一株曲霉及其在制备果糖基转移酶中的应用
技术领域
本发明涉及一株曲霉及其在制备果糖基转移酶中的应用,属于生物技术领域。
背景技术
低聚果糖是指通过β-(2-1)糖苷键在蔗糖分子的果糖残基上连接1-3个果糖分子而形成的果糖寡聚体蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物(Clevenger M A,TurnbullD,Inone H.Toxicological evaluation of neosugar:genotoxicity,carcinogenicityand chronic toxicity.Int J Toxicol,1988,7:643–662),因低聚果糖具有促进人类肠道有益细菌双岐杆菌(Bifidobacterium)的增殖,降低血液中的胆固醇,改善血脂,促进钙吸收、低热量,低龋齿等特殊的生理功效而成为近年来市场增长最快的健康食品配料。
虽然低聚果糖天然存在于许多果蔬中,但其在果蔬中的含量较低且受到季节限制,不适合于工业化生产。因此,工业上是利用微生物所产生的酶对蔗糖的转果糖基作用或水解酶对菊粉的水解作用生产低聚果糖(Crittenden R G,Playne M J.Production,properties and applications of food grade oligosaccharides.Ternds Food SciTech,1996,7:353–361)。而微生物酶法生产低聚果糖被认为是一种经济有效快捷的方法。微生物中广泛存在低聚果糖合成酶类,常被用来作为工业化生产的菌种有黑曲霉(Aspergillus niger)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)等。
合成低聚果糖的酶类一般称为β-果糖基转移酶(β-fructosyltransferase,E.C.2.4.1.9),但因为该酶的转果糖基活力最初是由Bacon及Blanchard在研究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)转化酶(invertase)时发现的,因此有些学者仍用β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,E.C.3.2.1.26)这一水解酶名称来称呼这类酶(Nguyen QD,Mattes F,HoschkeProduction,purification and identification offructooligosaccharides produced byβ-fructofuranosidase from Aspergillus nigerIMI303386.Biotechnol Lett,1999,21:183–186)。
1988年,Hidaka等人发现一株高产果糖基转移酶的黑曲霉菌株,且在高蔗糖浓度下表现出较高的转移活性,该酶与浓度为50%的蔗糖溶液反应,产物中低聚果糖的含量最高达到69%(Hidaka H,Hirayama M,Sumi N.Afructooligosaccharide-producing enzymefrom Aspergillus niger ATCC20611.Agric Biol Chem,1988,52:1181-1187)。随后,日本明治制糖公司人员将该酶应用于工业化生产商品化低聚果糖,其产品命名为明治低聚糖。此后,低聚果糖合成酶及低聚果糖工业化生产的研究开始热门起来。
由于受反应混合物中蔗糖浓度的限制以及生成的副产物葡萄糖的抑制作用,通过微生物的β-果糖基转移酶来进行低聚果糖的工业化生产,其理论的最大产率仅为55-60%(Yun JW.Fructooligosaccharides-occurrence,preparation,and application.EnzymeMicrob Tech,1996,19:107–117)。为了获得高纯度的低聚果糖,大部分研究人员尝试通过不断将副产物葡萄糖和残余蔗糖从反应产物中转移出来的方法获得高纯度低聚果糖(Nobre C,Teixeira J A,Rodrigues L R.New trends and technological challengesin the industrial production and purification of fructooligosaccharides.CritRev Food Sci Technol,2013,doi:10.1080/10408398.2012.697082)。Nishizawa等人通过使用一个具有纳滤膜的膜反应系统在反应过程中移除葡萄糖,最后得到的产物低聚果糖的含量约为90%(Nishizawa K,Nakajima M,Nabetani H.Kinetic study ontransfructosylation byβ-fructofuranosidase from Aspergillus nigerATCC20611and availability of a membrane reactor for fructooligosaccharideproduction.Food Sci Technol Res,2001,7:39–44)。