原料采用内切菊糖酶部分水解法生产低聚果糖，产品纯度可达75％(http://www.beneo.com)。该法中，内切菊糖酶的生产是一个瓶颈，增加工艺成本。由此可见，生产高纯度低聚果糖的技术工艺仍待提高。
发明内容
本发明目的在于提供一种发酵菊糖产低聚果糖的酿酒酵母及其构建方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母，发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母JZHΔS-TSC，拉丁文学名Saccharomyces cerevisiae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.10518，保藏日期为2015年2月4日。
一种发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母的构建方法，在酿酒酵母染色体Ty1转座位点整合表达分泌型外源菊糖内切酶基因InuC，并 敲除蔗糖酶基因，同时优化表达菊糖内切酶基因的密码子，再进一步使用组成型启动子，进而获得发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母。
进一步的说，以野生型酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae JZH为出发菌株，在染色体Ty1转座位点表达分泌型外源菊糖内切酶基因InuC，并敲除蔗糖酶基因SUC2，同时优化表达菊糖内切酶基因InuC的密码子，再进一步使用组成型TEF1启动子，进而获得发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母JZHΔS-TSC。
一种发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母应用，所述重组酿酒酵母作为生产低聚果糖的工程菌种的应用。
一种重组酿酒酵母菌株发酵菊糖产低聚果糖方法：
1)接种发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母JZHΔS-TSC至YPD培养基中，在30-40℃、100-300rpm条件下培养48-60小时，作为种子液；
2)将种子液按照5-10％(v/v)接种量，接种至100-300g/L菊糖溶液中，于35-40℃、100-200rpm搅拌，厌氧发酵18-36小时；
3)发酵自然沉淀，收获上清液即为富含低聚果糖溶液。
本发明的有益效果与特点在于：
1.本发明以整合生物加工方式利用菊糖生产低聚果糖，不需要外源酶制剂添加，一步中温生产，简化了生产工艺并降低了能耗及设备需求。
2.本发明应用菌株JZHΔS-TSC进行低聚果糖生产，产物中单糖含量低，低聚果糖纯度高，无需高成本的低聚果糖纯化步骤。
3.通过本发明提供的菌株及方法，以200g/L菊糖为原料生产低聚果糖，发酵24h获得低聚果糖180g/L，转化率达到90％(w/w)。所产低聚果糖中，四聚糖和五聚糖含量最高，分别占38％和33％，其次是三聚糖和六聚糖，分别占12％和17％，是比较理想的低聚果糖分布比例。
附图说明
图1为pUG6-TSC质粒图谱。
图2为本发明实施例提供的工程菌株利用菊糖产低聚果糖的原理示意图。
图3为本发明实施例提供的各菌株的胞外菊糖酶活效果图。
图4为本发明实施例提供的各菌株发酵菊糖产物的HPAEC-PAD图谱。
图5为本发明实施例提供的工程菌株发酵菊糖产物中的寡聚糖组成和产量效果图，
图6为本发明实施例提供的不同菌株发酵菊糖所产低聚果糖(FOS)的成分和聚合度(DP)分布图。
具体实施方式
实施例1：质粒及菌种构建
(1)DNA相关实验方法
E.coli质粒提取使用试剂盒Plasmid Mini Kit I(Omega Bio-Tek Inc.,USA)；琼脂糖凝胶回收使用试剂盒Gel Extraction Kit(Omega Bio-Tek Inc.,USA)；PCR及酶处理产物直接回收使用试剂盒Cycle Pure Kit(Omega Bio-Tek Inc.,USA)。限制性内切酶和DNA连接酶购于Thermo Fisher Scientific Inc.(USA)。高保真DNA聚合酶PrimeHS(Takara,Japan)用于载体构建片段和转化片段的PCR扩增。DpnI(NEB,USA)用于降解酶解回收PCR产物里的质粒模板。-Uni无缝克隆和组装试剂盒(北京全式金公司)用于组装片段构建载体。引物合成及测序在上海生工公司合成。密码子优化及基因合成在北京奥维森基因科技有限公司完成。
