CN111705030A - 高产l-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株 - Google Patents

高产l-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产L‑高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株。本发明构建获得的一株产L‑高丝氨酸的大肠杆基因工程菌——大肠杆菌ZJUT H‑2/AS(Escherichia coli ZJUT H‑2/AS)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2020233，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明中针对ppc基因，pyc基因，iclR基因的改造适用于其他工程菌株，可以减少发酵过程中乙酸等副产物的积累；(2)本发明中蔗糖代谢基因scrA，scrB和scrK可以通过合适的载体导入到其他工程菌株中使其获得高效代谢蔗糖的能力；(3)采用本发明方法诱变育种获得的L‑高丝氨酸的大肠杆基因工程菌相对原始菌株H‑0，L‑高丝氨酸产量提高了347％，能够作为基因工程菌的原始菌株。

Description

高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株
(一)技术领域
本发明涉及高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法，以及一株高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌菌株。
(二)背景技术
L-高丝氨酸(L-homoserine，2-amino-4-hydroxybutyric acid，HS)是苏氨酸、甲硫氨酸和胱硫醚生物合成的中间代谢物。因其丰富的生物活性和保湿能力被广泛地应用于医药，饲料和化妆品生产。L-高丝氨酸作为一种重要的平台化合物常通过酶法或者化学法转化为四氢叶酸，高丝氨酸环二酮哌嗪等产品。目前L-高丝氨酸主要依赖于化学法合成得到。
化学法中最常用的合成方法有两种。(1)甲硫氨酸法：通过与碘甲烷反应形成鎓盐，然后加水溶解回流，在碱性条件下生成高丝氨酸，收率为68％。此方法虽然收率高，但是碘甲烷的价格昂贵，反应时间太长。(2)以丁内酯原料，通过溴化，氨化，水解反应合成高丝氨酸，收率为70％。此方法原料易得，收率较高，但是提纯步骤繁琐，反应时间长达24h。此外，还能以L-天冬氨酸为原料，经过酯化、消旋、拆分后得到D-天冬氨酸甲酯，然后由D-天冬氨酸甲酯氨解得D-天冬酰胺，D-天冬氨酸甲酯还原得D-高丝氨酸所用原料易得，合成工艺简单，成本较低，流程短，实验条件易于控制，产品光学纯度较高，是具有潜在工业应用价值的合成路线。
大肠杆菌因其明确的基因背景，清晰的代谢网络，较短的生长周期而被广泛用于苏氨酸，蛋氨酸，琥珀酸等天然产物的发酵生产。在大肠杆菌中L-高丝氨酸的合成路径如下：首先，葡萄糖等碳源经过糖酵解后转化为磷酸烯醇式丙酮酸。部分磷酸烯醇式丙酮酸被羧化为草酰乙酸的补充到柠檬酸循环中，其余转化为丙酮酸后以乙酰辅酶A的形式进入柠檬酸循环最后同样可转化为草酰乙酸。以上两种方式产生的草酰乙酸经过天冬氨酸转氨酶作用后得到天冬氨酸。天冬氨酸经过天冬氨酸激酶(由thrA，metL，lysC编码)催化为β-天冬氨酰磷酸，后经天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)催化为L-天冬氨酸-β-半醛，最后由高丝氨酸合成酶(由thrA，metL编码)催化为L-高丝氨酸。
(三)发明内容
本发明目的本发明目的是一种高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法，以及一株高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌菌株。
本发明采用的技术方案是：
高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)将大肠杆菌E.coli W3110中metI、metJ、metB、thrB、metA和lysA基因敲除，并且过表达metL基因，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetBΔthrB ΔmetA ΔlysATrc-metL，记为E.coli H-0；
(2)以E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA Trc-metL为出发菌株，用来源于pTrc99A的trc启动子替换ppc基因的启动子，敲除iclR基因，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metLTrc-ppc；
(3)将编码抗反馈抑制的丙酮酸羧化酶pyc突变基因、编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶融合蛋白的thrA突变基因和编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅲ的lysC突变基因导入菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc，构建得到菌株E.coli W3110ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP；所述pyc基因和lysC基因来自Corynebacterium glutamicum K051，thrA基因来自Escherichia coli str.K-12substr.W3110。
(4)将编码蔗糖转运蛋白的scrA基因、编码蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB基因和编码果糖激酶的scrK基因导入E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysAΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP/pSCR，即所述高产高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
本发明术语“反馈抑制”指的是丙酮酸羧化酶活性受到乙酰辅酶A的抑制、天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶融合蛋白活性受到高丝氨酸和苏氨酸的抑制。天冬氨酸激酶Ⅲ活性受到赖氨酸的抑制。所述充足载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。术语“增强”指的是增加由对应的多核苷酸编码的酶的活性。可以通过基因的过表达或替换基因组上该基因的表达调控序列(启动子替换等)。
所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
所述pyc突变基因是将pyc编码的蛋白第458位脯氨酸替换为丝氨酸获得的突变体编码基因，所述thrA突变基因是将thrA编码的蛋白第345位丝氨酸替换为苯丙氨酸获得的突变体编码基因，所述lysC突变基因是将lysC编码的蛋白第311位苏氨酸替换为异亮氨酸获得的突变体编码基因。
所述thrA基因，lysC基因，pyc基因可以实验室保存的pACYC*质粒(序列如SEQID.11所示)为载体。
具体的，所述pyc突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，thrA突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
具体的，所述scrA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述scrB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述scrK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。所述scrA基因，scrB基因和scrK基因可以pTrc99a质粒为载体。
大肠杆菌因其明确的基因背景，清晰的代谢网络，较短的生长周期而被广泛用于苏氨酸，蛋氨酸，琥珀酸等天然产物的发酵生产。在大肠杆菌中L-高丝氨酸的主要合成路径如图1所示：首先，葡萄糖等碳源经过糖酵解后转化为磷酸烯醇式丙酮酸。部分磷酸烯醇式丙酮酸被羧化为草酰乙酸的补充到柠檬酸循环中，其余转化为丙酮酸后以乙酰辅酶A的形式进入柠檬酸循环最后同样可转化为草酰乙酸。以上两种方式产生的草酰乙酸经过天冬氨酸转氨酶作用后得到天冬氨酸。天冬氨酸经过天冬氨酸激酶(由thrA，metL，lysC编码)催化为β-天冬氨酰磷酸，后经天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)催化为L-天冬氨酸-β-半醛，最后由高丝氨酸合成酶(由thrA，metL编码)催化为L-高丝氨酸。
本发明采用CRISPR-Cas9基因编辑技术(重组表达质粒构建示意图参见图2)敲除旁路代谢的相关基因(lysA，metB，thrB)和调节基因(metI)，并且过表达转运蛋白rhtB构建得高产菌株E.coli H-0，该菌株经过48h葡萄糖发酵后能积累3.2g/L产物，同时产生大量乙酸和α-酮戊二酸。然后以E.coli H-0为底盘菌株从节点物质磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸出发使用CRISPR-Cas9基因编辑和质粒过表达技术对柠檬酸循环进行了优化：首先将ppc基因(编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)的天然启动子替换为了trc启动子，又通过质粒过表达了基因pyccg P458S(pyc*)。基因ppc和pyc*分别编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶，这两种酶可以增加了柠檬酸循环的物质输入。然后过表达了thrAC1034T(thrA*)和lysCcg C932T(lysC*)基因，thrA*编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅲ和高丝氨酸脱氢酶I融合蛋白，lysC*编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶I。thrA*和lysC*的过表达将减少草酰乙酸，柠檬酸等副产物的积累。随后敲除乙醛酸途径转录调控因子的基因iclR强化了乙醛酸循环，强化菌株对乙酰辅酶A的利用能力。随着产物合成路径上代谢通量的增加，产量的提高受到碳源摄取速率和发酵环境的限制。最后使用蔗糖作为碳源来解决以上问题。
本发明还涉及构建所述产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法，将大肠杆菌E.coli W3110中metI、metJ、metB、thrB、metA和lysA基因敲除，并且过表达metL基因，构建得到菌株E.coli W3110ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA ΔlysATrc-metL；
(2)以E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA Trc-metL为出发菌株，通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法，用序列如SEQ ID NO.12所示的trc启动子替换ppc基因的启动子，敲除iclR基因(genebank登录号：NC_007779.1，4226394～4227218，complement)，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc；
(3)通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法，将序列如EQ ID NO.13所示的pyc突变基因、序列如SEQ ID NO.14所示的thrA突变基因和序列如SEQ ID NO.15所示的lysC突变基因导入菌株E.coli W3110 ΔmetIΔmetJΔmetB ΔthrBΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metLTrc-ppc，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetIΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP；
(4)通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法，将序列如SEQ ID NO.8所示的scrA基因、序列如SEQ ID NO.9所示的scrB基因和序列如SEQ ID NO.10所示的scrK基因导入E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetAΔlysAΔiclRTrc-metL Trc-ppc/pACP/pSCR，即所述产高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
本发明还涉及一株高产L-高丝氨酸的基因工程菌——大肠杆菌ZJUT H-2/AS(Escherichia coli ZJUT H-2/AS)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2020年6月22日，保藏编号CCTCC NO：M 2020233，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还涉及所述大肠杆菌ZJUT H-2/AS(Escherichia coli ZJUT H-2/AS)在微生物发酵制备L-高丝氨酸中的应用。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种利用代谢工程改造的大肠杆菌高产L-高丝氨酸的方法。经过改造后的大肠杆菌相比于野生型能更好的利用葡萄糖等碳源物质进行L-高丝氨酸的发酵生产，并且产量从0g/L提高到11.1g/L。本发明重组大肠杆菌可以减少乙酸和α-酮戊二酸的积累，并且能够使用蔗糖作为碳源，为工程菌株的构建提供了可行的路线。
(四)附图说明
图1为工程菌株中L-高丝氨酸的合成路径；
图2为重组表达质粒构建示意图；
图3为ppc基因启动子置换和iclR基因敲除后菌株的OD600，副产物和L-高丝氨酸相对效价变化柱形图；
图4为pyc基因、thrA基因、lysC基因和scrA基因、scrB基因、scrK基因依次导入后菌株的OD600，副产物和L-高丝氨酸相对效价变化柱形图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1：E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA的获得
(1)metI基因的敲除
