CN111411092B - 高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了来源于谷氨酸棒状杆菌的突变的二氨基庚二酸脱氢酶及编码其的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的表达载体、含有该表达载体的表达系统，以及所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶及编码其的核苷酸序列、所述表达载体和所述表达系统在生产L‑赖氨酸中的应用及生产方法。本发明含有突变的二氨基庚二酸脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌生产L‑赖氨酸的产率高。

Description

高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶及其在生产L-赖氨酸中的应用。
背景技术
赖氨酸(lysine)，化学名称为2,6-二氨基己酸，性状为白色或近白色结晶性粉末，几乎无臭。赖氨酸有L-型、D-型和DL-型3种旋光异构体，然而可供人类和动物吸收利用的只有L-型赖氨酸。
L-赖氨酸广泛应用于饲料、食品及医药工业中。目前，90％以上的L-赖氨酸产品可用于饲料添加剂。用于制备L-赖氨酸的方法主要有三种：微生物发酵法、蛋白水解抽提法和化学合成与酶法。微生物发酵L-赖氨酸又可分为前体发酵法和直接发酵法。其中，前体发酵法是以二氨基庚二酸(DAP)为底物，借助微生物或酶转化为L-赖氨酸；直接发酵法是指利用具有合成L-赖氨酸能力的微生物，通过生物合成途径将碳水化合物转化为L-赖氨酸。
工业生产中，用来发酵生产L-赖氨酸的细菌主要是棒杆菌属的杆状细菌和埃希氏菌属的大肠杆菌。这些细菌的获得，一方面可以从自然界分离得到，另一方面也可以通过诱变或基因工程改造的方法得到，或者两者兼而有之。
现有文献中已有关于对二氨基庚二酸脱氢酶的编码基因ddh改造的相关报道。但主要都是通过对基因ddh进行强启动子的替换，或增加其在菌体中的拷贝数，以此来提高基因ddh在菌体中的表达量，进而提高L-赖氨酸的产量。例如，WO2009096690、WO2009014117、CN106318964B、CN101824392B等。
因此，需要对基因ddh编码区核苷酸序列进行位点突变，开发新的谷氨酸棒状杆菌菌株，以期提高生产L-赖氨酸的量。
发明内容
为了实现本发明目的，本发明提供一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶及其应用。
第一方面，本发明提供一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶，相对于野生型，突变的氨基酸位点选自以下中的一个或几个：F47Y(第47位苯丙氨酸变为酪氨酸)、P73L(第73位脯氨酸变为亮氨酸)、L114V(第114位亮氨酸变为缬氨酸)、Y130H(第130位酪氨酸变为组氨酸)、I159L(第159位异亮氨酸变为亮氨酸)。
作为一个具体的实施方案，野生型二氨基庚二酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示；编码所述野生型二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
作为一个具体的实施方案，突变的二氨基庚二酸脱氢酶为：(1)：由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(1)衍生的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列。
作为一个具体的实施方案，编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列为：(1)由SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列组成；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种表达系统，所述表达系统含有所述的表达载体。
作为一个具体的实施方案，所述表达系统是能够产生L-赖氨酸的表达系统；优选地，所述表达系统为谷氨酸棒状杆菌。
第五方面，本发明提供所述表达系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在谷氨酸棒状杆菌中，对二氨基庚二酸脱氢酶进行突变，所述突变的氨基酸位点选自以下中的一个或几个：F47Y(第47位苯丙氨酸变为酪氨酸)、P73L(第73位脯氨酸变为亮氨酸)、L114V(第114位亮氨酸变为缬氨酸)、Y130H(第130位酪氨酸变为组氨酸)、I159L(第159位异亮氨酸变为亮氨酸)。
第六方面，本发明提供所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶、编码其的核苷酸序列、含有所述核苷酸序列的表达载体、含有所述表达载体的表达系统在生产L-赖氨酸中的应用。
第七方面，本发明提供利用所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶、编码其的核苷酸序列、含有所述核苷酸序列的表达载体、含有所述表达载体的表达系统生产L-赖氨酸的方法。
另外，本发明还提供所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的筛选方法，包括以下步骤：
(1)从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA中，扩增二氨基庚二酸脱氢酶的编码基因ddh；
(2)采用易错PCR技术，以二氨基庚二酸脱氢酶的编码基因ddh为模板，扩增获得突变体基因；
(3)将步骤(2)所得易错PCR产物及表达质粒pET-42a用EcoR I和Pst I双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB(Kan)平板，将平板置37℃恒温培养箱培养，即得构建好的基因ddh突变体库；
(4)LB(Kan)平板上长出菌落，挑取其中的单克隆，转接到LB(Kan)液体培养基中，37℃摇床培养，待菌液OD600值达0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，放回37℃摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，测定二氨基庚二酸脱氢酶野生型和突变体酶活，挑选酶活力最强的菌株M1，并测定其基因的核苷酸序列，结果如SEQ ID NO.8所示。
本发明的突变的二氨基庚二酸脱氢酶及编码其的核苷酸序列还可以通过人工合成序列的方法获得。
本文通过对基因ddh编码区核苷酸序列进行位点的突变，得到新的谷氨酸棒状杆菌菌株FYLYS-O4-16，并进行后续发酵试验。发现含有该突变位点的菌株FYLYS-O4-16发酵产L-赖氨酸的量比未含有该突变位点的菌株FYLYS-K3-1发酵产L-赖氨酸的量得到了显著提高。而且，该方法与现有改造的高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高效果，从而在实践上可用于谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-赖氨酸。
根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见以下表格：
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu；Val
此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见以下表格：
Figure GDA0003408425090000051
具体实施方式
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就如同它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆试验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1.产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌含(lysCC932TpycC1372ThomT176C)突变体的构建