另外,通过向反应体系中加入葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸的方法,能够使反应体系中的葡萄糖浓度降低,解除副产物的抑制作用,从而使低聚果糖的产量达到90%-98%(g低聚果糖/gsucrose)(Yun J W,Song S K.The production of high-content fructooligosaccharides from sucroseby the mixed-enzyme system of fructosyltransferase and glucoseoxidase.Biotechnol Lett,1993,15:573–576)。
固定化技术具有方便固定化酶/细胞的回收和重复利用,易于产物分离纯化,且利于连续化操作,对降低生产成本、提高经济效益等具有重要意义。因此,也被广泛应用于低聚果糖工业化生产可能性的研究。Cheng等利用海藻酸钠对日本曲霉(Aspergillusjaponicas)菌丝体进行固定化,并与蔗糖在一个42℃填充床反应器内反应,反应连续进行35天仅有17%的酶活损失(Cheng C-Y.Production of fructooligosaccharides byimmobilized mycelium of Aspergillus japonicas.J Chem Tech Biotechnol,1996,66:135-138)。
由Novozymes A/S提供的商业酶试剂Pectinex Ultra SP-L来源于棘孢曲霉,该商业酶具有果糖基转移酶的活性,其最适pH和最适作用温度分别为5.0-7.0、60℃,其与蔗糖反应后,低聚果糖的最大产量可占总糖含量的60.7%(Ghazi I,Fernandez-Arrojo L,Garcia-Arellano H.Purification and kinetic characterization of afructosyltransferase from Aspergillus aculeatus.J Biotechnol,2007,128:204-211)。该酶制剂也可有效利用甜菜糖浆和糖蜜转化生成低聚果糖,反应达到最大产量时,低聚果糖分别占总糖含量的56%和49%(Ghazi I,Fernandez-Arrojo L,Segura A G.Beetsugar syrup and molasses as low-cost feedstock for the enzymatic productionof fructo-oligosaccharides.J Agric Food Chem,2006,54:2964-2968)。
我国对低聚果糖的研究起步较晚,到“九五”期间才形成工业规模和商品化。原无锡轻工业大学和中国食品发酵研究所分别承担并成功完成了国家“九五”重点攻关项目“酶法生产低聚果糖”和国家科委课题“寡果糖开发”的研究,且将取得的成果成功应用于工业化生产。广西大学利用微生物发酵法将蔗糖转化为蔗果低聚糖的生产工艺技术也于1994年通过了技术鉴定(广西大学工业测试实验中心蔗果低聚糖研究课题组:蔗果低聚糖研究课题成果鉴定技术报告,1994桂科鉴字1号,1994桂教高科鉴字01号)。但受低聚果糖和蔗糖价格以及生产成本的制约,低聚果糖的应用范围比较窄,民众认知度不高,还未实现低聚果糖惠泽大众的目标。
国内对低聚果糖的研究报道不少,但是关于果糖基转移酶的研究报道并不多。除上述几家单位研究果糖基转移酶外,目前虽有江门量子高科、山东保龄宝、武汉盛世天元等单位生产低聚果糖,但上述几家企业均没有菌种,而是外购酶制剂。且菌种多为胞内酶,增加了酶分离提纯的成本。
为降低生产成本,提高低聚果糖的纯度,近年来,人们也在不断尝试采用新的方法来研究高纯度低聚果糖的制备,并取得了一定进展。山东大学的Lu等人用4%海藻酸钠将Wickerhamomyces anomala细胞固定化,作用于反应好的低聚果糖糖浆12h后发现,93.6%的单糖被用来进行代谢而低聚果糖并未受到影响,低聚果糖的纯度从54.4%提高到80.1%,该固定化酵母细胞能够重复利用10次且每次的低聚果糖含量的纯度均能达到80%以上(Lu L,Wu J,Song D.Purification of fructooligosaccharides by immobilizedyeast cells and identification of ethyl β-D-fructofuranoside as a novelglycoside formed during the process.Bioresource Technol,2013,132:365-369)。台湾的Sheu等人也利用类似方法将法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)BCBR31346和BCBR22367进行深层共培养,反应结束后,新科斯糖(低聚果糖的另一种构型)的纯度达到了87.4%(Sheu D-C,Chang J-Y,Chen Y-J.Production of high-purity neo-fructooligosaccharides by culture of Xanthophyllomycesdendrorhous.Bioresource Technol,2013,132:432-435)。