为了阻断metI以实现L-蛋氨酸输入系统MetD的部分失活，使其减少L-蛋氨酸的摄入以降低对metA基因的反馈抑制作用，因此对野生型菌株中的metI基因进行了敲除，参见Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via theCRISPR-Cas9 System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514
通过CRISPR-Cas9系统编辑野生型大肠杆菌(Escherichia coli)W3110(购自大肠杆菌遗传育种中心The Coli Genetic Stock Center)基因组中编码L-蛋氨酸运输系统的metI基因。通过PCR使用引物1和引物2，以pTargetF载体作为模板构建能够表达靶定目的基因metI(genebank登录号：NC_007779.1，220968～221621)的sgRNA的pTarget-ΔmetI突变载体。PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔmetI载体。
通过PCR使用引物3和引物4，以大肠杆菌Escherichia coli W3110基因组为模板扩增得到metI基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10mino按同样的方法使用引物5和引物6扩增得到metI基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个DNA片段使用引物3和引物6进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃30s，55℃30s，72℃ lmin，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)。将pTarget-ΔmetI载体和回收的DNA片段一同电转化至含有pCas9载体的Escherichia coli W3110菌株。
为了电穿孔，转化有pCas9载体的Escherichia coli W3110菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物7和引物8进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在l000bp的DNA条带确认metI基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔmetI载体。然后将已经去除pTarget-ΔmetI载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。如此构建的菌株记为W3110ΔmetI。
表1：引物序列
引物1 TAATACTAGTCTACATCGGCTATAACGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物2 GCTCTAAAACTCGCGTTATAGCCGATGTAGACTAGTATTATACCTAGGAC
引物3 GACACGTTCTATTCTCGAAC
引物4 GTGTTGAACGAACCCAGTACCTCTACTTTT
引物5 GTACTGGGTTCGTTCAACACAACATAAATA
引物6 AAGCCCACTTTTTGCAGCAG
引物7 TACTGTTTTTGGCAACGTGG
引物8 TGGACGAATTTCTTCACGTT
(2)metJ基因的敲除
为了去除负调控转录因子MetJ对thrA、metI、lysC、asd、metA等基因转录水平的阻遏抑制作用，对W3110△metI菌株中的metJ基因进行了敲除。
通过CRISPR-Cas9系统编辑W3110△metI菌株基因组中编码负调控转录因子的metJ基因。通过PCR使用引物9和引物10，以pTargetF载体作为模板构建能够表达靶定目的基因metJ(genebank登录号：NC_007779.1，3508286～3508603)的sgRNA的pTarget-△metJ突变载体。PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用Dpnl于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-△metJ载体。
通过PCR使用引物11和引物12，以大肠杆菌Escherichia coli W3110基因组为模板扩增得到metJ基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min按同样的方法使用引物13和引物14扩增得到metJ基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个DNA片段使用引物11和引物14进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃30s，55℃ 30s，72℃ 1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)。将pTarget-△metJ载体和回收的DNA片段一同电转化至有pCas9载体的W3110△metI菌株。
为了电穿孔，转化有pCas9载体的W3110△metI菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物15和引物16进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在l000bp的DNA条带确认metJ基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-△metJ载体。然后将已经去除pTarget-△metJ载体的菌株在LB培养基中在37°下培养过夜以去除pCas载体。如此构建的菌株记为W3110 △metI△metJ。
表2：引物序列
引物9 TAATACTAGTATCTGCGTAAAGAGCGCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物10 GCTCTAAAACGCTGCGCTCTTTACGCAGATACTAGTATTATACCTAGGAC
引物11 ATGCCGGTATTAGTAAGTAC
引物12 CTTTTTTGCTGAGATACTTAATCCTCTTCG
引物13 TAAGTATCTCAGCAAAAAAGAGCGGCGCGG
引物14 TTTTGCCGTTTGCGCCAGTT
引物15 GTACCAGTTTGGGTTTTTCT
引物16 GAATATTCTTGCCGTAACGT
(3)metB基因的敲除
为了增加L-高丝氨酸的积累，通过敲除编码的胱硫脒合成酶的metB基因，阻断了O-琥珀酰-L-高丝氨酸分解代谢合成半胱氨酸的过程，以获得高浓度的、L-高丝氨酸，因此在W3110△metI△metJ菌种中对metB基因实施敲除。
通过CRISPR-Cas9系统编辑W3110△met△metJ菌株基因组中编码胱硫脒合成酶的metB基因。通过PCR使用引物17和引物18，以及pTargetF载体作为模板构建能够表达靶定目的基因metB(genebank登录号：NC_007779.1，3506849～3508009，complement)的sgRNA的pTarget-△metB突变载体。PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环；72℃继续延伸10mino将PCR产物用Dpnl于37℃处理3h，灭活后转化至E.coliBL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-△metB载体。
通过PCR使用引物19和引物20，以W3110△metI△metJ菌株的基因组为模板扩增得到metB基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物21和引物22扩增得到metB基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个DNA片段使用引物21和引物22进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃30s，72℃ 1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)。将pTarget-△metB载体和回收的DNA片段一同电转化至有pCas9载体的W3110ΔmetI △metJ菌株。
为了电穿孔，转化有pCas9载体的W3110 ΔmetIΔmetJ菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃培养，直至IJOD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物23和引物24进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在l000bp的DNA条带确认metB基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔmetB载体。然后将已经去除pTarget-ΔmetB载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。如此构建的菌株记为W3110 ΔmetI △metJ ΔmetB。
表3：引物序列
引物17 TAATACTAGTTTCGACAGTCTGGCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物18 GCTCTAAAACCGTTTCGCCAGACTGTCGAAACTAGTATTATACCTAGGAC
引物19 GCTTTACTTTGCGATGAGCG
引物20 ACACTCATTTGTGATGAAGTTCCCTGGGCT
引物21 ACTTCATCACAAATGAGTGTGATTGCGCAG
引物22 CAGCTGTTGCAGCAACGGGT
引物23 TGAGCGGGGTGTATTTCACC
引物24 ATTTGTGTCGCGGAATAGTC
(4)thrB基因的敲除
为了使胞内L-高丝氨酸的前体物质L-高丝氨酸的量得到进一步的积累，需要阻断L-高丝氨酸的代谢支路，而胞内的L-高丝氨酸经过thrB基因和thrC基因编码的高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶代谢合成L-苏氨酸。因此，对W3110 △metI △metJ△metB菌株中的thrB基因进行敲除。
通过CRISPR-Cas9系统对W3110 △metI△metJ△metB菌株基因组中编码高丝氨酸激酶的thrB基因进行编辑。通过PCR使用引物25和引物26，以pTargetF载体作为模板构建能够表达靶定目的基因thrB(genebank登录号：NC_007779.1，2801～3733)的sgRNA的pTarget-△thrB突变载体。PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环；72℃继续延伸10mino将PCR产物用Dpnl于37℃处理3h，灭活后转化至E.coliBL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-△thrB载体。
通过PCR使用引物27和引物28，以W3110△metI△metJ△metB菌株的基因组为模板扩增得到thrB基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸l0min按同样的方法使用引物29和引物30扩增得到thrB基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个DNA片段使用引物29和引物30进行融合PCR，PCR反应条件如下:95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)。将pTarget-△thrB载体和回收的DNA片段一同电转化至有pCas9载体的W3110 △metIΔmetJΔmetB菌株。
为了电穿孔转化有pCas9载体的W3110ΔmetIΔmetJΔmetB菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物31和引物32进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在l000bp的DNA条带确认thrB基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔthrB载体。然后将已经去除pTarget-ΔthrB载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。如此构建的菌株记为W3110 ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrB。
表4：引物序列
引物25 TAATATAG1AAAGTGGH AGAAAGT1AGAGCTAG AAATAG
引物26 GTTAAAATGGGAGGAGATATAGATTATATAGGAC
引物27 TGCTCAATGCAGGTGATGAA
引物28 AGAGTTTCAFGTCAGACTCCTAACTTCCAT
引物29 GGAGGTCTGACATGAAACTCTACAATCTGA
引物30 TTCATCAAACGCCTGCT
引物31 GTTGTCACGCCGAACAAAAA
引物32 ACCGAGACAACCAGCTGGTT
(5)metA基因的敲除
为了使胞内L-高丝氨酸的量得到进一步的积累，需要阻断L-高丝氨酸的代谢支路，而胞内的L-高丝氨酸经过metA基因编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶代谢合成O-琥珀酰高丝氨酸。因此，对W3110 △metIΔmetJΔmetBΔthrB菌株中的metA基因进行敲除。
通过CRISPR-Cas9系统对W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB菌株基因组中编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因进行编辑。通过PCR使用引物33和引物34，以pTargetF载体作为模板构建能够表达靶定目的基因metA(genebank登录号：NC_007779.1，4217870～4218799)的sgRNA的pTarget-A metA突变载体。PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用Dpnl于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔmetA载体。