根据谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，并参考文献(Ohnishi J,etal.A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genomeinformation to generate a new L-lysine producing mutant.Appl MicrobiolBiotechnol,2002,58:217-223)所述，构建能生产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株。其中含有突变位点的编码基因分别为天冬氨酸激酶编码基因lysCC932T、丙酮酸羧化酶编码基因pycC1372T、高丝氨酸脱氢酶编码基因homT176C。分别人工合成含有上述突变位点的相关编码基因的重组片段P1、P2、P3(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。其核苷酸序列如SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示。
根据质粒pK18mobsacB序列信息，选用合适的双酶切位点Pst I和EcoR I，对重组片段P1和质粒pK18mobsacB(购自Novagen公司)双酶切。经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，将双酶切后的重组片段P1、与质粒pK18mobsacB连接并转入DH5α感受态细胞，进行氨苄青霉素的筛选培养。对生长出的菌体进行PCR鉴定及质粒的提取，构建重组质粒pK18-P1。根据相同的方法分别构建重组质粒pK18-P2、pK18-P3。经双酶切验证及测序鉴定，确认重组质粒pK18-P1、pK18-P2、pK18-P3中分别含有重组片段P1、P2、P3。
将重组质粒pK18-P1电转入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，挑选出发生了一次同源重组并在含有卡那霉素的培养基上能长出的菌体进行PCR验证及测序鉴定，确定含有重组片段P1的菌株即为菌株G1。使菌株G1分别在含有蔗糖和卡那霉素的培养基上生长。对在含蔗糖的培养基上能生长而在含卡那霉素的培养基上不能生长的菌株进行PCR验证及测序鉴定，确定含有重组片段P1的菌株即为所得的重组谷氨酸棒状杆菌株G2。依据相同的试验原理及步骤，将重组质粒pK18-P2电转入谷氨酸棒状杆菌G2，得到重组谷氨酸棒状杆菌G3；随后将重组质粒pK18-P3电转入谷氨酸棒状杆菌G3，测序正确的菌体即为重组谷氨酸棒状杆菌FYLYS。
实施例2.产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌含3×(dapA/dapB/asd/lysA/ddh)突变体的构建
根据谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，并参考文献(Blombach B,etal.Acetohydroxyacid synthase,a novel target for improvement of L-lysineproduction by Corynebacterium glutamicum.Appl Environ Microbiol.2009Jan；75(2):419-27)重组载体的构建方法及相关序列，构建能进一步提高L-赖氨酸产量的谷氨酸棒状杆菌菌株。其中所需增加拷贝数的内源性编码基因分别为二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因dapA、二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因dapB、天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd、二氨基庚二酸脱羧酶编码基因lysA和二氨基庚二酸脱氢酶编码基因ddh。人工合成含有上述基因dapA/dapB/asd/lysA/ddh串联得到的二倍体操纵子序列的重组片段P4(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
根据质粒pK18mobsacB序列信息，选用合适的双酶切位点Pst I和EcoR I，分别对重组片段P4和质粒pK18mobsacB双酶切。经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，将双酶切后的重组片段P4与质粒pK18mobsacB连接并转入DH5α感受态细胞，进行氨苄青霉素的筛选培养。对生长出的菌体进行PCR验证及质粒的提取，构建重组质粒pK18-P4。经双酶切验证及测序鉴定，确认重组质粒pK18-P4中含有重组片段P4。
将重组质粒pK18-P4电转入谷氨酸棒状杆菌FYLYS，挑选出发生了一次同源重组并在含有卡那霉素的培养基上能长出的菌体进行PCR验证及测序鉴定，确认含有重组片段P4的菌株即为菌株K1。使菌株K1分别在含有蔗糖和卡那霉素的培养基上生长。对在含蔗糖的培养基上能生长而在含卡那霉素的培养基上不能生长的菌株进行PCR验证及测序鉴定，含有重组片段P4的菌株即为重组谷氨酸棒状杆菌FYLYS-K3-1。
实施例3.谷氨酸棒状杆菌基因ddh的获得
以1μg谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为PCR反应模板，按SEQ ID NO.7所示的序列设计正向引物序列ddh-F：5′-CGAATTCATGACCAACATCCGCGTAGC-3′，反向引物序列ddh–R：5'-CCTGCAGTTAGACGTCGCGTGCGATCA-3′；其中，斜体字母部分分别为酶切位点EcoR I和Pst I。PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为：94℃变性5min；94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。取3μL PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证。取100μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的说明回收目的片段。
实施例4.基因ddh表达载体的构建
将实施例3中的PCR产物经限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切消化后，与用EcoRI和Pst I内切酶消化的pET-42a质粒(购自Novagen公司)进行连接反应，构建的载体被命名为pET42a-ddh，然后用连接产物pET42a-ddh转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(购自promega公司)。
实施例5.易错PCR扩增谷氨酸棒状杆菌基因ddh
利用Taq DNA聚合酶不具有3′-5′校对功能的性质，在高镁离子浓度(8.0mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(其中dATP和dGTP浓度为1.5mmol/L，dTTP和dCTP浓度为3.0mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库。模板浓度A260值为1000ng/mL，酶浓度为5U/μL，引物浓度为100μM。实验中最优突变率约为0.6％。
易错PCR反应体系(100μL)：
Figure GDA0003408425090000091
PCR程序为：96℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，75℃延伸2min，45个循环；最后75℃延伸15min。采用胶回收方法回收PCR产物。取5μL产物1％琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。
实施例6.二氨基庚二酸脱氢酶突变体库的构建
将实施例5中的PCR产物(DNA改组后的混合物)经限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切消化后，与用EcoR I和Pst I内切酶消化的pET-42a质粒进行连接反应，构建的载体库被称为pET42a-ddhM，然后将pET42a-ddhM转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，构建表达突变体库。
实施例7.构建表达突变体库及高酶活突变体的筛选
随机挑取突变菌株至含60μg/mL卡那霉素的LB培养基的6孔板中，37℃、150rpm培养，待OD600值达0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.2mmol/L)，继续培养12h。离心收集菌体，以50mmol/L、pH 8.0Tris-HCl(含1mmol/L咪唑)缓冲液悬浮(湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体：5mL缓冲液)，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清。并进行蛋白纯化及酶活测定。具体方法如下所示：
