CN116024150A - 一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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CN116024150A CN202211601379.2A CN202211601379A CN116024150A CN 116024150 A CN116024150 A CN 116024150A CN 202211601379 A CN202211601379 A CN 202211601379A CN 116024150 A CN116024150 A CN 116024150A
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谢能中
陈先锐
刁梦雪
李检秀
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Abstract

本发明公开了一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用，先筛选和鉴定影响大肠杆菌乙偶姻胁迫抗性的功能基因，利用基因组遗传改造手段引入抗逆因子以提高菌株对产物的耐受性，再通过优化重组质粒拷贝数提高乙偶姻合成途径关键基因的表达水平，获得高合成能力和高胁迫抗性的工程菌株；然后采用廉价原料发酵合成乙偶姻，并在适宜条件下高效转化生成四甲基吡嗪；最后使用脱色纯化后的发酵液转化得到了较高纯度的四甲基吡嗪。本发明工艺方法绿色环保，可生成高值化学品（R）‑乙偶姻和四甲基吡嗪，为将来规模化工业生产奠定了重要的理论和技术基础。

Description

一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种可提高乙偶姻耐受性的生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法，以及涉及该基因工程菌株在发酵生产乙偶姻的应用，并且涉及该乙偶姻发酵液合成生产四甲基吡嗪的应用。
背景技术
四甲基吡嗪(Tetramethylpyrazine，TTMP)又名川芎嗪，是传统中药植物川芎中的主要活性生物碱成分，具有治疗心脑血管等疾病的药理作用。乙偶姻(Acetoin，AC)化学品名为3-羟基-2-丁酮，是合成四甲基吡嗪的前体，广泛应用于食品、医药、化工、生物燃料等行业。随着社会的快速发展，人们对乙偶姻和四甲基吡嗪的需求也越来越多，但利用传统的植物提取法获得四甲基吡嗪具有含量较低、成本过高等弊端，使用化学法合成乙偶姻或四甲基吡嗪工艺复杂，对环境污染大。
随着合成生物学的迅速发展，在微生物细胞中构建乙偶姻的异源合成途径，成为提高乙偶姻产量的重要研究手段，而高产量高浓度的乙偶姻前体是提高四甲基吡嗪合成产率的重要因素。越来越多的微生物细胞被改造成细胞工厂，这些工程菌株经过发酵往往可转化生成多种目标产物，但生产过程中，微生物细胞往往受到各种不利因素的胁迫，以致其生长代谢能力受到严重影响或完全丧失，最终生产效率也会下降。因此提高微生物细胞的胁迫抗性对提高菌株发酵生成目标产物的产量是非常必要的。增强微生物耐受性的传统方式主要包括耐受性驯化和通过物理或化学方式诱变，但这些方式普遍存在很多缺点，如实验周期长、工作任务重、优良表型易丢失等。与传统方法相比，通过分子生物学技术引入或改造某些抗逆因子为更加直接且有效的方式。
目前，国内外对微生物耐受多种有机溶剂的研究均有报道。Yongbo等人发现过表达来源于植物乳杆菌的基因murA2可以提高大肠杆菌对一些有机溶剂如乙醇、正丁醇、异丁醇的耐受性，进而可以提高大肠杆菌KO11发酵产乙醇的水平。Kamthan等人将来源于食用真菌金针菇的C-5甾醇去饱和酶导入裂殖酵母中异源表达后，发现不仅可以增加菌株的耐热性，也提高了其在乙醇以及酸性溶液中的生长能力。Ayushi K等人对野生型大肠杆菌与耐受丁醇的大肠杆菌菌株的转录表达谱比较分析，发现野生型菌株中基因yibT和yghW的表达水平显著下调，最后通过敲除这两个基因，显著提高了菌株对丁醇的耐受能力。Foo等人发现MdlB基因是提高大肠杆菌对异戊烯醇耐受性的关键因子，然后通过将MdlB基因过表达，最终使菌株的耐受性得到提高，其发酵合成异戊烯醇的能力也提高了12％。Fisher等人比较了大肠杆菌Ac rB优良突变体和野生型大肠杆菌MG1655对正丁醇的耐受能力，发现突变体菌株的耐受性明显增强。由此可知，增强菌株对乙偶姻的耐受性对于提高菌株发酵合成乙偶姻能力是非常必要的，亦有助于提高后续产物四甲基吡嗪的合成产率。
发明内容
本发明在探究乙偶姻对大肠杆菌胁迫效应的基础上，提供了一种通过引入抗逆因子构建生产乙偶姻基因工程菌株，提高了该菌株发酵产乙偶姻的能力；同时本发明还提供了利用该菌发酵生产乙偶姻，进一步利用乙偶姻发酵液合成生产四甲基吡嗪的工艺，通过对乙偶姻发酵液进行脱色以及采用高温高压反应条件，最终得到了较高转化率及较为纯净的四甲基吡嗪转化液。
具体的，本发明提供的生产乙偶姻基因工程菌株，是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在大肠杆菌GXASR10基因组脂肪酸合成基因Yibt位点整合单拷贝的蛋白质延伸因子EF-Ts基因tsf，获得的工程菌株ΔGXASR10。
本发明所述大肠杆菌GXASR10为通过基因改造获得的生产乙偶姻的基因工程菌株。可采用本申请人在先申请的专利(例如：CN107129959A生产(R)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用、CN107177620A一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法)所记载的基因工程菌株。本发明优选采用多基因缺失的突变株E.coli MG1655ΔgldAΔfrdABCDΔackA-ptaΔpoxB。
本发明提供的生产乙偶姻基因工程菌株，还包括在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE，获得的工程菌株GXASR10/pTrc99a-budB-budA-noxE(48#)、ΔGXASR10/pTrc99a-budB-budA-noxE(Δ48#)。
本发明提供的生产乙偶姻基因工程菌株，还包括利用无缝克隆技术，将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE的复制子ori得到新的重组质粒，然后将该新的重组质粒在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达，获得的工程菌株R48#、RΔ48#。