通过PCR使用引物35和引物36，以W3110 ΔmetIΔmetJ ΔmetBΔthrB菌株的基因组为模板扩增得到metA基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃30s，55℃30s，72℃ 30s，重复30个循环；72℃继续延伸l0min按同样的方法使用引物37和引物38扩增得到metA基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个DNA片段使用引物37和引物38进行融合PCR，PCR反应条件如下:95℃ 5min；95℃ 30s，55℃30s，72℃ lmin，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)。将pTarget-AmetA载体和回收的DNA片段一同电转化至有pCas9载体的W3110 ΔmetIΔmetJ ΔmetBΔthrB菌株。
为了电穿孔，转化有pCas9载体的W3110 ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrB菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物39和引物40进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在l000bp的DNA条带确认metA基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔmetA载体。然后将已经去除pTarget-ΔmetA载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。如此构建的菌株记为W3110ΔmetI△metJ△metBΔthrBΔmetA。
表5：引物序列
Figure BDA0002573705110000101
Figure BDA0002573705110000111
(6)lysA基因的敲除
为了使胞内L-高丝氨酸的量得到进一步的积累，需要阻断赖氨酸代谢支路，而胞内的L-高丝氨酸经过lysA二氨基庚二酸酯脱羧酶。因此，对W3110 ΔmetIΔmetJ△metB△thrB△metA菌株中的lysA基因进行敲除。
通过CRISPR-Cas9系统对W3110 △metI△metJ△metB△thrB△metA菌株基因组中编码二氨基庚二酸脱羧酶的lysA基因进行编辑。通过PCR使用引物41和引物42，以pTargetF载体作为模板构建能够表达靶定目的基因lysA(genebank登录号：NC_007779.1，2976293～2977555，complement)的sgRNA的pTarget-△lysA突变载体。PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用Dpnl于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-△lysA载体。
通过PCR使用引物35和引物36，以W3110 △metI△metJ ΔmetBΔthrB△metA菌株的基因组为模板扩增得到lysA基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃30s，55℃30s，72℃ 30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min按同样的方法使用引物37和引物38扩增得到lysA基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个DNA片段使用引物35和引物38进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃ 30s，55℃30s，72℃ 1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)。将pTarget-lysA载体和回收的DNA片段一同电转化至有pCas9载体的W3110△metI△metJ△metB△thrB△metA菌株。
为了电穿孔，转化有pCas9载体的W3110△metI△metJ△metB△thrB△metA菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物39和引物40进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在l000bp的DNA条带确认lysA基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-△lysA载体。然后将已经去除pTarget-△lysA载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。如此构建的菌株记为W3110 ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA△lysA。
表6：引物序列
引物41 TAATACTAGTATGCCACATTCACTGTTCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物42 GCTCTAAAACCTGAACAGTGAATGTGGCATACTAGTATTATACCTAGGAC
引物43 TATTTAAGCTGACATCGGG
引物44 AACAAACTCCAGATAAGTGC
引物45 CTGCGGTTAGTCGCTGGTTG
引物46 GTTATCTGTGCTCTAACCAC
引物47 CTTCAAGTAGCGGTGATTCC
引物48 ATTTAATTCAGCAAGGTCAT
实施例2：基于W3110ΔmetI△metJ △metB △thrB△metAΔlysA菌株的代谢改造
(l)metL基因表达的增强
metL基因编码的酶也是具有天冬氨酸激酶II和高丝氨酸脱氢酶II双功能酶活性，在L-天冬氨酸的代谢中，metL和thrA基因发挥相似的作用，因此也将用trc启动子序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示)替换metL基因(genebank登录号：NC_007779.1，3504414～3506846,complement)中的原始启动子序列以达到增强metL基因表达的目的。
通过CRISPR-Cas9系统编辑W3110 ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA△lysA菌株基因组中编码高丝氨酸脱氢酶的metL基因的启动子序列。通过PCR使用引物49和引物50，以及pTargetF载体作为模板构建能够表达靶定目的基因metL启动子序列的sgRNA的pTarget-△PmetI::Ptrc突变载体。PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用Dpn1于37℃处理3h，灭活后转化至E.coliBL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-△PmetI::Ptrc载体。
通过PCR使用引物51和引物52，以W3110△metIΔmetJ△metBΔthrB△metA菌株的基因组为模板扩增得到metL基因启动子序列上游同源片段，metL基因的启动子序列信息是基于Ecocyc E.coli Database数据库中获得的(EcoCyc基因登记号:EG10590)。
PCR反应条件如下：95℃ 5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物53和引物54扩增得到metL基因启动子序列下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。将回收的两个DNA片段使用引物51和引物54的引物进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃ 5min 95℃ 30s，55℃30s，72℃lmin，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示)，该基因条带中已将trc启动子序列插入至两同源片段之间。将pTarget-△PmetI::Ptrc载体和回收的DNA片段一同电转化至有pCas9载体的W3110△metI△metJΔmetBΔthrBΔmetA菌株。
为了电穿孔，转化有pCas9载体的W3110ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA菌株在含有50mg/L的卡那霉素和l0mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物55和引物56进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在700bp的DNA条带确认metL基因的原始启动子序列已被trc启动子序列替换。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔPmetL::Ptrc载体。然后将已经去除pTarget-ΔPmetL::Ptrc载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。将去除pCas载体后的菌株使用引物51和引物52进行PCR扩增，PCR反应条件如下:95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min l5s，重复30个循环；72℃继续延伸10min，将PCR产物进行测序验证，测序结果通过BLAST序列比对确认metL基因的原位启动子序列已被trc启动子成功替换。构建的菌株记为W3110 ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrB△metA△lysA Trc-metL(记为H-0)。
表7：引物序列
引物49 TAATACTAGTATGCCGATTCGTGTGCCGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物50 GCTCTAAAACTCCGGCACACGAATCGGCATACTAGTATTATACCTAGGAC
引物51 ATGCCGATTCGTGTGCCGGAC
引物52 GCTCGTAAACGCCAGAGAGTTTTTCGGTG
引物53 CTCTCTGGCGTTTACGAGCATCATATTCTC
引物54 TTAATCCAGCGTTGGATTC
引物55 CTACGCCCCCACATACGCC
引物56 CAATCAGCATCGCGAATGG
实施例3：替换ppc基因的启动子，敲除iclR基因
(1)以E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA Trc-metL(即菌株H-0)为出发菌，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，用来源于pTrc99A的trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.12所示)替换ppc基因的启动子。
(2)使用表8引物构建pTarget质粒。
表8：构建用于启动子置换的pTarget质粒的引物
Figure BDA0002573705110000131
Figure BDA0002573705110000141
表8中的除pTarget R-common外的引物具有相同的结构特征，用pTarget R-common引物与其余任意一条引物组合，以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，可以扩增获得对应基因的新的线性pTarget质粒片段，PCR产物使用NEB(北京)有限公司的内切酶DpnI进行消化，Clean up试剂盒回收DNA片段，再用T4连接酶连接10h转化到E.coli DH5α中，壮观酶素平板筛选，测序验证后提取质粒获得基因相应的pTarget质粒，用于后续基因编辑。
(3)使用表9引物扩增donor DNA片段。
表9：构建donor DNA的引物序列
Figure BDA0002573705110000142
以E.coli W3110基因组为模版，通过表9中的引物扩增获得donor DNA的上下游同源臂，胶回收纯化PCR片段，然后以上下同源臂为模板，用overlap进行同源臂的拼接，拼接PCR扩增获得表9所示基因的完整donor DNA片段，用于后续基因编辑。
(4)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL中，单克隆接种到LB试管中，30℃过夜培养，再以体积浓度1％的接种量接种到含50ml LB培养基的250ml摇瓶中，并加入500μl1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm，30℃培养至OD600 0.4～0.6，4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3edEdition，99-102)的描述。
(5)取5μl表9基因对应的donor DNA，1μl表1基因对应的pTarget质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1ml LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5ml离心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养12～16h，以引物V-X-F和V-X-R为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段1000bp左右的片段，则证明是阳性菌落，构建得到相应基因型的菌株(表10)，其中E.coliW3110 ΔmetIΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA Trc-metL Trc-ppc记为E.coliTrc-ppc，E.coli W3110 ΔmetIΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metLTrc-ppc记为E.coli ΔiclR Trc-ppc
表10：构建的新型菌株
Figure BDA0002573705110000151
实施例3：获得突变的pyc基因，thrA基因和lysC基因片段
表11：获得pyc基因，thrA基因，lysC基因片段的引物序列
Figure BDA0002573705110000152
以E.coli W3110基因组为模版，通过表11中引物扩增获得thrA基因片段，PCR产物使用NEB(北京)有限公司的内切酶DpnI进行消化，Clean up试剂盒回收DNA片段。
以Corynebacterium glutamicum K051基因组为模版，通过表11中引物扩增获得pyc基因和lysC基因片段，PCR产物使用NEB(北京)有限公司的内切酶DpnI进行消化，Cleanup试剂盒回收DNA片段。
表12：获得突变pyc基因，突变thrA基因，突变lysC基因片段的引物序列
Figure BDA0002573705110000153
Figure BDA0002573705110000161
以pyc基因，thrA基因，lysC基因为模板使用表12中的引物首先扩增获得相应的A和B片段，然后用overlap进行同源臂的拼接，拼接PCR扩增获得完整的突变pyc基因(EQ IDNO.13)，突变thrA基因(EQ ID NO.14)，突变lysC基因(EQ ID NO.15)片段，用于后续基因编辑。