(2)培养基
YPD培养基组成：10g/L酵母提取物,20g/L蛋白胨,20g/L葡萄糖，或YPD平板(添加15g/L琼脂粉)。LB培养基组成：10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/L氯化钠，或LB平板(添加15g/L琼脂粉)；YNBI发酵培养基组成：6.7g/L酵母氮基础,200g/L菊苣菊糖(上海生工)。YPG培养基组成：10g/L酵母提取物,20g/L蛋白胨,20g/L半乳糖。400mg/L G418(上海生工)和400mg/L Zeocin(Invitrogen,美国)分别或联合用于筛选带有G418或/和Zeocin抗性的酵母转化子。200g/L Ampicillin用于筛选E.coli转化子。YPD,YNBI和YPG培养基115℃灭菌20min，LB培养基在121℃灭菌20min,抗生素均在培养基灭菌后温度降至50℃左右时加入。
(3)质粒pUG6-TSC的构建
质粒pUG6-TSC采用-Uni无缝克隆试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)构建(图1)。质粒pUG6-TSC的骨架以质粒pUG6-SSC为模板，应用引物pUG6-TSC-F(ATGCTTTTGCA AGCTTTC)和pUG6-TSC-R(ACTAGTAACACGAATACTACTAAAC AAATG)扩增获得。模板质粒pUG6-SSC来自本实验室此前的工作(模板质粒pUG6-SSC可按照下述文献中记载获得，Wang D,Li FL,Wang SA.Engineering a natural Saccharomyces cerevisiae strain for ethanol production from inulin by consolidated bioprocessing.Biotechnology for Biofuels,2016,9:96)。启动子TEF片段采用引物TEFp-F(ttagtagtattcgtgttactagtTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGC)and TEFp-R(aggaaagcttgcaaaagcatGGTTGTTTATGTTCGGATG)扩展获得。质粒骨架和TEF片段的扩增采用Takara高保真DNA聚合酶 HS，扩增条件为：95℃预变性3分钟；98℃变性10秒、55℃退火15秒、72℃延伸1至4分钟，循环数为30；最后72℃延伸10分钟。
(4)菌种构建
以野生型酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae JZH为出发菌株。菌株JZHΔS通过同源重组敲除JZH菌株的SUC2基因获得，用于敲除该基因的质粒pUG6-ΔSUC2来自本实验室此前的工作(敲除质粒pUG6-ΔSUC2可按照下述文献中记载获得Wang SA,Li FL.Invertase SUC2is the key hydrolase for inulin degradation in Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol 2013,79:403-406)。菌株JZHΔS-TSC和JZHΔS-SSC通过在菌株JZHΔS中分别表达质粒pUG6-TSC和pUG6-SSC的内切菊糖酶元件获得；其中，表达质粒pUG6-TSC和pUG6-SSC的内切菊糖酶元件时采用扩增内切菊糖酶元件的引物为Ty1up-F(TATTACCCGGATCAAAGTTATTTC)和Ty1up-R(AATACAT CCGCACATAATTAAAAAT)，扩增条件为：95℃预变性3分钟；98℃变性10秒、55℃退火15秒、72℃延伸4分钟50秒，循环数为30；最后72℃延伸10分钟。
菌株转化采用醋酸锂方法，具体为：1)0.2(v/v)％接种菌种至5mL YPD培养基中，30℃，200rpm培养16小时；2)接种50mL YPD达到5×106/mL的细胞密度，30℃，200rpm培养至细胞密度为2×107/mL；3)1000×g，5分钟离心收集菌体，倒掉培养基，将菌体重悬于25mL蒸馏水中，再次离心收集菌体；4)倒掉水，重悬菌体于1mL100mM LiAc中，10,000×g离心15秒收集菌体，用移液器吸去LiAc溶液；5)将菌体重悬于500μL 100mL LiAc中；6)取50μL菌体至1.5mL的离心管中，离心后取出LiAc溶液，加入转化液涡旋振荡混匀；其中，转化液为240μL PEG(50％w/v)；36μL 1.0M LiAc；50μL SS-DNA(2.0mg/mL)；10μL DNA；24μL无菌水；7)42℃水浴40min，之后8,000×g 15秒离心菌体并去除转化液，加入600μL无菌水，混匀涂布含有抗性标记的YPD平板中进行抗性筛选，30℃倒置培养，即获得JZHΔS-TSC菌株。