取Ni2+-NTA Agarose 5mL装入层析柱，用25mL水洗涤，重复洗涤两次。接着用25mL的NAT-0缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl)平衡层析柱。将上述收集破碎菌体离心后得到的上清加入到Ni2+-NTA层析柱中，反复加入2-3次后，用25mL的NAT-1缓冲液(即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的上述缓冲液洗脱目的蛋白。
酶活测定体系包括200μmol甘氨酸-KCl-KOH(pH 10.0)、1μmol NADPH和10μmol内消旋-二氨基庚二酸盐的反应液混合及纯化所得目的蛋白溶液，总体积1mL。在25℃反应10min，340nm测定OD值。二氨基庚二酸脱氢酶活性定义为该反应体系中每分钟1mg蛋白消耗1μmol NADPH所需要的酶量。蛋白的浓度采用Brandford方法测定。经过计算，纯化后野生型菌株M的二氨基庚二酸脱氢酶比活力为2.8U/mg，纯化后突变株M1的二氨基庚二酸脱氢酶比活力为71.2U/mg。结果表明，通过易错PCR对二氨基庚二酸脱氢酶编码基因进行改造，获得了二氨基庚二酸脱氢酶活力提高了25.4倍的突变株M1。
挑取菌株M1的克隆，并提取其质粒pET-ddh1，进行PCR验证及测序鉴定。经测序鉴定，测定的二氨基庚二酸脱氢酶突变体菌株M1的基因ddh的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
实施例8.谷氨酸棒状杆菌二氨基庚二酸脱氢酶突变体FYLYS-O4-16的构建
根据质粒pK18mobsacB序列信息，选用合适的双酶切位点Pst I和EcoR I分别对重组质粒pET-ddh1和质粒pK18mobsacB双酶切。经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，将双酶切后的含突变位点的基因ddh片段与质粒pK18mobsacB连接并转入DH5α感受态细胞，进行氨苄青霉素的筛选培养。对生长出的菌体进行PCR鉴定及质粒的提取，构建重组质粒pK18-ddh1。经双酶切验证及测序鉴定，确认重组质粒pK18-ddh1中分别含有重组片段ddh1。
将重组质粒pK18-ddh1电转入谷氨酸棒状杆菌FYLYS-K3-1，挑选出发生了一次同源重组并在含有卡那霉素的培养基上能长出的菌体进行PCR验证及测序鉴定，确认含有重组片段ddh1的菌株即为菌株FYLYS-O1。使菌株FYLYS-O1分别在含有蔗糖和卡那霉素的培养基上生长。对在含蔗糖的培养基上能生长而在含卡那霉素的培养基上不能生长的菌株进行PCR验证及测序鉴定，确认含有重组片段ddh1的菌株即为菌株FYLYS-O2。对该菌株进行PCR验证及测序鉴定。
所述验证引物序列：
正向引物序列ddh-1：5′-ACAGATCCTGACTGCTGGG-3′，
反向引物序列ddh-2：5′-CGAAGTTTTGGCACGTGTG-3′。
所测定的突变体的基因ddh的核苷酸序列如SEQ ID NO.10序列所示。获得重组谷氨酸棒状杆菌菌株FYLYS-O4-16。
实施例9.产L-赖氨酸菌株发酵试验
实施例9用于示例性地说明本发明谷氨酸棒状杆菌菌株FYLYS-K3-1及FYLYS-O4-16在50升发酵罐中发酵生产L-赖氨酸，具体如下：
将本发明提供的谷氨酸棒状杆菌菌株FYLYS-K3-1及FYLYS-O4-16分别划线于平板培养基，在30℃培养20小时。平板培养基含酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO4 10g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 4g/L，NaAc 10g/L，(NH4)2SO4 6g/L，L-丙氨酸1.0g/L，生物素0.0005g/L，味精0.1g/L，硫胺素·HCl 0.0003g/L，烟酰胺0.007g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉10g/L，使用KOH调节pH至7.0。
将经平板培养得到的L-赖氨酸生产菌接种至500mL三角刺瓶(含有50mL种子培养基)中培养。种子培养基含酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO4 10g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 4g/L，NaAc 10g/L，(NH4)2SO4 13g/L，L-丙氨酸1.0g/L，生物素0.0005g/L，味精0.1g/L，硫胺素·HCl 0.0003g/L，烟酰胺0.007g/L，葡萄糖10g/L，使用KOH调节pH至7.0。在30℃下以200rpm培养至OD562值达4。
将上述经摇瓶培养得到的摇瓶种子按种子罐培养基体积的0.5％的接种量接入到种子罐培养基中培养，50升种子罐种后培养基体积20升。种子罐培养基含MgSO4·7H2O0.6g/L，KH2PO4 2g/L，CuSO4·5H2O 0.03g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.012g/L，NaAc 12g/L，(NH4)2SO4 15g/L，L-丙氨酸1.2g/L，大豆蛋白水解液15g/L，甘蔗糖蜜10g/L，玉米浆1mL/L，生物素0.0006g/L，味精0.2g/L，硫胺素·HCl 0.0004g/L，烟酰胺0.008g/L，葡萄糖80g/L，消泡剂4mL，灭菌前调节pH至7.0。在50升种子罐内培养种子，培养温度37℃，用25％氨水控制pH在7.0左右，通过调节搅拌速度、通气量及罐压控制溶氧在20-30％，培养至OD562值达40。
将上述经种子罐培养得到的种液按发酵罐培养基体积的9％的接种量接入到发酵罐培养基中培养，50升发酵罐接种后培养基体积20升。发酵罐初始培养基含(NH4)2SO4 45g/L，NaAc 32g/L，KH2PO4 3g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，MnSO4·H2O 0.06g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，FeSO4·7H2O 0.08g/L，葡萄糖40g/L，L-丙氨酸1.4g/L，甘蔗糖蜜10g/L，玉米浆1mL/L，大豆蛋白水解液30g/L，硫胺素·HCl 0.004g/L，生物素0.005g/L，烟酰胺0.09g/L，尿素6g/L，消泡剂4mL，接种前用氨水调节发酵液pH值至7.0。发酵培养期间使用25％氨水控制pH在7.0左右，通过调节搅拌速度、通气量及罐压控制溶氧在20-30％。流加葡萄糖溶液(含有葡萄糖800g/L)控制发酵液中葡萄糖浓度在2-5g/L和流加硫酸铵溶液(含有硫酸铵400g/L)控制发酵液中氨氮浓度在1.5-2.5g/L。培养期间40％消泡剂批加消泡，发酵温度维持在37℃。每个菌株发酵三批次，发酵结果如表1所示。
表1.产L-赖氨酸菌株发酵试验结果
菌株 赖氨酸产量(％)
FYLYS-K3-1 14.9
FYLYS-K3-1 15.2
FYLYS-K3-1 15.3
均值 15.1
FYLYS-O4-16 28.1
FYLYS-O4-16 28.0
FYLYS-O4-16 28.3
均值 28.1
由表1的结果可知，含有本申请所述突变位点的菌株FYLYS-O4-16发酵产L-赖氨酸的量比未含有该突变位点的菌株FYLYS-K3-1发酵产L-赖氨酸的量得到了显著提高。而且，本申请的方法具有叠加提高的效果，从而在实践上可利用本申请所述的谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-赖氨酸。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司
<120> 高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用
<130> RYP1910475.9
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1266
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 基因lysC
<400> 1
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
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cgctaa 1266
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<211> 1266
<212> DNA