实施例4：构建突变pyc基因，突变thrA基因，突变lysC基因的质粒载体
表13：构建突变pyc基因，突变thrA基因，突变lysC基因载体的引物序列
Figure BDA0002573705110000162
以质粒PACYC184*为模板使用表13中引物扩增获得线性pACYC片段，然后使用诺唯赞公司的
Figure BDA0002573705110000163
试剂盒与突变pyc基因，突变thrA基因，突变lysC基因完成连接，获得质粒载体pACP。
实施例5：获得scrA基因，scrB基因，scrK基因
在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上获得菌株Streptococcusmutans UA159的中的scrA基因，scrB基因，scrK基因的核苷酸序列，然后由Genscript公司负责密码子优化并合成。
表14：获得scrA基因，scrB基因，scrK基因片段的引物序列
Figure BDA0002573705110000164
以合成的质粒载体为模板使用表14中的引物扩增获得scrA基因(SEQ ID NO.8)，scrB基因(SEQ ID NO.9)，scrK基因(SEQ ID NO.10)片段。
实施例6：scrA基因，scrB基因，scrK基因表达载体的构建
表15：构建scrA基因，scrB基因，scrK基因载体的引物序列
Figure BDA0002573705110000171
以质粒pTrc99a为模板使用表15中引物扩增获得线性pTrc99a片段，PCR产物使用NEB(北京)有限公司的内切酶DpnI进行消化，Clean up试剂盒回收DNA片段，然后使用诺唯赞公司的
Figure BDA0002573705110000172
试剂盒降低scrA基因，scrB基因，scrK基因完成连接后转入E.coliDH5α中，氯霉素平板筛选，测序验证后提取质粒获得pACP质粒，用于后续改造。
实施例7：突变pyc基因，突变thrA基因，突变lysC基因的导入
(1)化转感受态的制备：从平板上挑取E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc单菌落接种到5mL的LB培养基中，37℃、200rpm恒温摇床培养箱过夜培养；然后吸取400mL菌液转接至40mL的LB培养基中，37℃、200rpm恒温摇床培养至OD处于0.4～0.6之间；将装有菌液的摇瓶置于冰里冷却10min左右，4℃，4000×g离心5min收集菌体；加入15mL预冷的11.1g/L的CaCl2无菌溶液，冰水浴重悬(动作轻柔)后冰浴30min；4000×g离心5min后加入1mL预冷的含11.1g/L CaCl2和15％甘油的无菌溶液，冰水浴重悬后分装至无菌1.5mL离心管(100μL每管)，-80℃保藏，用于化学转化。
(2)将pACP质粒转入E.coli W3110ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA ΔlysAΔiclR Trc-metLTrc-ppc的化学转化感受态中氯霉素平板筛选，测序验证后提取质粒获得菌株E.coli W3110ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetAΔlysAΔiclRTrc-metL Trc-ppc/pACP(记为ΔiclR Trc-ppc/pACP)，用于后续改造和发酵。
实施例8：scrA基因，scrB基因，scrK基因的导入
(1)电转感受态的制备：将E.coli W3110 ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP接种于的LB培养基中，30℃恒温摇床培养至OD600处于0.4～0.6之间；将装有菌液的摇瓶置于冰里冷却10min左右，4℃，4000×g离心5min收集菌体；加入40mL预冷的超纯水，冰水浴重悬后4000×g离心6min再次加入40mL预冷的超纯水，冰水浴重悬后4000×g离心7min后加入30mL预冷的含10％甘油的无菌溶液，冰水浴重悬后4000×g离心8min后加入0.8mL预冷的含10％甘油的无菌溶液，冰水浴重悬后分装至无菌1.5mL离心管(100μL每管)，-80℃保藏。
(2)将pSCR质粒转入E.coli W3110 ΔmetIΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysAΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP的电击转化感受态中氯霉素加卡纳抗性的平板筛选，测序验证后提取质粒获得菌株E.coli W3110 ΔmetIΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP/pSCR(记为ΔiclR Trc-ppc/pACP/pSCR)，即CCTCC NO：M2020233。
实施例9：不同基因型菌株的摇瓶发酵测试
将实施例1，实施例6，实施例7构建的一系列不同基因型菌株接种到10ml LB培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物。8～12h后，接种1ml预培养物到装有20ml MS培养基的500ml摇瓶中。然后在30℃、150rpm培养48h(蔗糖发酵72h)，发酵结束后取1ml发酵液测定OD600；取1ml发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释100倍，用全自动氨基酸分析仪(SYKAM S-433D，德国)分析氨基酸效价。在工程菌株中ppc基因启动子置换和iclR基因敲除后进行48h摇瓶发酵，OD600，副产物和L-高丝氨酸相对效价变化柱形图参见图3，由图可见，ppc基因的过表达能有效地为柠檬酸循环提供物质输入有助于菌体的生长，得到的前体物质草酰乙酸则有助于产物的积累，菌株E.coli ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetAΔlysA Trc-metL Trc-ppc菌体量提高至16.5，HS产量达到5.5g/L；随后敲除iclR基因，工程菌株可以减少合成α-酮戊二酸的碳流分配，并且利用乙酰辅酶A合成苹果酸，将副产物有效地用于前体物质的合成。菌株E.coli ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysAΔiclR Trc-metL Trc-ppc乙酸降低至0.3g/L，α-酮戊二酸降低至3.4g/L，产量为4.2g/L。ppc基因和iclR基因的改造为菌株提供了充足的前体物质，改善了发酵环境有助于后续改造的进行。
pyc基因、thrA基因、lysC基因和scrA基因、scrB基因、scrK基因依次导入后菌株的OD600，副产物和L-高丝氨酸相对效价变化柱形图参见图4。由图可见，在对ppc基因和iclR基因进行改造而获得充足的前体物质后，pyc基因、thrA基因、lysC基因的过表达将进一步强化前体物质的供给，并且将其用于产物的合成。产量达到9.9g/L，乙酸积累0.6g/L，α-酮戊二酸积累3.2g/L。在菌株ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP碳源可以被高效地摄入并且高效地合成高丝氨酸。而scrA基因、scrB基因、scrK基因的导入可以让大肠杆杆菌进行高效率的蔗糖发酵，这不仅提高了碳源的摄入速率，蔗糖代谢也能影响了胞内多种基因的转录水平，从而达到更高的合成效率。根据专利Ju J Y，Lee K H，Bae，H A.Microorganism which produces L-amino acid and methodfor producing L-amino acid using the same:EP，2405005A2.2012-01-11.所述配制蔗糖培养基，使用菌株E.coli ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP/pSCR进行蔗糖发酵。经过72h发酵后获得了11g/L产量，OD达到40，除0.2g/L的乙酸外未检测到其他副产物积累。因为蔗糖代谢时工程菌株对碳源的摄入效率高于葡萄糖代谢。同时也启用了果糖代谢途径，因此胞内关键基因的转录水平也发生了变化，有利于L-高丝氨酸的合成。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS培养基：葡萄糖40g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物4g/L、MgSO40.5g/L、CaCO3 20g/L，1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；1mL/L微量元素溶液组成：CuCl2 10g/L、FeSO4·7H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 1g/L、CuSO4 0.20g/L、NiCl2·7H2O0.02g/L，溶剂为去离子水。
蔗糖发酵培养基：蔗糖70g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 1g/L、酵母提取物4g/L、MgSO40.5g/L、CaCO3 20g/L，1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；1mL/L微量元素溶液组成：CuCl2 10g/L、FeSO4·7H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 1g/L、CuSO4 0.20g/L、NiCl2·7H2O0.02g/L，溶剂为去离子水。
不同基因型的菌株发酵的产量如表16所示。
表16：不同基因型工程菌株的发酵结果
Figure BDA0002573705110000191
经代谢工程改造后的菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetB ΔthrB ΔmetAΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP/pSCR(CCTCC NO：M 2020233)L-高丝氨酸产量最高，达到11.15g/L。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，如以其他属于大肠杆菌属的微生物作为出发菌株，对另一套摄入系统的破坏，其他分泌因子的表达上调，对其他碳源的利用，以及发酵过程优化、补料工艺开发均在本发明的范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1044
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
gacacgttct attctcgaac cgaccgcatc tgctgaaaga gttgatcacc cacgaaatgg 60
acgttgtgaa caatggagaa ctgatcgagc gctggcgcag aagtttattc acgtctgcaa 120
gcggagccat tcaatcggtc gatgccccac gtccgggctg tcactcgcaa cattctggtt 180
gtaacatcaa ccgccgtctg gggttgacga ttctgcgcat ttgtgattgc gtggcggtca 240
tcagaggaca cggtaagtga agtgttctcg catccgaaaa cgccagtcga ccctgcatct 300
ggatatcccg gaagattacc aggattactg actgcgtgcc gatgctgcgt ctggagttta 360
ccggtgcttt ctgaaaccgc gcgtcattat tagcgcgcag atggattacg ccggtggcgt 420
taagcgtttc aacgtcaaca acaattcggc atcatgctga ctgatggctg caggaacacc 480
atgtaatgca cggcacacaa caagatacgc aagccgccat tgccaaaagt agaggtactg 540
ggttcgttca acacaacata aataattgaa gaaggaataa ggtatggcgt tcaaattcaa 600
aacctttgcg gcagtgggag ccctgatcgg atcactggca ctggtaggct gcggtcagga 660
tgaaaaagat ccaaaccaca ttaaagtcgg cgtgattgtt ggtgccgaac agcaggttgc 720
agaagtcgcg cagaaagttg cgaaagacaa atatggcctg gacgttgagc tggtaacctt 780
caacgactat gttctgccaa acgaagcatt gagcaaaggc gatagatcgt ggcttccaag 840
aaaagaccca actatcgacg ccaacgcctt ccagcataaa ccgtaccttg atcagcaact 900
gaaaacaaac tggtcgcagt aggcaacact tttgtttatc cgattgctgg ttactcaaat 960
cactggatga actgcaggat ggttcgcagg ttgccgtgcc aaacaccttg gtcgttcact 1020
gctgctgctg caaaaagtgg gctt 1044
<210> 4
<211> 1000
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
gtattagtaa gtactgcacc agcaccacct tccagttctg ccagcgcacg ctgaaccaca 60
tcgcgcgttg ggttgccgcg acgcgagtaa tcatgcgcgc gcggttcatt aaatccggta 120
aagttatagg tgctggaaag atggatcggt gggacaacgc aaccatactg ttcgtcgtca 180
tttaacccgc tacgcactgc gatggtggcc tgtttacgcg tcatgtgatg aagttccctg 240
ggctttgtcg gtgaaatgtc aggcaccaga gtaaacattg tgttaatgga cgtcaataca 300
tctggacatc taaacttctt tgcgtataga ttgagcaaat cccaaatagc cgttaaaatt 360
atatgcatta tcacgccgac aggtgcatta cacgatgtca cggtaacgcc tgtacggtaa 420
actatgcggg tttacggtca gtacccacat caactgtgtg gtctggtctc aatttattga 480
cgaagaggat taagtatctc agcaaaaaag agcggcgcgg agtggaatcg cctgatgcgc 540
