CN113564090B

CN113564090B - 一种用于产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用

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Publication number: CN113564090B
Application number: CN202110719596.0A
Authority: CN
Inventors: 柯崇榕; 黄建忠; 杨欣伟; 韩剑; 崔树梅; 陈永涛; 陶勇
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113564090A

Abstract

本发明公开一种用于产四氢嘧啶的重组菌的构建方法及应用，将二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因通过重组载体导入突变型大肠杆菌中构建得到用于产四氢嘧啶的重组菌；利用重组菌能够阻断L‑天冬氨酸半醛的分支途径，有效地提高了四氢嘧啶的产量和天冬氨酸盐的转化效率；采用本发明的方法构建的重组菌生产四氢嘧啶，具有原料低廉，工艺简单，生产效率高等优点，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种用于产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用

技术领域

本发明具体涉及一种用于产四氢嘧啶重组菌的构建方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

四氢嘧啶属于杂环氨基酸，是一种极性、易溶且生理pH范围内不带电荷的相容性溶质，能够稳定细胞膨胀压力但不影响细胞正常生理功能。由于四氢嘧啶易于在蛋白质表面形成水化层，可以缓解高渗、高温、冻融、干燥、辐射和化学试剂对DNA双螺旋结构和蛋白质、生物膜及整个细胞的毒害作用，是微生物细胞的能源物质、渗透压调节物质和细胞及大分子物质的生物保护剂，在化妆品、生物技术和医药行业等领域应用广泛。

四氢嘧啶的主要生产方法是微生物发酵法和细胞转化法。发酵法是以葡萄糖为底物利用嗜盐微生物采用“细菌挤奶”工艺进行生产(高盐培养诱导合成，低盐刺激促进释放)，或者利用重组大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌进行分批补料培养生产；细胞转化法是以L-天冬氨酸盐和甘油为底物利用重组微生物或者静息细胞进行催化合成。目前，以L-天冬氨酸盐为底物，采用重组大肠杆菌进行全细胞生物催化生成四氢嘧啶，已广泛应用四氢嘧啶的大规模生产。底物L-天冬氨酸(Asp)需要经过L-天冬氨酸激酶和L-天冬氨酸半醛脱氢酶的催化才能形成前体L-天冬氨酸半醛(ASA)，然后再在二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的作用下合成四氢嘧啶。

现有技术中通过在大肠杆菌中过表达L-天冬氨酸激酶基因lysC来强化Asp到ASA的代谢流，但是大肠杆菌中thrA和metL编码的L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶才是催化Asp生成ASA的主要同工酶。此外，ASA是苏氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸等必须氨基酸的合成前体，造成全细胞转化法的转化率较低。公开号为CN104560844A的中国专利公开了一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌及其应用，具体公开了利用大肠杆菌K12实现四氢嘧啶合成的三个关键酶在阿拉伯糖启动子的调控下可溶性表达，诱导表达后的菌体以天冬氨酸钠为底物通过全细胞催化的方法实现了四氢嘧啶的分泌型转化，但是摇瓶转化24小时产量才3.4g/L(23.94mM)。公开号为CN109182236A的中国专利公开了一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用，具体公开了重组大肠杆菌是将大肠杆菌E.coli MG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因敲出，并导入核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectABC获得的，并将重组大肠杆菌应用在转化合成四氢嘧啶中，以L-天冬氨酸钠为底物，生物转化制备四氢嘧啶，但是利用该专利的基因重组构建大肠杆菌，进行四氢嘧啶合成的最高转化率仅为35％。综上所述，构建新型的四氢嘧啶高产菌株从而简化生产工艺、提高合成效率和转化率、降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义，同时也是生产四氢嘧啶的重要研究方向。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于产四氢嘧啶的重组菌构建方法，并将其应用在四氢嘧啶的生产中，能够实现四氢嘧啶的高产量、高转化率、低成本且生产工艺简单，为后续工业化生产四氢嘧啶奠定基础。

本发明的技术方案如下：

本发明目的之一在于提供一种用于产四氢嘧啶的重组菌的构建方法，将二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因通过重组载体导入受体菌得到用于产四氢嘧啶的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌；

所述二氨基丁酸氨基转移酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质或者由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸氨基转移酶活性的衍生蛋白；

所述二氨基丁酸乙酰基转移酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质或者由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸乙酰基转移酶活性的衍生蛋白；

所述四氢嘧啶合成酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质或者由SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有四氢嘧啶合成酶活性的衍生蛋白。

进一步的，所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述d1、d2和d3中任一种基因改造或任意两种基因改造结合得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

d1、将L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因(thrA)截短得到保留了L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因(thrA^*)；具体为截短L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因羧基端(471-820)中的部分氨基酸编码序列，该改造以“ΔthrA^*”表示；

d2、将L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因(metL)截短得到保留了L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因(metL^*)；具体为截短L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因羧基端(464-810)中的部分氨基酸编码序列，该改造以“ΔmetL^*”表示；

d3、将二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)。

进一步的，所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因编码氨基酸序列为SEQ IDNo.5的蛋白质；

所述二氨基庚二酸脱羧酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.6的蛋白质；

所述谷氨酸脱氢酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.7的蛋白质；

其中，所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因为D11-D13中的任一种DNA分子：

D11、编码序列是SEQ ID No.8的cDNA分子或基因组DNA；

D12、在严格条件下与D11限定的DNA分子杂交且编码所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I的cDNA分子或基因组DNA；

D13、与D11或D12限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性且编码所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I的cDNA分子或基因组DNA；

其中，所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因为D21-D23中的任一种DNA分子：

D21、编码序列是SEQ ID No.9的cDNA分子或基因组DNA；

D22、在严格条件下与D21限定的DNA分子杂交且编码所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II的cDNA分子或基因组DNA；

D23、与D21或D22限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性且编码所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II的cDNA分子或基因组DNA；

其中，所述二氨基庚二酸脱羧酶基因为D31-D33中的任一种DNA分子：

D31、编码序列是SEQ ID No.10的cDNA分子或基因组DNA；

D32、在严格条件下与D31限定的DNA分子杂交且编码所述二氨基庚二酸脱羧酶的cDNA分子或基因组DNA；

D33、与D31或D32限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性且编码所述丙酮酸激酶I的cDNA分子或基因组DNA；

其中，所述谷氨酸脱氢酶基因为D41-D43中的任一种DNA分子：

D41、编码序列是SEQ ID No.11的cDNA分子或基因组DNA；

D42、在严格条件下与D41限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；

D43、与D41或D42限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性且编码所述丙酮酸激酶I的cDNA分子或基因组DNA；

本发明中所使用的术语“同一性”指与天然核苷酸序列的序列相似性；“同一性”包括与本发明中SEQ ID No.4所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明中SEQ ID No.5所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明中SEQ ID No.6所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明中SEQ IDNo.7所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高同一性的核苷酸序列；其中，75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性

本发明中所述严格条件是在2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

进一步的，所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因截短得到的突变体基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.4中至少保留第1-470位氨基酸残基的蛋白质；

所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因截短得到的突变体基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.5中至少保留第1-463位氨基酸残基的蛋白质。

其中，所述突变型大肠杆菌D1为对野生型大肠杆菌进行上述d1、d2和d3改造得到野生型大肠杆菌的突变体；具体可为将大肠杆菌的二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)，并将L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因(thrA)和L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因(metL)截短得到保留L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因(thrA^*和metL^*)的大肠杆菌突变体ΔthrA^*ΔmetL^*ΔlysA::gdhA，该L-天冬氨酸激酶突变体基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.4中至少保留第1-470位氨基酸残基的蛋白质，或者氨基酸序列为SEQ ID No.5中至少保留第1-463位氨基酸残基的蛋白质；

其中，所述突变型大肠杆菌D2为对野生型大肠杆菌进行上述d1和d3改造得到野生型大肠杆菌的突变体；具体为将大肠杆菌的二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)，并将L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因(thrA)截短得到保留L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因(thrA^*)的大肠杆菌突变体ΔthrA^*ΔlysA::gdhA，该L-天冬氨酸激酶突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.4中至少保留第1-470位氨基酸残基的蛋白质；

其中，所述突变型大肠杆菌D3为对野生型大肠杆菌进行上述d2和d3改造得到野生型大肠杆菌的突变体；具体为将大肠杆菌的二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)，并将L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶Ⅱ基因(metL)截短得到保留L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因(metL^*)的大肠杆菌突变体ΔmetL^*ΔlysA::gdhA，该L-天冬氨酸激酶突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.5中至少保留第1-463位氨基酸残基的蛋白质；

其中，所述突变型大肠杆菌D4为对野生型大肠杆菌进行上述d1和d2改造得到野生型大肠杆菌的突变体；具体为将大肠杆菌的L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因(thrA)和L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因(metL)截短得到保留L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因(thrA^*和metL^*)的大肠杆菌突变体ΔthrA^*ΔmetL^*，该L-天冬氨酸激酶突变体基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.4中至少保留第1-470位氨基酸残基的蛋白质，或者氨基酸序列是SEQ ID No.5中至少保留第1-463位氨基酸残基的蛋白质；

其中，所述突变型大肠杆菌D5为对野生型大肠杆菌进行上述d1改造得到野生型大肠杆菌的突变体；具体为将大肠杆菌的L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因(thrA)截短得到保留L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因(thrA^*)得到大肠杆菌突变体ΔthrA^*；

其中，所述突变型大肠杆菌D6为对野生型大肠杆菌进行上述d2改造得到野生型大肠杆菌的突变体D6；具体为将大肠杆菌的L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因(metL)截短得到保留L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因(metL*)得到大肠杆菌突变体ΔmetL*；

