WO2011129293A1 - １，５－ペンタンジアミンの製造方法 - Google Patents

１，５－ペンタンジアミンの製造方法 Download PDF

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WO2011129293A1
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base sequence
promoter
seq
pentanediamine
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健司 澤井
志緒美 渡邊
耳塚　孝
澤井　秀樹
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東レ株式会社
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C211/02—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C211/09—Diamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
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    • C12P13/001—Amines; Imines
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01018—Lysine decarboxylase (4.1.1.18)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 1,5-pentanediamine by fermentation.
  • Polyamide (PA) is an important polymer group used as a raw material for a series of special plastics used in the automobile industry, sports industry, and lifestyle industry
  • diamine is an important raw material monomer component of this polyamide.
  • Diamines are condensed with dicarboxylic acids to form various polymers. At this time, the polymer properties are determined by the chain length of the diamine and dicarboxylic acid.
  • Non-patent Document 1 diamines are chemically produced from petroleum-derived materials via an intermediate stage of dicarboxylic acid, or produced by chemical decarboxylation of amino acids.
  • Non-patent Document 1 Considering the soaring oil prices, it is desirable to quickly switch to synthesis of diamines from renewable resources by biotechnology methods such as fermentation.
  • 1,5-pentanediamine which is a diamine having 5 carbon atoms
  • 1,5-pentanediamine is another name, cadaverine, and is a compound that can be a raw material monomer for polyamide.
  • 1,5-pentanediamine is a polyamine that exists universally in the living body, and its biosynthetic system is being elucidated (see Non-Patent Document 2).
  • -L-lysine decarboxylase hereinafter abbreviated as LDC
  • Non-patent Document 1 the production method by fermentation in recombinant Escherichia coli
  • Patent Document 2 the coryneform bacterium of the lysine-producing microorganism Method for further increasing lysine production capacity
  • Patent Document 3 method for blocking 1,5-pentanediamine decomposition system
  • Patent Document 3 the method for supplying lysine decarboxylase with a self-replicating vector
  • An object of the present invention is to provide a method for producing 1,5-pentanediamine by fermentation using a microorganism having an LDC gene in the chromosome and suppressing L-lysine side production.
  • the present inventor As a result of intensive research for the purpose of suppressing L-lysine by-product in the production method of 1,5-pentanediamine by fermentation, the present inventor has an LDC gene in the chromosome and 50 mU in culture. It has been found that by using coryneform bacteria that continue to have a specific activity of lysine decarboxylase greater than / mg protein for the fermentation of 1,5-pentanediamine, the side production of L-lysine can be suppressed, The present invention has been completed. That is, the present invention includes the following (1) to (12).
  • (A) Promoter comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2
  • (C) which is hybridized under stringent conditions with the promoter consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or the whole or a part of its complementary strand, the sequence identity with the base sequence described in SEQ ID NO: 2 (5)
  • the promoter according to any one of (1) to (4), wherein the gene encoding the lysine decarboxylase is a gene derived from E. coli. Method.
  • the gene encoding lysine decarboxylase is a gene selected from any of the following (A) to (D), and encodes a protein having lysine decarboxylase activity.
  • the method according to any one of (1) to (5).
  • the gene (C) which is hybridized under stringent conditions with the whole or a part of the gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or its complementary strand, and the same sequence as the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the coryneform bacterium has a mutant aspartate kinase in which the amino acid residue at position 311 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is substituted with an amino acid other than threonine.
  • FIG. 4 is a graph showing changes over time in glucose concentration, lysine concentration and 1,5-pentanediamine (1,5-PD) concentration in the culture supernatant when the coryneform bacterium CG4541 strain prepared in the example of the present invention is cultured. is there.
  • FIG. 3 is a graph showing changes over time in glucose concentration, lysine concentration and 1,5-pentanediamine (1,5-PD) concentration in the culture supernatant when the coryneform bacterium TM4552 strain prepared in the comparative example of the present invention is cultured. is there. It is a figure which shows a time-dependent change of the lysine decarboxylase specific activity during culture
  • the lysine decarboxylase (LDC) in the present invention means an enzyme that can be converted to 1,5-pentanediamine by decarboxylation using L-lysine as a substrate, and other enzyme actions are combined. You may have.