tacgcttatc aggcctacgt catattgcaa tttattgaat ttgcacgaac ttgtaggccg 600
gataaggcgt tcacgccgca tccggcataa acaacgagca cgttgtctgc gacccaccgc 660
tttttataca tggacgttta actatgaaaa acaggctgct gatcctcagc ctgctggttt 720
ctgtacctgc ctttgcctgg cagccacaaa ccggcgacat catctttcag atctctcgct 780
catcgcaaag taaagcgatc caactggcga cccataccga ttatagccac accggtatgc 840
tggtgatacg caacaaaaag ccctacgttt ttgaagcagt cggcccggtg aaatacaccc 900
cgctcaagca gtggatcgcc catggtgaaa agggcaaata cgttgttcgc cgcgttgaag 960
gcggactgag tgttgaacaa cagcaaaaac tggcgcaaac 1000
<210> 6
<211> 1000
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
gcatcatccg gcaaaggttg cccggtaaag gcatgcagaa acgcttcgca cagcagctcg 60
ctgttggtag cgtgacgcag gttgttcacc tgacgacgcg tgcgttcatc ggtgaggatt 120
tttaacacct taagaggaat ggaaaccgta atctttttga cttgttcact cttcttgccg 180
tgctcagcgt atgggctgat atattcgccg ctccattcag ccatgagata cttaatcctc 240
ttcgtcaata aattgagacc agaccacaca gttgatgtgg gtactgaccg taaacccgca 300
tagtttaccg tacaggcgtt accgtgacat cgtgtaatgc acctgtcggc gtgataatgc 360
atataatttt aacggctatt tgggatttgc tcaatctata cgcaaagaag tttagatgtc 420
cagatgtatt gacgtccatt aacacaatgt ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa 480
agcccaggga acttcatcac aaatgagtgt gattgcgcag gcaggggcga aaggtcgtca 540
gctgcataaa tttggtggca gtagtctggc tgatgtgaag tgttatttgc gtgtcgcggg 600
cattatggcg gagtactctc agcctgacga tatgatggtg gtttccgccg ccggtagcac 660
cactaaccag ttgattaact ggttgaaact aagccagacc gatcgtctct ctgcgcatca 720
ggttcaacaa acgctgcgtc gctatcagtg cgatctgatt agcggtctgc tacccgctga 780
agaagccgat agcctcatta gcgcttttgt cagcgacctt gagcgcctgg cggcgctgct 840
cgacagcggt attaacgacg cagtgtatgc ggaagtggtg ggccacgggg aagtatggtc 900
ggcacgtctg atgtctgcgg tacttaatca acaagggctg ccagcggcct ggcttgatgc 960
ccgcgagttt ttacgcgctg aacgcgccgc acaaccgcag 1000
<210> 8
<211> 1000
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 8
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tggtatggat gtggcgcgta aactattgat tctcgctcgt gaaacgggac gtgaactgga 120
gctggcggat attgaaattg aacctgtgct gcccgcagag tttaacgccg agggtgatgt 180
tgccgctttt atggcgaatc tgtcacaact cgacgatctc tttgccgcgc gcgtggcgaa 240
ggcccgtgat gaaggaaaag ttttgcgcta tgttggcaat attgatgaag atggcgtctg 300
ccgcgtgaag attgccgaag tggatggtaa tgatccgctg ttcaaagtga aaaatggcga 360
aaacgccctg gccttctata gccactatta tcagccgctg ccgttggtac tgcgcggata 420
tggtgcgggc aatgacgtta cagctgccgg tgtctttgct gatctgctac gtaccctctc 480
atggaagtta ggagtctgac atgaaactct acaatctgaa agatcacaac gagcaggtca 540
gctttgcgca agccgtaacc caggggttgg gcaaaaatca ggggctgttt tttccgcacg 600
acctgccgga attcagcctg actgaaattg atgagatgct gaagctggat tttgtcaccc 660
gcagtgcgaa gatcctctcg gcgtttattg gtgatgaaat cccacaggaa atcctggaag 720
agcgcgtgcg cgcggcgttt gccttcccgg ctccggtcgc caatgttgaa agcgatgtcg 780
gttgtctgga attgttccac gggccaacgc tggcatttaa agatttcggc ggtcgcttta 840
tggcacaaat gctgacccat attgcgggtg ataagccagt gaccattctg accgcgacct 900
ccggtgatac cggagcggca gtggctcatg ctttctacgg tttaccgaat gtgaaagtgg 960
ttatcctcta tccacgaggc aaaatcagtc cactgcaaga 1000
<210> 10
<211> 1000
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 10
ccaaccgcct gctcattttg ctcattaacg ttggttgtca gttccggtgc catcgagagc 60
gcatgctcca ccagcacccg acctacgccg cagccgcgca catcaggatc gataaacagc 120
gcatccatat gctgcccact tagcaacata aatccaaccg gctgatcccg ctcattaacc 180
gcgacccaca acggcgcttc cggcaggaag gaacgaacta ggtcctccag ctcggtccga 240
tactctgctg atagaaaatc gtgagtggca tcgacagaac gacaccaaat cgcaacgagt 300
tcctcccctt cctcatgccg tgagcggcga atactaataa ccattttctc tccttttagt 360
cattcttata ttctaacgta gtcttttcct tgaaactttc tcaccttcaa catgcaggct 420
cgacattggc aaattttctg gttatcttca gctatctgga tgtctaaacg tataagcgta 480
tgtagtgagg taatcaggtt tcttctgtga tagtcgatcg ttaagcgatt cagcacctta 540
cctcaggcac cttcgggtgc cttttttatt tccgaaacgt acctcagcag gtgaataaat 600
tttattcata ttgttatcaa caagttatca agtattttta attaaaatgg aaattgtttt 660
tgattttgca ttttaaatga gtagtcttag ttgtgctgaa cgaaaagagc acaacgatcc 720
ttcgttcaca gtggggaagt tttcggatcc atgacgagga gctgcacgat gactgaacag 780
gcaacaacaa ccgatgaact ggctttcaca aggccgtatg gcgagcagga gaagcaaatt 840
cttactgccg aagcggtaga atttctgact gagctggtga cgcattttac gccacaacgc 900
aataaacttc tggcagcgcg cattcagcag cagcaagata ttgataacgg aacgttgcct 960
gattttattt cggaaacagc ttccattcgc gatgctgatt 1000
<210> 12
<211> 1003
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 12
tatttaagct gacatcggga taacgtgcca gaaagggttg caggagctgc ggtaaaaaag 60
attgcgaaaa gaccggcagg caggcaatag acagttctcc ctggcgaaac tcgcgcagac 120
tttctgcggc gctgacaatg cgatccagtc cgtaccagga tcgttgcact tcttcaaaca 180
gacgcagtcc ttgcacggta ggatgtaatc gcccacgtac gcgctcaaac aatttcagcc 240
cgatcacctt ctcaaagcgc gcaagttcgc ggctgacggt tggctgtgag gtgtgtagca 300
ggtgtgccgc ctcagtcagg cttccggcgg tcattaccgc atgaaaaatt tcaatatgac 360
gtaagttaac ggcggccatt agcgctctct cgcaatccgg taatccatat catttttgca 420
tagactcgac ataaatcgat attttttatt ctttttatga tgtggcgtaa tcataaaaaa 480
gcacttatct ggagtttgtt taactgcggt tagtcgctgg ttgcatgatg acttgcctcc 540
agcgacggag ttgacactga atgacgacgt accagcgtcg gactaaagac attagtgatt 600
tccgggagag ggcgattatc cgccagcgcc aaagccagtt cggcagcctg ggtcgccatc 660
gtcacgattg ggtaacgcac ggtggtcagg cgcggacgca catagcgtga caccagcaca 720
tcatcaaagc caattaacga aatctcaccc ggtacatcaa taccattatc attgagaacg 780
cccatcgcac ccgccgccat tgaatcgtta taacaggcta ccgcagtgaa atttcttcct 840
cgtcccaaaa gctcggtcat tgcctgttcg ccgccgcttt cgtctggttc gccaaatgtc 900
accagccggt cattggccgc aataccactt tcagcaaggg catcgtaata cccttgcaga 960
cgatcttcgg cgtcagaaat agagtggtta gagcacagat aac 1003
<210> 14
<211> 1000
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 14
ctggcctggt gggcaaacaa tattggcgtg acgggcggcg cgtttgacag ctatctgctg 60
ctacgtgggt tgcgaacgct ggtgccgcgt atggagctgg cgcagcgcaa cgcgcaggcg 120
attgtgaaat acctgcaaac ccagccgttg gtgaaaaaac tgtatcaccc gtcgttgccg 180
gaaaatcagg ggcatgaaat tgccgcgcgc cagcaaaaag gctttggcgc aatgttgagt 240
tttgaactgg atggcgatga gcagacgctg cgtcgtttcc tgggcgggct gtcgttgttt 300
acgctggcgg aatcattagg gggagtggaa agtttaatct ctcacgccgc aaccatgaca 360
catgcaggca tggcaccaga agcgcgtgct gccgccggga tctccgagac gctgctgcgt 420
atctccaccg gtattgaaga tggcgaagat ttaattgccg acctggaaaa tggcttccgg 480
gctgcaaaca aggggtaaaa tttcagaaat ttaataatgc ccggtactca tgttttcggg 540
tttatggttt ctaatgaaat atattgaatt atcataggat taggccggat taagcgttta 600
cgacgaatcc ggcaagaagc aataagtaca tggttagttt atatttgcag tccggtttgc 660
tttgcatacc ggattttctt tttcttacca tcctgaagtt ttttcatctt ccctgatttt 720
tcctcaccat cattggtcat ttttcggttg acgcccttcg gcttttcctt catctttaca 780
tctggacgtc taaacggata gatgtgcaca acacaacata taactacaag cgattgatga 840
ggtaaggtat gagctttttt cacgccagcc agcgggatgc cctgaatcag agcctggcag 900
aagtccaggg gcagattaac gtttcgttcg agtttttccc gccgcgtacc agtgaaatgg 960