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<400> 2
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ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140
cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200
aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260
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gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380
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accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500
cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560
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ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680
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gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100
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ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340
ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400
gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460
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ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140
gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200
gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260
tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320
cgcctcgaaa gggactaa 1338
<210> 6
<211> 1338
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌FYLYS-O4-16 基因hom
<400> 6
atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60
attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120
ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgcttct 180
gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240
ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300
cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360
cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420
tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480
gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540
gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600
ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660
gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720
ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780
aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840
cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900
aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960
ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020
gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080
ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140
gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200
gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260
tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320
cgcctcgaaa gggactaa 1338
<210> 7
<211> 963
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 基因ddh
<400> 7
atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtgggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60
cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctc 120
gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga cgacgtggac 180
gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gacatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240
cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300
gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgttgcac tggtctctac cggctgggat 360
ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420
cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcatccct 480
ggcgttcaaa aggcagtcca gtacaccctc ccatccgaag acgccctgga aaaggcccgc 540
cgcggcgaag ccggcgacct taccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600
gccgacgcgg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc tgattacttc 660
gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720
ggcatgccac acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780
gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcctc acagatcgct 840
ttcggtcgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggagcttt caccgtcctc 900
gaagttgctc catacctgct ctccccagag aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960
taa 963
<210> 8
<211> 963
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌FYLYS-O4-16 基因ddh
<400> 8
atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtgggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60
cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctc 120
gacacaaaga cgccagtcta tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga cgacgtggac 180
gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gacatccttg agcaggcacc aaagttcgcg 240
cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300
gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgttgcag tggtctctac cggctgggat 360
ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtccac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420
cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcctccct 480
ggcgttcaaa aggcagtcca gtacaccctc ccatccgaag acgccctgga aaaggcccgc 540
cgcggcgaag ccggcgacct taccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600
gccgacgcgg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc tgattacttc 660
gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720
ggcatgccac acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780
gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcctc acagatcgct 840
ttcggtcgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggagcttt caccgtcctc 900
gaagttgctc catacctgct ctccccagag aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960
taa 963
<210> 9
<211> 320
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 基因ddh
<400> 9
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
85 90 95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
115 120 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145 150 155 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
180 185 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
195 200 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225 230 235 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305 310 315 320
<210> 10
<211> 320
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌FYLYS-O4-16 基因ddh
<400> 10
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Tyr Asp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Ile Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
85 90 95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ala Val Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
115 120 125
Val His Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Leu Pro
145 150 155 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
180 185 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
195 200 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225 230 235 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305 310 315 320
<210> 11
<211> 10378
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌FYLYS-O4-16 基因dapA/dapB/asd/lysA/ddh
<400> 11
cgcaaagctc acacccacga gctaaaaatt catatagtta agacaacatt tttggctgta 60
aaagacagcc gtaaaaacct cttgctcgtg tcaattgttc ttatcggaat gtggcttggg 120
cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg tttaaccccc aaatgaggga 180
agaaggtaac cttgaactct atgagcacag gtttaacagc taagaccgga gtagagcact 240
tcggcaccgt tggagtagca atggttactc cattcacgga atccggagac atcgatatcg 300
ctgctggccg cgaagtcgcg gcttatttgg ttgataaggg cttggattct ttggttctcg 360
cgggcaccac tggtgaatcc ccaacgacaa ccgccgctga aaaactagaa ctgctcaagg 420
ccgttcgtga ggaagttggg gatcgggcga agctcatcgc cggtgtcgga accaacaaca 480
cgcggacatc tgtggaactt gcggaagctg ctgcttctgc tggcgcagac ggccttttag 540
ttgtaactcc ttattactcc aagccgagcc aagagggatt gctggcgcac ttcggtgcaa 600
ttgctgcagc aacagaggtt ccaatttgtc tctatgacat tcctggtcgg tcaggtattc 660
caattgagtc tgataccatg agacgcctga gtgaattacc tacgattttg gcggtcaagg 720
acgccaaggg tgacctcgtt gcagccacgt cattgatcaa agaaacggga cttgcctggt 780