其中，所述突变型大肠杆菌D7为对野生型大肠杆菌进行上述d3改造得到野生型大肠杆菌的突变体；具体为将大肠杆菌的二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)得到的大肠杆菌突变体ΔlysA::gdhA；

上述方法中L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因(thrA)和L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因(metL)截短，以及二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdhA基因)等基因替换或基因敲除均可通过同源重组实现。

进一步的，所述重组载体含有二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因；所述重组载体中启动二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因转录的启动子是ara启动子，终止二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶基因转录的终止子是rrnB终止子。

进一步的，所述重组载体是将核苷酸序列为SEQ ID No.12的DNA分子替换载体pBADhisB的XhoI和BglⅡ识别位点间的片段、核苷酸序列为SEQ IDNo.13的DNA分子替换载体pBADhisB的PstI和KpnI识别位点间的片段以及核苷酸序列为SEQ ID No.14的DNA分子替换载体pBADhisB的EcoRI和HindⅢ识别位点间的片段进行重组，进而得到重组载体PSKE。

本发明的目的之一还在于提供一种用于产四氢嘧啶的重组菌的构建方法构建得到的重组菌。

本发明的目的之一还在于提供一种重组菌在产四氢嘧啶中的应用。

进一步的，将重组菌用于制备四氢嘧啶，制备方法包括如下步骤：

(1)将所述重组菌经过阿拉伯糖诱导培养后得到诱导重组菌；所述阿拉伯糖诱导培养在阿拉伯糖的质量浓度为2g/100mL的培养基中进行，所述诱导培养的温度为20-37℃，所述诱导培养的时间为12-24h；

(2)用所述诱导重组菌催化L-天冬氨酸盐和甘油进行催化反应，得到转化液，从转化液中收集四氢嘧啶，将所述催化反应称为第1次转化，将所述转化液称为第1次转化液；所述L-天冬氨酸盐具体为L-天冬氨酸钠或L-天冬氨酸氨；所述催化反应可进行20-28h；所述催化反应的温度为28-40℃；

其中，利用重组菌制备四氢嘧啶的方法还包括从第(n-1)次转化液中收集菌体，将该菌体命名为第n次转化菌，用所述第n次转化菌催化L-天冬氨酸盐和甘油进行催化反应，得到转化液，从所述转化液中收集四氢嘧啶；将所述催化反应称为第n次转化，将所述转化液称为第n次转化液，所述n为大于等于2的自然数。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明构建了新型的四氢嘧啶高产重组菌，通过将二氨基丁酸氨基转移酶基因、二氨基丁酸乙酰基转移酶基因和四氢嘧啶合成酶基因通过重组载体PSKE导入到突变型大肠杆菌K12ΔthrA^*ΔmetL^*ΔlysA::gdhA中构建形成重组菌ETK07，重组菌ETK07能够在不影响菌体生长的前提下最大限度弱化L-天冬氨酸半醛的分支途径，有效地提高四氢嘧啶的产量和天冬氨酸盐的转化效率。

2、本发明中将重组菌用于制备四氢嘧啶，重组菌经过阿拉伯糖诱导培养后得到诱导重组菌，诱导表达的重组菌ETK07以天冬氨酸氨为底物，生物转化制备四氢嘧啶，转化24h后，四氢嘧啶的产量达到32g/L，且菌株可以连续转化三次，天冬氨酸盐的转化率均在60％以上，便于下游结晶精制，利用本发明提供的重组菌制备四氢嘧啶具有工艺简单、合成效率高且生产成本低的优势，具有良好的工业化应用前景。

附图标记

图1为利用本发明提供的重组菌合成四氢嘧啶的示意图；

图2为本发明实施例中重组菌株ETK01、ETK02、ETK03、ETK04、ETK05、ETK06、ETK07、ETK08和K12转化L-天冬氨酸钠合成四氢嘧啶的时间变化曲线示意图；

图3为本发明实施例中重组菌株ETK07转化L-天冬氨酸钠或L-天冬氨酸氨合成四氢嘧啶的时间变化曲线示意图；

图4为本发明实施例中重组菌株ETK07连续三批次转化L-天冬氨酸氨合成四氢嘧啶的示意图；

图5为本发明中不同L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因截短突变体重组菌株转化L-天冬氨酸钠合成四氢嘧啶的示意图；

图6为本发明中不同L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因截短突变体重组菌株转化L-天冬氨酸钠合成四氢嘧啶的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；

本发明中野生型大肠杆菌为大肠杆菌K12；下述实施例中的大肠杆菌K12(TomoyaBaba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa，Yuki Takai，Yoshiko Okumura，Miki Baba，KirillADatsenko，Masaru Tomita，Barry L Wanner and Hirotada Mori1.Construction ofEscherichia coli K-12in-frame，single-gene knockout mutants：the Keiocollection.Molecular Systems Biology.(2006):1-11)公众可从福建师范大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；

下述实施例中载体pBADhisB为invitrogen公司产品，产品目录号为V430-01；

下述实施例中的T4连接酶为Thermo公司产品，产品目录号为EL0011；

下述实施例中的限制性内切酶XhoI、BglⅡ、PstI、KpnI、EcoRI、HindⅢ和DpnI均为NEB公司产品，产品目录号分别为R0146、R0144、R0140、R3142、R3101、R3104和R0176；

下述实施例中的pCas质粒购自Addgene，产品编号为Plasmid#62225(Jiang Y，Chen B，Duan C，Sun B，Yang J，Yang S:Multigene editing in the Escherichia coligenome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol 2015，81:2506-2514)；

下述实施例中的pTargetF质粒购自Addgene，产品编号为Plasmid#62226(JiangY，Chen B，Duan C，Sun B，Yang J，Yang S:Multigene editing in the Escherichia coligenome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol 2015，81:2506-2514)；

下述实施例中应用到的CRISPR技术参见现有技术(Jiang Y，Chen B，Duan C，SunB，Yang J，Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome via theCRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol 2015，81:2506-2514)。

实施例1产四氢嘧啶重组菌的构建

一、构建重组载体

将pBADhisB载体的XhoI和BglⅡ识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.12所示的用于编码二氨基丁酸氨基转移酶的DNA序列；将PstI和KpnI识别位点间DNA序列替换为SEQ ID No.13所示的用于编码二氨基丁酸乙酰基转移酶的DNA序列；将EcoRI和HindⅢ识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.14所示的用于编码四氢嘧啶合成酶的DNA序列，其它DNA序列保持不变，得到重组载体PSKE；从酶切鉴定证明EctB、EctA和EctC基因成功插入到pBADhisB载体的XhoI和HindⅢ识别位点间；重组载体PSKE可表达SEQ ID No.1所示的二氨基丁酸氨基转移酶，SEQ ID No.2所示的二氨基丁酸乙酰基转移酶，SEQ ID No.3所示的四氢嘧啶合成酶。

二、构建突变型大肠杆菌D7菌株K12ΔlysA::gdhA

(1)制备电转感受态细胞：将pCas质粒利用化学转化法转化大肠杆菌K12，在含卡那霉素的LB平板(卡那霉素浓度为50g/mL)上30℃培养筛选阳性克隆，阳性克隆接种在含2g/L阿拉伯糖的LB液体培养基中30℃培养至OD600约为0.6后，制备电转感受态细胞；

(2)构建pTarget质粒：利用网站https://crispy.secondarymetabolites.org选取敲除lysA基因的N20，设计引物构建pTarget质粒，以pTargetF为模板，用pTarget-lysA-F和pTarget-lysA-R进行PCR扩增，获得大小约为2100bp的片段，用DpnI甲基化酶消化约3h后，直接利用化学转化法转化大肠杆菌DH5感受态，在含链霉素的LB平板(链霉素浓度为50g/mL)上筛选阳性克隆，并用引物pTarget-cexu-F测序验证，测序正确后命名为pTarget-lysA；

所述引物序列如下(下划线所示为N20的序列)：

pTarget-lysA-F：5’-gtgtggtgctatggtgcgtcgttttagagctagaaatagc-3’；

pTarget-lysA-R：5’-gacgcaccatagcaccacacactagtattatacctaggac-3’；

pTarget-cexu-F：5’-ctttcctgcgttatcccctg-3’；

(3)扩增打靶片段：分别用引物对lysA-up-F和lysA-up-R，gdhA-F和gdhA-R，lysA-down-F和lysA-down-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，1300bp和500bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对lysA-up-F和lysA-down-R进行PCR扩增，得到大小约为2300bp的lysA::gdhA打靶片段，回收打靶片段；

所用引物序列如下：

lysA-up-F：5’-tcttcaagtagcggtgattcctgg-3’；

lysA-up-R：5’-gaatatgtctgatccataacaaactccagataagtgcttttttatgattacg-3’；

gdhA-F：5’-gcacttatctggagtttgttatggatcagacatattctctggagtca-3’；

gdhA-R：5’-ccagcgactaaccgcagttaaatcacaccctgcgccag-3’；

lysA-down-F：5’-ctggcgcagggtgtgatttaactgcggttagtcgctgg-3’；

lysA-down-R：5’-ccgcattggttatctgtgctctaac-3’；

(4)电转化：将200ng的pTarget-lysA质粒，400ng的lysA::gdhA打靶片段与100μL步骤(1)制备的电转化感受态细胞混合，置于2mm的电转杯中，2.5kV电击，加入1mL LB液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的LB平板上(卡那霉素浓度为50g/mL，链霉素浓度为50g/mL)，30℃培养，筛选阳性克隆，用引物对lysA-up-F和lysA-down-R进行PCR扩增，将扩增片段测序验证；