另外，本发明还提供了上述生产乙偶姻基因工程菌株ΔGXASR10的构建方法，包括以下步骤：
S21、根据大肠杆菌GXASR10基因组上的Yibt位点的基因序列，设计合成基因片段N20；然后以pTarget骨架基因片段作为模板，与基因片段N20进行无缝克隆连接，构建pTarget-N20重组质粒；
S22、以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，分别扩增目的基因tsf、插入位点Yibt的上游同源臂及下游同源臂；同时将该目的基因tsf、插入位点Yibt的上游同源臂及下游同源臂进行拼接，获得打靶片段；然后将打靶片段电转入含有pCas质粒的大肠杆菌GXASR10中并进行PCR验证；
S23、使用测序成功的菌液进行进行pTarget-N20和pCas9质粒的丢失。
另外，本发明还提供了上述生产乙偶姻基因工程菌株R48#、RΔ48#的构建方法，其是利用无缝克隆技术，将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE的复制子ori得到新的重组质粒，然后将该新的重组质粒在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达得到的。其中，所述将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a-bud B-budA-noxE的复制子ori得到新的重组质粒，包括以下步骤：
S31、以质粒pRSFDuet为模板，RSF-F/R为引物PCR扩增其复制子RSF连带卡那基因；以RSF连带卡那基因片段为模板，使用含质粒pTrc99a-budB-budA-noxE上ori复制子两端同源序列的引物RSF-F1/R1进行PCR扩增，获得含有同源序列的高拷贝复制子RSF目的基因；
S32、以质粒pTrc99a-budB-budA-noxE为模板，设计引物pTrc99a(-ori)-F/R扩增该质粒不含ori及氨苄基因的骨架片段；
S33、将RSF连带卡那基因的目的片段与pTrc99a-budB-budA-noxE质粒骨架进行无缝克隆连接，获得新的重组质粒。
质粒是独立于宿主细胞染色体，在许多细菌、病原体、古细菌中都存在的环状DNA分子，质粒的拷贝数越高，随着质粒的不断复制，连接在质粒上的外源基因复制次数就越多，也就是外源基因表达获得的蛋白质就会越多。质粒是否可以在长时间生长过程中稳定表达外源基因取决于质粒的稳定性，因为重组质粒的丢失会使重组菌生产力显著降低，重组质粒的转化对微生物细胞的的生长代谢影响越小，质粒就越容易长期稳定在菌体中表达外源蛋白。
RSF连带卡那基因的目的片段是指RSF连着Kan基因的一整个片段。因为在质粒pRSFDu et上，RSF基因和Kan基因挨着，把Kan基因也一起扩增下来，方便后续使用抗生素来筛选。
另外，本发明还提供了上述基因工程菌株在生产乙偶姻的应用，主要是利用葡萄糖、木薯粉和/或棉籽粉水解液为初始碳源，发酵合成乙偶姻。
另外，本发明还提供了上述基因工程菌株在合成四甲基吡嗪的应用，包括以下步骤：
S51、取上述乙偶姻发酵液进行离心处理，取上清液，测定乙偶姻含量；
S52、按照乙偶姻和磷酸氢二铵的摩尔浓度比为2-3：5，将磷酸氢二铵加入上清液；
S53、在转化反应温度为150-180℃、转化反应转速为350-450rpm、压力为2-10Mpa及起始pH值7-8的条件下，转化反应2-4h，得到四甲基吡嗪。
作为上述基因工程菌株在合成四甲基吡嗪的应用的进一步说明，还包括对乙偶姻发酵液上清液的脱色处理，所述脱色处理包括以下步骤：
S61、按照乙偶姻发酵液上清液和壳聚糖溶液的体积比为20:0-2，添加壳聚糖溶液对上清液进行絮凝，然后通过滤纸过滤除去絮凝物；
S62、向乙偶姻发酵液上清液添加0.5-1g/ml的活性炭粉末，控制水浴摇床转速为100-200rpm、水浴脱色时间为30-50min、水浴脱色温度为60-80℃及乙偶姻发酵液脱色前pH为3.5-4.5，对絮凝处理的上清液进行脱色。
本发明达到的有益效果如下：
1、本发明利用双质粒系统的CRISPR/Cas9基因编辑技术，在大肠杆菌基因组上敲除脂肪酸合成基因(Yibt)，同时引入tsf抗逆因子，大大提高了工程菌株的乙偶姻耐受性。
2、本发明使用无缝克隆技术将pRSFDuet质粒中的高拷贝复制子RSF替换了pTrc99a质粒中的ori复制子，有效提高了菌株发酵合成乙偶姻的水平。
3、目前生物法制备乙偶姻和四甲基吡嗪的报道大多以高价的酵母粉、蛋白胨和高纯糖为原料，本发明利用廉价非粮木薯粉及棉籽粉作为发酵底物，节约了生产成本，为乙偶姻及四甲基吡嗪的高效、低成本产业化生产奠定了基础。
4、由于木薯粉-棉籽粉水解液中杂质较多导致乙偶姻发酵液颜色较深，且反应釜转化过程温度及压力较高，会导致反应生成的四甲基吡嗪转化液颜色进一步加深。本发明采用医用活性炭粉末和壳聚糖对乙偶姻发酵液进行了脱色处理，获得了较为纯净的乙偶姻发酵液，进一步转化生成的四甲基吡嗪产物中杂质明显减少。
附图说明
图1为本发明实施2关于乙偶姻胁迫作用下的菌株生长曲线图。
图2为本发明应用CRISPR/Cas9双质粒系统的工作原理图。
图3为本发明实施例3中重组质粒pTarget-N20构建过程的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图。图中，M：GenStar D5000 DNA Ladder，1-9：pTarget质粒骨架(2098bp)。
图4为本发明实施例3中目的片段获得过程的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图。图中，M：GenStar D2000ⅡDNA Ladder，1-4：Yibt上游同源臂(525bp)，5-7：tsf基因(852bp)，8：Yibt下游同源臂(520bp)。
图5为本发明应用Overlap制备打靶片段的原理示意图。
图6为本发明实施例3中目的片段电转入受体细胞过程的菌液PCR验证结果图。图中，M：GenStar D5000 DNA Ladder，2、3、5：打靶片段(1897bp)。
图7为本发明实施例6中引物RSF-F/R进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳结果图。图中，M:GenStar D5000 DNA Ladder，1-4：RSF基因片段(1673bp)。
图8为本发明实施例6中引物RSF-F1/R1进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳结果图。图中，M:GenStar D5000 DNA Ladder，1-4：RSF基因片段(1737bp)。