所述YPD平板中抗性标记为400mg/L G418(上海生工)或/和400mg/L Zeocin(Invitrogen,美国)分别或联合用于筛选。
实施例中涉及的质粒和菌株见表1。基于菌株JZHΔS-TSC和JZHΔS-SSC设计的由菊糖产低聚果糖的技术路线如图2所示。
表1
菌种/质粒 特征 来源
菌种
JZH 敲除HO基因，JZ1C的单倍体 本实验室
JZHΔS SUC2基因敲除菌株 本研究
JZH-SSC JZH表达元件Ty1-PSUC2-SPSUC2-InuC 本实验室
JZHΔS-SSC JZHΔS表达元件Ty1-PSUC2-SPSUC2-InuC 本研究
JZHΔS-TSC JZHΔS表达元件Ty1-PTEF-SPSUC2-InuC 本研究
质粒
pUG6 用作质粒构建骨架，带有G418抗性标签 EUROSCARF
pSH65 GAL1-cre，Zeocin抗性 EUROSCARF
pUG6-SSC 带有表达元件Ty1-PSUC2-SPSUC2-InuCopz-TCYC1 本实验室
pUG6-TSC 带有表达元件Ty1-PTEF-SPSUC2-InuCopz-TCYC1 本研究
pUG6-ΔSUC2 带有用于敲除SUC2的序列 本实验室
实施例2：工程菌株胞外菊糖酶活分析
菊糖酶活单位(包括内切酶和外切酶)定义为在测试条件下酶解菊糖产生1μmol/min的果糖所需的酶量。菊糖酶活通过测定菊糖释放的还原糖量来分析：50μL待检测溶液中加入450μL浓度为2％(w/v)菊糖溶液(菊糖溶液为将菊糖溶于0.1M醋酸盐缓冲液pH5.4)，反应液在50℃孵育15min,之后立即沸水浴10min使酶失活。反应液中还原糖浓度通过DNS法测定。
用于菊糖酶活分析的菌株经两步法活化：-80℃保存的各菌株(表1中所述的JZH、JZHΔS、JZH-SSC、JZHΔS-SSC或JZHΔS-TSC)首先按0.2％(v/v)分别接种于5mL YPD培养基中，200rpm,30℃培养24h。然后，以1％(v/v)的接种量将活化的菌株接种于50mL YPD(装于100mL烧瓶中)培养基中，至细胞密度为7.5×106/mL。此后，在200rpm,30℃培养，每24h取1mL培养物保存于-80℃。培养物经10,000×g离心2min，取上清用于胞外菊糖酶活分析。
酶活分析结果如图3所示。菌株JZHΔS未检测到胞外菊糖酶活性，而菌株JZHΔS-SSC和JZHΔS-TSC的发酵液胞外菊糖酶活性分别为0.76U/mL和4.72U/mL，后者为前者的6倍。酶活分析表明菌株JZHΔS-TSC具有发酵菊糖产低聚果糖的优势。
实施例3：低聚果糖发酵
(1)低聚果糖(FOS)发酵
-80℃保存JZHΔS-SSC或JZHΔS-TSC菌种分别0.2％(v/v)接种至5mL YPD中，30℃，200rpm培养24h，之后将其1％(v/v) 接种至40mL YPI(YPD培养基中加入200g/L菊糖)培养基中，30℃，200rpm进行有氧发酵。其间，每24h取500ul发酵液保存至-80℃用于检测。发酵液10,000g离心2min，上清液用0.1M醋酸盐缓冲液(pH 5.4)稀释400倍后用于离子色谱检测，并检测上清的菊糖酶活。
(2)离子色谱(HPAEC-PAD)检测低聚果糖(FOS)
带有脉冲安倍检测器的高效离子交换色谱(HAPEC-PAD)用于分析表达不同菌株对菊糖的转化效果。使用Dionex ICS-3000色谱系统(Dionex Corporation)，装备有有Dionex PA200色谱柱。由250mM NAOH混合1M NaAC和ddH2O的梯度溶液作为流动相，流速0.3mL/min。梯度洗脱程序为：a.0-5min内保持40％250mM NaOH,2％1M NaAc,58％ddH2O,(2)5-40min内梯度变至40％250mM NaOH,20％1M NaAc,40％ddH2O,(3)40-50min内梯度变至40％250mM NaOH,50％1M NaAc,10％ddH2O,(4)50-55min内梯度变至40％250mM NaOH,20％1M NaAc,40％ddH2O,(5)立刻变至40％250mM NaOH,2％1M NaAc,58％ddH2O并在55-60min内保持。