attcaggcga tgacccacta aaccttgttt ggcttgcttt gggcggatca ggtttcattt 840
ccgtaattgg acatgcagcc cccacagcat tacgtgagtt gtacacaagc ttcgaggaag 900
gcgacctcgt ccgtgcgcgg gaaatcaacg ccaaactatc accgctggta gctgcccaag 960
gtcgcttggg tggagtcagc ttggcaaaag ctgctctgcg tctgcagggc atcaacgtag 1020
gagatcctcg acttccaatt atggctccaa atgagcagga acttgaggct ctccgagaag 1080
acatgaaaaa agctggagtt ctataaatgg gaatcaaggt tggcgttctc ggagccaaag 1140
gccgtgttgg tcaaactatt gtggcagcag tcaatgagtc cgacgatctg gagcttgttg 1200
cagagatcgg cgtcgacgat gatttgagcc ttctggtaga caacggcgct gaagttgtcg 1260
ttgacttcac cactcctaac gctgtgatgg gcaacctgga gttctgcatc aacaacggca 1320
tttctgcggt tgttggaacc acgggcttcg atgatgctcg tttggagcag gttcgcgact 1380
ggcttgaagg aaaagacaat gtcggtgttc tgatcgcacc taactttgct atctctgcgg 1440
tgttgaccat ggtcttttcc aagcaggctg cccgcttctt cgaatcagct gaagttattg 1500
agctgcacca ccccaacaag ctggatgcac cttcaggcac cgcgatccac actgctcagg 1560
gcattgctgc ggcacgcaaa gaagcaggca tggacgcaca gccagatgcg accgagcagg 1620
cacttgaggg ttcccgtggc gcaagcgtag atggaatccc ggttcatgca gtccgcatgt 1680
ccggcatggt tgctcacgag caagttatct ttggcaccca gggtcagacc ttgaccatca 1740
agcaggactc ctatgatcgc aactcatttg caccaggtgt cttggtgggt gtgcgcaaca 1800
ttgcacagca cccaggccta gtcgtaggac ttgagcatta cctaggcctg taaatgacca 1860
ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg tcggccaggt tatgcgcacc cttttggaag 1920
agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt tctttgcttc cccacgttcc gcaggccgta 1980
agattgaatt ccgtggcacg gaaatcgagg tagaagacat tactcaggca accgaggagt 2040
ccctcaagga catcgacgtt gcgttgttct ccgctggagg caccgcttcc aagcagtacg 2100
ctccactgtt cgctgctgca ggcgcgactg ttgtggataa ctcttctgct tggcgcaagg 2160
acgacgaggt tccactaatc gtctctgagg tgaacccttc cgacaaggat tccctggtca 2220
agggcattat tgcgaaccct aactgcacca ccatggctgc gatgccagtg ctgaagccac 2280
ttcacgatgc cgctggtctt gtaaagcttc acgtttcctc ttaccaggct gtttccggtt 2340
ctggtcttgc aggtgtggaa accttggcaa agcaggttgc tgcagttgga gaccacaacg 2400
ttgagttcgt ccatgatgga caggctgctg acgcaggcga tgtcggacct tatgtttcac 2460
caatcgctta caacgtgctg ccattcgccg gaaacctcgt cgatgacggc accttcgaaa 2520
ccgatgaaga gcagaagctg cgcaacgaat cccgcaagat tctcggtctc ccagacctca 2580
aggtctcagg cacctgcgtc cgcgtgccgg ttttcaccgg ccacacgctg accattcacg 2640
ccgaattcga caaggcaatc accgtggacc aggcgcagga gatcttgggt gccgcttcag 2700
gcgtcaagct tgtcgacgtc ccaaccccac ttgcagctgc cggcattgac gaatccctcg 2760
ttggacgcat ccgtcaggac tccactgtcg acgataaccg cggtctggtt ctcgtcgtat 2820
ctggcgacaa cctccgcaag ggtgctgcgc taaacaccat ccagatcgct gagctgctgg 2880
ttaagtaaat ggctacagtt gaaaatttca atgaacttcc cgcacacgta tggccacgca 2940
atgccgtgcg ccaagaagac ggcgttgtca ccgtcgctgg tgtgcctctg cctgacctcg 3000
ctgaagaata cggaacccca ctgttcgtag tcgacgagga cgatttccgt tcccgctgtc 3060
gcgacatggc taccgcattc ggtggaccag gcaatgtgca ctacgcatct aaagcgttcc 3120
tgaccaagac cattgcacgt tgggttgatg aagaggggct ggcactggac attgcatcca 3180
tcaacgaact gggcattgcc ctggccgctg gtttccccgc cagccgtatc accgcgcacg 3240
gcaacaacaa aggcgtagag ttcctgcgcg cgttggttca aaacggtgtg ggacacgtgg 3300
tgctggactc cgcacaggaa ctagaactgt tggattacgt tgccgctggt gaaggcaaga 3360
ttcaggacgt gttgatccgc gtaaagccag gcatcgaagc acacacccac gagttcatcg 3420
ccactagcca cgaagaccag aagttcggat tctccctggc atccggttcc gcattcgaag 3480
cagcaaaagc cgccaacaac gcagaaaacc tgaacctggt tggcctgcac tgccacgttg 3540
gttcccaggt gttcgacgcc gaaggcttca agctggcagc agaacgcgtg ttgggcctgt 3600
actcacagat ccacagcgaa ctgggcgttg cccttcctga actggatctc ggtggcggat 3660
acggcattgc ctataccgca gctgaagaac cactcaacgt cgcagaagtt gcctccgacc 3720
tgctcaccgc agtcggaaaa atggcagcgg aactaggcat cgacgcacca accgtgcttg 3780
ttgagcccgg ccgcgctatc gcaggcccct ccaccgtgac catctacgaa gtcggcacca 3840
ccaaagacgt ccacgtagac gacgacaaaa cccgccgtta catcgccgtg gacggaggca 3900
tgtccgacaa catccgccca gcactctacg gctccgaata cgacgcccgc gtagtatccc 3960
gcttcgccga aggagaccca gtaagcaccc gcatcgtggg ctcccactgc gaatccggcg 4020
atatcctgat caacgatgaa atctacccat ctgacatcac cagcggcgac ttccttgcac 4080