agcagaccct gtggaactcc atcgatcgcc ttagcagcct 1000
<210> 18
<211> 1995
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 18
atggactaca gcaaggttgc gagcgaagtg atcaccgcgg ttggtaaaga taacctggtt 60
gcggcggcgc actgcgcgac ccgtctgcgt ctggtgctga aggacgatag caaagttgac 120
caaaaggcgc tggacaaaaa cgcggatgtt aagggtacct tcaaaaccga tggccagtac 180
caagtgatca ttggtccggg cgacgttaac tttgtgtatg atgagatcat taagcagacc 240
ggcctgaccg aagttagcac cgacgatctg aagaaaatcg cggcgagcgg taagaaattc 300
aacccgatca tggcgctgat taaactgctg agcgacattt ttgtgccgat cattccggcg 360
ctggttgcag gtggtctgct gatggcgctg aacaacttcc tgaccagcga gggcctgttt 420
ggtaccaaga gcctggtgca gcaattcccg atcattaaag gcagcagcga tatgatccaa 480
ctgatgagcg cggcgccgtt ctggtttctg ccgatcctgg ttggcattag cgcggcgaag 540
cgtttcggtg cgaaccagtt tctgggtgcg agcatcggca tgattatggt ggcgccgggt 600
gcggcgaaca tcattggcct ggcggcgaac gcgccgatca gcaaagcggc gaccattggt 660
gcgtacaccg gcttctggaa catctttggt ctgcacgtga cccaagcgag ctacacctat 720
caggttatcc cggtgctggt tgcggtgtgg ctgctgagca ttctggagaa gttctttcac 780
aaacgtctgc cgagcgcggt ggacttcacc tttaccccgt tgctgagcgt tatcattacc 840
ggcttcctga cctttatcgt gattggtccg gttatgaagg aagtgagcga ctggctgacc 900
aacggcatcg tttggctgta cgataccacc ggcttcctgg gtatgggcgt gtttggtgcg 960
ctgtatagcc cggtggttat gaccggtctg caccaaagct tcccggctat cgagacccaa 1020
ctgattagcg cgtttcagaa cggtaccggc cacggtgact tcatctttgt gaccgcgagc 1080
atggcgaacg ttgcgcaggg tgcggcgacc ttcgcgattt actttctgac caaggataag 1140
aaaatgaaag gtctgagcag cagcagcggt gtgagcgcgc tgctgggtat caccgaaccg 1200
gctctgttcg gtgtgaacct gaagtatcgt tttccgttct tttgcgcgct gattggtagc 1260
gcgagcgcgg cggcgattgc tggtctgctg caagtggttg cggttagcct gggcagcgct 1320
ggtttcctgg gctttctgag catcaaagcg agcagcattc cgttctacgt ggtttgcgag 1380
ctgatcagct tcgcgattgc gtttgcggtg acctacggct atggtaagac caaagcggtt 1440
gatgtgtttg cggcggaggc ggcggtggag gaagcgatcg aggaagttca agaaattccg 1500
gaggaagcgg cgagcgcggc gaacaaggcg caggttaccg atgaggtgct ggcggcgccg 1560
ctggctggtg aagcggttga actgaccagc gttaacgatc cggtgttcag cagcgaagcg 1620
atgggcaagg gtatcgcgat taaaccgagc ggcaacaccg tttacgcgcc ggtggacggt 1680
accgttcaga tcgcgttcga taccggtcac gcgtatggca ttaaaagcga caacggcgcg 1740
gagatcctga ttcacatcgg tattgatacc gtgagcatgg agggcaaggg tttcgaacag 1800
aaagttcaag cggaccagaa gatcaagaaa ggtgatgtgc tgggcacctt cgacagcgat 1860
aaaatcgcgg aagctggtct ggacaacacc accatgttta ttgtgaccaa caccgcggat 1920
tatgcgagcg ttgagaccct ggcgagcagc ggtaccgttg cggtgggcga tagcctgctg 1980
gaagtgaaga aataa 1995
<210> 19
<211> 1440
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 19
atgaacctgc cgcagaacat ccgttaccgt cgttatcaag attggaccga ggaagagatc 60
aagagcatta aaaccaacgt ggcgctgagc ccgtggcaca ccacctacca cattgagccg 120
aaaaccggtc tgctgaacga cccgaacggt ttcagctatt ttaacggcaa attcaacctg 180
ttttaccaga actggccgtt tggtgcggcg cacggcctga agagctggat ccacaccgaa 240
agcgaggacc tggtgcactt caaagaaacc ggcaccgttc tgtatccgga caccagccac 300
gatagccacg gtgcgtatag cggcagcgcg tacgagatcg gtgatcagct gttcctgttt 360
tacaccggca acgtgcgtga cgaaaactgg gttcgtcatc cgctgcaaat tggtgcgttt 420
atggataaga aaggcaacat ccagaagttc accgacgtgc tgattaaaca accgaacgac 480
gttaccgagc acttccgtga tccgcagatc tttaactata agggtcaatt ctacgcgatt 540
gttggcgcgc agagcctgga taagaaaggt ttcatcaagc tgtacaaagc ggtggacaac 600
gatattaaga actggcaaga agttggcaac ctggactttg gtggcagcaa aagcgaatat 660
atgatcgagt gcccgaacct ggtgttcatc aacgagcagc cggttctgat ttactctccg 720
cagggtctga gcaaaagcga actggattac cacaacatct atccgaacac ctacaaggtg 780
tgccagagct ttgacaccga aaaaccggcg ctggttgatg cgagcgagat tcagaacctg 840
gacttcggct ttgaatgcta tgcgacccaa gcgttcaacg cgccggacgg tcgtgtgtat 900
gcggttagct ggatcggcct gccggacatt gattacccga gcgacagcta cgattatcag 960
ggtgcgctga gcctggtgaa ggagctgagc ctgaagcacg gcaaactgta ccaatatccg 1020
gtggaagcgg ttcgtagcct gcgtagcgaa aaagaggcgg ttacctataa accggagacc 1080
aacaacacct acgaactgga gctgaccttt gatagcagca gcgtgaacga actgctgctg 1140
ttcgcggaca acaagggtaa cggcctggcg atcaccgttg ataccaagat gggtaccatc 1200
ctgattgacc gtagcaaagc tggtgaacag tatgcgctgg agtttggcag ccagcgtagc 1260
tgcagcattc aagcgaagga gaccgtggtt aacatcttcg tggataagag catcttcgaa 1320
atcttcatca acaagggcga gaaagtgttc accggccgtg tttttccgaa cgacaagcaa 1380
accggtatcg ttattaagag cggtaaaccg agcggcaact actatgaact gaaatactaa 1440
<210> 20
<211> 882
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 20
atgagcaagc tgtacggtag cattgaggca ggtggtacca aattcgtgtg cgcggttggc 60
gacgagaact tccagattct ggaaaaggtg caatttccga ccaccacccc gtatgagacc 120
atcgaaaaaa ccgtggcgtt ctttaagaaa ttcgaagcgg acctggcgag cgttgcgatt 180
ggcagctttg gtccgatcga cattgatcag aacagcgata cctacggtta tatcaccagc 240
accccgaagc cgaactgggc gaacgtggac ttcgttggcc tgattagcaa ggattttaaa 300
atcccgttct actttaccac cgatgtgaac agcagcgcgt atggcgagac catcgcgcgt 360
agcaacgtga aaagcctggt ttactatacc atcggcaccg gtattggcgc tggtaccatt 420
caaaacggcg agtttatcgg tggcatgggt cacaccgaag ctggtcacgt ttacatggcg 480
ccgcacccga acgatgtgca ccacggcttc gttggtacct gcccgtttca taaaggttgc 540
ctggaaggtc tggcggctgg tccgagcctg gaagcgcgta ccggcatccg tggtgagctg 600
attgaacaga acagcgaggt gtgggatatc caagcgtact atattgcgca ggcggcgatc 660
caagcgaccg ttctgtatcg tccgcaggtg atcgttttcg gtggcggtgt gatggcgcaa 720
gagcacatgc tgaaccgtgt tcgtgaaaag tttaccagcc tgctgaacga ctacctgccg 780
gtgccggacg ttaaagatta tattgtgacc ccggcggttg cggaaaacgg tagcgcgacc 840
ctgggtaacc tggcgctggc gaagaaaatc gcggcgcgtt aa 882
<210> 22
<211> 4858
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 22
aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 60
cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 120
gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 180
catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 240
ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 300
gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 360
ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc ttttatggaa 420
gccggcggca cctcgctaac ggattcacca ctccaagaat tggagccaat caattcttgc 480
ggagaactgt gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct 540
ccagcagccg cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga 600
tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 660
atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 720
gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 780
cccctacgtg ctgctgaagt tgcccgcaac agagagtgga accaaccggt gataccacga 840
tactatgact gagagtcaac gccatgagcg gcctcatttc ttattctgag ttacaacagt 900
ccgcaccgct gtccggtagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 960
ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg cccaacagtc 1020
ccccggccac ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca agcgccctgc accattatgt 1080
tccggatctg catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa 1140
cgaagcgcta accgttttta tcaggctctg ggaggcagaa taaatgatca tatcgtcaat 1200
