CN105219663A - 合成海藻糖的专用菌株及其用于合成海藻糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株合成海藻糖的专用菌株及其用于合成海藻糖的方法。该菌株为解脂亚罗威酵母(Yarrowia？lipolytica)CGMCC？NO.11367。将菌株培养于含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基中，进行发酵，结束后进行菌液分离，从发酵液中纯化海藻糖；分离得到的酵母细胞，还可加入到低聚麦芽糖或麦芽糖水溶液转化合成海藻糖。该方法的有益效果是：第一，该酵母能自我高效合成海藻糖所需要的酶，且能循环使用，降低了生产成本。第二，该酵母还能合成赤藓糖醇，可以利用合成赤藓糖醇后得到的废酵母细胞转化低聚麦芽糖合成海藻糖，节省了培养细胞的成本。第三，酵母细胞更容易高密度发酵与高浓度底物转化，合成更多的海藻糖。

Description

合成海藻糖的专用菌株及其用于合成海藻糖的方法

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株用于合成海藻糖的解脂亚罗威酵母菌株(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367，及其用于合成海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖(Trehalose)由两分子α-葡萄糖通过α-1，1糖苷键连接，属于非还原性二糖(non-reducingdisaccharide)，最早在十九世纪早期从黑麦麦角中发现的，后来在各种动植物，微生物细胞中均发现海藻糖的存在，尤其是在低含水量或者脱水的细胞中含量丰富。比如，在干燥的复活草(如鳞片卷柏Selaginellalepidophylla)、休眠的线虫(nematodes)、脱水面包酵母(baker’syeast)、干燥的地衣植物中含量丰富(Elbeinetal.Newinsightsontrehalose：amultifunctionalmolecule.Glycobiology，13：17-27)，这些生物细胞中失去99％的水分仍能生存若干年，而当有水存在时能迅速恢复细胞活力。在脱水面包酵母中，海藻糖的含量占据细胞干重的10～15％左右。

海藻糖在细胞中的存在，除了作为能源储存外，更多的作为抵御外界不良环境的保护剂(protectant)，使得细胞中的大分子(如酶)在极端条件下(如高温、低pH、干燥、冷冻等)仍然具有活性，能维持细胞质中大分子的结构以及维持细胞膜的完整性(OhtaniandUsui.1994.Productionoftrehalosebyfermentationanditsapplication.FoodChem，2：91-95；SingerandNas-Lindquist.1998.Multipleeffectsoftrehaloseonproteinfoldinginvitroandinvivo.MolCell，1：639-648)。由于没有还原基团，海藻糖与富含氨基酸的食品配料混合后在高温下不会发生美拉德反应，能良好的保持食品的风味。海藻糖还具有良好的持水性，能与失水细胞中残余的水牢固结合保护生物大分子的结构完整性(BeltonandGil.1994.IRandRamanspectroscopicsstudiesoftheinteractionoftrehalosewithheneggwhitelysozyme.Biopolymers，34：957-961)。

由于海藻糖具有上述优良的生理生化特性，其在医药领域、食品领域以及化妆品领域都得到十分广泛的应用。

在医药领域常用于疫苗、血液制品、抗体的稳定剂，使疫苗在常温下以及冷冻的条件下同样具有稳定性，增加血液制品以及抗体在冷冻条件下的稳定性(PatentWO1996/022107)。海藻糖还可以和透明质酸配伍用于制备眼部用药传递系统以及润滑剂(中国发明专利200410036422.0，200410075549.3)，还可以制成关节腔内注射药剂，起到抗氧化和抗自由基的作用，改善炎症症状，为软骨修复提供所需要的糖分，加速软骨的修复(中国发明专利200610103472.5)。同时海藻糖还可以进行衍生化合成其它的药物，在防止肿瘤的侵袭以及转移具有显著的效果(中国发明专利201010246792.2，201110150999.4)。海藻糖的衍生物还可以用于制备皮肤外用剂，具有促进血液循环，保湿，吸收紫外线以及抗氧化的功效(PatentWO2004/071472，JP2004/001401)。

海藻糖由于具有低甜度、非还原性、抗干燥等作用，在食品领域有着广阔的应用前景。海藻糖的甜度相当于蔗糖的45％，口感柔和，能在小肠内被消化吸收，可作营养源。此外还具有抗腐蚀性，不生成引起龋齿的不溶性葡聚糖，不被口腔病原菌所利用，因此可以作为新型甜味剂，添加于奶粉、口香糖、巧克力、冰淇淋、糖果等食品中。由于海藻糖对酸、热都非常稳定，不具有还原性，在食品加工过程中不会产生美拉德反应，因此在食品加工过程中添加一定量德海藻糖，对于淀粉类食品可抑制淀粉的老化，延长食品的保质期；可抑制蛋白质的变性；对于肉类、油炸类等含脂肪多的食品。添加海藻糖可有效的抑制脂肪酸化，保持食品原有风味。

海藻糖由于具有优良的保湿性使其成为化妆品原料之一。用于皮肤化妆品如洗面奶中，可抑制皮肤干燥；用于唇膏、口腔清凉剂、口腔芳香剂中，可作为甜味剂、呈味改良剂及品质改良剂。无水海藻糖可用于护肤霜等中，作为磷脂及酶的脱水剂。