  • the LDC used in the present invention is not particularly limited. , Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces pirosus, Streptomyces pirosus orrodens, Eubacterium acidaminophilum, Salmonella typhimurium, Hafnia alvide, Neisseria meningide Those derived from Pyrococcus abyssi are preferably used. More preferably, it is derived from E. coli.
  • the gene encoding lysine decarboxylase used in the present invention include the gene encoding lysine decarboxylase derived from the above-mentioned organism.
  • a base is selected according to the codon usage of the microorganism used. The sequence may be redesigned.
  • the base sequence which codes the above-mentioned biological origin lysine decarboxylase is registered into the database (GenBank).
  • GenBank a gene derived from Escherichia coli is preferable, and is a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the LDC activity can be expressed by the following formula 1.
  • the activity per protein amount of LDC that is, the specific activity can be calculated by the following formula 2.
  • the LDC specific activity in the present invention means the specific activity per total protein of the coryneform bacterium, and can be calculated by measuring the specific activity using the total protein extracted from the coryneform bacterium. The measurement operation is specifically described in the following examples.
  • the method for extracting proteins from coryneform bacteria is not limited.
  • a method of combining these can be used, but a method using glass beads is preferable.
  • the coryneform bacterium having a gene encoding lysine decarboxylase in the chromosome of the present invention is characterized by having an LDC specific activity of 50 mU / mg protein or more, preferably an LDC ratio of 80 mU / mg protein or more. It has an activity, and more preferably has an LDC specific activity of 180 mU / mg protein or more. In addition, as described later in the Examples, even if the LDC specific activity is 50 mU / mg protein or more at a certain point in the culture, if the specific activity subsequently decreases, the precursor L-lysine accumulates.
  • the coryneform bacterium used in the invention has the above-mentioned LDC specific activity throughout the culture.
  • the term “during culturing” refers to a period during which substrate sugar is consumed after inoculating coryneform bacteria into the fermentation medium, and can be confirmed by measuring the specific activity at any point during that period.
  • the culture time for maintaining the LDC specific activity is 5 hours or more after the start of culture, more preferably 10 hours or more, and even more preferably 20 hours or more. There is no particular upper limit on the culture time during which the specific activity can be maintained.
  • a method for increasing the copy number of a gene encoding lysine decarboxylase introduced into the chromosome of coryneform bacteria or a lysine introduced into the chromosome There are a method using a strong promoter as a promoter of a gene encoding decarboxylase, a method using a gene encoding lysine decarboxylase with improved enzyme activity, and the like. It is preferable to use a strong promoter as the promoter of the gene encoding lysine decarboxylase to be introduced into.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited, and can be generally used as long as it can function in coryneform bacteria, and may be a promoter derived from a different species.
  • Synthetic systems such as glutamate biosynthesis system glutamate dehydrogenase gene, glutamine synthesis system glutamine synthase gene, lysine biosynthesis system aspartokinase gene, threonine biosynthesis system homoserine dehydrogenase gene, isoleucine and valine biosynthesis Acetohydroxy acid synthase gene, leucine biosynthesis system 2-isopropylmalate synthase gene, proline and arginine biosynthesis system glutamate kinase gene, histidine biosynthesis system phosphoribosyl-ATP pyrophosphorylase gene, trypto Deoxyarabinohepturonic acid phosphate (DAHP) synthase genes of aromatic amino acid biosynthetic systems such as guanine, tyrosine and pheny
  • promoters that function in the logarithmic growth phase include divIVA, gap, ldhA, fda, glyA, cysK, aroF, gpmA, eno, fumC, pfk, sdhA, mdh, argF, proA, proC, aceE, serA, metE. , NifS1, tpi, aceD, cysD, sdhB or pck gene promoter, among which the divIA gene promoter is preferred, and specifically, the promoter having the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is particularly preferred.
  • the base sequence of the gene encoding the promoter sequence and lysine decarboxylase As long as it has the function as the base sequence of the gene encoding the promoter sequence and lysine decarboxylase, one or several base substitutions, deletions, insertions or additions in each base sequence. Sequences are also included. Here, “several” is usually 1 to 40, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 9, and further preferably about 1 to 5.
