CN108949713A - 一种米曲霉菌体发酵液的制备方法及其在低聚果糖生产中的应用 - Google Patents

一种米曲霉菌体发酵液的制备方法及其在低聚果糖生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种米曲霉菌体发酵液的制备方法及其在低聚果糖生产中的应用。本发明所述的米曲霉为米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY‑03，于2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.9450，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。通过对米曲霉BYCY‑03培养基及培养条件的优化，一方面大大降低了生产成本，另一方面通过运用菌体发酵液发酵生产低聚果糖，可显著提高低聚果糖生产中蔗糖的利用率和低聚果糖的收率，提供生产效率，降低生产成本。

Description

一种米曲霉菌体发酵液的制备方法及其在低聚果糖生产中的 应用
技术领域
本发明涉及一种米曲霉菌体发酵液的制备方法及其在低聚果糖生产中的应用，属于功能糖制造技术领域。
背景技术
低聚果糖是指2～5个果糖基为链节，以一个葡萄糖基为链的端基，以果糖基→果糖连接键为主体骨架连结形成的碳水化合物。低聚果糖是一种天然活性物质，甜度为蔗糖的0.3～0.6倍。既保持了蔗糖的纯正甜味性质，又比蔗糖甜味清爽，是具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂——促生物质。
当前国内外生产低聚果糖的方法主要是菌种发酵法和酶转化法，这两种方法涉及的关键物质为β-果糖基转移酶，菌种发酵法是指用产β-果糖基转移酶的菌种直接发酵蔗糖溶液生产低聚果糖，酶转化法是直接利用β-果糖基转移酶转化生产低聚果糖。菌种发酵法普遍存在产物低聚果糖纯度不高、后续提纯困难的问题，酶转化法存在的问题则是提取的酶活较低、副产物葡萄糖的抑制、生产成本较高。
中国专利文献CN104130950A公开了一株黑曲霉及其培养方法与应用，该发明提供了一株黑曲霉BLCY-02，并通过该发明提供的培养方法制备菌体发酵液，提取β-果糖基转移酶后用于生产低聚果糖。但是该专利仍存在蔗糖利用率过低的问题。中国专利文献CN105112306A(申请号：201510603109.9)公开了一株米曲霉及其培养方法与应用，但是该发明中米曲霉BYCY-03的培养成本较高，培养基成分复杂，产生的β-果糖基转移酶酶活也较低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种米曲霉菌体发酵液的制备方法。
本发明还提供了该米曲霉在低聚果糖生产中的应用，由于该菌株所产β-果糖基转移酶具有较高的酶活，能够高转化蔗糖产生低聚果糖，可显著提高低聚果糖生产中蔗糖的利用率和低聚果糖的生产效率。
本发明的技术方案如下：
一种米曲霉菌体发酵液的制备方法，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于种子培养基中，在28～35℃的条件下，200～250rpm振荡培养30～60h，制得种子液；
其中，所述种子培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖0.5％；麸皮50％，余量水，pH为4.5～6.5；
(2)取步骤(1)制得的种子液，接种于发酵培养基中，28～35℃，扩大培养20～35h，即得米曲霉菌体发酵液；所述米曲霉菌体发酵液中β-果糖基转移酶的酶活为2000～2300U/mL；
其中，所述发酵培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖1％，麸皮1％，玉米浆粉1％，余量水，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03，于2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.9450，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该菌种在中国专利文献CN105112306A中有详细记载。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中种子液的接种体积比为0.1‰～1％。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中扩大培养的条件为：控制转速为200～250rpm，通风比为2:1，控制pH为4.0～5.5。
采用上述制备方法制备的米曲霉菌体发酵液。
上述米曲霉在低聚果糖生产中的应用，步骤如下：
(a)将按照上述制备方法制备的米曲霉菌体发酵液经过滤收集菌丝体，加入到30％～60％质量浓度的蔗糖溶液中，保温反应10～36h，得低聚果糖粗溶液；
(b)将步骤(a)得到的低聚果糖粗溶液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩、干燥制得低聚果糖。
根据本发明优选的，步骤(a)中，所述过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.3～0.5MPa，流速为5～10m3/h。
根据本发明优选的，步骤(a)中，所述菌丝体的加入量，以蔗糖质量计，为0.05％～0.5％。
根据本发明优选的，步骤(a)中，所述保温反应的温度为40～60℃。
根据本发明优选的，步骤(b)中，所述脱色所需活性炭添加量为0.1wt％，脱色时间为1.5h；所述色谱分离的运行压力为0.2MPa，温度为60℃，水耗比1:1.2，每小时进料1.8m3。
本发明未详细说明的实验步骤可按照文献记载或现有技术进行。
有益效果
1、本发明通过对米曲霉培养基及培养条件的优化，以麸皮、玉米浆粉等为培养基的主要原料，大大降低了生产成本，简化了生产步骤。
2、本发明通过优化的培养基和培养条件制备得到菌体发酵液，可有效提高菌体发酵液中β-果糖基转移酶的酶活，其酶活可达2000～2300U/mL；将上述菌体发酵液应用于生产低聚果糖，可显著提高低聚果糖生产中蔗糖的利用率和低聚果糖的收率，使蔗糖利用率达到86％以上，低聚果糖的收率达到60％左右，提高生产效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
本发明中所涉及材料及药品均为普通市售产品。
实施例1
一种米曲霉菌体发酵液的制备方法，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于种子培养基中，在28℃的条件下，200rpm振荡培养30h，制得种子液；
其中，所述种子培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖0.5％；麸皮50％，余量水，pH为4.5；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按体积比0.1‰的比例接种于发酵培养基中，28℃，扩大培养20h，即得米曲霉BYCY-03菌体发酵液；
其中，所述发酵培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖1％，麸皮1％，玉米浆粉1％，余量水，pH自然。