图9为本发明实施例6中引物pTrc99a(-ori)-F/R进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳结果图。图中，M：GenStar 1kb plus DNA Ladder，1-6：pTrc99a-budB-budA-noxE质粒骨架(7439bp)。
图10为本发明实施例6中菌液PCR验证结果图。图中，M:GenStar D5000 DNALadder，1-4：RSF基因片段(1737bp)。
图11为本发明实施例7基因工程菌株48#和Δ48#摇瓶发酵生产乙偶姻的发酵曲线图。
图中，A：发酵过程的耗糖曲线；B：发酵过程中乙偶姻浓度变化；C：发酵过程丁二醇浓度变化；D：整个发酵过程中发酵液中的菌体密度变化情况。
图12为本发明实施例8基因工程菌株48#和Δ48#发酵罐发酵生产乙偶姻的发酵曲线图。
图中，A：发酵液中残糖浓度变化趋势；B：发酵液中菌体密度变化情况；C：发酵液中乙偶姻的浓度变化；D：发酵液中的丁二醇浓度变化情况。
图13为本发明实施例9基因工程菌株48#、Δ48#、R48#、RΔ48#初始发酵培养基补料摇瓶发酵生产乙偶姻的发酵曲线图。图中，A：发酵过程中乙偶姻浓度变化趋势；B：发酵液中残糖消耗情况；C：发酵液中菌体增长趋势；D：发酵液中副产物丁二醇浓度变化情况。
图14为本发明实施例9基因工程菌株48#、Δ48#、R48#、RΔ48#初始发酵培养基非补料摇瓶发酵生产乙偶姻的发酵曲线图。图中，A：发酵过程中乙偶姻浓度变化趋势；B：发酵液中残糖消耗情况；C：发酵液中菌体增长趋势；D：代表发酵液中副产物丁二醇浓度变化情况。
图15为本发明实施例10基因工程菌株48#、Δ48#、R48#、RΔ48#木薯粉-棉籽粉水解液摇瓶发酵生产乙偶姻的发酵曲线图。图中，A：发酵液中菌体增长趋势；B：发酵液中残糖消耗情况；C：发酵过程中乙偶姻浓度变化趋势；D：代表发酵液中副产物丁二醇浓度变化情况。
图16为本发明实施例11基因工程菌株RΔ48#发酵罐分批补料生产乙偶姻的发酵曲线图。
图17为本发明实施例12活性炭添加量对脱色效果的影响结果图。
图18为本发明实施例12水浴摇床转速对脱色的影响结果图。
图19为本发明实施例12水浴时间对脱色的影响结果图。
图20为本发明实施例12水浴温度对脱色的影响结果图。
图21为本发明实施例12乙偶姻发酵液脱色前pH对脱色的影响结果图。
图22为本发明实施例12壳聚糖添加对脱色的影响结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本实施例所涉及的培养基、反应溶液及其制备方法如下：
(1)LB培养基：10g/L的蛋白胨，5g/L的酵母抽提物，10g/L的氯化钠，固体培养基需另加2％的琼脂粉，使用高压灭菌锅121℃处理20min，待使用时在无菌环境下添加相应浓度的抗生素，放置4℃冰箱保存备用；固体培养基降温至60℃左右时加入相应浓度的抗生素，混合摇匀避免出现气泡，缓慢倒入培养皿制作固体培养基，晾干凝固后放置4℃冰箱保存备用。
(2)初始发酵培养基：100g/L的葡萄糖，10g/L的蛋白胨，7g/L的酵母粉，0.5g/L的氯化钠，0.2g/L的硫酸镁，4mmol/L的甜菜碱，0.1g/L的维生素B1，调节体系pH至7.0。
(3)木薯粉-棉籽粉水解液
水解过程分为以下三个阶段：
第一阶段预处理：使用电子天平称量木薯粉56.4g，棉籽粉20.1g，全部加入到500mL锥形瓶中，再添加300mL自来水，搅拌均匀后调节体系pH为6.3，再加入液化酶10mL，在灭菌锅中121℃灭菌预处理15min，使颗粒结构在高温下被破坏便于水解；
第二阶段液化：将灭菌锅处理后的木薯粉和棉籽粉混合液的pH调节至6.3，使用量筒量取15mL液化酶，加入混合液中，之后在温度为95℃水浴摇床中以160rpm震荡1h，使其充分液化；
第三阶段水解与糖化：将其从95℃水浴摇床中拿出，放置凉水中降温，再用20％(v/v)的H2SO4溶液调节瓶内体系pH到4.3，随后加入25mL糖化酶，同时每瓶液体需添加0.6g酸性蛋白酶，在55℃，160rpm的水浴摇床中糖化24h。
以上三个阶段完成以后，调节体系pH为7.0左右，使用500mL离心瓶，6000rpm离心5min收集上清液，将上清液在灭菌锅中115℃处理20min后作为后续菌株发酵所用的底物。
(4)制作大肠杆菌感受态所需溶液配制
A液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)：称取4.07g的MgCl2·6H2O和0.74g的CaCl2·2H2O，加入超纯水搅拌使之溶解，使用250mL容量瓶定容，在高压灭菌锅中121℃处理30min，灭菌完成后，密封放置在4℃冰箱保存。
B液(100mmol/L CaCl2，15％甘油)：称取0.37g的CaCl2·2H2O和3.75g的甘油共同溶于25mL的超纯水中，经0.22μm滤膜过滤达到除菌目的，密封放置在4℃冰箱保存。
上述培养基、反应溶液制备所使用的及下述具体实施例过程所使用的原料，未特别说明的，均为商业化产品，可直接通过市场上采购获得。
实施例1：大肠杆菌GXASR10的制备
通过分析发现菌株E.coli MG1655发酵的副产物为2,3-丁二醇、丁二酸、乙酸，其合成途径的关键基因是gldA、frdABCD、ackA-pta和poxB。利用大肠杆菌λ噬菌体来源的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件的原理，先用两侧带有FRT位点的抗生素抗性基因取代上述目标基因，再通过诱导外源性温敏质粒表达FLP重组酶删除抗生素抗性基因达到敲除目标基因的目的。具体步骤如下：将pKD46质粒转化入宿主细胞，制备电转化感受态细胞；利用引物进行PCR构建打靶序列(含氯霉素抗性基因)，并将其直接转化入含pKD46的宿主细胞；氯霉素平板筛选发生同源重组的克隆；利用测序技术验证、挑选目标基因被氯霉素抗性基因取代的克隆，制备电转化感受态细胞；电转导入pCP20质粒删除氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因删除的克隆连续划线传代三次，制备甘油管-20℃保存。通过叠加敲除，可获得多基因缺失的突变株E.coli MG1655ΔgldAΔfrdABCDΔackA-ptaΔpoxB。
实施例2：乙偶姻对菌株生长的胁迫作用
使用LB培养基对大肠杆菌GXASR10进行乙偶姻耐受实验：本实验过程设置两个乙偶姻浓度：20g/L和40g/L，另设一组空白对照，每个浓度设置三个重复组。首先挑取大肠杆菌GXASR10的单克隆于5mL直型瓶中活化8-12h，再以1％转接量转接至250mL锥形瓶，装液量为50mL，在菌体培养4h后加入一定量的乙偶姻。随后定点取样1mL，稀释合适的倍数后使用可见光-紫外分光光度计检测菌体密度，制作生长曲线。