由于海藻糖在医药、食品、化妆品领域均具有十分重要的功效，而且新的功效正在不断的被开发应用，因此，如何更加经济的规模化制备就具有十分重要的价值。

最开始的海藻糖制备方法是从酿酒酵母细胞中提取得到(巴西发明专利Patent9303490，，日本发明专利JP7000190，JP7099988)。由于提取得率低，需要破细胞壁，步骤多，难以实际规模化制备。后来发现有些微生物能够以淀粉或麦芽糊精为原料合成海藻糖，但合成效率较低(Katoetal.1996.Reactionmechanismofanewglycosyltrehalose-producingenzymeisolatedfromthehyperthermopholicarchaeumSulfolobussolfataricusKM1.BiosciBiotechnolBiochem，60：921-924)。经过研究，以麦芽糊精为原料合成海藻糖是在低聚麦芽糖基海藻糖合成酶(MTSase)以及低聚麦芽糖基海藻糖水解酶(MTHase)的协同催化下合成的。后来人们将这两种酶分别克隆并在大肠杆菌中异源表达，纯化这两种酶后能够以低聚麦芽糖(或麦芽糊精)为底物合成海藻糖。基于这种双酶协同催化合成海藻糖的原理，国内外许多学者申请了合成海藻糖的发明专利。

中国发明专利CN201310128939.1(新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用)描述了一种采用分别表达该双酶体系(MTSase与MTHase)以液化淀粉为底物协同催化合成海藻糖的方法。另外Seo等人采用将麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶进行融合，在大肠杆菌中进行表达，再转化液化淀粉合成海藻糖的报道(Seoetal.2008.BiofunctionalrecombinantfusionenzymebetweenmaltooligosyltrehalosesynthaseandmaltooligosyltrehalosetrehalohydrolaseofthermophilicmicroorganismMetallosphaerahakonensis.JMicrobiolBiotechnol，18：1544-1549)。但不管是分别表达还是融合表达，使用的两种酶(MTSase与MTHase)均采用大肠杆菌表达。表达的过程较为复杂，需要使用抗生素(如卡那霉素或者氨苄青霉素等)保持筛选压力，还需要使用诱导剂(如IPTG等)，另外还需要破壁大肠杆菌以释放这两种酶，在破壁的同时大肠杆菌的内毒素等有害物质也释放出来，同时大肠杆菌是致病微生物，不适合用于食品制备。虽然从大肠杆菌中分别纯化这两种酶，然后以纯酶进行转化液化淀粉合成海藻糖，也可以进行，但是纯化得到纯酶的成本太高。另外，该双酶体系不能以麦芽糖为底物合成海藻糖，而淀粉液化液里面还有较多的麦芽糖，而麦芽糖难以与海藻糖分离。因此，采用该方法难以规模化生产海藻糖，或成本很高。

还有采用单酶体系转化麦芽糖或者麦芽糖浆合成海藻糖的报道。中国发明专利(申请号201310112536.8，一种利用全细胞催化合成海藻糖的方法)描述了在大肠杆菌中表达海藻糖合成酶基因，并用经过表面活性剂渗透处理的全细胞转化麦芽糖合成海藻糖。该方法步骤与使用的试剂较多，比如需要采用抗生素筛选，使用诱导剂诱导，使用表面活性剂进行处理细胞，转化率也较低。这些限制条件使得该方法难以规模化采用。中国发明专利(申请号201310182033.8，一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法)描述了一种采用来自恶臭假单胞菌、热带假丝酵母、玫瑰链霉菌或大肠杆菌的海藻糖合成酶，并将该酶固定来转化麦芽糖合成海藻糖。该方法同样存在步骤繁多的缺点(培养细胞，破壁，纯化酶，固定化酶等)。另外，采用麦芽糖为底物转化合成海藻糖，由于麦芽糖与海藻糖均属于二糖，反应液中存在较多的未反应完的麦芽糖(一般仍有20％以上的麦芽糖残留)，存在难以将二者分离或者分离困难。

因此，研究开发一种能够将淀粉高效转化为海藻糖的新的合成途径对于提高生产效率，降低生产成本具有十分重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的酶合成或细胞合成海藻糖的不足之处，提供一种能合成海藻糖的解脂亚罗威酵母菌株(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367及其用于合成海藻糖的方法。本发明通过遗传工程将解脂亚罗威酵母进行改良，使得该酵母能够合成麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)以及海藻糖合成酶(Trehalosesynthase，TreS)，能高效将淀粉液化液或者麦芽糖合成海藻糖。该酵母菌株除了具备出发菌株的性能之外(合成赤藓糖醇)，还具有出发菌株所没有的功能，即：能由淀粉液化液或麦芽糖合成海藻糖。因此不但可以直接培养该酵母细胞发酵淀粉液化液或麦芽糖合成海藻糖，还可以用合成赤藓糖醇后的酵母泥作为细胞催化剂，再转化淀粉液化液或麦芽糖生成海藻糖。

本发明中使用的合成海藻糖的酵母菌株是解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)，已经于2015年9月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.11367。