(5)消除pTarget质粒：将测序验证正确的阳性克隆接种在含有0.1mM IPTG和卡那霉素的LB液体培养基中30℃培养过夜以消除pTarget-lysA质粒。过夜培养后的菌株在含有卡那霉素的LB固体平板上划线，30℃培养过夜，得到含有pCas质粒的突变型大肠杆菌D7菌株K12ΔlysA::gdhA。

三、构建突变型大肠杆菌D5菌株K12ΔthrA^*、突变型大肠杆菌D6菌株K12ΔmetL^*和突变型大肠杆菌D4菌株K12ΔthrA^*ΔmetL^*

按照构建突变型大肠杆菌D7菌株的步骤(2)-(5)构建突变型大肠杆菌D5菌株K12ΔthrA^*和突变型大肠杆菌D6菌株K12ΔmetL^*；以突变型大肠杆菌D5菌株为出发菌株，按照构建突变型大肠杆菌D7菌株的步骤(1)-(5)构建突变型大肠杆菌D4菌株K12ΔthrA^*ΔmetL^*。

所用引物序列如下(下划线所示为N20的序列)：

pTarget-thrA-F：5’-cgaaggcatgagtttctccggttttagagctagaaatagc-3’；

pTarget-thrA-R：5’-cggagaaactcatgccttcgactagtattatacctaggac-3’；

pTarget-metL-F：5’-tggctgttcctgcaattcgagttttagagctagaaatagc-3’；

pTarget-metL-R：5’-tcgaattgcaggaacagccaactagtattatacctaggac-3’；

thrA-up-F：5’-tcctacttcggcgctaaagttct-3’；

thrA-up-R：5’-cggggcataaactttaaccatgtcacacaaacacttcgataacctgatcgg-3’；

thrA-down-F：5’-ccgatcaggttatcgaagtgtttgtgtgacatggttaaagtttatgccccg-3’；

thrA-down-R：5’-aatagcaggcgtgaatgaagcc-3’；

metL-up-F：5’-aggttccacgcgcattgaac-3’；

metL-up-R：5’-taaatttctgaaattacaataccaggccgatgcgt-3’；

metL-down-F：5’-gtattgtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL-down-R：5’-gcaagtaagatgcggtgccg-3’；

四、构建突变型大肠杆菌D2菌株K12ΔthrA^*ΔlysA::gdhA、突变型大肠杆菌D3菌株K12ΔmetL^*ΔlysA::gdhA和突变型大肠杆菌D1菌株K12ΔthrA^*ΔmetL^*ΔlysA::gdhA

分别以突变型大肠杆菌D5菌株K12ΔthrA^*、突变型大肠杆菌D6菌株K12ΔmetL^*和突变型大肠杆菌D4菌株K12ΔthrA^*ΔmetL^*为出发菌株，重复构建突变型大肠杆菌D7菌株的步骤(1)-(5)构建突变型大肠杆菌D2菌株K12ΔthrA^*ΔlysA::gdhA、突变型大肠杆菌D3菌株K12ΔmetL^*ΔlysA::gdhA和突变型大肠杆菌D1菌株K12ΔthrA^*ΔmetL^*ΔlysA::gdhA。

五、构建产四氢嘧啶的重组菌

采用氯化钙法将获得的重组载体PSKE导入构建的突变型大肠杆菌D7菌株、突变型大肠杆菌D5菌株、突变型大肠杆菌D6菌株、突变型大肠杆菌D4菌株、突变型大肠杆菌D2菌株、突变型大肠杆菌D3菌株、突变型大肠杆菌D1菌株和野生型大肠杆菌K12菌株中，在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子分别命名为PSKE/K12ΔlysA::gdhA、PSKE/K12ΔthrA^*(、PSKE/K12ΔmetL^*、PSKE/K12ΔthrA^*ΔmetL^*、PSKE/K12ΔthrA^*ΔlysA::gdhA、PSKE/K12ΔmetL^*ΔlysA::gdhA、PSKE/K12ΔthrA^*ΔmetL^*ΔlysA::gdhA和PSKE/K12，将该菌株编号为ETK01、ETK02、ETK03、ETK04、ETK05、ETK06、ETK07和ETK08。

实施例2重组菌转化L-天冬氨酸钠产四氢嘧啶

一、重组菌的诱导培养

分别将产四氢嘧啶的重组菌ETK01、ETK02、ETK03、ETK04、ETK05、ETK06、ETK07、ETK08和大肠杆菌K12划线到含有质量浓度1.5％的琼脂和质量浓度100μg/mL的氨卞青霉素的LB平板上，37℃培养12h后挑取平板上的单菌落，接种到含有质量浓度100μg/mL的氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，转速为220rpm；将过夜培养物以体积比为1％的接种量接种至自诱导培养基AYM中，在转速为200rpm，30℃条件下振荡培养16h，分别获得诱导后的ETK01菌株、ETK02菌株、ETK03菌株、ETK04菌株、ETK05菌株、ETK06菌株、ETK07菌株、ETK08菌株和K12菌株。

二、重组菌转化L-天冬氨酸钠产四氢嘧啶

将获得的诱导后的ETK01菌株、ETK02菌株、ETK03菌株、ETK04菌株、ETK05菌株、ETK06菌株、ETK07菌株、ETK08菌株和K12菌株于4℃，8000g条件下离心10min，收集菌体；再用浓度为10mM的氯化钠水溶液洗涤菌体1次后以相同的离心条件再次收集菌体，分别获得洗涤后的各菌株；将洗涤后的各菌株重悬于含有浓度100mM L-天冬氨酸氨和甘油的PBS缓冲液(pH 7.0)，分别获得ETK01菌株、ETK02菌株、ETK03菌株、ETK04菌株、ETK05菌株、ETK06菌株、ETK07菌株、ETK08菌株和K12菌株的转化液，转化液中菌体含量以湿重计为15g/L；将各菌株的转化液在30℃，转速为100rpm的条件下进行L-天冬氨酸钠到四氢嘧啶的转化，分别获得ETK01菌株、ETK02菌株、ETK03菌株、ETK04菌株、ETK05菌株、ETK06菌株、ETK07菌株、ETK08菌株和K12菌株在转化3h、6h和9h的转化液，参见图1为重组菌中四氢嘧啶的合成途径；

上述不同菌株的四氢嘧啶产量参见图2，ETK01菌株转化9h，四氢嘧啶产量为12.88mM；ETK02菌株转化9h，四氢嘧啶产量为15.45mM；ETK03菌株转化9h，四氢嘧啶产量为10.61mM；ETK04菌株转化9h，四氢嘧啶产量为19.35mM；ETK05菌株转化9h，四氢嘧啶产量达到32.31mM；ETK06菌株转化9h，四氢嘧啶产量为26.6mM；ETK07菌株转化9h，四氢嘧啶产量高达38.26mM；ETK08菌株转化9h，四氢嘧啶产量仅为6.09mM；K12菌株转化9h，仍然检测不到四氢嘧啶的产生；从图2中可以看出，ETK01菌株、ETK02菌株、ETK03菌株、ETK04菌株、ETK05菌株、ETK06菌株和ETK07菌株的四氢嘧啶的产量均明显高于ETK08菌株，其中，ETK07菌株的产量最高，转化率最好，提高了四氢嘧啶的单位时间转化效率。

实施例3重组菌ETK07菌株产四氢嘧啶的分析

一、ETK07菌株转化不同L-天冬氨酸盐产四氢嘧啶

挑取ETK07单菌落接种到含有质量浓度100μg/mL氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速220rpm；将过夜培养物以体积比为1％的接种量接种至装有1.5L自诱导培养基ZYM的2L发酵罐中，通气比为1.2-1.5vvm，在30℃，转速为700rpm的条件下发酵培养18h，得到发酵液；然后利用离心机离心发酵液，收集ETK07菌体至1L转化罐中，加入600mL左右PBS缓冲液(pH7.0)重悬菌株，获得重悬菌株液，使得重悬菌株液中菌体的含量以菌体湿重计15g/L，并向重悬菌株液中添加甘油和L-天冬氨酸钠或L-天冬氨酸氨，使得重悬菌株液中甘油和L-天冬氨酸盐的浓度为100mM，将转化液在30℃，转速为250rpm的条件下进行L-天冬氨酸到四氢嘧啶的转化，获得ETK07菌株在L-天冬氨酸钠或L-天冬氨酸氨为底物的条件下的转化液，转化时间为24h(每隔3小时取样)，9h以后开始流加含有2M甘油和L-天冬氨酸钠或L-天冬氨酸氨的补料液，流加速率为0.15mL/min；

两种底物的四氢嘧啶产量参见图3，以L-天冬氨酸钠为底物，ETK07菌株转化24h，四氢嘧啶产量达到207.13mM，共消耗L-天冬氨酸钠356.73mM，转化率为58.11％；对照菌株ETK08采用同样的培养和转化条件转化24h四氢嘧啶的产量仅为72.94mM，转化率为35.27％；以天冬氨酸氨为底物，ETK07菌株转化24h，四氢嘧啶产量达到225.87mM，共消耗L-天冬氨酸氨320.68mM，转化率为70.43％，ETK07菌株以L-天冬氨酸氨为底物的四氢嘧啶产量，底物转化率提高了12.32％；对照菌株ETK08采用同样的培养和转化条件转化24h四氢嘧啶的产量仅为46.39mM，转化率为21.84％。