结果如图1所示，在没有乙偶姻胁迫时，菌株GXASR10在8h达到最大OD600为4.0；在培养基中添加了20g/L乙偶姻后菌体生长明显受到抑制，菌体生长速度减慢，10h的OD600值最高仅为3.16；在培养基中添加40g/L乙偶姻后菌体生长受到严重胁迫，2h后菌体OD600值就开始下降。说明乙偶姻对大肠杆菌具有明显的胁迫作用，且乙偶姻浓度越高，对菌株生长的胁迫作用越强。
实施例3：工程菌株ΔGXASR10的构建
本实施例，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除工程菌株GXASR10基因组的脂肪酸合成基因Yibt，同时在该脂肪酸合成基因Yibt位点上插入单拷贝蛋白质延伸因子EF-Ts基因tsf，可获得工程菌株ΔGXASR10。所述Yibt核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，tsf核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本实施所使用到的引物如表1所示。
表1本实施例所使用的引物
Figure BDA0003995341770000071
Figure BDA0003995341770000081
上述CRISPR/Cas9双质粒系统的工作原理如图2所示，是crRNA(CRISPR-derivedRNA)经碱基互补配对和tracrRNA(trans-acti-vating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，核酸酶Cas9蛋白由此复合物引导，于crRNA引导的序列靶位点处进行剪切双链DNA，达到敲除或整合基因的目的。本实施例工程菌株ΔGXASR10的构建具体包括以下步骤：
一、质粒pTarget-N20的构建
1、N20的设计。本实施例中基因插入位置是菌株GXASR10基因组上的Yibt位点，在NCBI官网上查找并下载目标位点Yibt的基因序列，根据此基因序列于在线网站(http://crispr.tefor.net/)设计N20，从系统给出的多个N20中，选择得分最高的一个N20序列：ACGGCTTTATCGATAAGAAG。然后在N20基因序列两边分别加上pTarget质粒上N20注释位点两端的同源序列设计长度为59bp的正反引物，同源序列长度约20-30bp，由于N20序列较短，故可将其设计进引物中合成，以便在后续过程中N20与pTarget载体通过无缝克隆连接。
2、N20的退火连接。合成含同源序列及N20的引物后，将其于PCR仪中退火连接可得到含有同源序列及N20的基因片段。连接体系与程序见表2。
表2PCR扩增体系及程序
Figure BDA0003995341770000082
3、pTarget载体骨架的获得。以pTarget-tdcC质粒(该质粒是CRISPR双质粒系统中固有质粒，质粒中包含N20注释位点，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)作为模板，设计引物对该质粒除N20注释位点以外的基因序列进行PCR扩增，PCR反应体系与程序见表3，PCR反应程序如表4所示，其中变性、退火、延伸三个步骤设置3、4个循环。
表3PCR扩增体系
Figure BDA0003995341770000091
表4PCR反应程序
Figure BDA0003995341770000092
PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳(结果如图3所示，扩增条带的大小与已知目的基因2098bp相符)，并回收纯化目的基因。
4、构建重组质粒。将上述N20与胶回收所得的pTarget骨架片段进行无缝克隆连接，反应体系如表5所示。加好反应体系后使用PCR仪50℃保温50min，即可使用。
表5无缝克隆反应体系
Figure BDA0003995341770000093
5、制备大肠杆菌DH5α感受态，然后将重组质粒在大肠杆菌中进行转化。本实施例大肠杆菌感受态制备及转化过程为常规技术手段，在此不作详细说明。
6、菌液PCR验证。从平板上挑取5-10个转化的大肠杆菌单菌落到含相应抗性的LB液体培养基中养至浑浊，取1-2μL进行菌液PCR。菌液PCR验证体系如表6所示。PCR反应完成后经琼脂糖凝胶电泳，观察并分析电泳结果。
表6PCR扩增体系
Figure BDA0003995341770000094
7、质粒的提取。将验证正确的菌液转接于LB液体培养基中活化8-10h后，即可使用1-5mL菌液提取质粒。本实施例采用北京天根质粒小提试剂盒提取质粒，提取过程为常规技术手段，在此不作详细说明。待获取重组质粒pTarget-N20后将该质粒送去测序公司(擎科生物)测序，将测序成功的重组质粒置于-20℃冰箱保存备用。重组质粒pTarget-N20在后续步骤中可引导cas蛋白在特定位置(yibt基因)完成剪切。
二、目的片段的获得
1、提取大肠杆菌MG1655基因组DNA。本实施例大肠杆菌MG1655基因组DNA提取过程为常规技术手段，在此不作详细说明。
2、PCR扩增目的片段。以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，分别扩增目的基因tsf、插入位点Yibt上游同源臂以及插入位点Yibt下游同源臂(500bp左右的同源序列)，PCR扩增体系及扩增程序参考表1-3。琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，扩增片段的电泳条带与目的基因片段长度相符，表明目的基因扩增成功，分别通过切胶回收可以获得三个基因片段，再使用重叠延伸PCR进行三片段连接即得打靶片段。
3、胶回收目的片段。胶回收方法参照步骤“3、pTarget载体骨架的获得”。
三、Overlap制备打靶片段
通过overlapPCR方法(原理示意见图5)，将上述胶回收得到的目的基因片段及上下游同源臂进行拼接，获得打靶片段。具体过程方法参照步骤“二、目的片段的获得”。
四、目的片段电转入受体细胞
1、电转感受态的制备。在制备电转感受态之前，将质粒pCas预先转化菌株GXASR10，再将含有pCas质粒的GXASR10制备成电转感受态。
