CN105349583A - 一种酶法制备(r)-邻氯扁桃酸的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种酶法制备医药中间体(R)-邻氯扁桃酸的方法，利用基因工程和生物发酵的方法获得大量表达有腈水解酶的E.coli菌体，该菌体通过水解邻氯扁桃腈消旋体定向生产(R)-邻氯扁桃酸。该方法原料价格低廉，工艺简单，反应条件温和，能耗少，反应步骤少，反应中无传统的有毒试剂的参与，绿色无污染，制备的(R)-邻氯扁桃酸纯度和ee值均达到98％以上，达到了药物中间体的质量要求。

Description

一种酶法制备(R)-邻氯扁桃酸的方法及应用
技术领域
本申请属于生物化学或药物化学领域，具体涉及一种医药中间体(R)-邻氯扁桃酸的制备方法。
背景技术
(R)-邻氯扁桃酸为白色结晶性粉末，化学式为C8H7ClO3，结构式为
分子量为186.59，熔点为86～92℃，是一种重要的医药中间体，是用于合成药物氯吡格雷的原料。氯吡格雷是一种血小板聚集抑制剂，临床上广泛应用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心肌梗塞、中风、动脉硬化等心脑血管疾病，与其它血小板抑制剂相比，具有作用强、耐受性好和副作用小等优点。氯吡格雷于1998年在美国和英国上市，2001年8月在中国上市，目前是市场占有率最高的抗血栓药物。
研究表明，(S)-氯吡格雷显示出的血小板凝聚抑制活性，远大于(R)-氯吡格雷，所以氯吡格雷的有效成分是(S)-氯吡格雷，只有合成单-(S)构型的氯吡格雷才能作为药物进行销售。采用手性(R)-邻氯扁桃酸为原料进行氯吡格雷的生产可获得单一构型的(S)-氯吡格雷，无需再对氯吡格雷进行拆分。因此，随着氯吡格雷市场的扩大，(R)-邻氯扁桃酸的市场需求也会日益扩大。
目前的制备方法较复杂，成本高，且得到的(R)-邻氯扁桃酸纯度较低，不能直接满足制药中间体的要去。
发明内容
本申请提供了一种适合工业化生产的(R)-邻氯扁桃酸的酶法制备方法，该方法原料价格低廉，所得产物纯度高，工艺简单，反应条件温和。
为实现本申请的目的，提供了如下技术方案：
一种酶法制备(R)-邻氯扁桃酸的方法，该方法包括如下步骤：
(1)通过基因工程的方法构建能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种；
(2)将步骤(1)获得的能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种通过发酵扩增培养，通过离心收集静息细胞；
(3)将收集的静息细胞、作为底物的5～40mmol/L的邻氯扁桃腈消旋体以及助溶剂加入pH＝7.0～9.0的缓冲液中，形成反应体系，在25～50℃的温度下反应将底物转化成(R)-邻氯扁桃酸；
(4)反应完后调节反应液至pH＝1～3，再用有机溶剂萃取出水相中的(R)-邻氯扁桃酸，分离出有机溶剂后得到(R)-邻氯扁桃酸的粗品。
优选地，所述方法还包括步骤：
(5)再通过进一步纯化获得(R)-邻氯扁桃酸晶体。所述步骤(5)中的进一步纯化是指，向步骤(4)中的(R)-邻氯扁桃酸粗品中加入的甲苯，加热溶解后再冷却，析出(R)-邻氯扁桃酸晶体，析出的晶体通过抽滤、干燥即可得到(R)-邻氯扁桃酸晶体。
优选地，步骤(1)所述的腈水解酶是由以下基因表达：粪产碱杆菌来源的ZJUTB10，洋葱伯克菌属的ECU0401，LabrenziaAggregate来源的LaN，Agrobacteriumradiobacter来源的ArN2，Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000a来源的PsN1，Variovoraxparadoxus来源的VpN。
上述优选基因具有较高的立体选择性和底物耐受性。其中，ZJUTB10、ECU0401与LaN三种基因表达的腈水解酶对底物的立体选择性好，底物耐受性强，酶催化活性高。
进一步优选地，步骤(1)所述的腈水解酶是由以下基因表达：粪产碱杆菌来源的ZJUTB10，洋葱伯克菌属的ECU0401，LabrenziaAggregate来源的La。