广西是我国目前最大的产糖省份,具有丰富的蔗糖资源,其甘蔗种植面积占全国常年糖料作物种植面积的85%以上,产甘蔗糖量在食糖总产量中占90%以上,占全国总产糖量的60%以上(李小玲.广西优质高产甘蔗生产若干问题与对策.沿海农业科技,2011,8:56-58)。
分离筛选出产高活力胞外果糖基转移酶的菌株对生产低聚果糖具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株曲霉及其在制备果糖基转移酶中的应用,本发明提供的棘孢曲霉M105制备的液态果糖基转移酶制剂对蔗糖酶解时的最适作用pH为5.0、最适作用温度为65℃、pH耐受性范围较广,在pH值为3.5-10.0条件下的酶活力降低不明显,在温度为45℃以下,棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂的稳定性较好,DNS(3,5-二硝基水杨酸,3,5-dinitrosalicylic acid)法检测棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂酶活,该酶在最适作用条件下(pH5.0、65℃)对蔗糖的活力为4.76U/mL。另外,棘孢曲霉M105的菌丝体制备的固定化细胞对蔗糖酶解时的最适作用pH值为7.0、最适作用温度为45℃,在反应时间为10h时,对蔗糖酶解得到的低聚果糖的百分含量达到最大值即62.99%,此时蔗糖转化率为88.59%,可以连续循环使用至少5次。棘孢曲霉M105的菌丝体制备的固定化细胞对糖蜜作用时的最适pH为7.5,在pH值为6.0-7.5范围内,固定化细胞的酶活比较稳定,在反应时间为12h时,对糖蜜作用得到的低聚果糖的百分含量达到最大值即48.74%,此时蔗糖转化率为82.91%。
本发明提供一株曲霉,其保藏号为CGMCC No.8912。
上述曲霉的培养液、菌丝体、孢子或孢子培养液也属于本发明的保护范围;
所述培养液是将所述曲霉或其孢子在基本培养基中培养得到的;
所述基本培养基按照如下方法制备:蔗糖30g,酵母粉1.5g,蛋白胨1.5g,NaNO33.0g,KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,羧甲基纤维素钠2g,以上溶质用800mL去离子水溶解,然后调节pH值至4.0-6.0,用去离子水定容至1L,115℃湿热灭菌;
所述pH值具体用盐酸或NaOH水溶液调节;
所述pH值具体为6.0;
所述灭菌的时间具体为30min。
一种液态果糖基转移酶制剂也属于本发明的保护范围,按照如下方法制备:将所述的曲霉的孢子液在基本培养基中培养,得到培养液;将培养液离心,收集上清液即得;
所述培养的条件具体为26℃-32℃、180rpm-200rpm、培养5-7天,再具体为28℃、180rpm、培养6天;
所述基本培养基具体按照如下方法制备:蔗糖30g,酵母粉1.5g,蛋白胨1.5g,NaNO33.0g,KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,羧甲基纤维素钠2g,以上溶质用800mL去离子水溶解,然后调节pH值至4.0-6.0,用去离子水定容至1L,115℃湿热灭菌;
所述pH值具体用盐酸或NaOH水溶液调节;
所述pH值具体为6.0;
所述灭菌的时间具体为30min;
所述曲霉的孢子液具体是用无菌水制备的;
所述离心的条件具体为4℃-15℃,3000rpm-4000rpm,离心半径7cm–15cm,离心10min-15min,再具体为4℃,3500rpm,离心半径7cm,离心10min。
一种固定化细胞也属于本发明的保护范围,按照如下方法制备:将所述曲霉的孢子液在基本培养基中培养,得到培养液;取培养液中的菌丝体,将菌丝体与2g/100ml-4g/100ml海藻酸钠的水溶液按照1g:(5ml-10ml)的比例混合,形成细胞/海藻酸钠悬浮液;将悬浮液滴入灭菌的2.2g/100ml-4.4g/100ml的CaCl2水溶液中,制成珠状固定化细胞,将其固化即得;
所述海藻酸钠的水溶液的浓度具体为3g/100ml;
所述比例具体为1g:10ml;
所述CaCl2水溶液的浓度具体为3.3g/100ml;
所述固化的条件具体为4℃-15℃中固化10h-24h,再具体为4℃固化24h;
所述培养的条件具体为28℃-32℃、180rpm-200rpm、培养2-4天,再具体为28℃、180rpm、培养2天;
所述基本培养基具体按照如下方法制备:蔗糖30g,酵母粉1.5g,蛋白胨1.5g,NaNO33.0g,KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,羧甲基纤维素钠2g,以上溶质用800mL去离子水溶解,然后调节pH值至4.0-6.0,用去离子水定容至1L,115℃湿热灭菌;