2、电转化。具体制备过程如下：(1)取电转感受态置于冰中自然融化；(2)吸取200ng左右的打靶片段加入已融化的感受态中，使用移液枪轻轻吹打，将其移至2mm电转杯中；(3)电转仪条件设置参数2.5kV/5ms，电击后立即吸取50℃预热的无抗LB液体培养基1mL加入点转杯中，再将点转杯中的菌液全部转入无菌离心管中；(4)在220rpm，37℃的摇床中培养40-50min；(5)取复苏后的菌液涂至加有卡那霉素和链霉素的固体平板上，在37℃恒温培养箱培养10-12h；(6)待平板上长出单菌落，挑取9个单菌落进行液体培养，使用引物yibt(up)-F/yibt(down)-R进行菌液PCR验证，结果如图6所示，打靶片段基因长度为1897bp，Lane 2、Lane 3和Lane 5三个条带对应Marker位置与打靶片段长度相符，结果表明2号，3号和5号菌中成功转入了目的片段。将2号、3号和5号菌液送去测序，根据测序结果，与已知三片段目的基因进行比对，结果是2号和3号基因组编辑位点左右有少许碱基突变，仅5号菌液测序结果比对完全正确。将5号菌继续进行下一步的pTarget-N20和pCas9质粒的丢失。
五、质粒丢失
1、质粒pTarget-N20丢失。具体过程如下：(1)使用测序成功的菌液，转接至同时加有卡那霉素及IPTG的LB液体培养基中培养，经IPTG诱导可使菌株中的pTarget-N20质粒丢失，在220rpm，30℃的恒温摇床中培养12-15h；(2)将前一步得到的菌液分别于卡那霉素和链霉素的LB固体平板上划线，在30℃恒温培养箱中倒置培养；(3)挑取卡那霉素平板上长出的单克隆，进行LB液体培养基加IPTG培养后，再次分别划线于卡那霉素和链霉素平板上，若加有链霉素的固体平板上无菌落生长，便可挑取卡那霉素固体平板上的单菌落继续进行质粒pCas9的丢失；如果加有链霉素的固体平板上有菌长出，则需将第(1)步的菌液再次转接到含IPTG以及卡那霉素的LB液体培养基中，使用培养后的菌液分别划线于加卡那霉素和链霉素的LB固体平板上，重新进行pTarget-N20质粒的消除，直至完全将pTarget-N20丢失。
2、pCas9质粒丢失。具体过程如下：(1)pCas9质粒是温敏型质粒，可以在42℃的培养条件下进行该质粒的丢失。将完全丢失pTarget-N20质粒的菌液转接至LB无抗液体培养基中，置于220rpm，42℃的摇床培养；(2)培养好的菌液分别于含卡那霉素和无抗的固体平板上划线，静置培养于30℃恒温培养箱中；(3)如果卡那霉素平板上未发现有菌长出，可挑取LB无抗平板上的单菌落于LB无抗液体培养基中于220rpm，37℃的摇床中培养，便得到成功丢失质粒的菌液；如果在LB含卡那霉素固体平板依然有菌株生长，那么应挑取LB无抗平板上的单菌落置于220rpm，42℃的摇床中培养，直至完全丢失pCas9质粒。
将测序成功并成功丢失质粒的菌株命名为ΔGXASR10(E.coli MG1655ΔgldAΔfrdAB CDΔackA-ptaΔpoxBΔYibt::tsf)。
实施例4：工程菌株GXASR10/pTrc99a-budB-budA-noxE(48#)的构建
将实施例2重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE(该重组质粒的制备详细见本申请人在先申请的专利(例如：CN107129959A生产(R)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用、CN107177620A一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法))电转导入实施例1的大肠杆菌GXASR10中，获得工程菌株GXASR10/pTrc99a-budB-budA-noxE(简称48#)。
实施例5：工程菌株ΔGXASR10/pTrc99a-budB-budA-noxE(Δ48#)的构建
将实施例2重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE电转导入实施例4的大肠杆菌ΔGXASR10中，获得工程菌株ΔGXASR10/pTrc99a-budB-budA-noxE(简称Δ48#)。
实施例6：工程菌株R48#和RΔ48#的构建
本实施例中，利用无缝克隆技术，将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE的复制子ori得到新的重组质粒，然后将该新的重组质粒在大肠杆菌GX ASR10、ΔGXASR10分别转化表达，可获得的工程菌株R48#、RΔ48#。本实施所使用到的引物如表7所示。
表7本实施例所使用的引物
Figure BDA0003995341770000121
本实施例工程菌株R48#和RΔ48#的构建具体包括以下步骤(其中，涉及PCR扩增体系，扩增程序，电泳方法及胶回收过程，以及感受态制备、转化、质粒提取等，参照“实施例4：工程菌株ΔGXASR10的构建”，在此不再详细累述)：
一、高拷贝复制子RSF的获得。以质粒pRSFDuet为模板，先使用不含同源序列的引物RSF-F/R进行PCR扩增该质粒上的RSF复制子连带卡那霉素抗性基因，琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。通过胶回收试剂盒可回收得到目的片段，然后再以RSF连带卡那霉素抗性基因为模板，使用含同源序列的引物RSF-F1/R1进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，结果显示电泳条带大小与已知目的基因的片段长度相吻合，说明片段扩增成功，如图8所示。经胶回收可得到含有同源序列的目的基因，便于后续进行融合表达构建重组质粒。
二、pTrc99a-budB-budA-noxE质粒骨架的克隆。以重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE为模板，设计引物pTrc99a(-ori)-F/R扩增该质粒除ori及氨苄抗性基因以外，琼脂糖凝胶电泳结果见图9，结果显示扩增条带的大小与已知目的基因片段长度(7439bp)大小相符，使用胶回收试剂盒回收得到目的片段，测定回收的基因片段浓度后，将其置于-20℃冰箱保存。
三、无缝克隆构建重组质粒。将回收得到的pTrc99a-budB-budA-noxE质粒骨架片段与RSF连带卡那霉素抗性基因片段通过无缝克隆试剂盒进行无缝连接，将无缝克隆连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态中，涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体平板，在37℃培养箱中静置培养8-12h左右，从长出的单菌落中，挑取4个进行液体培养，进行菌液PCR验证，验证结果如图10所示，再将验证正确的菌液进行测序，测序结果与目的基因序列比对正确，将测序正确的菌液使用甘油管保藏于-80℃，提取含有RSF复制子的pTrc99a-budB-budA-nox E质粒保存于-20℃冰箱备用。