  • the promoter sequence and the base sequence encoding lysine decarboxylase have the function, the base sequence or the base sequence that hybridizes with the whole or a part of the complementary strand under stringent conditions Is mentioned.
  • the “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” means, for example, any one of the continuous sequences of at least 20, preferably 25, more preferably at least 30 of the original base sequence.
  • a known hybridization technique (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausbel et al., (1987) Publisher. John Wily & Sons Section 6.3-6.4) and the like. It is a base sequence to be hybridized.
  • stringent conditions include, for example, a hybridization temperature of 37 ° C. in the presence of 50% formamide, 42 ° C. as a more severe condition, and 65 ° C. as a more severe condition.
  • sequence identity is usually 80% or more, Preferably it is 90% or more, More preferably, it is 95% or more, More preferably May be a base sequence having 99% or more.
  • sequence identity is such that two base sequences are arranged so that the number of matching bases is maximized (a gap is inserted if necessary), and the number of matching bases is the number of bases in the full-length sequence. It means a value obtained by dividing by (the number of bases of the longer sequence when the number of all bases differs between the two sequences).
  • Such homology calculations can be easily performed by well-known software such as BLAST.
  • Such a promoter and a base sequence encoding lysine decarboxylase can be obtained from other than coryneform bacteria, and a base sequence obtained from coryneform bacteria can be obtained by in vitro mutation treatment or site-specific treatment known to those skilled in the art. It can also be obtained by subjecting to a mutation.
  • the method for introducing the promoter and lysine decarboxylase-encoding base sequences into coryneform bacteria is not particularly limited, and can be introduced by electroporation (Bio / Technology, (1989), 7, 1067-1070). it can.
  • the coryneform bacterium is an aerobic gram-positive gonococcus and has been conventionally classified into the genus Brevibacterium, but now includes bacteria integrated into the genus Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol). (1981) 41, p. 225). In addition, it includes Brevibacterium bacteria that are very closely related to the genus Corynebacterium. Examples of such coryneform bacteria include Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium colactorium, Corynebacterium.
  • each coryneform bacterium includes Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511, Corynebacterium carnae ATCC 15991, Corynebacterium Umm Glutamicum ATCC13020, ATCC13020, ATCC13060, Corynebacterium lilium ATCC15990, Corynebacterium melacecola ATCC17965, Corynebacterium efficiens AJ12340 (Deposit number: FERM BP-1539), Corynebacterium herculis brevis ATCC13838 Divali Katam ATCC1 020, Brevibacterium flavum ATCC13826, ATCC14067, AJ12418 (deposit number: FERM BP-2205), Brevibacterium inmariophyllum ATCC14068, Brevibacterium lactoferment
  • coryneform bacteria can be sold, for example, from the American Type Culture Collection. That is, the registration number corresponding to each strain is given, and this registration number is described in the catalog of the American Type Culture Collection, and the distribution of each strain can be received with reference to this number.
  • the coryneform bacterium having a gene encoding lysine decarboxylase in the chromosome used in the method for producing 1,5-pentanediamine of the present invention improves the productivity of L-lysine, which is a precursor of 1,5-pentanediamine.
  • Coryneform bacterium is preferable.
  • There is no limitation on the method for improving L-lysine productivity of coryneform bacteria and a known method can be used. For example, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the coryneform bacterium preferably has an aspartate kinase that is desensitized to feedback inhibition by L-lysine.
  • an aspartate kinase that is desensitized to feedback inhibition by L-lysine.
  • SEQ ID NO: 3 It is more preferable to have a mutant aspartate kinase in which the 311th amino acid residue is substituted with an amino acid other than threonine.
  • the homoserine dehydrogenase activity is preferably reduced or deleted, and the homoserine dehydrogenase gene is disrupted or disrupted by gene insertion mutation. More preferably, it lacks homoserine dehydrogenase activity.
  • batch culture fed-batch culture or continuous culture
  • continuous culture it is preferable to perform continuous culture as described in, for example, JP-A-2008-104453.
  • a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like can be used.
  • the carbon source for example, sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose and starch hydrolysate, alcohols such as ethanol, and organic acids such as acetic acid, lactic acid and succinic acid can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium acetate and other inorganic and organic ammonium salts, urea, other nitrogen-containing compounds, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soybean hydrolysate Nitrogen-containing organic substances such as can be used.