tcgcagccac cggcgcatac tgctacgcca tgagctcccg ctacaacgcc ttcacacggc 4140
ccgccgtcgt gtccgtccgc gctggcagct cccgcctcat gctgcgccgc gaaacgctcg 4200
acgacatcct ctcactagag gcataaatga ccaacatccg cgtagctatc gtgggctacg 4260
gaaacctggg acgcagcgtc gaaaagctta ttgccaagca gcccgacatg gaccttgtag 4320
gaatcttctc gcgccgggcc accctcgaca caaagacgcc agtctttgat gtcgccgacg 4380
tggacaagca cgccgacgac gtggacgtgc tgttcctgtg catgggctcc gccaccgaca 4440
tccctgagca ggcaccaaag ttcgcgcagt tcgcctgcac cgtagacacc tacgacaacc 4500
accgcgacat cccacgccac cgccaggtca tgaacgaagc cgccaccgca gccggcaacg 4560
ttgcactggt ctctaccggc tgggatccag gaatgttctc catcaaccgc gtctacgcag 4620
cggcagtctt agccgagcac cagcagcaca ccttctgggg cccaggtttg tcacagggcc 4680
actccgatgc tttgcgacgc atccctggcg ttcaaaaggc agtccagtac accctcccat 4740
ccgaagacgc cctggaaaag gcccgccgcg gcgaagccgg cgaccttacc ggaaagcaaa 4800
cccacaagcg ccaatgcttc gtggttgccg acgcggccga tcacgagcgc atcgaaaacg 4860
acatccgcac catgcctgat tacttcgttg gctacgaagt cgaagtcaac ttcatcgacg 4920
aagcaacctt cgactccgag cacaccggca tgccacacgg tggccacgtg attaccaccg 4980
gcgacaccgg tggcttcaac cacaccgtgg aatacatcct caagctggac cgaaacccag 5040
atttcaccgc ttcctcacag atcgctttcg gtcgcgcagc tcaccgcatg aagcagcagg 5100
gccaaagcgg agctttcacc gtcctcgaag ttgctccata cctgctctcc ccagagaact 5160
tggacgatct gatcgcacgc gacgtctaaa tgagcacagg tttaacagct aagaccggag 5220
tagagcactt cggcaccgtt ggagtagcaa tggttactcc attcacggaa tccggagaca 5280
tcgatatcgc tgctggccgc gaagtcgcgg cttatttggt tgataagggc ttggattctt 5340
tggttctcgc gggcaccact ggtgaatccc caacgacaac cgccgctgaa aaactagaac 5400
tgctcaaggc cgttcgtgag gaagttgggg atcgggcgaa gctcatcgcc ggtgtcggaa 5460
ccaacaacac gcggacatct gtggaacttg cggaagctgc tgcttctgct ggcgcagacg 5520
gccttttagt tgtaactcct tattactcca agccgagcca agagggattg ctggcgcact 5580
tcggtgcaat tgctgcagca acagaggttc caatttgtct ctatgacatt cctggtcggt 5640
caggtattcc aattgagtct gataccatga gacgcctgag tgaattacct acgattttgg 5700
cggtcaagga cgccaagggt gacctcgttg cagccacgtc attgatcaaa gaaacgggac 5760
ttgcctggta ttcaggcgat gacccactaa accttgtttg gcttgctttg ggcggatcag 5820
gtttcatttc cgtaattgga catgcagccc ccacagcatt acgtgagttg tacacaagct 5880
tcgaggaagg cgacctcgtc cgtgcgcggg aaatcaacgc caaactatca ccgctggtag 5940
ctgcccaagg tcgcttgggt ggagtcagct tggcaaaagc tgctctgcgt ctgcagggca 6000
tcaacgtagg agatcctcga cttccaatta tggctccaaa tgagcaggaa cttgaggctc 6060
tccgagaaga catgaaaaaa gctggagttc tataaatggg aatcaaggtt ggcgttctcg 6120
gagccaaagg ccgtgttggt caaactattg tggcagcagt caatgagtcc gacgatctgg 6180
agcttgttgc agagatcggc gtcgacgatg atttgagcct tctggtagac aacggcgctg 6240
aagttgtcgt tgacttcacc actcctaacg ctgtgatggg caacctggag ttctgcatca 6300
acaacggcat ttctgcggtt gttggaacca cgggcttcga tgatgctcgt ttggagcagg 6360
ttcgcgactg gcttgaagga aaagacaatg tcggtgttct gatcgcacct aactttgcta 6420
tctctgcggt gttgaccatg gtcttttcca agcaggctgc ccgcttcttc gaatcagctg 6480
aagttattga gctgcaccac cccaacaagc tggatgcacc ttcaggcacc gcgatccaca 6540
ctgctcaggg cattgctgcg gcacgcaaag aagcaggcat ggacgcacag ccagatgcga 6600
ccgagcaggc acttgagggt tcccgtggcg caagcgtaga tggaatcccg gttcatgcag 6660
tccgcatgtc cggcatggtt gctcacgagc aagttatctt tggcacccag ggtcagacct 6720
tgaccatcaa gcaggactcc tatgatcgca actcatttgc accaggtgtc ttggtgggtg 6780
tgcgcaacat tgcacagcac ccaggcctag tcgtaggact tgagcattac ctaggcctgt 6840
aaatgaccac catcgcagtt gttggtgcaa ccggccaggt cggccaggtt atgcgcaccc 6900
ttttggaaga gcgcaatttc ccagctgaca ctgttcgttt ctttgcttcc ccacgttccg 6960
caggccgtaa gattgaattc cgtggcacgg aaatcgaggt agaagacatt actcaggcaa 7020
ccgaggagtc cctcaaggac atcgacgttg cgttgttctc cgctggaggc accgcttcca 7080
agcagtacgc tccactgttc gctgctgcag gcgcgactgt tgtggataac tcttctgctt 7140
ggcgcaagga cgacgaggtt ccactaatcg tctctgaggt gaacccttcc gacaaggatt 7200
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accacaacgt tgagttcgtc catgatggac aggctgctga cgcaggcgat gtcggacctt 7440