二、ETK07菌株制备四氢嘧啶

挑取ETK07单菌落接种到含有质量浓度100μg/mL氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速220rpm；将过夜培养物以体积比为1％的接种量接种至装有7L自诱导培养基ZYM的10L发酵罐中，通气比为0.8-1vvm，在30℃，转速为500rpm的条件下发酵培养18h，得到发酵液；然后利用离心机离心发酵液，收集ETK07菌体至5L转化罐中，加入4L纯水重悬菌株，获得重悬菌株液，使得重悬菌株液中菌体的含量以菌体湿重计为20g/L，并向重悬菌株液中添加甘油和L-天冬氨酸氨，使得重悬菌株液中甘油和L-天冬氨酸的浓度为100mM，将转化液在30℃，转速为150rpm的条件下进行L-天冬氨酸到四氢嘧啶的转化，获得ETK07菌株在L-天冬氨酸氨为底物的条件下的第1次转化液，9h后开始流加含有2M甘油和L-天冬氨酸氨的补料液，流加速率为1mL/min，总共转化24h，得到第1次转化液；第1次转化结束后重新离心收集菌体再进行第2次转化，第2次转化液中菌体的含量以菌体湿重计为20g/L，甘油和L-天冬氨酸氨的起始浓度也为100mM，9h后也开始流加含有2M甘油和L-天冬氨酸氨的补料液，流加速率为1mL/min，第2次转化时间为21h，得到第2次转化液，第2次转转结束后重新离心收集菌体再进行第3次转化，第3次转化液中菌体的含量以菌体湿重计为20g/L，甘油和L-天冬氨酸氨的起始浓度也为100mM，9h后也开始流加含有2M甘油和L-天冬氨酸氨的补料液，流加速率为1mL/min，第3次转化时间为24h，得到第3次转化液。

三次天冬氨酸氨到四氢嘧啶的转化结果参见图4，第1次转化液中四氢嘧啶产量达到220.83mM(31.39g/L)，L-天冬氨酸氨消耗307.36mM，摩尔转化率为71.85％；第2次转化液中四氢嘧啶产量为189.62mM(26.96g/L)，L-天冬氨酸氨消耗283.57mM，摩尔转化率为66.87％；第3次转化液中四氢嘧啶产量为153.28mM(21.79g/L)，L-天冬氨酸氨消耗283.57mM，摩尔转化率为66.87％；第3次转化液中四氢嘧啶产量为153.28mM(21.79g/L)，L-天冬氨酸氨消耗245.16mM，摩尔转化率为62.52％；结果表明，ETK07菌株可以连续催化L-天冬氨酸氨转化为四氢嘧啶，保持每次的转化率高于60％，便于下游结晶精制，具有良好的工业化应用前景。

实施例4重组菌ETK05和ETK06菌株产四氢嘧啶的分析

按照实施例3所述培养和转化方法分别在10L发酵罐中培养工程菌ETK05和ETK06，5L发酵罐中转化L-天冬氨酸氨；ETK05菌株转化24h转化液中四氢嘧啶产量为193.31mM(27.48g/L)，L-天冬氨酸氨消耗297.77mM，摩尔转化率为64.92％；ETK06菌株转化24h转化液中四氢嘧啶产量为161.53mM(22.96g/L)，L-天冬氨酸氨消耗265.98mM，摩尔转化率为60.73％。

实施例5不同thrA截短得到的突变体基因对四氢嘧啶产量的影响

一、构建不同thrA截短长度的大肠杆菌突变体

按照构建突变型大肠杆菌D7菌株的步骤(1)-(5)构建大肠杆菌突变体K12ΔthrA、K12ΔthrA220、K12ΔthrA320、K12ΔthrA400、K12ΔthrA440、K12ΔthrA460、K12ΔthrA480、K12ΔthrA500、K12ΔthrA540、K12ΔthrA620、K12ΔthrA720，分别保留L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I氨基酸残基6aa、220aa、320aa、400aa、440aa、460aa、480aa、500aa、540aa、620aa、720aa；

截短thrA基因所用引物序列如下(下划线所示为N20的序列)：

pTarget-thrA*-F:5’-ccgctgccgttggtactgcggttttagagctagaaatagc-3’；

pTarget-thrA*-R:5’-cgcagtaccaacggcagcggactagtattatacctaggac-3’；

thrA0-up-F：5’-ctctggcagtggcagatgaca-3’；

thrA0-up-R：5’-taaactttaaccatgtcagaacttcaacactcgcatggttgt-3’；

thrA0-down-F：5’-gttgaagttctgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA*-down-R：5’-atcaaaccctggcacttgctg-3’；

thrA220-up-F：5’-tggcgatgattgaaaaaaccattagcg-3’；

thrA220-up-R：5’-tttaaccatgtcaggcgcgtaaacaggcag-3’；

thrA220-down-F：5’-tgtttacgcgcctgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA320-up-F：5’-tcgaaaaactgctggcagtggg-3’；

thrA320-up-R：5’-aaactttaaccatgtcaaacgctgaacattgccatgttat-3’；

thrA320-down-F：5’-cagcgtttgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA400-up-F：5’-tatacctgcgacccgcgtc-3’；

thrA400-up-R：5’-ctttaaccatgtcacgagataatggccagccgt-3’；

thrA400-down-F：5’-ggccattatctcgtgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA440-up-F：5’-tacccccatcgcccagtt-3’；

thrA440-up-R：5’-ctttaaccatgtcaagagattgagcgttcagaagatccc-3’；

thrA440-down-F：5’-tgaacgctcaatctcttgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA460-up-F：5’-tcattggtgccagccgtga-3’；

thrA460-up-R：5’-actttaaccatgtcagaacagcatctgatgagtaacgcg-3’；

thrA460-down-F：5’-gctgttctgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA480-up-F：5’-taacatggcaatgttcagcgtttct-3’；

thrA480-up-R：5’-aactttaaccatgtcacagcgcaccgccaac-3’；

thrA480-down-F：5’-ggtgcgctgtgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA500-up-F：5’-gcgtctttgcagcgatgtcac-3’；

thrA500-up-R：5’-ctttaaccatgtcagacacgtaagtcgatatgtttattcttcagc-3’；

thrA500-down-F：5’-tcgacttacgtgtctgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA540-up-F：5’-tgcaggaagagttctacctggaact-3’；

thrA540-up-R：5’-actttaaccatgtcagaggcgaattaagcgcccg-3’；

thrA540-down-F：5’-cgcttaattcgcctctgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA620-up-F：5’-gcgttactcatcagatgctgttcaatacc-3’；

thrA620-up-R：5’-ctttaaccatgtcattgcaggttctcaataaccggtaatcca-3’；

thrA620-down-F：5’-gagaacctgcaatgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

thrA720-up-F：5’-tgactgcacttccagccagg-3’；

thrA720-up-R：5’-aactttaaccatgtcacgccataaaagcggcaacat-3’；

thrA720-down-F：5’-ttatggcgtgacatggttaaagtttatgccccgg-3’；

二、构建产四氢嘧啶的重组菌

采用氯化钙法将获得的重组载体PSKE导入大肠杆菌突变体菌株中，分别在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子分布命名为PSKE/K12ΔthrA、PSKE/K12ΔthrA220、PSKE/K12ΔthrA320、PSKE/K12ΔthrA400、PSKE/K12ΔthrA440、PSKE/K12ΔthrA460、PSKE/K12ΔthrA480、PSKE/K12ΔthrA500、PSKE/K12ΔthrA540、PSKE/K12ΔthrA620、PSKE/K12ΔthrA720，菌株分别编号为ET01、ET02、ET03、ET04、ET05、ET06、ET07、ET08、ET09、ET10和ET11。

三、分析不同thrA截短突变体对四氢嘧啶产量的影响

参照实施例2的重组菌的诱导培养和重组菌转化L-天冬氨酸钠产四氢嘧啶的方法对ET01、ET02、ET03、ET04、ET05、ET06、ET07、ET08、ET09、ET10和ET11进行诱导培养后，并用于转化L-天冬氨酸钠产四氢嘧啶，获得ET01菌株、ET02菌株、ET03菌株、ET04菌株、ET05菌株、ET06菌株、ET07菌株、ET08菌株、ET09菌株、ET10菌株和ET11菌株在9h的转化液；

不同菌株的四氢嘧啶产量参见图5，选择实施例1中获得的ETK08为阳性对照菌株，转化9h，四氢嘧啶产量为6.37mM，阴性对照菌株为ET01，转化9h，四氢嘧啶产量仅为1.76mM，ET01菌株的四氢嘧啶产量仅为ETK08菌株的27.63％，表明敲除thrA基因极大影响了四氢嘧啶的合成；ET02菌株、ET03菌株、ET04菌株、ET05菌株和ET06菌株转化9h，四氢嘧啶产量均低于2mM，与thrA基因完全敲除的ET01菌株的四氢嘧啶产量差异不大；而ETK02菌株、ET07菌株、ET08菌株、ET09菌株、ET10菌株和ET11菌株转化9h，四氢嘧啶产量均达到16mM左右，是阳性对照菌株ETK08四氢嘧啶产量的2.5倍左右；上述结果表明，截短thrA基因保留天冬氨酸激酶活性有利于提高四氢嘧啶的产量，至少保留1-470个氨基酸残基。