所述步骤(2)扩大培养过程中控制转速为250rpm，通风比2:1，通入稀硫酸与氨水溶液控制pH为4.0。
实施例2
一种米曲霉菌体发酵液的制备方法，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于种子培养基中，在30℃的条件下，220rpm振荡培养45h，制得种子液；
其中，所述种子培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖0.5％；麸皮50％，余量水，pH为5.5；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按体积比0.5‰的比例接种于发酵培养基中，30℃，扩大培养30h，即得米曲霉BYCY-03菌体发酵液；
其中，所述发酵培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖1％，麸皮1％，玉米浆粉1％，余量水，pH自然。
所述步骤(2)扩大培养过程中控制转速为220rpm，通风比2:1，通入稀硫酸与氨水溶液控制pH为5.0；
实施例3
一种米曲霉菌体发酵液的制备方法，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于种子培养基中，在35℃的条件下，250rpm振荡培养60h，制得种子液；
其中，所述种子培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖0.5％；麸皮50％，余量水，pH为6.5；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按体积比1％的比例接种于发酵培养基中，35℃，扩大培养35h，即得米曲霉BYCY-03菌体发酵液；
其中，所述发酵培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖1％，麸皮1％，玉米浆粉1％，余量水，pH自然。
所述步骤(2)扩大培养过程中控制转速为200rpm，通风比2:1，通入稀硫酸与氨水溶液控制pH为5.5。
对比例1
中国专利文献CN105112306A(申请号：201510603109.9)公开了一株米曲霉及其培养方法与应用，并提供了该米曲霉菌株在生产低聚果糖中的应用。应用该专利的公开的培养基培养米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03，制备米曲霉菌体发酵液，培养条件与实施例2相同，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于种子培养基中，在30℃的条件下，220rpm振荡培养45h，制得种子液；
其中，所述种子培养基组分为，均为重量百分比：硝酸铵0.2％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.05％，蛋白胨1％，蔗糖2％，葡萄糖5％，余量水，pH为5.5；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按体积比0.5‰的比例接种于发酵培养基中，30℃，扩大培养30h，即得米曲霉菌体发酵液；
其中，所述发酵培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖5％，葡萄糖5％，蛋白胨1％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1，余量水，pH自然。
所述步骤(2)扩大培养过程中控制转速为220rpm，通风比2:1，通入稀硫酸与氨水溶液控制pH为5.0。
实验例1
取实施例1、2、3以及对比例1培养得到的菌体发酵液，检测发酵液中β-果糖基转移酶的酶活。
其中，β-果糖基转移酶酶活测定方法如下：
用pH 5.5、50mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制反应液，10％(w/v，单位g/mL)的蔗糖溶液作底物，加入适量的酶液(控制三糖最终生成量10％)，40℃水浴振荡反应40min后，立即于100℃沸水浴中15min，终止反应，离心，取上清液测定各糖组分含量。
酶活定义如下：在上述反应条件下，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需酶量为β-果糖基转移酶1个活力单位(U)。
实施例1、2、3以及对比例1所制备的菌体发酵液，其β-果糖基转移酶的酶活结果如下表1：
表1菌体发酵液酶活
组别 β-果糖基转移酶酶活
实施例1 2150U/mL
实施例2 2200U/mL
实施例3 2140U/mL
对比例1 1800U/mL
从表1可以看出，实施例1～3中，米曲霉BYCY-03按照本发明所述培养基及培养条件，制备得到的菌体发酵液中，β-果糖基转移酶的酶活均高于2100U/mL，而对比例1按照现有技术(中国专利文献CN105112306A)公开的培养基制备得到的米曲霉菌体发酵液中，β-果糖基转移酶的酶活为1800U/mL，实施例1～3与对比例1相比，实施例1～3制备的菌体发酵液中β-果糖基转移酶酶活有较大的提高。
实验例2
米曲霉在低聚果糖生产中的应用，步骤如下：
(a)取实施例1、2、3及对比例1制备的米曲霉菌体发酵液经过滤收集菌丝体，分别加入到质量浓度为30％、40％、60％的蔗糖溶液中，菌丝体的添加量为蔗糖质量的0.1％，50℃保温反应25h后得到低聚果糖粗溶液；
(b)将步骤(a)得到的低聚果糖粗溶液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩、干燥制得低聚果糖。
其中，步骤(a)中，过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.4MPa，流速为8m3/h；
步骤(b)中，脱色活性炭添加量为0.1wt％，脱色时间为1.5h；色谱分离的运行压力为0.2MPa，温度为60℃，水耗比为1:1.2，每小时进料1.8m3。
过滤、离交、浓缩、干燥均按照常规方法操作。
取步骤(c)制备得到的低聚果糖粗溶液，检测其中的葡萄糖含量、蔗糖含量以及低聚果糖含量；取步骤(d)制得的低聚果糖检测低聚果糖纯度及收率，结果如表2～3所示。
表2 30％蔗糖溶液制备低聚果糖的各项指标
表3 40％蔗糖溶液制备低聚果糖的各项指标
表4 60％蔗糖溶液制备低聚果糖的各项指标
通过以上数据可以看出，按照本发明所述的制备方法得到的菌体发酵液对蔗糖的利用率达到86％以上，应用上述菌体发酵液制备得到的低聚果糖粗酶液中低聚果糖的含量达到61％以上，而应用现有技术(中国专利文献CN105112306A)制备得到的菌体发酵液对蔗糖的利用率不足78％，所产低聚果糖粗酶液中低聚果糖的含量也在53％以下，通过对比可以发现，本发明中制备的菌体发酵液对蔗糖的利用率显著提高，所产低聚果糖粗酶液中低聚果糖的含量也显著提升。
从最后得到的低聚果糖产物中分析，利用实施例1～3和对比例1的菌体发酵液制备的低聚果糖的纯度均在95％以上，但是利用实施例1～3的菌体发酵液制备的低聚果糖收率为60％左右，而利用对比例1的菌体发酵液制备的低聚果糖收率仅为50％左右，实施例1～3中低聚果糖的收率也有显著提高。