进一步优选地，步骤(1)所述的腈水解酶是由以下基因表达：Agrobacteriumradiobacter来源的ArN2，Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000a来源的PsN1，Variovoraxparadoxus来源的VpN。
本申请的技术方案，将腈水解酶通过基因工程的方法与不同的荧光蛋白融合，可以实现这些腈水解酶基因的高可溶性表达，尤其是对于难以得到有效可溶性表达的ArN2，PSN1，VPN三种腈水解酶基因所表达的腈水解酶。本申请技术方案中，将腈水解酶通过基因工程的方法与不同的荧光蛋白融合，不仅能够通过荧光蛋白的荧光特性更直观快速地观察腈水解酶是否成功表达；还能通过荧光蛋白促进腈水解酶的可溶性表达、增加腈水解酶蛋白正确折叠的比例；还能通过荧光蛋白使腈水解酶蛋白结合于细胞外膜上，起到固定化酶蛋白质的作用，利于下游酶反应过程。本申请技术方案能够利用荧光蛋白的荧光强度表征腈水解酶酶的活性强弱，即通过荧光蛋白的荧光强度变化来表征反应进程中的腈水解酶的活性变化。
优选地，所述腈水解酶可通过基因工程的方法与荧光蛋白融合。进一步优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白sfGFP、黄素荧光蛋白EcFb、红色荧光蛋白mCherry、冰核形成蛋白。
优选地，步骤(1)构建能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种的步骤中可采用无酶克隆方法。所述无酶克隆方法，即通过序列同源性进行同源重组制备重组DNA的方法(AschematicforproductionofrecombinantDNAthroughhomologousrecombinationinE.coli)，其原理如图1所示。
优选地，步骤(2)发酵可采用摇瓶发酵法或发酵罐发酵法。
优选地，步骤(2)发酵所用的培养基的组分及含量如下：SOB培养基(SuperOptimalBroth)，每升培养基，在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨20g、酵母提取物5g、NaCl0.5g，摇动容器使溶质完全溶解，加10ml250mmol/LKCl溶液(将1.86gKCl用100ml去离子水溶解即配成250mmol/lKCl溶液)，用5mol/LKOH调pH值至7.0，用去离子水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌30min；该溶液在使用前，加入5ml灭菌的2MMgCl2溶液。
优选地，步骤(3)的反应体系中，静息细胞的浓度为4g/L～60g/L。进一步优选地，步骤(3)的反应体系中，静息细胞的浓度下限选自4g/L、6g/L、10g/L，上限选自30g/L、40g/L、50g/L、60g/L。更进一步优选地，步骤(3)的反应体系中，静息细胞的浓度为10g/L～40g/L。
优选地，所述步骤(3)的缓冲液为KH2PO4/K2HPO4缓冲液、NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液或者三羟甲基氨基甲烷-HCl(简写为Tris-HCl)缓冲液。
优选地，步骤(3)的反应体系中，反应的pH为7.0～9.0。进一步优选地，步骤(3)的反应体系中，反应的pH为7.5～8.5。
优选地，在反应过程中采用1～5mol/L的NaOH调节pH值。
优选地，步骤(3)中反应的温度为25～50℃之间。进一步优选地，步骤(3)中反应的温度为30℃。
优选地，步骤(3)中助溶剂为选自乙醇、甲醇、正己烷、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、正己醇、正戊醇、正辛醇等有机溶剂中的一种或者几种。
优选地，步骤(3)中助溶剂添加的量为0.5％～10％(v/v)。进一步优选地，所述步骤(3)中助溶剂添加的量为1％～5％(v/v)。
优选地，步骤(3)中静息细胞和助溶剂分批加入。
优选地，步骤(4)中稀盐酸的浓度为1～3mol/L。
优选地，所述步骤(4)的反应完后用稀盐酸调节反应液至pH＝1～3。
优选地，所述步骤(4)中分离出有机溶剂的方法为旋转蒸发。