1-Kestose(GF2),Nystose(GF3),1F-Fructofuranosylnystose(GF4)(Wako,Japan)和GF5(Elicityl,France)作为FOS标准样品。菊糖型FOS包括FF2、FF3、FF4、FF5，也根据GF2、GF3、GF4、GF5标准品进行定量。蔗糖(GF),果糖(F)和葡萄糖(G)标准样品使用纯度>99％的分析纯试剂。总FOS产量以GF2,GF3,GF4,GF5和FF2,FF3,FF4,FF5之和计算。
(3)发酵产物中FOS产量
植物菊糖天然含有一定量的FOS。本实施例所使用的菊苣菊糖自身含有14.6％的FOS(图5)，其中大部分是GFn型(图4，图6)。HPAEC-PAD图谱表明，JZH-SSC彻底水解菊糖至葡萄糖和果糖，不能在胞外积累FOS(图4)。而JZHΔS-SSC和JZHΔS-TSC可以在胞外积累FOS。JZHΔS-SSC和JZHΔS-TSC在30℃发酵200g/L菊糖，最高FOS产量分别为72h的95.6±0.1g/L at和48h的124.2±0.7(图4，图5A)。而JZHΔS-TSC在40℃发酵进一步提升FOS产量至180.2±0.8g/L，转化了90.1±0.39％的菊糖，在24h内具有最高的FOS产率(7.51±0.03g/L/h)。产量最高的FOS中包含12％的DP3、38％的DP4、33％的DP5、17％的DP6，是较理想的聚合度分布(图6)。
(4)非FOS糖类的含量
发酵过程中，FOS以外产生的糖类主要包括葡萄糖(G)，果糖(F)，蔗糖(GF)和双果糖(FF)，以及没有被酶解为FOS的聚合度较高的菊糖(图4)。菌株JZHΔS-TSC在40℃，24小时发酵达到 最高FOS产量，此时葡萄糖和果糖含量分别为0.14g/L和0.37g/L，所产FOS纯度高。果糖和葡萄糖含量在发酵48-72小时内明显升高，而此时FOS含量显著下降，暗示此过程中部分FOS被降解为单糖。这一结果表明发酵可在24小时结束，此时低聚果糖纯度高。

Claims (5)

1.一种发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母，其特征在于：发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母JZHΔS-TSC，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10518，保藏日期为2015年2月4日。
2.一种权利要求1所述的发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于：在酿酒酵母染色体Ty1转座位点整合表达分泌型外源菊糖内切酶基因InuC，并敲除蔗糖酶基因，同时优化表达菊糖内切酶基因的密码子，再进一步使用组成型启动子，进而获得发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母。
3.按权利要求2所述的发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于：以野生型酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae JZH为出发菌株，在染色体Ty1转座位点表达分泌型外源菊糖内切酶基因InuC，并敲除蔗糖酶基因SUC2，同时优化表达菊糖内切酶基因InuC的密码子，再进一步使用组成型TEF1启动子，进而获得发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母JZHΔS-TSC。
4.一种权利要求1所述的发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母应用，其特征在于：所述重组酿酒酵母作为生产低聚果糖的菌种的应用。
5.一种权利要求1所述的重组酿酒酵母菌株发酵菊糖产低聚果糖方法，其特征在于：
1)接种发酵菊糖产低聚果糖重组酿酒酵母JZHΔS-TSC至YPD培养基中，在30-40℃、100-300rpm条件下培养48-60小时，作为种子液；
2)将种子液按照5-10％(v/v)接种量，接种至100-300g/L菊糖溶液中，于35-40℃、100-200rpm搅拌，厌氧发酵18-36小时；
3)发酵自然沉淀，收获上清液即为富含低聚果糖溶液。
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