Claims (10)

1.一种米曲霉菌体发酵液的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于种子培养基中，在28～35℃的条件下，200～250rpm振荡培养30～60h，制得种子液；
其中，所述种子培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖0.5％；麸皮50％，余量水，pH为4.5～6.5；
(2)取步骤(1)制得的种子液，接种于发酵培养基中，28～35℃，扩大培养20～35h，即得米曲霉菌体发酵液；
其中，所述发酵培养基组分为，均为重量百分比：蔗糖1％，麸皮1％，玉米浆粉1％，余量水，pH自然。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述米曲霉(Aspergillusoryzae)BYCY-03，于2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.9450，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述种子液的接种体积比为0.1‰～1％；所述扩大培养的条件为：控制转速为200～250rpm，通风比为2:1，控制pH为4.0～5.5。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述米曲霉菌体发酵液中β-果糖基转移酶的酶活为2000～2300U/mL。
5.一种权利要求1～4任一项所述的制备方法制备的米曲霉菌体发酵液。
6.一种米曲霉在低聚果糖生产中的应用，其特征在于，步骤如下：
(a)将按照权利要求1～4任一项所述的制备方法制备的米曲霉菌体发酵液经过滤收集菌丝体，加入到30％～60％质量浓度的蔗糖溶液中，保温反应10～36h，得低聚果糖粗溶液；
(b)将步骤(a)得到的低聚果糖粗溶液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩、干燥制得低聚果糖。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在与，步骤(a)中，所述过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.3～0.5MPa，流速为5～10m3/h。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在与，步骤(a)中，所述菌丝体的加入量，以蔗糖质量计，为0.05％～0.5％。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在与，步骤(a)中，所述保温反应的温度为40～60℃。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在与，步骤(b)中，所述脱色所需活性炭添加量为0.1wt％，脱色时间为1.5h；所述色谱分离的运行压力为0.2MPa，温度为60℃，水耗比1:1.2，每小时进料1.8m3。
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