根据本申请的另一个方面，提供了腈水解酶在(R)-邻氯扁桃酸的制备中的用途，所述的腈水解酶由以下基因中的一种表达：粪产碱杆菌来源的ZJUTB10，洋葱伯克菌属的ECU0401，LabrenziaAggregate来源的LaN，Agrobacteriumradiobacter来源的ArN2，Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000a来源的PsN1，Variovoraxparadoxus来源的VpN。
优选地，提供了所述腈水解酶与荧光蛋白融合后在(R)-邻氯扁桃酸的制备中的用途。进一步优选地，所述所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白sfGFP、黄素荧光蛋白EcFb、红色荧光蛋白mCherry、冰核形成蛋白。
本申请提供了一种适合工业化生产的(R)-邻氯扁桃酸的酶法制备方法，该方法以(R)-邻氯扁桃腈为起始原料，通过腈水解酶的生物催化，于25℃-50℃，pH7.0～pH9.0的条件下，产生(R)-邻氯扁桃酸，该方法原料价格低廉，工艺简单，反应条件温和，能耗少，反应步骤少，反应中无传统的有毒试剂的参与，绿色无污染，所得产物(R)-邻氯扁桃酸纯度和ee值均达到98％以上，收率30％～80％，达到了药物中间体的质量要求。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的方法，所得产物(R)-邻氯扁桃酸纯度和e.e.值均达到98％以上，达到了药物中间体的质量要求。
2)优选了6种腈水解酶基因，其中ZJUTB10、ECU0401与LaN三种基因表达的腈水解酶对底物的立体选择性好，底物耐受性强，酶催化活性高；ArN2，PSN1，VPN三种基因与荧光蛋白融合可以实现这些基因的高可溶性表达，反应效果显著提升。
3)融合这些荧光蛋白的目的在于：(a)更直观快速地观察腈水解酶是否成功表达；(b)促使腈水解酶的可溶性表达，即增加腈水解酶蛋白正确折叠的比例；(c)使酶蛋白结合于细胞外膜上，起到固定化酶蛋白质的作用，利于下游酶反应过程；(d)利用荧光蛋白的荧光强度表征腈水解酶酶的活性强弱，即通过荧光蛋白的荧光强度变化来表征反应进程中的腈水解酶的活性变化。
4)本申请所提供的方法，原料价格低廉，工艺简单，易于操作，污染小。
附图说明
图1无酶克隆的原理
图2腈水解酶的生物催化机制
图3荧光蛋白基因与腈水解酶基因重组原理图
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。
实施例1制备重组了腈水解酶基因的E.coli工程菌株
用基因工程的方法制备能表达腈水解酶的E.coli工程菌株：通过无酶克隆方法将腈水解酶基因与荧光蛋白基因重组，过程如图3所示，无酶克隆方法如图1所示。然后加入DH5α大肠杆菌感受态细胞，进行常规转化涂布平板，挑取单菌落进行PCR验证，将正确重组的菌落接种于小细菌瓶中并于37℃、200rpm的摇床上培养过夜。收集摇瓶中的菌体，用质粒小提试剂盒抽提得到重组质粒。将抽提的质粒转化于RosettaBlue(DE3)感受态细胞中，得到的单菌落，分别记为菌株1#～菌株6#，作为菌种进行发酵操作。
重组菌株中的腈水解酶基因和荧光蛋白基因见表1所示，其中菌株1#为不融合荧光蛋白基因的菌株；菌株2#～菌株6#为融合了荧光蛋白基因的菌株。
表1
实施例2制备SOB培养基
每升SOB培养基的组分含量及制备方法如下：在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨20g、酵母提取物5g、0.5g的NaCl，摇动容器使溶质完全溶解，加10ml的250mmol/L的KCl溶液(将1.86gKCl用100ml去离子水溶解即配成250mmol/lKCl溶液)，用5mol/LKOH调pH值至7.0，用去离子水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌30min。该溶液在使用前，加入5ml灭菌的2mol/L的MgCl2溶液，即为SOB培养基。
实施例3重组菌株摇瓶发酵培养
将实施例1得到的菌株1#接种到含有50mg/ml卡那霉素的SOB液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD600达到0.5时，移至30℃摇床过夜，待菌体生长至平台期后期时取出，4℃离心(6000rpm，5min)收集静息细胞，记为静息细胞1#，湿菌体质量达到4g/L。