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ccttcgaaac cgatgaagag cagaagctgc gcaacgaatc ccgcaagatt ctcggtctcc 7560
cagacctcaa ggtctcaggc acctgcgtcc gcgtgccggt tttcaccggc cacacgctga 7620
ccattcacgc cgaattcgac aaggcaatca ccgtggacca ggcgcaggag atcttgggtg 7680
ccgcttcagg cgtcaagctt gtcgacgtcc caaccccact tgcagctgcc ggcattgacg 7740
aatccctcgt tggacgcatc cgtcaggact ccactgtcga cgataaccgc ggtctggttc 7800
tcgtcgtatc tggcgacaac ctccgcaagg gtgctgcgct aaacaccatc cagatcgctg 7860
agctgctggt taagtaaatg gctacagttg aaaatttcaa tgaacttccc gcacacgtat 7920
ggccacgcaa tgccgtgcgc caagaagacg gcgttgtcac cgtcgctggt gtgcctctgc 7980
ctgacctcgc tgaagaatac ggaaccccac tgttcgtagt cgacgaggac gatttccgtt 8040
cccgctgtcg cgacatggct accgcattcg gtggaccagg caatgtgcac tacgcatcta 8100
aagcgttcct gaccaagacc attgcacgtt gggttgatga agaggggctg gcactggaca 8160
ttgcatccat caacgaactg ggcattgccc tggccgctgg tttccccgcc agccgtatca 8220
ccgcgcacgg caacaacaaa ggcgtagagt tcctgcgcgc gttggttcaa aacggtgtgg 8280
gacacgtggt gctggactcc gcacaggaac tagaactgtt ggattacgtt gccgctggtg 8340
aaggcaagat tcaggacgtg ttgatccgcg taaagccagg catcgaagca cacacccacg 8400
agttcatcgc cactagccac gaagaccaga agttcggatt ctccctggca tccggttccg 8460
cattcgaagc agcaaaagcc gccaacaacg cagaaaacct gaacctggtt ggcctgcact 8520
gccacgttgg ttcccaggtg ttcgacgccg aaggcttcaa gctggcagca gaacgcgtgt 8580
tgggcctgta ctcacagatc cacagcgaac tgggcgttgc ccttcctgaa ctggatctcg 8640
gtggcggata cggcattgcc tataccgcag ctgaagaacc actcaacgtc gcagaagttg 8700
cctccgacct gctcaccgca gtcggaaaaa tggcagcgga actaggcatc gacgcaccaa 8760
ccgtgcttgt tgagcccggc cgcgctatcg caggcccctc caccgtgacc atctacgaag 8820
tcggcaccac caaagacgtc cacgtagacg acgacaaaac ccgccgttac atcgccgtgg 8880
acggaggcat gtccgacaac atccgcccag cactctacgg ctccgaatac gacgcccgcg 8940
tagtatcccg cttcgccgaa ggagacccag taagcacccg catcgtgggc tcccactgcg 9000
aatccggcga tatcctgatc aacgatgaaa tctacccatc tgacatcacc agcggcgact 9060
tccttgcact cgcagccacc ggcgcatact gctacgccat gagctcccgc tacaacgcct 9120
tcacacggcc cgccgtcgtg tccgtccgcg ctggcagctc ccgcctcatg ctgcgccgcg 9180
aaacgctcga cgacatcctc tcactagagg cataaatgac caacatccgc gtagctatcg 9240
tgggctacgg aaacctggga cgcagcgtcg aaaagcttat tgccaagcag cccgacatgg 9300
accttgtagg aatcttctcg cgccgggcca ccctcgacac aaagacgcca gtctttgatg 9360
tcgccgacgt ggacaagcac gccgacgacg tggacgtgct gttcctgtgc atgggctccg 9420
ccaccgacat ccctgagcag gcaccaaagt tcgcgcagtt cgcctgcacc gtagacacct 9480
acgacaacca ccgcgacatc ccacgccacc gccaggtcat gaacgaagcc gccaccgcag 9540
ccggcaacgt tgcactggtc tctaccggct gggatccagg aatgttctcc atcaaccgcg 9600
tctacgcagc ggcagtctta gccgagcacc agcagcacac cttctggggc ccaggtttgt 9660
cacagggcca ctccgatgct ttgcgacgca tccctggcgt tcaaaaggca gtccagtaca 9720
ccctcccatc cgaagacgcc ctggaaaagg cccgccgcgg cgaagccggc gaccttaccg 9780
gaaagcaaac ccacaagcgc caatgcttcg tggttgccga cgcggccgat cacgagcgca 9840
tcgaaaacga catccgcacc atgcctgatt acttcgttgg ctacgaagtc gaagtcaact 9900
tcatcgacga agcaaccttc gactccgagc acaccggcat gccacacggt ggccacgtga 9960
ttaccaccgg cgacaccggt ggcttcaacc acaccgtgga atacatcctc aagctggacc 10020
gaaacccaga tttcaccgct tcctcacaga tcgctttcgg tcgcgcagct caccgcatga 10080
agcagcaggg ccaaagcgga gctttcaccg tcctcgaagt tgctccatac ctgctctccc 10140
cagagaactt ggacgatctg atcgcacgcg acgtctaatt tagctcgagg ggcaaggaaa 10200
cagtgtggtt tccttgcctc ttttagcctt ttcagagggt gtcttcgctg gaccaagagg 10260
aaaccagaca ggcgtgacaa aaatctggat ttccgccagg ttttggcacg cctgtctggt 10320
ttaggggatg agaaaccgga cacacgtgcc aaaacttcgg ctttttcgcc aatcttgt 10378

Claims (6)

1.突变的二氨基庚二酸脱氢酶，其特征在于，所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.编码权利要求1所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核酸分子。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种能够生产L-赖氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求3所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
6.权利要求1所述的突变的二氨基庚二酸脱氢酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组表达载体、权利要求4或5所述的重组菌在生产L-赖氨酸中的应用。
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