四、转化。测序正确的质粒再分别将其转化进GXASR10和ΔGXASR10的感受态中，37℃恒温培养12h左右，固体平板上长出的单克隆即分别为含有高拷贝质粒pTrc99a-budB-budA-noxE的产乙偶姻菌株R48#与RΔ48#。
实施例7：基因工程菌株48#和Δ48#摇瓶发酵生产乙偶姻
使用木薯粉-棉籽粉水解液和初始发酵培养基分别对菌株48#和Δ48#进行摇瓶对比发酵，设置三个重复组，调节木薯粉-棉籽粉水解液和初始发酵培养基的pH为7.0，摇床转速设置为250rpm，温度为37℃，以10％接种量接种至装有50mL培养基的250mL三角瓶中。
发酵过程定点检测菌株OD600、发酵上清液中残余葡萄糖浓度、乙偶姻浓度和主要副产物2,3-丁二醇浓度四个指标，制作发酵曲线，对比考察两个菌株的发酵性能。其中，菌株OD600的测定方法为：发酵过程中定点取样，取一定量发酵液使用单蒸水稀释合适的倍数后，使用可见光-紫外分光光度计检测波长在600nm处的吸光度；发酵液中残糖的测定方法为：取适量发酵液12500rpm离心处理3min，使用超纯水将上清液稀释100倍后混匀，吸取25μL用于生物传感分析仪SBA-40D测定，记录发酵液样品中残余的葡萄糖浓度值；发酵液中乙偶姻和丁二醇采用气相色谱法测定。
结果如图11所示，菌株发酵过程中副产物丁二醇一直处于较低水平，在以木薯粉-棉籽粉水解液作为培养基时，丁二醇产量略高。使用初始发酵培养基进行发酵时，Δ48#和48#两者的OD600值随发酵时间变化的趋势基本一致，但是菌株Δ48#对底物葡萄糖的消耗更快，发酵合成的乙偶姻产量也较高为37.33g/L，相对于48#提高了20.92％。使用木薯粉-棉籽粉水解液进行发酵时，Δ48#对底物葡萄糖的消耗更快，发酵产生的乙偶姻产量也较高为44.25g/L，相对于48#菌株提高了18.94％。综上，说明菌株在木薯粉-棉籽粉水解液中发酵效果较好，同时说明在GXASR10基因组上脂肪酸合成基因Yibt位点整合单拷贝蛋白质延伸因子EF-Ts基因tsf提高了菌株对乙偶姻的耐受性以及发酵合成乙偶姻产量。
实施例8：基因工程菌株48#和Δ48#发酵罐分批补料生产乙偶姻
使用木薯粉-棉籽粉水解液分别对菌株48#和Δ48#进行3L发酵罐分批补料发酵，设置起始装液量1.5L，发酵过程中起始糖浓度控制在110g/L左右，补料策略是糖浓度从110g/L降到40g/L左右时，使用木薯粉-棉籽粉水解液的浓缩液对其补料至发酵液中葡萄糖浓度为100g/L左右，再降至60g/L左右时补料至糖浓度为100g/L左右。接种量为10％，发酵过程中使用氨水及50％(v/v)磷酸控制pH为6.5，转速设置为400rpm，一次补料之后调为500rpm，温度恒定为37℃，通气量1.5vvm。
参照实施例8，发酵过程定点取样检测发酵液OD600、残糖、乙偶姻及丁二醇浓度，制作发酵曲线，对比考察两个菌株的发酵性能。结果如图12所示，可以看出菌株Δ48#的发酵优势，Δ48#对底物的利用能力以及发酵合成乙偶姻的能力都比48#强，OD600值也始终高于菌株48#，在发酵进行到50h时，乙偶姻产量达到最高，其中Δ48#发酵产乙偶姻产量达到了74.61g/L，比48#发酵产乙偶姻能力提高了14.80％，说明在GXASR10基因组上脂肪酸合成基因Yibt位点整合单拷贝蛋白质延伸因子EF-Ts基因tsf提高了菌株对乙偶姻的耐受性以及发酵合成乙偶姻产量。
实施例9：菌株48#、Δ48#、R48#、RΔ48#初始发酵培养基摇瓶发酵生产乙偶姻
使用500mL摇瓶(装液量80mL)对48#、Δ48#、R48#、RΔ48#四个菌株同时进行发酵，使用初始发酵培养基同时进行补料和非补料的发酵，发酵接种量为10％(v/v)，每组实验设置三个重复组，发酵过程在转速为250rpm、温度为37℃的摇床中进行，待补料组发酵液中葡萄糖浓度降至40g/L时，使用1g/mL的葡萄糖水溶液对进行补料，葡萄糖水溶液需提前使用灭菌锅115℃处理20min。
参照实施例8，发酵过程定点取样检测发酵液OD600、残糖、乙偶姻及丁二醇浓度，制作发酵曲线，对比考察四个菌株的发酵性能。摇瓶补料发酵结果如图13所示，摇瓶非补料发酵结果如图14所示。从图中曲线可以看出，在四个菌株发酵过程中，补料和非补料情况下，乙偶姻产量最高和耗糖最多的菌株都是RΔ48#，且在非补料的情况下其乙偶姻产量更高。在菌株进行非补料发酵过程中，四个菌株发酵合成的副产物丁二醇浓度均处于较低水平，但RΔ48#在菌体生长、耗糖及合成乙偶姻方面均表现出良好优势，经过50h的发酵，其发酵液中乙偶姻浓度达到最高为49.88g/L，发酵结束时发酵液中的葡萄糖浓度仅为15.47g/L。通过对菌株RΔ48#和Δ48#的发酵情况对比，发现RΔ48#在发酵过程中生长代谢能力较强，其耗糖能力比Δ48#提高了14.09％，发酵产乙偶姻能力相比Δ48#提高了13.54％。菌株RΔ48#发酵产乙偶姻水平优于R48#可归功于对菌株进行的乙偶姻耐受性改造。
实施例10：菌株48#、Δ48#、R48#、RΔ48#木薯粉-棉籽粉水解液摇瓶发酵生产乙偶姻
根据实施例10中四个菌株在初始发酵培养基中的发酵结果得出在非补料时菌株发酵合成乙偶姻产量较高，故使用木薯粉-棉籽粉水解液为底物进行四个菌株48#、Δ48#、R48#、RΔ48#的非补料方式发酵。
参照实施例8，发酵过程定点取样检测发酵液OD600、残糖、乙偶姻及丁二醇浓度，制作发酵曲线，对比考察四个菌株的发酵性能。结果如图15所示，四个菌株发酵过程合成的丁二醇浓度基本处于较低水平，RΔ48#和R48#两个菌株在发酵中后期OD600升高较快，表明此时菌株生长代谢活力较强，其主要是由于其中适当增大拷贝数的重组质粒更利于菌株生长；而且RΔ48#和R48#两个菌株对葡萄糖的消耗也相对较快，但R48#菌株发酵合成的乙偶姻产量并不如RΔ48#高，此外菌株Δ48#的OD600值在整个发酵过程中始终低于其它三个菌株，但其发酵合成的乙偶姻浓度仅次于RΔ48#。四个菌株中，RΔ48#的发酵性能最好，在60h的发酵过程中合成了66.50g/L的乙偶姻，相比于Δ48#提高了14.36％。说明使用RSF复制子替换质粒pTrc99a-budB-budA-noxE上的ori复制子可以提高菌株发酵合成乙偶姻的能力。
实施例11：菌株RΔ48#发酵罐分批补料生产乙偶姻
根据摇瓶发酵结果可以得出菌株RΔ48#发酵合成乙偶姻能力较强，故使用菌株RΔ48#进行3L发酵罐分批补料发酵，以木薯粉-棉籽粉水解液作为发酵培养基，发酵过程进行两次补料。设置起始装液量1.5L，发酵过程中起始糖浓度控制在110g/L左右，补料策略是糖浓度从110g/L降到40g/L左右时，使用木薯粉-棉籽粉水解液浓缩液对其补料至100g/L左右，再次降至20g/L左右时再次补料至60g/L。发酵过程中pH控制在6.5，发酵转速设置为400rpm，温度控制为37℃，接种量为10％(v/v)。