所述pH值具体用盐酸或NaOH水溶液调节;
所述pH值具体为6.0;
所述灭菌的时间具体为30min;
所述曲霉的孢子液具体是用无菌水制备的;
所述菌丝体与所述海藻酸钠的水溶液混合之前还包括将菌丝体用去离子水洗涤,用纱布过滤并压干的步骤;
所述珠状固定化细胞的直径具体为5mm-10mm,再具体为5mm。
一种生产低聚果糖的方法也属于本发明的保护范围,是在底物中加入所述的液态果糖基转移酶制剂或所述的固定化细胞,进行酶解反应即得。
上述方法中,所述底物为蔗糖;
所述酶解中所用的酶为所述的液态果糖基转移酶制剂时,所述酶解反应的条件为pH值为3.5-7.0,具体为4.5-6.0,再具体为5.0;所述温度为30℃-80℃,具体为50℃-70℃,再具体为65℃;
所述酶解中所用的细胞为所述的固定化细胞时,所述酶解反应的条件为pH值为4.0-8.0,具体为6.0-8.0,再具体为7.0;所述温度为30℃-60℃,具体为40℃-50℃,再具体为45℃。
上述方法中,所述底物为糖蜜;
所述酶解中所用的细胞为所述的固定化细胞时,所述酶解反应的条件为pH值为5.0–7.5,具体为6.0-7.5,再具体为7.5;所述温度为45℃。
上述的曲霉、上述的培养液、菌丝体、孢子或孢子培养液在制备果糖基转移酶和/或具有果糖基转移酶活性的产品和/或制备低聚果糖中的应用也属于本发明的保护范围。
上述的液态果糖基转移酶制剂或上述的固定化细胞在制备果糖基转移酶和/或具有果糖基转移酶活性的产品和/或制备低聚果糖中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中,所述低聚果糖为蔗果三糖和/或蔗果四糖。
本发明提供的棘孢曲霉菌株是一株产高活力胞外果糖基转移酶的菌株,该菌株可以应用于以蔗糖或糖蜜为原料生产低聚果糖,对促进蔗糖的深加工和废弃物的有效利用具有重要意义。
附图说明
图1为棘孢曲霉M105在PDA平板上的菌落形态。
图2为光学显微镜下的棘孢曲霉M105的有隔菌丝(A)、分生孢子梗(B)、顶囊(C)、分生小梗(D)及孢子(E)的显微形态。
图3为棘孢曲霉M105的ITS序列和棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株A2S2_D14的ITS序列比对的结果。
图4为棘孢曲霉M105的β-微管蛋白(β-tubulin)基因序列和棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株A2S3_D3的β-微管蛋白基因序列比对的结果。
图5为棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂和蔗糖反应后的产物分析。
图6为棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂的最适作用pH曲线。
图7为棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂的最适作用温度曲线。
图8为棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂的pH耐受性曲线。
图9为棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂的温度耐受性曲线。
图10为棘孢曲霉M105菌丝体作为固定化细胞的最适作用pH曲线。
图11为棘孢曲霉M105菌丝体作为固定化细胞的最适作用温度曲线。
图12为棘孢曲霉M105菌丝体作为固定化细胞的反应进程时间曲线。
图13为棘孢曲霉M105菌丝体作为固定化细胞的循环使用次数检测结果。
图14为棘孢曲霉M105菌丝体作为固定化细胞对糖蜜作用的最适pH曲线。
图15为棘孢曲霉M105菌丝体作为固定化细胞对糖蜜作用的反应进程时间曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的%,如无特殊说明,均为质量百分含量。
下述实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
基本培养基的制备:蔗糖30g,酵母粉1.5g,蛋白胨1.5g,NaNO33.0g,KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,羧甲基纤维素钠2g,用800mL去离子水溶解,然后用浓盐酸或NaOH溶液调节pH值至4.0-6.0(下述实施例中pH为6.0),用去离子水定容至1L,115℃湿热灭菌30min。
pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制:将7.71毫升0.2M Na2HPO4水溶液和12.29毫升0.1M柠檬酸水溶液混合。
在实施例1和实施例2中,果糖基转移酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法测定产生的还原糖(参考文献“Miller GL.Use ofdinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.AnalChem1959,31:426-428),具体步骤如下:
1、用去离子水配制1mg/mL的葡萄糖标准液,进行8个梯度稀释;每个稀释度取400μL葡萄糖液加入800μL DNS试剂,沸水浴5min显色,冷却至室温,取200μL加入96孔酶标板,540nm处测定光吸收值;得到光吸收值和葡萄糖含量的标准曲线,标准曲线公式为y=4.1345x+0.0305(R2=0.999),y为540nm处的光吸收值,x为葡萄糖含量(μg)。
2、将10g蔗糖溶于100mL pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中,得到蔗糖溶液;向2mL EP管中加入350μL蔗糖溶液,置于65℃的恒温水浴锅中;再加入50μL菌株M105的培养液的上清液,65℃保温30min,期间不断振荡,使酶与底物充分接触;然后加入800μL DNS试剂,沸水浴5min显色,冷却至室温,取200μL澄清液加入96孔酶标板,于540nm处测定光吸收值,将光吸收值带入步骤1的标准曲线公式,得到反应后的葡萄糖含量,进而计算酶活力。果糖基转移酶活力定义:65℃条件下,每分钟催化蔗糖生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
糖蜜购自广西金源生物化工实业有限公司。
下述实施例中的产物中的总糖量按照DNS法测定。
下述实施例中的葡萄糖、蔗糖标准品的浓度为10mg/mL,蔗果三糖、蔗果四糖标准品的浓度为1mg/mL,将标准品和反应混合物在相同条件下进行HPLC检测分析,得到洗脱曲线,计算各样品的峰面积。分别将反应混合物中的葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的洗脱峰面积除以各自标准品的峰面积,再将得到的比值分别乘以各自标准品的浓度,计算得到反应混合物中葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量。
实施例1、棘孢曲霉菌株M105的分离鉴定
一、菌株的获得
1、产果糖基转移酶菌株的分离筛选
(1)用去离子水配制分离培养基(察氏固体培养基);每升分离培养基中含有:蔗糖30g,NaNO33.0g,KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,羧甲基纤维素钠2g,琼脂15g,自然pH,115℃湿热灭菌30min;灭菌后冷却至50℃倒平板。
(2)取实验室保存的29株曲霉菌株的菌液各2μL涂布至步骤(1)制备的平板上,28℃恒温培养箱倒置培养6天。
(3)配制pH6.0的察氏培养基(液体),方法同步骤(1),不加琼脂,调pH为6.0。
(4)将步骤(2)培养得到的真菌菌株接种至步骤(3)配制的察氏培养基(液体)中,28℃、180rpm培养6天,取上清液,以蔗糖为底物反应6h,取5μL反应产物进行硅胶薄层层析(thin layer chromatography,TLC),从中筛选出能够产生胞外果糖基转移酶且酶活力最高的菌株GXN15。
2、菌株GXN15的诱变
(1)收集菌株GXN15的孢子悬液,将孢子浓度为108个/mL的孢子悬液1mL分装至已灭过菌的2mL EP管中,用封口胶封口,根据辐照梯度的个数分别装入各EP管盒中,进行钴源辐照诱变。
(2)将经60Co-γ射线辐照诱变后的孢子悬浮液进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-77个浓度梯度稀释,每个浓度吸100μL孢子悬浮液涂布在察氏固体平板上,以未经过诱变处理的孢子悬浮液作为对照组,每个浓度梯度做三个重复。平板于28℃恒温培养箱倒置培养四天,计算各诱变剂量下孢子悬液的致死率。
(3)选择致死率达到99%以上的该辐照梯度下的孢子悬液进行大量稀释涂平板,从中挑取突变株接种至察氏液体培养基中,28℃、180rpm培养6天,取上清液,以蔗糖为底物进行果糖基转移酶活力测定,从中筛选出果糖基转移酶活力明显提高的突变株M105。
二、菌株M105的鉴定
菌株M105在葡萄糖琼脂(PDA)平板上的菌落形态如图1所示,该菌株在PDA上28℃暗培养72h的菌落形成圆形,圆形外围产生较密的白色菌丝,菌落呈丝绒状质地,菌丛厚2-3mm;菌落中央产生较密的黑色的分生孢子;菌落背面呈浅黄色;菌落无明显气味,菌落表面干燥,无渗出液,不产生色素。
菌株M105的菌丝在光学显微镜下的形态如图2所示。分生孢子梗的主轴明显,可育分枝沿主轴方向依次产生,一级分枝可再次分枝或者直接产生瓶梗,瓶梗为直的或者稍微弯曲的安瓿形,中间部位明显膨大,基部稍缢缩。分生孢子梗顶端膨大成为顶囊,一般呈球形。顶囊表面长满一层或两层辐射状小梗(初生小梗与次生小梗)。最上层小梗瓶状,顶端着生成串的球形分生孢子。