本发明所使用的酵母菌株--解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367来源于出发菌株解脂亚罗酵母(YarrowialipolyticaBLC13)CGMCCNO.7326，该菌株在中国发明专利ZL201310282059.X中已经做了描述。实验表明该菌株不能同化低聚麦芽糖，也不能同化麦芽糖，更不能将淀粉液化液或麦芽糖合成海藻糖。而本发明所采用的酵母菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367由于含有MTSase、MTHase以及TreS酶，能将淀粉液化液或麦芽糖合成海藻糖。因此，本发明使用的解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株不但能合成赤藓糖醇，还具备新的特性，即能将淀粉液化液或麦芽糖合成海藻糖。这是第一次报道能够以淀粉液化液或者麦芽糖为底物合成海藻糖的解脂亚罗威酵母，具有发明创造性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一株解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367，该酵母含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehaloseaynthasegene，MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalosetrehalohydrolasegene，MTHase)以及海藻糖合成酶(Trehalosesynthasegene，TreS)的编码序列。上述3种酶的脱氧核糖核酸编码序列都已经公开，可以从公共GenBank数据库中免费得到。如来自耐热耐酸细菌Sulfolobussolfataricus的MTSase与MTHase酶的编码序列都已经在GenBank数据库中，可以免费得到(GenBank登录号AE006641)。来自嗜热嗜酸古菌Picroplilustorridus的海藻糖合成酶编码序列(TreS)也可以从GenBank数据库中免费得到(GenBank登录号AE017261)。

第二方面，本发明涉及解脂亚罗威酵母菌株在合成海藻糖中的用途。

第三方面，本发明涉及解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、将解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株培养于含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基中，在pH值2.0～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养，发酵结束后菌液分离得到含海藻糖的发酵液以及解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞；

S2、从所述含海藻糖的发酵液中分离纯化得到海藻糖；

和/或，利用所述酵母细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖。

即，将所述酵母接种在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中进行发酵，酵母一边生长一边合成海藻糖。发酵结束后，从发酵液中分离纯化得到海藻糖，得到的酵母细胞还可以作为酶催化剂以低聚麦芽糖或者麦芽糖为底物合成海藻糖。

优选的，步骤S1中，所述菌液分离前还包括在发酵结束后加入糖化酶反应，再加入酿酒酵母发酵分解葡萄糖的步骤。所述的糖化酶是指能将低聚麦芽糖或者麦芽糖水解为葡萄糖的酶。加入糖化酶的目的是将发酵液中未转化完的低聚麦芽糖或者麦芽糖水解为葡萄糖，然后再采用酿酒酵母将葡萄糖分解利用。通过这种方法，能够显著提高发酵液中海藻糖的纯度，有利于分离纯化。

优选的，步骤S1中，发酵pH值为3.0～6.0，更优选为5.0；发酵初始温度为25℃～35℃，更优选28℃～32℃，最优选30℃。

优选的，步骤S1中，所述发酵培养还包括如下步骤：经过多级(一级、二级甚至是三级)扩大发酵培养，以得到更多的发酵液以及酵母细胞。

优选的，步骤S1中，所述培养基中的碳源为低聚麦芽糖(或称为麦芽糊精)、麦芽糖中的一种或两种和葡萄糖的混合，所述碳源用量为70～300克/升(优选为70～280克/升，更优选为250克/升)，其中葡萄糖用量占碳源总用量的6.5％～28.5％；所述培养基的氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种。上述氮源用量为本领域常规用量，可根据实际需要进行选择；例如可以为：氮源添加量为0.2％～4％(质量体积百分比)，在此范围内根据需要进行调整。无机盐一般为微生物生长提供微量元素，用量很小。本发明中的无机盐用量为0.01克/升～2克/升，在此范围内根据需要进行调整。

优选的，步骤S2中，所述的分离纯化得到海藻糖，其方法为过滤除菌、浓缩，离子交换，再浓缩，脱色，结晶等常规步骤，这些纯化方法为本领域内通识的常用方法，本领域技术人员通过有限的探索既能掌握。

优选的，步骤S2中，所述酵母细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖包括如下步骤：

S21、在所述酵母细胞中加入质量百分比浓度为20％～45％的低聚麦芽糖或麦芽糖，在温度20～80℃，pH3～8条件下振荡或搅拌进行转化；

S22、对转化液进行菌液分离，得到不含酵母细胞的转化液与解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞，从转化液中分离纯化得到海藻糖；

S23、步骤S22得到的所述解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞可重复进行步骤S21、S22。即，该分离得到的酵母细胞还可以作为酶催化剂，再次转化20％～50％的低聚麦芽糖或者麦芽糖，生成海藻糖。细胞可以重复利用3～5次。

优选的，步骤S21中，是在温度50～70℃，pH5～6条件下振荡或搅拌进行转化。

优选的，步骤S22中，所述菌液分离前也可包括在所述转化液中加入糖化酶反应，再加入酿酒酵母发酵分解葡萄糖的步骤。加入糖化酶的目的是分解未转化完的底物为葡萄糖，并加入酿酒酵母分解葡萄糖。

第四方面，本发明还涉及解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，所述方法还可以包括如下步骤：

A1、将解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株培养于含高浓度葡萄糖、氮源、无机盐以及水的发酵培养基中，在pH值2.0～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌培养发酵，发酵结束后菌液分离，上清为含赤藓糖醇的溶液，沉淀为解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞；

A2、从所述含赤藓糖醇的溶液中纯化分离得到赤藓糖醇；

和/或，利用所述酵母细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖。

上述方法是先以解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367细胞在高浓度葡萄糖的发酵液中先发酵合成赤藓糖醇，菌液分离后，从发酵液中纯化得到赤藓糖醇，酵母细胞用来转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖，充分利用了废酵母细胞。转化结束后，分离得到的酵母细胞还可以作为酶催化剂，再次转化20％～45％的低聚麦芽糖或者麦芽糖，生成海藻糖。细胞可以重复利用3～5次。