实施例6不同metL截短得到的突变体基因对四氢嘧啶产量的影响

一、构建不同metL截短长度的大肠杆菌突变体

按照构建突变型大肠杆菌D7菌株的步骤(1)-(5)构建大肠杆菌突变体K12ΔmetL、K12ΔmetL213、K12ΔmetL313、K12ΔmetL393、K12ΔmetL433、K12ΔmetL453、K12ΔmetL473、K12ΔmetL493、K12ΔmetL533、K12ΔmetL613、K12ΔmetL713，分别保留L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II氨基酸残基6aa、213aa、313aa、393aa、433aa、453aa、473aa、493aa、533aa、613aa、713aa；

截短metL基因所用引物序列如下(下划线所示为N20的序列)：

pTarget-metL*-F：5’-gataaccctctggtgatccggttttagagctagaaatagc-3’；

pTarget-metL*-R：5’-cggatcaccagagggttatcactagtattatacctaggac-3’；

metL0-up-F：5’-tggtgggcaaacaatattggcg-3’；

metL0-up-R：5’-atttctgaaattactgcgcaatcacactcatttttaccc-3’；

metL0-down-F：5’-agtgtgattgcgcagtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL*-down-R：5’-caggctgctaaggcgatcg-3’；

metL213-up-F：5’-tatgatggtggtttccgccgc-3’；

metL213-up-R：5’-aaatttctgaaattaggaatagtcggaaccgttacgc-3’；

metL213-down-F：5’-ccgactattcctaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL313-up-F：5’-taatcaacaagggctgccagc-3’；

metL313-up-R：5’-tttctgaaattagctggtgacaatacgcgc-3’；

metL313-down-F：5’-gcgtattgtcaccagctaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL393-up-F：5’-tctcgcgtaaccatctggagc-3’；

metL393-up-R：5’-aatttctgaaattacagcgccagcccctg-3’；

metL393-down-F：5’-caggggctggcgctgtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL433-up-F：5’-gctcccgttcttcacgcc-3’；

metL433-up-R：5’-ttaaatttctgaaattacaccaggctgatgccgtc-3’；

metL433-down-F：5’-catcagcctggtgtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL453-up-F：5’-ctgcgctgtagctacacgc-3’；

metL453-up-R：5’-taaatttctgaaattagaagacggactgatgcagcc-3’；

metL453-down-F：5’-tcagtccgtcttctaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL473-up-F：5’-gtactggtgcgcgtattgtcac-3’；

metL473-up-R：5’-ttaaatttctgaaattaccaacgggaaccgatattgcc-3’；

metL473-down-F：5’-gttcccgttggtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL493-up-F：5’-gccagtcaggatttcaaactggc-3’；

metL493-up-R：5’-ttaaatttctgaaattacacaaactcaaagccggtacgt-3’；

metL493-down-F：5’-ctttgagtttgtgtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL533-up-F：5’-ctcagaagtggccgacagtg-3’；

metL533-up-R：5’-atttctgaaattacaggaacaacgactcttcatcctg-3’；

metL533-down-F：5’-agtcgttgttcctgtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL613-up-F：5’-tgattcaggggctgcatcagt-3’；

metL613-up-R：5’-ttattaaatttctgaaattacacggtgtggttgatcggc-3’；

metL613-down-F：5’-accacaccgtgtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

metL713-up-F：5’-tgctggacgttaccgcc-3’；

metL713-up-R：5’-tattaaatttctgaaattattcaaagaaatggtcgatgctgccg-3’；

metL713-down-F：5’-catttctttgaataatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；

二、构建产四氢嘧啶的重组菌

采用氯化钙法将获得的重组载体PSKE导入大肠杆菌突变体菌株中，分别在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子分布命名为PSKE/K12ΔmetL、PSKE/K12ΔmetL213、PSKE/K12ΔmetL313、PSKE/K12ΔmetL393、PSKE/K12ΔmetL433、PSKE/K12ΔmetL453、PSKE/K12ΔmetL473、PSKE/K12ΔmetL493、PSKE/K12ΔmetL533、PSKE/K12ΔmetL613、PSKE/K12ΔmetL713，菌株分别编号为EM01、EM02、EM03、EM04、EM05、EM06、EM07、EM08、EM09、EM10和EM11。

三、分析不同thrA截短突变体对四氢嘧啶产量的影响

参照实施例2的重组菌的诱导培养和重组菌转化L-天冬氨酸钠产四氢嘧啶的方法对EM01、EM02、EM03、EM04、EM05、EM06、EM07、EM08、EM09、EM10和EM11进行诱导培养后，并用于转化L-天冬氨酸钠产四氢嘧啶，获得EM01菌株、EM02菌株、EM03菌株、EM04菌株、EM05菌株、EM06菌株、EM07菌株、EM08菌株、EM09菌株、EM10菌株和EM11菌株在9h的转化液；

不同菌株的四氢嘧啶产量参见图6，选择实施例1中获得的ETK08为阳性对照菌株，转化9h，四氢嘧啶产量为6.72mM，阴性对照菌株为EM01，转化9h，四氢嘧啶产量仅为3.67mM，EM01菌株的四氢嘧啶产量仅为ETK08菌株的54.61％，表明敲除metL基因影响了四氢嘧啶的合成；EM02菌株、EM03菌株、EM04菌株、EM05菌株和EM06菌株转化9h，四氢嘧啶产量均低于4mM，与metL基因完全敲除的EM01菌株的四氢嘧啶产量差异不大；而ETK03菌株、EM07菌株、EM08菌株、EM09菌株、EM10菌株和EM11菌株转化9h，四氢嘧啶产量均达到16.5mM左右，是阳性对照菌株ETK08四氢嘧啶产量的2.5倍左右；上述结果表明，截短metL基因保留天冬氨酸激酶活性有利于提高四氢嘧啶的产量，至少保留1-463个氨基酸残基。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 福建师范大学

<120> 一种用于产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 423

<212> PRT

<213> 阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)

<400> 1

Met Thr Ile Thr Gln Pro Asp Leu Ser Val Phe Glu Thr Val Glu Ser

1 5 10 15

Glu Val Arg Ser Tyr Cys Arg Gly Trp Pro Thr Val Phe Asp Arg Ala

20 25 30

Gln Gly Ser Arg Met Tyr Asp Glu Asp Gly His Ala Tyr Leu Asp Phe

35 40 45

Phe Ala Gly Ala Gly Ser Leu Asn Tyr Gly His Asn Asn Pro Val Leu

50 55 60

Lys Arg Ala Leu Ile Asp Tyr Leu Glu Arg Asp Gly Val Thr His Gly

65 70 75 80

Leu Asp Met Ser Thr Ala Ala Lys Arg Ala Phe Leu Glu Ser Phe Gln

85 90 95

Asn Leu Ile Leu Arg Pro Arg Asp Leu Pro Tyr Lys Val Met Phe Pro

100 105 110

Gly Pro Thr Gly Thr Asn Ala Val Glu Ser Ala Leu Lys Leu Ala Arg

115 120 125

Lys Val Lys Gly Arg Glu Ala Ile Val Ser Phe Thr Asn Ala Phe His

130 135 140

Gly Met Ser Leu Gly Ser Leu Ala Val Thr Gly Asn Ala Phe Lys Arg

145 150 155 160

Ala Gly Ala Gly Ile Pro Leu Val His Gly Thr Pro Met Pro Phe Asp

165 170 175

Asn Tyr Phe Asp Gly Lys Val Pro Asp Phe Leu Trp Phe Glu Arg Leu

180 185 190

Leu Glu Asp Gln Gly Ser Gly Leu Asn Lys Pro Ala Ala Val Ile Val

195 200 205

Glu Thr Val Gln Gly Glu Gly Gly Ile Asn Val Ala Arg Pro Glu Trp

210 215 220

Leu Arg Ala Leu Ala Glu Leu Cys Lys Arg Gln Asp Met Leu Leu Ile

225 230 235 240

Val Asp Asp Ile Gln Met Gly Cys Gly Arg Thr Gly Ala Phe Phe Ser

245 250 255

Phe Glu Glu Ala Gly Val Thr Pro Asp Ile Val Thr Val Ser Lys Ser

260 265 270

Ile Ser Gly Tyr Gly Leu Pro Met Ser Leu Cys Leu Phe Lys Pro Glu

275 280 285

Leu Asp Ile Trp Glu Pro Gly Glu His Asn Gly Thr Phe Arg Gly Asn

290 295 300

Asn Pro Ala Phe Val Thr Ala Ala Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Trp Ala

305 310 315 320

Asp Gly Ser Ala Met Glu Lys Gln Thr Leu Ala Arg Gly Glu Gln Val

325 330 335

Glu Gln Ala Leu Ile Ser Ile Thr Glu Glu Asn Leu Ala Asp Val Lys

340 345 350

Glu Tyr Arg Gly Arg Gly Leu Val Trp Gly Ile Glu Phe Lys Asp Lys

355 360 365

Asp Arg Ala Gly Arg Ile Ala Gln Arg Ala Phe Glu Leu Gly Leu Leu

370 375 380

Ile Glu Thr Ser Gly Pro Glu Ser Glu Val Val Lys Leu Leu Pro Ala

385 390 395 400

Leu Thr Ile Thr Pro Glu Glu Leu Asp Glu Gly Leu Arg Thr Leu Ala

405 410 415

Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala

420

<210> 2

<211> 173

<212> PRT

<213> 坐皮肤球菌(Kytococcus sedentarius)

<400> 2

Met Thr Ser Asp Ala Gln Pro Thr Gly Ala Asp Ala Gln Pro Ala Val

1 5 10 15

Thr Phe Arg Ala Ala Thr Leu Asp Asp Gly Ala Ala Met Trp Arg Ile

20 25 30

Ala Arg Asp Ser Gln Val Leu Asp Val Asn Thr Ser Tyr Ala Tyr Leu

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Leu Met Ala Arg Asp Phe Gly Ala His Ser Ala Val Ala Glu Val Asp