提取菌株M105的总DNA并作为模板,利用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,SEQ ID No.1)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-3′,SEQ IDNo.2),PCR扩增得到该菌株的ITS的PCR产物,分别用引物ITS1和ITS4对产物测序获得了552bp的核苷酸序列(SEQ ID No.3所示)。同源性比对分析表明:该序列与棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株A2S2_D14的ITS(GenBank登录号:JX501377.1)的比对得分最高,序列覆盖度为100%,一致性为100%(如图3所示)。
提取菌株M105的总DNA并作为模板,利用β-微管蛋白基因的通用引物Bt2a(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’,SEQ ID No.4)和Bt2b(5’–ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’,SEQ ID No.5),PCR扩增得到该菌株β-微管蛋白基因的PCR产物,分别用引物Bt2a和Bt2b对产物进行测序分析,获得了537bp的核苷酸序列(SEQ ID No.6所示)。同源性比对分析表明:该序列与棘孢曲霉菌株A2S3_D3的β-微管蛋白基因(GenBank登录号:JX545070.1)的比对得分最高,序列覆盖度为100%,一致性为100%(如图4所示)。
根据该菌株的形态特征,参照《真菌鉴定手册》(魏景超,上海:上海科学技术出版社,1979),结合分子鉴定结果,菌株M105鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus),该菌株已于2014年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCC No.8912。
实施例2、利用曲霉菌株M105制备果糖基转移酶
一、培养液的获得
1、孢子液的制备
(1)将PDA培养基(固体)115℃灭菌30min。
(2)把PDA平板上传代活化6天的由实施例1得到的棘孢曲霉M105的孢子用无菌水洗下后制成孢子悬液,孢子浓度为1×108个/mL。
2、粗酶液的制备
(1)取150mL基本培养基于500mL三角烧瓶中。
(2)取棘孢曲霉M105的孢子液按1%的接种量(体积百分含量)接种至基本培养基中,28℃、180rpm,培养6天(26-32℃、180rpm-200rpm、培养5-7天均可),收集培养物。
(3)将培养物进行离心,4℃,离心半径7cm,3500rpm,离心培养物10min(4℃-15℃,离心半径为7cm–15cm,3000rpm-4000rpm,离心时间为10min–15min均可)去除菌体,收集上清液即为棘孢曲霉M105粗酶液。
二、粗酶液中果糖基转移酶的验证及其酶学特性
1、粗酶液和蔗糖反应后的产物分析
将步骤一制备的粗酶液与pH6.0、500g/L的蔗糖的水溶液于40℃恒温水浴锅中反应6h,沸水煮沸5分钟,反应产物经HPLC检测,结果如图5所示。
HPLC条件:岛津(RID-10A)示差检测器,依利特NH2 +(4.6mm×250mm),温度:30℃,流动相:乙腈/水(体积比75:25),流速:1.0mL/min。样品上样前用0.22μm的滤膜过滤。
图5中各数字的意义分别为:1:果糖,2:葡萄糖,3:蔗糖,4:蔗果三糖,5:蔗果四糖。
图5表明,步骤一制备的棘孢曲霉M105粗酶液含有果糖基转移酶,可以将蔗糖酶解转化为蔗果三糖和蔗果四糖。因此,该粗酶液也可以称为果糖基转移酶制剂,下述将其记为棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂。
2、果糖基转移酶制剂的最适作用pH和最适作用温度
(1)最适作用pH
将棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂按照DNS方法检测其对蔗糖的酶活力,仅分别用不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH6.5、7.0、7.5)、Tris-HCl缓冲液(pH7.5、8.0、8.5)、Glycine-NaOH缓冲液(pH8.5、9.0、9.5、10.0),反应温度采用40℃;
酶活力定义:40℃条件下,每分钟催化蔗糖生成1μmol还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
以最高酶活力为100%,其它pH值的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力,以pH值为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图,结果如图6所示。图6表明,棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂的最适作用pH为5.0,在pH值为4.5-6.0范围内较稳定。
(2)最适作用温度
将棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂按照DNS方法检测其对蔗糖的酶活,仅分别采用不同的反应温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃),反应缓冲液采用pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠。
酶活力定义:pH5.0条件下,每分钟催化蔗糖生成1μmol还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
以最高酶活力作为100%,其它温度的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力,以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图,结果如图7所示。图7表明,棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂的最适作用温度为65℃。
3、果糖基转移酶制剂的pH耐受性和温度耐受性
(1)pH耐受性
将棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂分别以等量混入不同pH值的缓冲液中[柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH3.5-6.5),磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5-7.5),Tris-HCl缓冲液(pH7.5-8.5),Glycine-NaOH缓冲液(pH8.5–10.0)],于4℃冰箱中静置24h后,按照DNS方法检测其对蔗糖的酶活力。
酶活力定义:65℃条件下,每分钟催化蔗糖生成1μmol还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
以最高酶活力为100%,其它pH值的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力,以pH值为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图,结果如图8所示。图8表明,棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂在pH值为3.5-10.0条件下的酶活力降低不明显,说明M105的液态果糖基转移酶制剂的pH耐受性范围较广。
(2)温度耐受性
将棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂分别以等量分装至不同EP管中,于不同温度下(30℃-75℃)保温1h后,用DNS方法检测其对蔗糖的酶活。
酶活力定义:65℃条件下,每分钟催化蔗糖生成1μmol还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
以最高酶活力作为100%,其它温度的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力,以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图,结果如图9所示。图9表明,在温度为45℃以下,M105液态果糖基转移酶制剂的稳定性较好,超过45℃后,随着温度的升高,酶活急剧降低。
4、果糖基转移酶制剂对蔗糖的酶活力
DNS法检测棘孢曲霉M105液态果糖基转移酶制剂酶活,该酶在最适作用条件下(pH5.0、65℃)对蔗糖的活力为4.76±0.11U/mL。
实施例3、棘孢曲霉M105的菌丝体细胞的固定化
一、棘孢曲霉M105固定化细胞的制备
将实施例2中步骤一制备的孢子悬液按1%的接种量(体积百分含量)接种于装有150mL基本培养基的500mL三角瓶中,28℃、180rpm、摇床培养两天(28℃-32℃、180rpm–200rpm、摇床培养2-4天均可)。取10mL培养后菌液的菌丝体,用去离子水洗涤三次,用纱布过滤并压干水,收集菌丝体。将海藻酸钠加热溶于灭菌水,制成3g/100ml(2g/100ml–4g/100ml均可)的海藻酸钠水溶液。取1g菌丝体与10ml(5ml-10ml均可)3g/100ml海藻酸钠水溶液均匀混合,形成细胞/海藻酸钠悬浮液,用注射器把悬浮液滴入已除菌的3.3g/100ml(2.2g/100ml-4.4g/100ml均可)的CaCl2水溶液中,制成直径约5mm(5mm-10mm均可)的珠状固定化细胞,4℃固化24h(4℃-15℃固化10h-24h均可),得到棘孢曲霉M105固定化细胞,备用。
二、棘孢曲霉M105固定化细胞特性及产物分析
1、最适反应pH
将步骤一制备的固定化细胞与10mL不同pH值[柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH3-7),磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7-8),Tris-HCl缓冲液(pH8-9)]的600g/L蔗糖溶液45℃温度下反应6h,反应产物经HPLC检测。