优选的，步骤A1中，所述高浓度碳源为葡萄糖，含量为200～300克/升(优选为250克/升)；所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种。该氮源用量为本领域常规用量，可根据实际需要进行选择；例如可以为：氮源添加量为0.2％～4％(质量体积百分比)。在此范围内根据需要进行调整。无机盐一般为微生物生长提供微量元素，用量很小。本发明中的无机盐用量为0.01克/升～2克/升，在此范围内根据需要进行调整。

优选的，步骤A1中，发酵pH起始值为3.0～6.0，更优选为5.0；发酵初始温度为28℃～32℃，更优选30℃。

优选的，步骤A2中，所述纯化分离，其方法为过滤除菌、浓缩，离子交换，再浓缩，脱色，结晶等常规步骤，这些纯化方法均为本领域内通识的常用方法，本领域技术人员通过有限的探索既能掌握。

优选的，步骤A2中，所述酵母细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖包括如下步骤：

A21、在所述酵母细胞中加入质量百分比浓度为20％～45％的低聚麦芽糖或麦芽糖，在温度20～80℃，pH3～8条件下振荡或搅拌进行转化；

A22、对转化液进行菌液分离，得到不含酵母细胞的转化液与解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞，从转化液中分离纯化得到海藻糖；

A23、步骤A22得到的所述解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞可重复进行步骤A21、A22。

优选的，步骤A22中，所述分离纯化，其方法为过滤除菌、浓缩，离子交换，再浓缩，脱色，结晶等常规步骤，这些纯化方法均为本领域内通识的常用方法，本领域技术人员通过有限的探索既能掌握。

优选的，步骤A22中，所述菌液分离前还包括在发酵液中加入糖化酶反应，再加入酿酒酵母发酵分解葡萄糖的步骤。

本发明中所述的能由低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖的解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株，是通过以下方法构建的：

按照Yarrowialipolytica密码子偏好性，合成含MTSase、MTHase以及TreS编码序列的表达盒，这3种酶的编码序列形成一个融合编码序列(MTSase-MTHase-TreS，简称MTSHS)并将该表达盒转化出发菌株解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)CGMCC7326，在含麦芽糖为唯一碳源的基本培养基中筛选，只有含有MTSHS融合编码序列的表达盒的酵母转化子才能利用麦芽糖，并长出单菌落克隆，该单菌落克隆能转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖。

含MTSHS编码序列的表达盒包含同源臂DNA序列、启动子DNA序列、MTSHS融合编码序列、终止子DNA序列。同源臂序列可以为来自Yarrowialipolytica酵母的URA3编码的序列，也可以为LEU2编码的序列，也可以为核糖体18SrDNA编码序列，也可以为长末端重复DNA序列(Zeta序列)等。启动子DNA序列可以为来自Yarrowialipolytica酵母的任意基因的启动子DNA序列，比如TEF1编码序列(转录延长因子1基因)的启动子，也可以为hp4d启动子(杂合启动子)，也可以为GPD编码序列(3-磷酸甘油醛脱氢酶基因)启动子，也可以是1，6-二磷酸果糖裂解酶编码序列(FBA)的启动子，也可以是XPR2编码序列的启动子等。MTSase编码序列与MTHase编码序列可以来自但不限于Sulfolobussolfataricus、Sulfolobusacidocaldaricus、Achromobacterxylosoxidans等生物。TreS编码序列可以来自但不限于Picroplilustorridus、Grifolafrondosa等生物。终止子DNA序列可以为来自Yarrowialipolytica酵母的任何基因的终止子DNA序列，如TEF1编码序列的终止子DNA序列，也可以是XPR2编码序列的终止子DNA序列等。上述启动子DNA序列、终止子DNA序列在公共数据库中都已公开，如在GenBank数据库中都能查询并免费得到序列。合成含酶的编码序列的表达盒的技术目前也是很成熟的技术，一般的DNA合成公司都能合成。DNA的转化、酵母的转化、转化子的筛选等技术都是常规的实验技术。本发明提供的合成海藻糖的专用菌株含有上述编码序列的表达盒。

与现有的合成海藻糖的技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明采用公认安全的解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)作为麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶，以及海藻糖合成酶表达宿主，该酵母在发酵合成食品添加剂行业被允许使用(如合成赤藓糖醇等)。而以往的技术是采用大肠杆菌作为表达宿主，大肠杆菌不被允许在食品添加剂发酵行业使用。

(2)本发明使用的解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株能同时表达合成麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶，以及海藻糖合成酶。以往的方法都是采用大肠杆菌单独表达这3种酶，并破碎细胞释放酶，然后按比率加入到转化液中，操作比较复杂，而且酶的比率不好控制。

(3)由于本发明使用的解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株能同时表达合成麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶，以及海藻糖合成酶，可以同时将低聚麦芽糖与麦芽糖转化为海藻糖。而现有的技术无法同时将低聚麦芽糖与麦芽糖转化为海藻糖。

(4)解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolyica)CGMCCNO.11367可以被循环利用3～5次，而采用从大肠杆菌中纯化的酶只能被利用一次。

(5)解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367还可以来自发酵赤藓糖醇后经过过滤得到的废酵母泥，有效提高了资源的利用率。由于解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367来自于解脂亚罗酵母(YarrowialipolyticaBLC13)CGMCCNO.7326，具备其合成赤藓糖醇的特性，同时又具备了合成海藻糖的新性能。因此，可以先用其来合成赤藓糖醇，再用得到的废酵母细胞用来合成海藻糖。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为出发菌株解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.7326与本发明提供的解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株在含低聚麦芽糖或麦芽糖的基本培养基中生长比较；其中，A为出发菌株在含低聚麦芽糖的培养基中的生长情况，B为出发菌株在含麦芽糖的培养基中的生长情况，C为本发明菌株载在含低聚麦芽糖的培养基中的生长情况，D为本发明菌株在含麦芽糖的培养基中的生长情况；