菌株2#、菌株3#的发酵培养操作相同，得到的静息细胞分别记为静息细胞2#、静息细胞3#。静息细胞1#～静息细胞3#的湿菌体质量见表2所示。
表2
静息细胞编号 湿菌体质量浓度
静息细胞1# 4g/L
静息细胞2# 6g/L
静息细胞3# 10g/L
实施例4重组菌株发酵罐发酵培养
将实施例1得到的菌株1#接种到SOB液体培养基中，其中含有50mg/ml的卡那霉素；接种后于37℃、200rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD600达到0.9时，转接至含有2LSOB培养基的5L发酵罐中，接种比例为5％。反应前期发酵温度为37℃，后期产酶温度为25℃，搅拌转速为400rpm，通气比及罐压分别为2VVM(立方米/(立方米*分钟))和0.05MPa；发酵过程中每1小时取样监测菌体量并测定酶活力，待菌体量、酶活力均保持稳定时停止发酵，4℃离心(6000rpm，5min)收集静息细胞，记为静息细胞4#，湿菌体质量达到60g/L。
酶活的检测方法
腈水解酶的酶活单位：在邻氯扁桃腈的浓度为20mmol/L，30℃，pH＝8.0，220rpm的反应条件下，每分钟生成1微摩尔(R)-邻氯扁桃酸所需的酶量。
检测方法：在100ml的三角瓶中加入23.5ml的反应缓冲液，加入1.25ml含有100mg/ml的的菌悬液，以及终浓度20mM的邻氯扁桃腈，扁桃腈用0.25ml的甲醇溶解后再加入；将三角瓶放在30℃，220rpm的摇床上反应30min后用25毫升2mol/L盐酸终止反应，用高效液相色谱检测(R)-邻氯扁桃酸的含量。
静息细胞4#～静息细胞6#的湿菌体质量见表3所示，其中静息细胞5#和静息细胞6#的菌株分别为菌株5#和菌株6#，其余操作一致。
表3
静息细胞编号 湿菌体质量浓度
静息细胞4# 60g/L
静息细胞5# 50g/L
静息细胞6# 30g/L
实施例5制备(R)-邻氯扁桃酸
在100ml的三角瓶中加入23ml磷酸缓冲液(KH2PO4/K2HPO4缓冲液)pH在7.5～9)，加入25mg的菌体、邻氯扁桃腈以及助溶剂，在220rpm的摇床中反应，用薄层层析监测反应的终点。当底物反应完后加入2mol/L的盐酸调节pH至1～3之间即可；加入50毫升的乙酸乙酯剧烈摇晃后静置分层，收集上层的乙酸乙酯通过旋蒸得到(R)-邻氯扁桃酸浓缩液，乙酸乙酯可以回收利用。再向得到的(R)-邻氯扁桃酸浓缩液中加入等体积的甲苯，加热溶解后冷却可析出(R)-邻氯扁桃酸晶体，析出的晶体通过抽滤、干燥即可得到(R)-邻氯扁桃酸晶体。得到的(R)-邻氯扁桃酸晶体纯度达到98％，e.e.为98.6％，收率80％，已经能达到药物中间体的质量要求。反应条件见表4。
表4
注1：底物为邻氯扁桃腈消旋体。
实施例6
2L反应体系制备化合物(R)-邻氯扁桃酸：在5升的反应釜中加入2LpH值在7.5～9内的磷酸缓冲液(KH2PO4/K2HPO4缓冲液)，加入25g的菌体以及0.5％～5％的助溶剂，一次加入4g邻氯扁桃腈25～50℃、220rpm中的条件下反应2小时，用薄层层析法(TLC)监测反应的终点进展，当底物反应完后再补4g底物，依次重复，共加入146g底物并完全能反应完后，加人1/2体积2M盐酸调节反应的pH≤3。共用3L乙酸乙酯萃取3次，后静置分层，收集上层的乙酸乙酯，通过旋蒸得到(R)-邻氯扁桃酸浓缩液，乙酸乙酯可以回收利用，向(R)-邻氯扁桃酸浓缩液中加入等体积的甲苯，加热溶解后冷却可析出(R)-邻氯扁桃酸晶体，析出的晶体通过抽滤、干燥即可得到(R)-邻氯扁桃酸粗品80g，产品纯度可达98％，e.e.值达到98.9％，收率80％。
对比例1
试验操作与实施例4中的反应2#相同，区别在于其腈水解酶基因未融合荧光蛋白。得到的(R)-邻氯扁桃酸：灰色晶体，纯度81％，收率85％，e.e.＞99.7％。
通过比较本申请实施例4的反应2#得到的晶体纯度与对比例1得到的晶体纯度，可以看出，采用本申请的技术方案，可以获得纯度更高(≥97％)、色泽更好(白色结晶)的(R)-邻氯扁桃酸的纯品，可以直接作为药物中间体。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种酶法制备(R)-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)通过基因工程的方法构建能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种；