参照实施例8，发酵过程定点取样检测发酵液OD600、残糖、乙偶姻及丁二醇浓度，制作发酵曲线。结果如图16所示，可以看出整个发酵过程耗糖彻底，发酵进行至40h基本停止，其中副产物丁二醇产量始终处于较低水平，在发酵40h时浓度达到最大仅为17.51g/L。菌株RΔ48#在发酵过程的前30h内，底物充足，菌体细胞代谢活力强，故OD600数值增长速率较快，在30h后其生长速率增长变缓，直至40h后发酵液中菌体密度开始下降。在发酵过程的前35h内，发酵液中乙偶姻浓度提高速率较快，此后缓慢增加，至40h浓度达到最大，此时底物也基本耗尽。使用3L发酵罐对菌株RΔ48#进行分批补料发酵，在40h内，发酵液中乙偶姻浓度最高可达为81.62g/L，相对于菌株Δ48#的3L发酵罐分批补料发酵的乙偶姻最高产量提高了9.4％，进一步说明了使用RSF复制子替换质粒pTrc99a-budB-budA-noxE上的ori复制子可以提高菌株发酵合成乙偶姻的能力。此外发酵液中残糖基本耗尽，有利于后续乙偶姻发酵液与磷酸氢二铵反应生成四甲基吡嗪的反应及后期产物纯化。
实施例12：乙偶姻发酵液的脱色纯化
取实施例12发酵得到的浓度为81.62g/L的乙偶姻发酵液，通过离心收集含有乙偶姻的上清液进行后续的脱色优化。整个脱色过程均使用100mL密闭蓝盖瓶。每次脱色完成后的乙偶姻发酵液均使用80mm布氏漏斗抽滤，气相色谱检测脱色前后乙偶姻的产量并计算乙偶姻保留率。脱色率是先利用可见光-紫外分光光度计对乙偶姻发酵液进行全波长扫描，结果显示乙偶姻发酵液在波长280nm处存在最大吸收峰，最终每个样品的脱色率根据乙偶姻发酵液脱色前后的吸光度计算得到：脱色率(％)＝(A1-A2)/A1，其中A1是原始溶液的吸光度，A2是脱色后溶液的吸光度。
一、优化乙偶姻发酵液脱色过程中活性炭粉末的添加量。设置100mL蓝盖瓶中加入固定的20mL乙偶姻发酵液，同时设置9个梯度对活性炭粉末添加量进行优化：0.2g，0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、2.0g、3.0g、4.0g、5.0g，每个梯度设置三个重复组。优化活性炭粉末添加量时选择不调整乙偶姻发酵液的pH，设置水浴摇床温度为50℃，水浴摇床转速为100rpm，脱色时间设为10min。
结果如图17所示，随着活性炭粉末添加量的增多，脱色率越来越高，但是乙偶姻保留率随活性炭粉末的增加先升高再持续降低。原因是活性炭对色素分子优先吸附，随活性炭增加，越来越多的色素分子被吸附直至平衡，故脱色率呈现递增趋势直至稳定于70％左右。在活性炭添加量为0.4g时，乙偶姻保留率最高达99.1％，但此时脱色率较低。活性炭粉末添加量在0.6-0.8g之间时，乙偶姻保留率均处于较高水平，在此区间随着活性炭粉末添加量逐渐增加，乙偶姻保留率变化不大，但脱色率提高较为显著，故在同时考虑乙偶姻保留率和脱色率的同时，选择在20mL发酵液中添加0.8g医用活性炭粉末，此时乙偶姻的保留率为92.77％，脱色率为52.87％。
二、优化乙偶姻发酵液脱色过程中的水浴摇床转速。设置0rpm、50rpm、100rpm、150rpm、200rpm五个梯度，每个梯度设置三个重复组。其中对于乙偶姻发酵液的pH选择不调整且使用最优的活性炭粉末添加量，水浴摇床温度设置为50℃，脱色时间设为10min。
结果如图18所示，可以看出在固定活性炭粉末添加量为0.8g的情况下，转速对乙偶姻保留率及脱色率影响并不显著。随着水浴摇床转速的提高，脱色率缓慢升高。在0-150rpm范围内，乙偶姻保留率呈现缓慢升高的趋势，原因是随着转速的升高，活性炭对色素分子吸附逐渐充分。水浴摇床转速达到200rpm时，乙偶姻保留率开始降低，故乙偶姻发酵液脱色过程中的水浴摇床转速为150rpm时最优，此时乙偶姻的保留率为94.79％，脱色率为57.23％。
三、优化乙偶姻发酵液脱色过程中脱色时间。设置10min、20min、30min、40min、50min五个梯度，每个梯度设置三个重复组。其中对于乙偶姻发酵液的pH选择不调整且使用最优的活性炭粉末添加量和脱色过程最优的水浴摇床转速，水浴摇床温度设置为50℃。
结果如图19所示，在固定活性炭添加量为0.8g和水浴摇床转速为150rpm的情况下，脱色时间对乙偶姻保留率及脱色率的影响。从图中可以看出，随着脱色过程中水浴时间的增加，脱色率先缓慢降低再逐渐升高，而乙偶姻保留率呈现出先缓慢升高再降低的趋势。在10-30min范围内，随着水浴时间的延长，活性炭对乙偶姻分子的吸附量逐渐减少，随着水浴脱色时间继续延长，活性炭对乙偶姻分子的吸附达到动态平衡，在水浴脱色时间为40min时，乙偶姻保留率达到最高，此时的脱色率也相对较高。故乙偶姻发酵液脱色过程中的水浴时间最优为40min，此时发酵液中乙偶姻的保留率为97.62％，脱色率为62.04％。
四、优化乙偶姻发酵液脱色过程中水浴摇床的温度。设置50℃、60℃、70℃、80℃、90℃五个梯度，每个梯度设置三个重复组。其中对于乙偶姻发酵液的pH选择不调整且使用最优的活性炭粉末添加量、脱色过程最优水浴摇床转速和脱色时间。
结果如图20所示，在固定活性炭粉末添加量为0.8g、水浴摇床转速为150rpm、水浴脱色时间为40min的情况下，脱色水浴温度对发酵液中乙偶姻保留率及发酵液脱色率的影响。从图中可以看出随着水浴脱色温度的逐渐升高，发酵液的脱色率呈现先缓慢降低再逐渐升高的趋势，而乙偶姻保留率呈现先升高后降低再稳定的趋势。在50-70℃的范围内，随着脱色过程水浴温度的升高，乙偶姻保留率逐渐提升，发酵液脱色率几乎处于稳定状态，温度上升至80℃时，乙偶姻保留率和发酵液脱色率都开始下降。故乙偶姻发酵液脱色过程中的水浴温度最优为70℃，此时乙偶姻的保留率为96.24％，发酵液脱色率为60.85％。
五、优化乙偶姻发酵液脱色前的pH。在发酵液中加入活性炭粉末进行脱色之前，分别使用磷酸或氨水调节其pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，同时设置三个重复组。脱色过程中使用最优的活性炭粉末添加量、最优水浴摇床转速、脱色时间和温度。
结果如图21所示，随着发酵液初始pH逐渐升高，脱色效果逐渐下降，乙偶姻保留率呈现先升高再下降的趋势。当发酵液的初始pH为3.0时，发酵液的脱色率最高，此时乙偶姻保留率却最低，而当发酵液的初始pH为4.0时存在最大的乙偶姻保留率，且此时的脱色率也处于较高水平，故乙偶姻发酵液脱色前的最佳pH为4.0，此时对应的乙偶姻保留率为95.77％，发酵液脱色率为74.00％。