图2为解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367在含250克/升低聚麦芽糖的发酵液中发酵起始时与结束时的液相分析；其中，A：起始时的HPLC分析；B：发酵结束时的HPLC分析；

图3为发酵结束后加入糖化酶反应2小时HPLC分析；

图4为在加入糖化酶的发酵液中再加入酿酒酵母后的HPLC分析。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域内的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367能利用低聚麦芽糖与麦芽糖

由于解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367来源于解脂亚罗酵母(YarrowialipolyticaBLC13)CGMCCNO.7326，解脂亚罗酵母CGMCCNO.7326不能分解低聚麦芽糖与麦芽糖，不能在含低聚麦芽糖或麦芽糖为唯一碳源的基本培养基上生长(基本培养基成分：低聚麦芽糖或麦芽糖10克/升，酵母氮碱6.7克/升，硫酸铵5克/升，pH6.0)。而解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367由于含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶，以及海藻糖合成酶，在以低聚麦芽糖或麦芽糖合成海藻糖的同时还能释放出葡萄糖，而释放的葡萄糖能作为碳源支持其生长。因此，解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367能在含低聚麦芽糖或麦芽糖为唯一碳源的基本培养基中生长。将出发菌株解脂亚罗酵母CGMCCNO.7326与本发明提供的解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367接种在含10克/升的低聚麦芽糖或麦芽糖的基本液体培养基中(低聚麦芽糖或麦芽糖：10克/升，酵母氮碱6.7克/升，硫酸铵5克/升，pH6.0)，在30℃培养60小时，测定细胞在600纳米的吸光值，出发菌株不能生长，而本发明提供的解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367由培养0时的0.05提高到7.5。出发菌株解脂亚罗威酵母CGMCCNO.7326与本发明提供的解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367菌株在上述基本液体培养基中的培养60小时的生长图见图1所示。由图1可知，出发菌株解脂亚罗威酵母CGMCCNO.7326在含低聚麦芽糖(A)与麦芽糖(B)的基本培养基中不生长：本发明提供的解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株含低聚麦芽糖(C)与麦芽糖(D)的基本培养基中生长良好。

实施例2、不同条件下发酵合成海藻糖的试验

以下实施例详细描述解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株在不同pH、温度、底物浓度(碳源)、不同氮源及浓度对发酵合成海藻糖的影响。

2.1pH值对合成海藻糖的影响

在250毫升摇瓶中装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，低聚麦芽糖250，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2，氯化锰0.005，氯化铜0.005，pH分别调节至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，灭菌后接入酵母解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367在30℃振荡发酵。发酵到100小时取样，分别测定细胞的生长密度与发酵液中海藻糖的含量。结果如下表1：

表1不同pH对酵母生长以及海藻糖合成的影响

pH值	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0
								OD600值	10.5	18.6	23.5	26.5	23.7	23.6	24.2
海藻糖含量(g/L)	37.5	146.4	148.2	150.4	143.5	139.6	130.3

由表1结果初步可见，在pH2.0～8.0条件下酵母均能生长并合成海藻糖，但在pH2.0的生长与合成海藻糖的量明显低于其它pH条件下的量。

2.2温度对发酵合成海藻糖的影响

培养基成分同上2.1。pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367，分别在25℃，28℃，30℃，32℃，35℃振荡发酵培养。发酵到100小时取样，分别测定细胞的生长密度与发酵液中海藻糖的含量。结果如下表2：

表2不同温度对酵母生长以及海藻糖合成的影响

温度	25	28	30	32	35
						OD600值	17.5	23.6	27.5	24.8	18.5
海藻糖含量(g/L)	130.8	137.4	143.4	139.4	123.5

由表2结果初步可见，在温度25～35℃条件下酵母均能生长并合成海藻糖，但在30℃的生长与合成海藻糖的量高于其它温度条件下的量。HPLC分析海藻糖的纯度在65～75％之间。

2.3不同低聚麦芽糖的底物浓度对合成海藻糖的影响

在250毫升摇瓶中装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，低聚麦芽糖分别为0、50、100、150、200、250、280，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2，硫酸镁1.5，氯化锰0.01，氯化铜0.01，pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367在30℃振荡发酵。发酵到100小时取样，分别测定细胞的生长密度与发酵液中海藻糖的含量。结果如下表3：

表3不同低聚麦芽糖对酵母生长以及海藻糖合成的影响

低聚麦芽糖浓度(g/L)	0	50	100	150	200	250	280
								OD600值	24.5	25.4	24.5	22.5	23.2	24.6	27.2
海藻糖含量(g/L)	0	28.5	63.4	85.3	128.5	152.5	172.6
								转化率(％)	0	57	63.4	56.9	64.3	61	61.6

由表3可见，合成海藻糖的转化率并不是随着底物低聚麦芽糖的浓度提高而增加，在57～64％之间。HPLC分析海藻糖的纯度在70～75％之间。

2.4不同麦芽糖的底物浓度对合成海藻糖的影响

在250毫升摇瓶中装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，麦芽糖分别为0、50、100、150、200、250、280，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2，硫酸镁2，pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367在30℃振荡发酵。发酵到100小时取样，分别测定细胞的生长密度与发酵液中海藻糖的含量。结果如下表4：