(2)将步骤(1)获得的能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种通过发酵扩增培养，通过离心收集静息细胞；
(3)将收集的静息细胞、作为底物的5～40mmol/L的邻氯扁桃腈消旋体以及助溶剂加入pH＝7.0～9.0的缓冲液中，形成反应体系，在25～50℃的温度下反应将底物转化成(R)-邻氯扁桃酸；
(4)反应完后调节反应液至pH＝1～3，再用有机溶剂萃取出水相中的(R)-邻氯扁桃酸，分离出有机溶剂后得到(R)-邻氯扁桃酸的粗品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
(5)再通过进一步纯化获得(R)-邻氯扁桃酸晶体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)所述的腈水解酶是由以下基因表达：粪产碱杆菌来源的ZJUTB10、洋葱伯克菌属的ECU0401、LabrenziaAggregate来源的LaN、Agrobacteriumradiobacter来源的ArN2、Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000a来源的PsN1、Variovoraxparadoxus来源的VpN。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶通过基因工程的方法与荧光蛋白融合。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白sfGFP、黄素荧光蛋白EcFb、红色荧光蛋白mCherry、冰核形成蛋白的荧光蛋白。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中构建能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种的步骤采用无酶克隆方法。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的反应体系中，静息细胞的浓度为4g/L～60g/L。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的缓冲液为KH2PO4/K2HPO4缓冲液、NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液或者三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液；
优选地，所述步骤(3)的反应体系中，反应的pH为7.5～8.5；
优选地，所述步骤(3)中反应的温度为25～50℃；进一步优选地，所述步骤(3)中反应的温度为30℃；
优选地，所述步骤(3)中助溶剂为选自乙醇、甲醇、正己烷、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、正己醇、正戊醇、正辛醇等有机溶剂中的一种或者几种；
优选地，所述步骤(3)中助溶剂添加的量为0.5％～10％(v/v)；进一步优选地，所述步骤(3)中助溶剂添加的量为1％～5％(v/v)。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的反应完后用稀盐酸调节反应液至pH＝1～3；优选地，所述步骤(4)中分离出有机溶剂的方法为旋转蒸发。
10.腈水解酶在(R)-邻氯扁桃酸的制备中的用途，所述腈水解酶由以下基因中的一种表达：粪产碱杆菌来源的ZJUTB10，洋葱伯克菌属的ECU0401，LabrenziaAggregate来源的LaN，Agrobacteriumradiobacter来源的ArN2，Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000a来源的PsN1，Variovoraxparadoxus来源的VpN。
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