六、优化乙偶姻发酵脱色过程中壳聚糖添加量。壳聚糖的前处理：分别称取0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g的壳聚糖溶于100mL含1％(v/v)的乙酸溶液中，在4℃冰箱中静置6h后方可使用，且需一周内使用完。将5个不同浓度的壳聚糖溶液分别吸取1mL添加进20mL乙偶姻发酵液中，充分振荡使其絮凝完全，通过滤纸过滤除去絮凝物，再使用过滤后的乙偶姻溶液进行活性炭粉末脱色，脱色前调节溶液pH为最优pH，且使用最优的活性炭粉末添加量、最优水浴摇床转速、脱色时间和温度，同时设置三个重复组。
结果如图22所示，可以发现随着添加的壳聚糖溶液浓度的增加，发酵液脱色率呈现先降低再平衡的趋势，乙偶姻保留率呈先出先升高再降低最后稳定的趋势。在添加的壳聚糖溶液浓度为5g/L时，体系中的壳聚糖对乙偶姻分子和色素分子的吸附能力都较强，故此时乙偶姻的保留率较低，而发酵液的脱色率较高。在壳聚糖浓度升高到10g/L时，壳聚糖对乙偶姻分子及色素分子的吸附能力都有所下降，故此时的乙偶姻保留率较高，发酵液脱色率略微下降。随着壳聚糖添加量继续增加，其对乙偶姻分子的吸附能力越来越强，对色素分子的吸附能力达到动态平衡。故综合考虑得出在20mL乙偶姻发酵液中添加1mL浓度为10g/L的壳聚糖溶液时最优，此时对应的乙偶姻保留率为92.18％，脱色率为81.62％。
实施例13：基因工程菌株在合成四甲基吡嗪的应用
取实施例12发酵得到的浓度为81.62g/L的乙偶姻发酵液进行离心处理，取含有乙偶姻的上清液。使用活性炭和壳聚糖对乙偶姻发酵液上清液进行脱色纯化，控制在20mL乙偶姻发酵液中添加活性炭粉末0.8g、水浴摇床转速150rpm、时间40min、温度70℃、初始pH值为4.0、10g/L的壳聚糖溶液添加1mL，得到乙偶姻保留率达92.18％、脱色率达81.62％，为后续生成较纯净的四甲基吡嗪提供保障。
取上述经脱色纯化的乙偶姻发酵液上清液，放入微型高温高压反应釜中，同时按照乙偶姻与磷酸氢二铵摩尔浓度比为2.5:5将磷酸氢二铵加入上清液，控制转化反应温度为180℃、转化反应转速为400rpm、压力为5Mpa及起始pH值7.5的条件下，转化反应3h，得到四甲基吡嗪产量为53.81g/L，转化率为85.30％。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1. 一种生产乙偶姻基因工程菌株, 其特征在于，包括：
（1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在大肠杆菌GXASR10基因组脂肪酸合成基因Yibt位点整合单拷贝的蛋白质延伸因子EF-Ts基因tsf，获得的工程菌株ΔGXASR10；
（2）在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE，获得的工程菌株GXASR10/pTrc99a-budB-budA-noxE（48#）、ΔGXASR10/pTrc99a-budB-budA-noxE（Δ48#）；
（3）利用无缝克隆技术，将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE的复制子ori得到新的重组质粒，然后将该新的重组质粒在大肠杆菌GXASR10、ΔGXASR10分别转化表达，获得的工程菌株R48#、RΔ48#。
2.如权利要求1所述生产乙偶姻基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述工程菌株ΔGXASR10的构建包括以下步骤：
S21、根据大肠杆菌GXASR10基因组上的Yibt位点的基因序列，设计合成基因片段N20；然后以pTarget骨架基因片段作为模板，与基因片段N20进行无缝克隆连接，构建pTarget-N20重组质粒；
S22、以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，分别扩增目的基因tsf、插入位点Yibt的上游同源臂及下游同源臂；同时将该目的基因tsf、插入位点Yibt的上游同源臂及下游同源臂进行拼接，获得打靶片段；然后将打靶片段电转入含有pCas质粒的大肠杆菌GXASR10中并进行PCR验证；
S23、使用测序成功的菌液进行进行pTarget-N20和pCas9质粒的丢失。
3.如权利要求1所述生产乙偶姻基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述将质粒pRSFDuet上的RSF复制子替换重组质粒pTrc99a-budB-budA-noxE的复制子ori得到新的重组质粒，包括以下步骤：
S31、以质粒pRSFDuet为模板，RSF-F/R为引物PCR扩增其复制子RSF连带卡那基因；以RSF连带卡那基因片段为模板，使用含质粒pTrc99a-budB-budA-noxE上ori复制子两端同源序列的引物RSF-F1/R1进行PCR扩增，获得含有同源序列的高拷贝复制子RSF目的基因；
S32、以质粒pTrc99a-budB-budA-noxE为模板，设计引物pTrc99a（-ori）-F/R扩增该质粒不含ori及氨苄基因的骨架片段；
S33、将RSF连带卡那基因的目的片段与pTrc99a-budB-budA-noxE质粒骨架进行无缝克隆连接，获得新的重组质粒。
4.如权利要求1所述的基因工程菌株在生产乙偶姻的应用，其特征在于，包括以下步骤：利用葡萄糖、木薯粉和/或棉籽粉水解液为初始碳源，发酵合成乙偶姻。
5.如权利要求1所述的基因工程菌株在合成四甲基吡嗪的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S51、取上述乙偶姻发酵液进行离心处理，取上清液，测定乙偶姻含量；
S52、按照乙偶姻和磷酸氢二铵的摩尔浓度比为2-3：5，将磷酸氢二铵加入上清液；
S53、在转化反应温度为150-180℃、转化反应转速为350-450 rpm、压力为2-10 Mpa及起始pH值7-8的条件下，转化反应2-4h，得到四甲基吡嗪。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌株在合成四甲基吡嗪的应用，其特征在于，还包括对乙偶姻发酵液上清液的脱色处理，所述脱色处理包括以下步骤：
S61、按照乙偶姻发酵液上清液和壳聚糖溶液的体积比为20:0-2，添加壳聚糖溶液对上清液进行絮凝，然后通过滤纸过滤除去絮凝物；
S62、向乙偶姻发酵液上清液添加0.5-1g/ml的活性炭粉末，控制水浴摇床转速为100-200 rpm、水浴脱色时间为30-50 min、水浴脱色温度为60-80℃及乙偶姻发酵液脱色前pH为3.5-4.5，对絮凝处理的上清液进行脱色。
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