表4不同麦芽糖浓度对酵母生长以及海藻糖合成的影响

低聚麦芽糖浓度(g/L)	0	50	100	150	200	250	280
								OD600值	23.2	26.8	23.1	27.2	24.6	22.4	26.6
海藻糖含量(g/L)	0	30.5	56.2	83.2	124.2	160.5	167.8
								转化率(％)	0	61	56.2	55.5	62.1	64.1	59.9

由表4可见，合成海藻糖的转化率并不是随着底物麦芽糖的浓度提高而增加，在55～64％之间。HPLC分析海藻糖的纯度在70～75％之间。

实施例3、发酵结束后海藻糖的生物净化

上述实施例2中合成海藻糖后，发酵液中还有少量残留的低聚麦芽糖、麦芽糖以及葡萄糖，为了提高发酵液中海藻糖的纯度，以便纯化，本发明在发酵液中添加一定量的糖化酶，反应一段时间后再加入酿酒酵母分解葡萄糖。

在250毫升摇瓶中装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，低聚麦芽糖为250，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2，硫酸镁1.98，氯化锰0.01，氯化铜0.01，pH调节至5.0，灭菌后接入酵母在30℃振荡发酵。以海藻糖的含量在连续5小时内不再增加作为发酵结束的依据，HPLC分析发酵液起始与结束的成分，图谱如图2所示，图2A中，5.4与8.2min均为低聚麦芽糖的峰。图2B中，5.4为残留的低聚麦芽糖，7.8为海藻糖的峰。由图2可知，海藻糖的纯度为75％。再加入发酵液质量百分比为0.05％的糖化酶，升温至50℃反应2小时，HPLC分析此酶解液，图谱如图3所示，图3中，7.8min为海藻糖，9.0min为葡萄糖。由图3可见，糖化酶将发酵液中残余的低聚麦芽糖全部水解为葡萄糖，此时海藻糖的纯度与酶解前基本一致，为77.2％。降温至30℃，加入酿酒酵母搅拌12小时，HPLC分析，图谱如图4所示，图4中，7.8min为海藻糖。由图4可见，加入酿酒酵母后能将葡萄糖分解完全，提高发酵液中海藻糖的纯度，此时海藻糖的纯度为99％以上。

由上述结果可见，在发酵液中加入糖化酶以及酿酒酵母能显著提高发酵液中海藻糖的纯度。

实施例4、发酵液中海藻糖的分离纯化

采用本领域内通识的分离方法既能从发酵液中分离纯化海藻糖。这些方法技术人员通过有限的操作实践既能掌握。

首先进行菌液分离，采取的方法有离心(管式离心机离心)、陶瓷膜过滤、板框过滤等。得到澄清的发酵液后浓缩到折光60％，冷却，海藻糖既能结晶析出。离心得到海藻糖晶体。再进行二次结晶，步骤为：溶解、脱色、离子交换、浓缩、再结晶。离心晶体并干燥，得到白色海藻糖。

实施例5、不同条件对细胞转化合成海藻糖的影响

以下实施例详细描述解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367细胞在不同pH、温度、底物浓度(碳源)对转化合成海藻糖的影响。

5.1pH值对细胞转化合成海藻糖的影响

在6个250毫升摇瓶中分别装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，低聚麦芽糖250，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2，硫酸镁1，氯化锰0.02，氯化铜0.01，pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367在30℃振荡发酵。发酵结束后菌液分离，按照实施例4描述的方法从发酵液分离纯化海藻糖，每个摇瓶离心得到的酵母细胞分别用50毫升250克/升的低聚麦芽糖悬浮，分别在pH3～8，温度为50℃条件下转化，转化结束后分别测定发酵液中海藻糖的含量。结果如下表5：

表5不同pH对酵母细胞转化低聚麦芽糖合成海藻糖的影响

pH值	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0
							海藻糖含量(g/L)	187.2	186.4	191.5	190.4	183.5	169.6
转化率(％)	74.9	74.5	76.6	76.2	73.4	67.8

由表5结果初步可见，在pH3.0～8.0条件下酵母细胞的均能较好地转化低聚麦芽糖合成海藻糖，但在pH5～6的条件下转化率高于其它pH值的转化率。

5.2温度对细胞转化合成海藻糖的影响

在6个250毫升摇瓶中分别装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，低聚麦芽糖250，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2，硫酸镁1，氯化锰0.02，氯化铜0.01，pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367*在30℃振荡发酵。发酵结束后菌液分离，按照实施例4描述的方法从发酵液分离纯化海藻糖，每个摇瓶离心得到的酵母细胞分别用50毫升250克/升的低聚麦芽糖悬浮，调节pH为5.0，温度分别为20℃～80℃条件下转化，转化90小时后分别测定发酵液中海藻糖的含量。结果如下表6：

表6不同温度对酵母细胞转化低聚麦芽糖合成海藻糖的影响

温度(℃)

20

30

40

50

60

70

80

海藻糖含量(g/L)	107.2	136.4	161.5	187.4	195.2	53.5	37.6
								转化率(％)	42.8	50.6	64.6	74.9	78.1	21.4	15.0

由表6结果初步可见，在温度20～60℃的范围内，转化率随着温度的升高而增加，但温度超过70℃转化率显著下降。

5.3不同低聚麦芽糖的底物浓度对细胞转化合成海藻糖的影响

在6个250毫升摇瓶中分别装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，低聚麦芽糖250，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2，硫酸镁1，氯化锰0.02，氯化铜0.01，pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367，在30℃振荡发酵。发酵结束后菌液分离，按照实施例4描述的方法从发酵液分离纯化海藻糖，每个摇瓶离心得到的酵母细胞分别用50毫升200～450克/升的低聚麦芽糖悬浮，调节pH为5.0，温度为60℃条件下转化，转化结束后分别测定发酵液中海藻糖的含量，结果如下表7：