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Gly Glu Ile Val Gly Tyr Cys Met Ser Tyr Leu Arg Pro Gln Asp Pro

65 70 75 80

Asp Thr Val Phe Val Trp Gln Ile Ala Val Asp Ala Ser Gln Arg Gly

85 90 95

Arg Gly Leu Ala Gly Arg Leu Leu Asp Ala Val Val Asp Ala Thr Gly

100 105 110

Ala Arg Ala Leu Glu Ser Thr Val Thr Thr Asp Asn Asp Ala Ser Asn

115 120 125

Ala Leu Phe Ala Arg Phe Ala Glu Arg Arg Gly Ala Thr Glu Thr Val

130 135 140

Thr Glu Phe Ile Thr Arg Asp His Phe Pro Pro Asp Asp Val His Asp

145 150 155 160

Ala Glu Leu Leu His Arg Ile Glu Pro Leu Thr Pro Ala

165 170

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)

<400> 3

Met Ile Val Arg Thr Leu Ala Glu Cys Glu Lys Thr Asp Arg Lys Val

1 5 10 15

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20 25 30

Asp Lys Val Gly Phe Ser Phe His Ile Thr Thr Ile Tyr Ala Gly Ser

35 40 45

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50 55 60

Ser Gly Asn Gly Glu Ile Glu Thr Ile Ala Asp Gly Lys Ile Tyr Lys

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Leu Arg Gly Gly Ser Glu Asp Met Lys Leu Ala Cys Val Phe Asn Pro

100 105 110

Pro Leu Asn Gly Arg Glu Val His Asp Glu Ser Gly Val Tyr Pro Leu

115 120 125

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130

<210> 4

<211> 820

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

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1 5 10 15

Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln

20 25 30

Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val

35 40 45

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50 55 60

Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala

65 70 75 80

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85 90 95

Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly

100 105 110

Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys

115 120 125

Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn

130 135 140

Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala

165 170 175

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180 185 190

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val

305 310 315 320

Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe

325 330 335

Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser

340 345 350

Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val

355 360 365

Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu

370 375 380

Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser

385 390 395 400

Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe

405 410 415

Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln

420 425 430

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Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala

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Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala

725 730 735

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Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu

755 760 765

Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr

770 775 780

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785 790 795 800

Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp

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820

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<211> 810

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

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Phe Gly Gly Ser Ser Leu Ala Asp Val Lys Cys Tyr Leu Arg Val Ala

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Gly Ile Met Ala Glu Tyr Ser Gln Pro Asp Asp Met Met Val Val Ser

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50 55 60

Gln Thr Asp Arg Leu Ser Ala His Gln Val Gln Gln Thr Leu Arg Arg

65 70 75 80

Tyr Gln Cys Asp Leu Ile Ser Gly Leu Leu Pro Ala Glu Glu Ala Asp

85 90 95

Ser Leu Ile Ser Ala Phe Val Ser Asp Leu Glu Arg Leu Ala Ala Leu

100 105 110

Leu Asp Ser Gly Ile Asn Asp Ala Val Tyr Ala Glu Val Val Gly His

115 120 125

Gly Glu Val Trp Ser Ala Arg Leu Met Ser Ala Val Leu Asn Gln Gln

130 135 140

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180 185 190

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Ile Asp Gln Ile Leu Lys Arg Ala Gln Val Arg Pro Leu Ala Val Gly

340 345 350

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420 425 430

Val Ala Val Leu Arg Thr Gly Pro Thr Glu Ser Leu Ile Gln Gly Leu

435 440 445

His Gln Ser Val Phe Arg Ala Glu Lys Arg Ile Gly Leu Val Leu Phe

450 455 460

Gly Lys Gly Asn Ile Gly Ser Arg Trp Leu Glu Leu Phe Ala Arg Glu

465 470 475 480

Gln Ser Thr Leu Ser Ala Arg Thr Gly Phe Glu Phe Val Leu Ala Gly

485 490 495

Val Val Asp Ser Arg Arg Ser Leu Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Asp Ala

500 505 510

Ser Arg Ala Leu Ala Phe Phe Asn Asp Glu Ala Val Glu Gln Asp Glu

515 520 525

Glu Ser Leu Phe Leu Trp Met Arg Ala His Pro Tyr Asp Asp Leu Val

530 535 540

Val Leu Asp Val Thr Ala Ser Gln Gln Leu Ala Asp Gln Tyr Leu Asp

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Phe Ala Ser His Gly Phe His Val Ile Ser Ala Asn Lys Leu Ala Gly

565 570 575

Ala Ser Asp Ser Asn Lys Tyr Arg Gln Ile His Asp Ala Phe Glu Lys

580 585 590

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595 600 605

Ile Asn His Thr Val Arg Asp Leu Ile Asp Ser Gly Asp Thr Ile Leu

610 615 620

Ser Ile Ser Gly Ile Phe Ser Gly Thr Leu Ser Trp Leu Phe Leu Gln

625 630 635 640

Phe Asp Gly Ser Val Pro Phe Thr Glu Leu Val Asp Gln Ala Trp Gln

645 650 655

Gln Gly Leu Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu Ser Gly Lys Asp

660 665 670

Val Met Arg Lys Leu Val Ile Leu Ala Arg Glu Ala Gly Tyr Asn Ile

675 680 685

Glu Pro Asp Gln Val Arg Val Glu Ser Leu Val Pro Ala His Cys Glu

690 695 700

Gly Gly Ser Ile Asp His Phe Phe Glu Asn Gly Asp Glu Leu Asn Glu

705 710 715 720

Gln Met Val Gln Arg Leu Glu Ala Ala Arg Glu Met Gly Leu Val Leu

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Arg Tyr Val Ala Arg Phe Asp Ala Asn Gly Lys Ala Arg Val Gly Val

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

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Val Arg Phe Ala Gln Lys Ala Cys Ser Asn Ile His Ile Leu Arg Leu

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Met Arg Glu Gln Gly Val Lys Val Asp Ser Val Ser Leu Gly Glu Ile

65 70 75 80

Glu Arg Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Asn Pro Gln Thr His Pro Asp Asp

85 90 95

Ile Val Phe Thr Ala Asp Val Ile Asp Gln Ala Thr Leu Glu Arg Val

100 105 110

Ser Glu Leu Gln Ile Pro Val Asn Ala Gly Ser Val Asp Met Leu Asp

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Gln Leu Gly Gln Val Ser Pro Gly His Arg Val Trp Leu Arg Val Asn

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145 150 155 160

Asn Ser Lys His Gly Ile Trp Tyr Thr Asp Leu Pro Ala Ala Leu Asp

165 170 175

Val Ile Gln Arg His His Leu Gln Leu Val Gly Ile His Met His Ile

180 185 190

Gly Ser Gly Val Asp Tyr Ala His Leu Glu Gln Val Cys Gly Ala Met

195 200 205

Val Arg Gln Val Ile Glu Phe Gly Gln Asp Leu Gln Ala Ile Ser Ala

210 215 220

Gly Gly Gly Leu Ser Val Pro Tyr Gln Gln Gly Glu Glu Ala Val Asp

225 230 235 240

Thr Glu His Tyr Tyr Gly Leu Trp Asn Ala Ala Arg Glu Gln Ile Ala

245 250 255

Arg His Leu Gly His Pro Val Lys Leu Glu Ile Glu Pro Gly Arg Phe

260 265 270

Leu Val Ala Gln Ser Gly Val Leu Ile Thr Gln Val Arg Ser Val Lys

275 280 285

Gln Met Gly Ser Arg His Phe Val Leu Val Asp Ala Gly Phe Asn Asp

290 295 300

Leu Met Arg Pro Ala Met Tyr Gly Ser Tyr His His Ile Ser Ala Leu

305 310 315 320

Ala Ala Asp Gly Arg Ser Leu Glu His Ala Pro Thr Val Glu Thr Val

325 330 335

Val Ala Gly Pro Leu Cys Glu Ser Gly Asp Val Phe Thr Gln Gln Glu

340 345 350

Gly Gly Asn Val Glu Thr Arg Ala Leu Pro Glu Val Lys Ala Gly Asp

355 360 365

Tyr Leu Val Leu His Asp Thr Gly Ala Tyr Gly Ala Ser Met Ser Ser

370 375 380

Asn Tyr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Val Leu Phe Asp Asn Gly

385 390 395 400

Gln Ala Arg Leu Ile Arg Arg Arg Gln Thr Ile Glu Glu Leu Leu Ala

405 410 415

Leu Glu Leu Leu

420

<210> 7

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

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50 55 60

Val Val Trp Val Asp Asp Arg Asn Gln Ile Gln Val Asn Arg Ala Trp

65 70 75 80

Arg Val Gln Phe Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Met Arg

85 90 95

Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe Leu Gly Phe Glu

100 105 110

Gln Thr Phe Lys Asn Ala Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Glu Gly Glu Val Met

130 135 140

Arg Phe Cys Gln Ala Leu Met Thr Glu Leu Tyr Arg His Leu Gly Ala

145 150 155 160

Asp Thr Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Val

165 170 175

Gly Phe Met Ala Gly Met Met Lys Lys Leu Ser Asn Asn Thr Ala Cys

180 185 190

Val Phe Thr Gly Lys Gly Leu Ser Phe Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro

195 200 205

Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Phe Thr Glu Ala Met Leu Lys

210 215 220

Arg His Gly Met Gly Phe Glu Gly Met Arg Val Ser Val Ser Gly Ser

225 230 235 240

Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Met Glu Phe Gly Ala

245 250 255

Arg Val Ile Thr Ala Ser Asp Ser Ser Gly Thr Val Val Asp Glu Ser

260 265 270

Gly Phe Thr Lys Glu Lys Leu Ala Arg Leu Ile Glu Ile Lys Ala Ser

275 280 285

Arg Asp Gly Arg Val Ala Asp Tyr Ala Lys Glu Phe Gly Leu Val Tyr

290 295 300

Leu Glu Gly Gln Gln Pro Trp Ser Leu Pro Val Asp Ile Ala Leu Pro

305 310 315 320

Cys Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asp Val Asp Ala Ala His Gln Leu Ile

325 330 335

Ala Asn Gly Val Lys Ala Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr

340 345 350

Ile Glu Ala Thr Glu Leu Phe Gln Gln Ala Gly Val Leu Phe Ala Pro

355 360 365

Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Gly Leu Glu Met

370 375 380

Ala Gln Asn Ala Ala Arg Leu Gly Trp Lys Ala Glu Lys Val Asp Ala

385 390 395 400

Arg Leu His His Ile Met Leu Asp Ile His His Ala Cys Val Glu His

405 410 415

Gly Gly Glu Gly Glu Gln Thr Asn Tyr Val Gln Gly Ala Asn Ile Ala

420 425 430

Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile

435 440 445

<210> 8

<211> 2463

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 8

atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60

gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120

gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180

ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240

gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300

ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360

gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420

cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480

ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540

gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600

gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660

gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720

cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780

ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840

ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900

gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata acatggcaat gttcagcgtt 960

tctggtccgg ggatgaaagg gatggtcggc atggcggcgc gcgtctttgc agcgatgtca 1020

cgcgcccgta tttccgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag catcagtttc 1080

tgcgttccac aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140

gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcagtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200

gtggtaggtg atggtatgcg caccttgcgt gggatctcgg cgaaattctt tgccgcactg 1260

gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320

gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380

aataccgatc aggttatcga agtgtttgtg attggcgtcg gtggcgttgg cggtgcgctg 1440

ctggagcaac tgaagcgtca gcaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500

tgcggtgttg ccaactcgaa ggctctgctc accaatgtac atggccttaa tctggaaaac 1560

tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620

gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680

gcggatcaat atgccgactt cctgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740

gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800

cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860

aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920

tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980

cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040

cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100

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aatctgtcac aactcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220

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tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtactgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400

gttacagctg ccggtgtctt tgctgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460