HPLC条件:岛津(RID-10A)示差检测器,依利特NH2+(4.6mm×250mm),温度:30℃,流动相:乙腈/水(体积比75:25),流速:1.0mL/min。样品上样前用0.22μm的滤膜过滤。
以低聚果糖(蔗果三糖、蔗果四糖)占总糖的百分含量为纵坐标,pH值为横坐标作图,结果如图10所示。图10表明,棘孢曲霉M105固定化细胞的最适作用pH值为7.0。
低聚果糖占总糖的百分含量=(蔗果三糖生成量+蔗果四糖生成量)*100%/产物中总糖量(下述计算方法相同)
2、最适反应温度
将步骤一制备的固定化细胞与10mL pH7.0600g/L蔗糖溶液在不同温度(30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃,60℃)下反应6h,反应产物经HPLC分析检测。
HPLC条件:岛津(RID-10A)示差检测器,依利特NH2+(4.6mm×250mm),温度:30℃,流动相:乙腈/水(体积比75:25),流速:1.0mL/min。样品上样前用0.22μm的滤膜过滤。
以低聚果糖(蔗果三糖、蔗果四糖)占总糖的百分含量为纵坐标,反应温度为横坐标作图,结果如图11所示。图11表明,棘孢曲霉M105固定化细胞的最适作用温度为45℃。
3、在最适条件下的反应时间进程
将步骤一制备的固定化细胞与10mL600g/L蔗糖溶液在最适条件下(pH7.0,温度为45℃)反应不同时间(3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h),反应产物经HPLC分析检测。
HPLC条件:岛津(RID-10A)示差检测器,依利特NH2+(4.6mm×250mm),温度:30℃,流动相:乙腈/水(体积比75:25),流速:1.0mL/min。样品上样前用0.22μm的滤膜过滤。
以各糖(葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖)占总糖的百分含量为纵坐标,低聚果糖(蔗果三糖、蔗果四糖)占总糖的百分含量、蔗糖转化率为次坐标,反应时间为横坐标作图,结果如图12所示。图12表明,在反应时间为10h时,低聚果糖的百分含量达到最大值即62.99%,此时蔗糖转化率为88.59%。
蔗糖转化率=(产物中总糖量-剩余蔗糖量)*100%/产物中总糖量(下述计算方法相同)
4、固定化细胞的循环使用情况
将步骤一制备的固定化细胞与10mL600g/L蔗糖溶液在最适条件下(pH7.0,温度为45℃),反应6h,将反应产物移去后,立即加入新鲜的10mL600g/L蔗糖溶液继续在上述条件下反应10h,连续循环反应。每次的反应产物经HPLC分析检测。
HPLC条件:岛津(RID-10A)示差检测器,依利特NH2+(4.6mm×250mm),温度:30℃,流动相:乙腈/水(体积比75:25),流速:1.0mL/min。样品上样前用0.22μm的滤膜过滤。
以低聚果糖占总糖的百分含量为纵坐标,循环次数为横坐标作图,结果如图13所示。图13表明,步骤一制备的固定化细胞能够连续循环5次,每循环使用一次所得低聚果糖占总糖的百分含量都有所降低。
三、棘孢曲霉M105固定化细胞对糖蜜的转化研究
1、糖蜜pH值对反应的影响
初始糖蜜pH值为4.75,将糖蜜用10mol/L NaOH水溶液调成不同的pH值(pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0),将步骤一制备的固定化细胞与不同pH值的糖蜜在45℃条件下反应6h,反应产物经HPLC分析检测。
HPLC条件:岛津(RID-10A)示差检测器,依利特NH2+(4.6mm×250mm),温度:30℃,流动相:乙腈/水(体积比75:25),流速:1.0mL/min。样品上样前用0.22μm的滤膜过滤。
以低聚果糖占总糖的百分含量为纵坐标,反应pH为横坐标作图,结果如图14所示。图14表明,在pH7.5条件下,低聚果糖的百分含量最高,表明步骤一制备的固定化细胞在此pH条件下活性最高。但在pH值为6.0-7.5范围内,固定化细胞的酶活比较稳定。
2、固定化细胞与糖蜜反应的时间进程研究
将步骤一制备的固定化细胞与10mL pH7.5的糖蜜于45℃恒温水浴锅中反应不同的时间,反应产物经HPLC检测分析。
HPLC条件:岛津(RID-10A)示差检测器,依利特NH2+(4.6mm×250mm),温度:30℃,流动相:乙腈/水(体积比75:25),流速:1.0mL/min。样品上样前用0.22μm的滤膜过滤。
以各糖(葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖)占总糖的百分含量为纵坐标,低聚果糖占总糖的百分含量、蔗糖转化率为次坐标,反应时间为横坐标作图,结果如图15所示。图15表明,在反应时间为12h时,低聚果糖的百分含量达到最大值48.74%,此时蔗糖转化率为82.91%。此后,随着反应时间的延长,低聚果糖的百分含量以及蔗糖的转化率等都在逐渐降低。