表7不同低聚麦芽糖对细胞转化合成海藻糖的影响

低聚麦芽糖浓度(g/L)	200	250	300	350	400	450
							海藻糖含量(g/L)	156.4	188.5	233.2	268.8	318.5	352.5
转化率(％)	78.2	75.4	77.7	76.8	79.6	78.3

由表7可见，在200～450克/升的底物浓度范围内，合成海藻糖的转化率与低聚麦芽糖的浓度并没有相关性。

5.4不同麦芽糖的底物浓度对合成海藻糖的影响

在6个250毫升摇瓶中分别装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，麦芽糖250，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2，硫酸镁1，氯化锰0.02，氯化铜0.01，pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367，在30℃振荡发酵。发酵结束后菌液分离，按照实施例4描述的方法从发酵液分离纯化海藻糖，每个摇瓶离心得到的酵母细胞分别用50毫升200～450克/升的麦芽糖悬浮，调节pH为5.0，温度为60℃C条件下转化，转化结束后分别测定发酵液中海藻糖的含量，结果如下表8：

表8不同麦芽糖浓度对酵母生长以及海藻糖合成的影响

麦芽糖浓度(g/L)	200	250	300	350	400	450
							海藻糖含量(g/L)	158.6	190.8	238.3	272.5	320.7	345.2
转化率(％)	79.3	76.3	79.4	77.9	80.2	76.7

由表8可见，在200～450克/升的底物浓度范围内，合成海藻糖的转化率与麦芽糖的浓度并没有相关性。而且与用低聚麦芽糖为底物得到的转化率基本一致。

实施例6、细胞转化结束后海藻糖的生物净化

上述实施例5中采用细胞转化合成海藻糖后，转化液中还有残留的低聚麦芽糖、麦芽糖以及葡萄糖，为了提高海藻糖的纯度，本发明在转化液中添加一定量的糖化酶，反应一段时间后再加入酿酒酵母分解葡萄糖。上述实施例5中，细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖结束后，加入质量百分比为0.05％的糖化酶，50℃反应2小时，温度降为30℃生物净化处理，直到葡萄糖分解完全。海藻糖的纯度由处理前的80％提高到99％，极大的方便了海藻糖的结晶。

实施例7、解脂亚罗威酵母菌株(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367合成赤藓糖醇的性能评估

由于本发明所采用的解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367来自于出发菌株CGMCCNO.7326，该出发菌株能合成赤藓糖醇。本实施例研究在不同条件下，含有海藻糖合成表达盒的新菌株解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367合成赤藓糖醇的性能。

7.1pH值对新菌株解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367合成赤藓糖醇的影响

在6个250毫升摇瓶中分别装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖200，酵母粉5，玉米浆干粉3，柠檬酸铵2，硫酸镁1.98，氯化锰0.01，氯化铜0.01，pH分别调节至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367在30℃振荡发酵100小时。发酵结束后菌液分离并测定发酵液中赤藓糖醇的含量，结果如表9所示。按照实施例4描述的方法从发酵液中分离纯化赤藓糖醇。

表9不同pH对酵母细胞发酵合成赤藓糖醇的影响

由表9结果初步可见，在pH2.0～8.0范围内，在pH3～7的条件下均能良好的合成赤藓糖醇，在pH2.0以及8.0合成效果明显降低。

7.2温度对新菌株解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367合成赤藓糖醇的影响

在3个250毫升摇瓶中分别装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖300，酵母粉5，玉米浆干粉3，柠檬酸铵2，氯化锰0.005，氯化铜0.005，pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367，分别在25，30，35℃振荡发酵100小时。发酵结束后菌液分离并测定发酵液中赤藓糖醇的含量，结果如表10所示。

表10不同温度对酵母细胞发酵合成赤藓糖醇的影响

温度(℃)	25	30	35
				赤藓糖醇含量(g/L)	92.4	164.5	112.6
转化率(％)	30.8	54.8	37.5

由表10结果初步可见，在25～35℃范围内，在30℃合成效果最佳。

7.3、不同氮源对新菌株解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367合成赤藓糖醇的影响

在3个250毫升摇瓶中分别装入50毫升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖250，氮源10克，硫酸镁1.5，氯化锰0.02，氯化铜0.01，pH调节至5.0，灭菌后接入解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367，在30℃振荡发酵100小时。所示氮源分别为：酵母粉、玉米浆干粉，玉米浆、柠檬酸铵、酵母粉5克加玉米浆干粉5克、酵母粉5克加柠檬酸铵2克加玉米浆3克，发酵结束后菌液分离并测定发酵液中赤藓糖醇的含量，结果如表11所示：