tattacctcc acggggagag cctgagcaaa ctggcctcag gcatttgaga agcacacggt 1260
cacactgctt ccggtagtca ataaaccggt aaaccagcaa tagacataag cggctattta 1320
acgaccctgc cctgaaccga cgaccgggtc gaatttgctt tcgaatttct gccattcatc 1380
cgcttattat cacttattca ggcgtagcac caggcgttta agggcaccaa taactgcctt 1440
aaaaaaatta cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc 1500
tgccgacatg gaagccatca cagacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca 1560
ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca 1620
tattggccac gtttaaatca aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa 1680
acatattctc aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat 1740
cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg 1800
aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca 1860
ccagctcacc gtctttcatt gccatacgga attccggatg agcattcatc aggcgggcaa 1920
gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg 1980
ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct 2040
caaaatgttc tttacgatgc cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt 2100
tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta 2160
gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt 2220
ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg tatcaacagg gacaccagga tttatttatt 2280
ctgcgaagtg atcttccgtc acaggtattt attcggcgca aagtgcgtcg ggtgatgctg 2340
ccaacttact gatttagtgt atgatggtgt ttttgaggtg ctccagtggc ttctgtttct 2400
atcagctgtc cctcctgttc agctactgac ggggtggtgc gtaacggcaa aagcaccgcc 2460
ggacatcagc gctagcggag tgtatactgg cttactatgt tggcactgat gagggtgtca 2520
gtgaagtgct tcatgtggca ggagaaaaaa ggctgcaccg gtgcgtcagc agaatatgtg 2580
atacaggata tattccgctt cctcgctcac tgactcgcta cgctcggtcg ttcgactgcg 2640
gcgagcggaa atggcttacg aacggggcgg agatttcctg gaagatgcca ggaagatact 2700
taacagggaa gtgagagggc cgcggcaaag ccgtttttcc ataggctccg cccccctgac 2760
aagcatcacg aaatctgacg ctcaaatcag tggtggcgaa acccgacagg actataaaga 2820
taccaggcgt ttccccctgg cggctccctc gtgcgctctc ctgttcctgc ctttcggttt 2880
accggtgtca ttccgctgtt atggccgcgt ttgtctcatt ccacgcctga cactcagttc 2940
cgggtaggca gttcgctcca agctggactg tatgcacgaa ccccccgttc agtccgaccg 3000
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gaaagacatg caaaagcacc 3060
actggcagca gccactggta attgatttag aggagttagt cttgaagtca tgcgccggtt 3120
aaggctaaac tgaaaggaca agttttggtg actgcgctcc tccaagccag ttacctcggt 3180
tcaaagagtt ggtagctcag agaaccttcg aaaaaccgcc ctgcaaggcg gttttttcgt 3240
tttcagagca agagattacg cgcagaccaa aacgatctca agaagatcat cttattaatc 3300
agataaaata tttctagatt tcagtgcaat ttatctcttc aaatgtagca cctgaagtca 3360
gccccatacg atataagttg taattctcat gtgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc 3420
gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag 3480
taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg 3540
tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg 3600
agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga 3660
ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta 3720
aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg 3780
tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca 3840
ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc 3900
cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg 3960
aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc 4020
tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat 4080
atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt 4140
ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg 4200
ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg 4260
ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca tgttatatcc 4320
cgccgtcaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct 4380
tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg 4440
tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 4500
attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 4560
gcaattaatg tgagttagcg cgaattgatc tggtttgaca gcttatcatc gactgcacgg 4620
tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg 4680
taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg 4740
cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc 4800
cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagacc 4858
<210> 23
<211> 52
<212> DNA
<213> Unknown
<400> 23
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggtcaca aaggagatat ac 52
<210> 24
<211> 3423
<212> DNA
<213> Unknown
<400> 24
gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60
ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120
atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180
attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240
gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300
cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360
cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420
gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480
cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540
gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600
gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660
gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720
ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780
ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840
gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900
ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960
gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020
atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080
ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140
cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200
aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260
gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320
gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380
cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440
accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500
cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560
ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620
ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680
gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740
gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800
ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860
ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920
ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980
atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040
gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100
gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160
ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220
gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280
ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340
ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400
gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460
tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520
tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580
gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640
aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700
gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760
cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820
tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880
gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940
gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000
ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060
ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120
gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180
accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240
ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300
atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360
cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420
taa 3423
<210> 25
<211> 2463
<212> DNA
<213> Unknown
<400> 25
atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60
gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120
gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180
ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240
gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300
ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360
gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420
cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480
ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540
gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600
gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660
gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720
cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780
ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840
ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900
gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata acatggcaat gttcagcgtt 960
tctggtccgg ggatgaaagg gatggtcggc atggcggcgc gcgtctttgc agcgatgtca 1020
cgcgcccgta tttccgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag catcagtttc 1080
tgcgttccac aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140
gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcagtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200
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gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320
gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380
aataccgatc aggttatcga agtgtttgtg attggcgtcg gtggcgttgg cggtgcgctg 1440
ctggagcaac tgaagcgtca gcaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500
tgcggtgttg ccaactcgaa ggctctgctc accaatgtac atggccttaa tctggaaaac 1560
tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620
gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680
gcggatcaat atgccgactt cctgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740
gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800
cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860
aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920
tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980
cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040
cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100
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aatctgtcac aactcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220
aaagttttgc gctatgttgg caatattgat gaagatggcg tctgccgcgt gaagattgcc 2280
gaagtggatg gtaatgatcc gctgttcaaa gtgaaaaatg gcgaaaacgc cctggccttc 2340
tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtactgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400
gttacagctg ccggtgtctt tgctgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460
tga 2463
<210> 26
<211> 1266
<212> DNA
<213> Unknown
<400> 26
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
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atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266

Claims (8)

1.高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)将大肠杆菌E.coli W3110中metI、metJ、metB、thrB、metA和lysA基因敲除，并且过表达metL基因，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetBΔthrB ΔmetA ΔlysA Trc-metL；
(2)以E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA Trc-metL为出发菌株，用来源于pTrc99A的trc启动子替换ppc基因的启动子，敲除iclR基因，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc；
(3)将编码抗反馈抑制的丙酮酸羧化酶pyc突变基因、编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶融合蛋白的thrA突变基因和编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅲ的lysC突变基因导入菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclRTrc-metL Trc-ppc，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetAΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP；
(4)将编码蔗糖转运蛋白的scrA基因、编码蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB基因和编码果糖激酶的scrK基因导入E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP/pSCR，即所述高产高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
3.如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述pyc突变基因是将pyc编码的蛋白第458位脯氨酸替换为丝氨酸获得的突变体编码基因，所述thrA突变基因是将thrA编码的蛋白第345位丝氨酸替换为苯丙氨酸获得的突变体编码基因，所述lysC突变基因是将lysC编码的蛋白第311位苏氨酸替换为异亮氨酸获得的突变体编码基因。
4.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述pyc突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，thrA突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
5.如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述scrA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述scrB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述scrK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.构建权利要求1所述高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法，将大肠杆菌E.coli W3110中metJ、metI、metB、thrB、metA和lysA基因敲除，并且过表达metL基因，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetBΔthrB ΔmetA ΔlysATrc-metL；
(2)以E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA Trc-metL为出发菌株，通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法，用序列如SEQ ID NO.12所示的trc启动子替换ppc基因的启动子，敲除iclR基因，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc；
(3)通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法，将序列如EQ ID NO.13所示的pyc突变基因、序列如SEQ ID NO.14所示的thrA突变基因和序列如SEQ ID NO.15所示的lysC突变基因导入菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP；
(4)通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法，将序列如SEQ ID NO.8所示的scrA基因、序列如SEQ ID NO.9所示的scrB基因和序列如SEQ ID NO.10所示的scrK基因导入E.coliW3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc-metL Trc-ppc/pACP，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclRTrc-metL Trc-ppc/pACP/pSCR，即所述产高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
7.一株高产L-高丝氨酸的基因工程菌——大肠杆菌ZJUT H-2/AS(Escherichia coliZJUT H-2/AS)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2020年6月22日，保藏编号CCTCCNO：M 2020233，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
8.如权利要求7所述大肠杆菌ZJUT H-2/AS(Escherichia coli ZJUT H-2/AS)在微生物发酵制备L-高丝氨酸中的应用。
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