tga 2463

<210> 9

<211> 2433

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 9

atgagtgtga ttgcgcaggc aggggcgaaa ggtcgtcagc tgcataaatt tggtggcagt 60

agtctggctg atgtgaagtg ttatttgcgt gtcgcgggca ttatggcgga gtactctcag 120

cctgacgata tgatggtggt ttccgccgcc ggtagcacca ctaaccagtt gattaactgg 180

ttgaaactaa gccagaccga tcgtctctct gcgcatcagg ttcaacaaac gctgcgtcgc 240

tatcagtgcg atctgattag cggtctgcta cccgctgaag aagccgatag cctcattagc 300

gcttttgtca gcgaccttga gcgcctggcg gcgctgctcg acagcggtat taacgacgca 360

gtgtatgcgg aagtggtggg ccacggggaa gtatggtcgg cacgtctgat gtctgcggta 420

cttaatcaac aagggctgcc agcggcctgg cttgatgccc gcgagttttt acgcgctgaa 480

cgcgccgcac aaccgcaggt tgatgaaggg ctttcttacc cgttgctgca acagctgctg 540

gtgcaacatc cgggcaaacg tctggtggtg accggattta tcagccgcaa caacgccggt 600

gaaacggtgc tgctggggcg taacggttcc gactattccg cgacacaaat cggtgcgctg 660

gcgggtgttt ctcgcgtaac catctggagc gacgtcgccg gggtatacag tgccgacccg 720

cgtaaagtga aagatgcctg cctgctgccg ttgctgcgtc tggatgaggc cagcgaactg 780

gcgcgcctgg cggctcccgt tcttcacgcc cgtactttac agccggtttc tggcagcgaa 840

atcgacctgc aactgcgctg tagctacacg ccggatcaag gttccacgcg cattgaacgc 900

gtgctggcct ccggtactgg tgcgcgtatt gtcaccagcc acgatgatgt ctgtttgatt 960

gagtttcagg tgcccgccag tcaggatttc aaactggcgc ataaagagat cgaccaaatc 1020

ctgaaacgcg cgcaggtacg cccgctggcg gttggcgtac ataacgatcg ccagttgctg 1080

caattttgct acacctcaga agtggccgac agtgcgctga aaatcctcga cgaagcggga 1140

ttacctggcg aactgcgcct gcgtcagggg ctggcgctgg tggcgatggt cggtgcaggc 1200

gtcacccgta acccgctgca ttgccaccgc ttctggcagc aactgaaagg ccagccggtc 1260

gaatttacct ggcagtccga tgacggcatc agcctggtgg cagtactgcg caccggcccg 1320

accgaaagcc tgattcaggg gctgcatcag tccgtcttcc gcgcagaaaa acgcatcggc 1380

ctggtattgt tcggtaaggg caatatcggt tcccgttggc tggaactgtt cgcccgtgag 1440

cagagcacgc tttcggcacg taccggcttt gagtttgtgc tggcaggtgt ggtggacagc 1500

cgccgcagcc tgttgagcta tgacgggctg gacgccagcc gcgcgttagc cttcttcaac 1560

gatgaagcgg ttgagcagga tgaagagtcg ttgttcctgt ggatgcgcgc ccatccgtat 1620

gatgatttag tggtgctgga cgttaccgcc agccagcagc ttgctgatca gtatcttgat 1680

ttcgccagcc acggtttcca cgttatcagc gccaacaaac tggcgggagc cagcgacagc 1740

aataaatatc gccagatcca cgacgccttc gaaaaaaccg ggcgtcactg gctgtacaat 1800

gccaccgtcg gtgcgggctt gccgatcaac cacaccgtgc gcgatctgat cgacagcggc 1860

gatactattt tgtcgatcag cgggatcttc tccggcacgc tctcctggct gttcctgcaa 1920

ttcgacggta gcgtgccgtt taccgagctg gtggatcagg cgtggcagca gggcttaacc 1980

gaacctgacc cgcgtgacga tctctctggc aaagacgtga tgcgcaagct ggtgattctg 2040

gcgcgtgaag caggttacaa catcgaaccg gatcaggtac gtgtggaatc gctggtgcct 2100

gctcattgcg aaggcggcag catcgaccat ttctttgaaa atggcgatga actgaacgag 2160

cagatggtgc aacggctgga agcggcccgc gaaatggggc tggtgctgcg ctacgtggcg 2220

cgtttcgatg ccaacggtaa agcgcgtgta ggcgtggaag cggtgcgtga agatcatccg 2280

ttggcatcac tgctgccgtg cgataacgtc tttgccatcg aaagccgctg gtatcgcgat 2340

aaccctctgg tgatccgcgg acctggcgct gggcgcgacg tcaccgccgg ggcgattcag 2400

tcggatatca accggctggc acagttgttg taa 2433

<210> 10

<211> 1413

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 10

atgaaaaaga ccaaaattgt ttgcaccatc ggaccgaaaa ccgaatctga agagatgtta 60

gctaaaatgc tggacgctgg catgaacgtt atgcgtctga acttctctca tggtgactat 120

gcagaacacg gtcagcgcat tcagaatctg cgcaacgtga tgagcaaaac tggtaaaacc 180

gccgctatcc tgcttgatac caaaggtccg gaaatccgca ccatgaaact ggaaggcggt 240

aacgacgttt ctctgaaagc tggtcagacc tttactttca ccactgataa atctgttatc 300

ggcaacagcg aaatggttgc ggtaacgtat gaaggtttca ctactgacct gtctgttggc 360

aacaccgtac tggttgacga tggtctgatc ggtatggaag ttaccgccat tgaaggtaac 420

aaagttatct gtaaagtgct gaacaacggt gacctgggcg aaaacaaagg tgtgaacctg 480

cctggcgttt ccattgctct gccagcactg gctgaaaaag acaaacagga cctgatcttt 540

ggttgcgaac aaggcgtaga ctttgttgct gcttccttta ttcgtaagcg ttctgacgtt 600

atcgaaatcc gtgagcacct gaaagcgcac ggcggcgaaa acatccacat catctccaaa 660

atcgaaaacc aggaaggcct caacaacttc gacgaaatcc tcgaagcctc tgacggcatc 720

atggttgcgc gtggcgacct gggtgtagaa atcccggtag aagaagttat cttcgcccag 780

aagatgatga tcgaaaaatg tatccgtgca cgtaaagtcg ttatcactgc gacccagatg 840

ctggattcca tgatcaaaaa cccacgcccg actcgcgcag aagccggtga cgttgcaaac 900

gccatcctcg acggtactga cgcagtgatg ctgtctggtg aatccgcaaa aggtaaatac 960

ccgctggaag cggtttctat catggcgacc atctgcgaac gtaccgaccg cgtgatgaac 1020

agccgtctcg agttcaacaa tgacaaccgt aaactgcgca ttaccgaagc ggtatgccgt 1080

ggtgccgttg aaactgctga aaaactggat gctccgctga tcgtggttgc tactcagggc 1140

ggtaaatctg ctcgcgcagt acgtaaatac ttcccggatg ccaccatcct ggcactgacc 1200

accaacgaaa aaacggctca tcagttggta ctgagcaaag gcgttgtgcc gcagcttgtt 1260

aaagagatca cttctactga tgatttctac cgtctgggta aagaactggc tctgcagagc 1320

ggtctggcac acaaaggtga cgttgtagtt atggtttctg gtgcactggt accgagcggc 1380

actactaaca ccgcatctgt tcacgtcctg taa 1413

<210> 11

<211> 1344

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 11

atggatcaga catattctct ggagtcattc ctcaaccatg tccaaaagcg cgacccgaat 60

caaaccgagt tcgcgcaagc cgttcgtgaa gtaatgacca cactctggcc ttttcttgaa 120

caaaatccaa aatatcgcca gatgtcatta ctggagcgtc tggttgaacc ggagcgcgtg 180

atccagtttc gcgtggtatg ggttgatgat cgcaaccaga tacaggtcaa ccgtgcatgg 240

cgtgtgcagt tcagctctgc catcggcccg tacaaaggcg gtatgcgctt ccatccgtca 300

gttaaccttt ccattctcaa attcctcggc tttgaacaaa ccttcaaaaa tgccctgact 360

actctgccga tgggcggtgg taaaggcggc agcgatttcg atccgaaagg aaaaagcgaa 420

ggtgaagtga tgcgtttttg ccaggcgctg atgactgaac tgtatcgcca cctgggcgcg 480

gataccgacg ttccggcagg tgatatcggg gttggtggtc gtgaagtcgg ctttatggcg 540

gggatgatga aaaagctctc caacaatacc gcctgcgtct tcaccggtaa gggcctttca 600

tttggcggca gtcttattcg cccggaagct accggctacg gtctggttta tttcacagaa 660

gcaatgctaa aacgccacgg tatgggtttt gaagggatgc gcgtttccgt ttctggctcc 720

ggcaacgtcg cccagtacgc tatcgaaaaa gcgatggaat ttggtgctcg tgtgatcact 780

gcgtcagact ccagcggcac tgtagttgat gaaagcggat tcacgaaaga gaaactggca 840

cgtcttatcg aaatcaaagc cagccgcgat ggtcgagtgg cagattacgc caaagaattt 900

ggtctggtct atctcgaagg ccaacagccg tggtctctac cggttgatat cgccctgcct 960

tgcgccaccc agaatgaact ggatgttgac gccgcgcatc agcttatcgc taatggcgtt 1020

aaagccgtcg ccgaaggggc aaatatgccg accaccatcg aagcgactga actgttccag 1080

caggcaggcg tactatttgc accgggtaaa gcggctaatg ctggtggcgt cgctacatcg 1140

ggcctggaaa tggcacaaaa cgctgcgcgc ctgggctgga aagccgagaa agttgacgca 1200

cgtttgcatc acatcatgct ggatatccac catgcctgtg ttgagcatgg tggtgaaggt 1260

gagcaaacca actacgtgca gggcgcgaac attgccggtt ttgtgaaggt tgccgatgcg 1320

atgctggcgc agggtgtgat ttaa 1344

<210> 12

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgactatca cccagccgga cttatccgtg ttcgaaaccg tggaatctga ggtgcgctca 60

tattgccgtg gttggcctac cgtttttgac cgcgcacaag gttcgcgtat gtacgatgaa 120

gatggccacg cctatttaga cttctttgcg ggagcgggtt ccctcaatta cgggcacaac 180

aacccggtgc tgaaacgtgc gctgattgac tatcttgaac gtgatggtgt aacccatggt 240

ttggatatga gcacggcggc gaaacgcgca ttcctggaaa gctttcagaa ccttatttta 300

cgtccgcgcg atctgccgta taaagtaatg ttcccgggtc ccactggcac caatgcggta 360

gaatcggcgc tgaaattagc acgtaaagtg aagggtcgcg aagcgattgt ttcatttacc 420

aacgcattcc acggaatgag cctcggctcg ttagcagtta ccggcaatgc ttttaagcgc 480

gcaggtgcag gcattcctct ggtgcacggc acgcccatgc cgttcgacaa ctattttgat 540

ggtaaagttc cggactttct gtggtttgag cgcctgttag aagaccaggg gagcggtctg 600

aataaaccgg ccgccgtgat tgttgaaaca gttcaggggg aagggggtat caacgttgcc 660

cgtcctgaat ggctgcgtgc cctggcggaa ctgtgtaaac gccaagatat gctgctgatt 720

gtcgatgaca tccagatggg ctgtggccgc acgggcgcgt tcttcagctt cgaagaagcg 780

ggcgttactc cggatattgt tactgtatcg aaatcaattt ctggatacgg actgccaatg 840

tccctctgtc tttttaaacc ggaactggat atttgggagc cgggcgaaca taatgggacc 900

tttcgtggca ataacccggc attcgtgacg gcggcagcgg cgctgcagac ttattgggcg 960

gatggttcgg caatggaaaa acagactctg gcccgcggcg aacaggttga acaggccttg 1020

atcagcatca cggaagaaaa tctcgccgat gtaaaagaat atcgcggccg tggtctggtt 1080

tggggaatcg agtttaagga caaggaccgc gcgggtcgca ttgcacaacg tgcatttgaa 1140

ctgggccttc tgatcgaaac ctcaggcccg gaatcagagg ttgtgaaatt actgccggca 1200

ctgactatta cgccggaaga actggatgag ggccttcgta ctctcgcccg cgcggtccgt 1260

gaaaccgca 1269

<210> 13

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgactagtg atgcacaacc gactggtgca gatgcgcaac ctgcagtaac ctttcgtgct 60

gcgacactgg atgatggagc tgcgatgtgg cgtattgcgc gcgacagcca ggtgctggat 120

gttaacacct cgtatgcgta cctgctgatg gcgcgtgatt tcggtgcgca ttctgcggtc 180

gcggaggtag atggagaaat tgttgggtat tgcatgtcgt atttacgccc gcaggatccc 240

gatacagttt ttgtatggca gatcgcagtg gatgcaagtc agcgtggtcg cggtcttgca 300

ggccgtttac tggacgcagt tgttgatgca acaggtgccc gtgcgttaga gtcaaccgtt 360

actaccgata acgatgcaag caacgcgttg tttgcacgtt ttgcggaacg ccgtggagcc 420

acagagactg ttactgaatt catcacgcgt gaccacttcc cgcctgatga cgttcatgat 480

gcagaactgc tgcaccgcat tgaaccgctg accccggca 519

<210> 14

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgattgtgc gtaccctggc cgagtgtgaa aaaacagatc gcaaagttca ttcacaaacc 60

ggcacctggg attcaacacg tatgctgctc aaagatgata aagtgggttt ctcttttcat 120

attaccacga tttatgcagg ttcagagacc catattcatt accaaaacca ctttgaaagc 180

gtatattgta tttctggcaa tggcgagatt gagaccattg cggatggcaa aatctataaa 240

attgaaccgg gtaccctgta tgtgttggat aaacatgatg aacatctgtt acgtggcggt 300

tcggaagaca tgaaactggc ctgtgtcttt aatcctccac tgaatggccg cgaagtgcat 360

gacgaaagcg gcgtttatcc gctcgaggca gaaactgtg 399

Claims

1.一种用于产四氢嘧啶的重组菌的构建方法，其特征在于：将二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因通过重组载体导入受体菌得到用于产四氢嘧啶的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌；

所述二氨基丁酸氨基转移酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述二氨基丁酸乙酰基转移酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

所述四氢嘧啶合成酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

其中，所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌K12进行下述d1、d2和d3中任一种基因改造、任意两种基因改造结合或者三种基因改造结合得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

d1、将L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因截短得到的保留了L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因编码氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质中至少保留第1-470位氨基酸残基的蛋白质；

d2、将L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因截短得到的保留了L-天冬氨酸激酶活性的突变体基因编码氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质中至少保留第1-463位氨基酸残基的蛋白质；

d3、将二氨基庚二酸脱羧酶基因替换为谷氨酸脱氢酶基因；

其中，所述L-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因编码氨基酸序列为SEQ IDNo.4的蛋白质；

所述谷氨酸脱氢酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.7的蛋白质。

2.如权利要求1所述的一种用于产四氢嘧啶的重组菌的构建方法，其特征在于：所述重组载体含有二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因；所述重组载体中启动二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因转录的启动子是ara启动子，终止二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶基因转录的终止子是rrnB终止子。

3.如权利要求2所述的一种用于产四氢嘧啶的重组菌的构建方法，其特征在于：所述重组载体是将核苷酸序列为SEQ ID No.12的DNA分子替换载体pBADhisB的XhoI和BglⅡ识别位点间的片段、核苷酸序列为SEQ ID No.13的DNA分子替换载体pBADhisB的PstI和KpnI识别位点间的片段以及核苷酸序列为SEQID No.14的DNA分子替换载体pBADhisB的EcoRI和HindⅢ识别位点间的片段进行重组，进而得到重组载体PSKE。

4.一种按照权利要求1至3任一所述的用于产四氢嘧啶的重组菌的构建方法构建得到的重组菌。

5.如权利要求4所述的重组菌在产四氢嘧啶中的应用。

6.如权利要求5所述的重组菌在产四氢嘧啶中的应用，其特征在于：将重组菌用于催化转化制备四氢嘧啶，具体包括如下步骤：

（1）将权利要求4所述的重组菌经过阿拉伯糖诱导培养后得到诱导重组菌；

（2）用所述诱导重组菌催化L-天冬氨酸盐和甘油进行催化反应，得到转化液，从转化液中收集四氢嘧啶。