表11不同氮源种类对合成赤藓糖醇的影响

由表11结果可知，新菌株在酵母粉+玉米浆+柠檬酸铵混合氮源的条件下合成赤藓糖醇效果最佳，在单一的无机铵盐(柠檬酸铵)效果最差。

实施例8、以合成赤藓醇后得到的酵母细胞泥为催化剂转化合成海藻糖

由于本发明所采用的酵母菌株--解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367来自于出发菌株解脂亚罗威酵母CGMCCNO.7326，保留了该出发菌株合成赤藓糖醇的特性，同时又能合成海藻糖。合成赤藓糖醇后，酵母菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367仍然具备合成海藻糖的能力。本实施例先按照实施例7描述的方法，以酵母菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367在含葡萄糖的发酵培养基中合成赤藓糖醇，以菌液分离后得到的酵母泥来转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖。转化的方法按照实施例5描述的方法进行，分别研究pH、温度、不同低聚麦芽糖或者麦芽糖对转化合成海藻糖的影响。结果表明，以来自合成赤藓糖醇后得到的酵母泥为催化剂，转化合成海藻糖的效果与采用来自合成海藻糖后得到的酵母泥为催化剂的效果一致。第一次转化后，菌液分离，得到的酵母细胞再用于转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖，转化结束后再次菌液分离，得到的细胞还可以再次用于转化合成海藻糖，细胞可以反复利用5次，转化率分别为80.5％，77.6％，74.5％，70.8％以及65.4％。转化结束后按照实施例3描述的方法加入糖化酶以及酿酒酵母进行分解去除葡萄糖，提高海藻糖的纯度。细胞一般反复利用3次。说明可以以合成赤藓糖醇后留下的废酵母细胞为催化剂转化合成海藻糖，充分利用了酵母资源，这是本发明的一个重要创新点。

实施例9、以淀粉为起始原料合成海藻糖

上述实施例中以低聚麦芽糖或者麦芽糖为起始原料发酵或者细胞转化得到海藻糖。而制备低聚麦芽糖或者麦芽糖的原料又是淀粉，因此在该实施例中描述以淀粉为起始原料来合成海藻糖。

称取1000克淀粉，用3升蒸馏水调成淀粉乳，加热到90℃，加入质量百分比为0.05％的高温淀粉酶反应，直到DE值在8～12结束反应，再加热到105℃维持10分钟以灭活淀粉酶。冷却到60℃，再按照质量百分比为0.02％的量加入普鲁兰酶(一种淀粉去分支酶)，反应5小时，得到低聚麦芽糖(或麦芽糊精)。再按照实施例2或者实施例5描述的方法来发酵或者细胞转化合成海藻糖。

综上所述，本发明的解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367能自我高效合成海藻糖所需要的酶，且能循环使用，降低了生产成本；该酵母还能合成赤藓糖醇，可以利用合成赤藓糖醇后得到的废酵母细胞转化低聚麦芽糖合成海藻糖，节省了培养细胞的成本；并且，该酵母细胞更容易高密度发酵与高浓度底物转化，合成更多的海藻糖。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一株解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367，该酵母含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehaloseaynthase，MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalosetrehalohydrolase，MTHase)以及海藻糖合成酶(Trehalosesynthase，TreS)。

2.一种如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株在合成海藻糖中的用途。

3.一种如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、将解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株培养于含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基中，在pH值2.0～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养，发酵结束后菌液分离得到含海藻糖的发酵液以及解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞；

S2、从所述含海藻糖的发酵液中分离纯化得到海藻糖；

和/或，利用所述酵母细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖。

4.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，其特征在于，所述酵母细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖包括如下步骤：

S21、在所述酵母细胞中加入质量百分比浓度为20％～45％的低聚麦芽糖或麦芽糖，在温度20～80℃，pH3～8条件下振荡或搅拌进行转化；

S22、对转化液进行菌液分离，得到不含酵母细胞的转化液与解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞，从转化液中分离纯化得到海藻糖；

S23、步骤S22得到的所述解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞可重复进行步骤S21、S22。

5.如权利要求3或4所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，其特征在于，步骤S1中，所述菌液分离前还包括在发酵结束后加入糖化酶反应，再加入酿酒酵母发酵分解葡萄糖的步骤；步骤S22中，所述菌液分离前还可以包括在所述转化液中加入糖化酶反应，再加入酿酒酵母发酵分解葡萄糖的步骤。

6.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，其特征在于，

步骤S1中，所述培养基中的碳源为低聚麦芽糖、麦芽糖中的一种或两种和葡萄糖的混合，所述碳源用量为70～300克/升，其中葡萄糖用量占碳源总用量的6.5％～28.5％；所述培养基的氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种。

7.一种如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，其特征在于，所述方法还可以包括如下步骤：

A1、将解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCCNO.11367菌株培养于含高浓度葡萄糖、氮源、无机盐以及水的发酵培养基中，在pH值2.0～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌培养发酵，发酵结束后菌液分离，上清为含赤藓糖醇的溶液，沉淀为解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞；

A2、从所述含赤藓糖醇的溶液中纯化分离得到赤藓糖醇；

和/或，利用所述酵母细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖。

8.如权利要求7所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，其特征在于，所述酵母细胞转化低聚麦芽糖或者麦芽糖合成海藻糖包括如下步骤：

A21、在所述酵母细胞中加入质量百分比浓度为20％～45％的低聚麦芽糖或麦芽糖，在温度20～80℃，pH3～8条件下振荡或搅拌进行转化；

A22、对转化液进行菌液分离，得到不含酵母细胞的转化液与解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞，从转化液中分离纯化得到海藻糖；

A23、步骤A22得到的所述解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11367酵母细胞可重复进行步骤A21、A22。

9.如权利要求8所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，其特征在于，步骤A22中，所述菌液分离前还包括在发酵液中加入糖化酶反应，再加入酿酒酵母发酵分解葡萄糖的步骤。

10.如权利要求7所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成海藻糖的方法，其特征在于，步骤A1中，所述高浓度碳源为葡萄糖，含量为200～300克/升；所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种。