  • potassium monohydrogen phosphate potassium dihydrogen phosphate
  • ammonium sulfate sodium chloride
  • magnesium sulfate calcium carbonate and the like
  • trace nutrient sources such as biotin, thiamine, and vitamin B6 can be added as necessary.
  • micronutrient sources can be substituted with medium additives such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid and the like.
  • the culture conditions are not particularly limited, and are performed under aerobic conditions such as shaking culture and deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is generally 25 ° C to 42 ° C, preferably 28 ° C to 38 ° C.
  • the culture time is usually 1 day to 10 days.
  • ammonia, hydrochloric acid or dicarboxylic acid is preferably used, and dicarboxylic acid is more preferably used.
  • the culture pH is controlled to 5 to 8, preferably pH 6.5 to 7.5, using these neutralizing agents.
  • limiting in the state of a neutralizing agent It uses by gas, a liquid, solid, or aqueous solution. Particularly preferred is an aqueous solution.
  • the dicarboxylic acid preferably used as a neutralizing agent is a dicarboxylic acid substantially free of a functional group other than the two carboxyl groups.
  • the functional group here means an amino group, a carboxyl group or the like during a polyamide polymerization reaction (reaction conditions are, for example, a reaction temperature of 250 to 270 ° C., a pressure of 10 to 20 kg / cm 2 and a reaction time of 1 to 5 hours).
  • acidic groups sulfonic acid groups, phosphoric acid groups, phenolic hydroxyl groups, etc.
  • basic groups hydrazino groups, etc.
  • protonic polar groups hydroxyl groups, etc.
  • cleavable groups epoxy groups, peroxy groups, etc.
  • Oxidation groups, etc. and other highly reactive groups (isocyanate groups, etc.).
  • halogen substituents, aromatic substituents, ether groups, ester groups, amide groups, and the like have low reactivity and do not correspond to the functional groups mentioned here.
  • the dicarboxylic acid is more preferably a dicarboxylic acid represented by the following general formula (1), (2) or (3).
  • the dicarboxylic acid is more preferably adipic acid, sebacic acid, 1,12-dodecanedicarboxylic acid, succinic acid, isophthalic acid, or terephthalic acid.
  • 1,5-pentanediamine in the culture medium exists as a free form of 1,5-pentanediamine or a 1,5-pentanediamine salt.
  • a method for collecting 1,5-pentanediamine in the culture solution first, microorganisms are removed from the culture solution. At that time, microorganisms grow and fermentation proceeds sufficiently to produce 1,5-pentanediamine, and then the cells and culture supernatant are separated (separation methods include precipitation removal, centrifugation, and membrane filtration separation). Or the bacterial cells may be separated, held or fixed from the beginning with a holding material or the like.
  • 1,5-pentanediamine As a method for collecting 1,5-pentanediamine from the culture solution containing 1,5-pentanediamine from which the bacterial cells have been removed in this way, as described in JP-A-2009-207495, 1,5-pentanediamine is used. It can also be collected by crystallization as a pentanediamine dicarboxylate. Further, as described in JP-A-2009-29872, 1,5-pentanediamine can be purified and collected using an NF membrane. Further, as described in JP-A-2009-28045, 1,5-pentanediamine can be collected by extraction with a polar organic solvent and distillation.
  • Sample pretreatment 25 ⁇ l of analytical sample, 25 ⁇ l of 1,4-diaminobutane (0.03 M), 150 ⁇ l of sodium hydrogen carbonate (0.075 M) as an internal standard, and ethanol of 2,4-dinitrofluorobenzene (0.2 M) The solution is added and mixed and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After dissolving 50 ⁇ l of the reaction solution in 1 ml acetonitrile, 10 ⁇ l of the supernatant after centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes was analyzed by HPLC.
  • Example 1 and Comparative Example 1 Preparation of Corynebacterium glutamicum capable of producing L-lysine by fermentation Aspartokinase (AK) was used to prepare Corynebacterium glutamicum capable of synthesizing L-lysine, a precursor of 1,5-pentanediamine.
  • An L-lysine fermenting bacterium was prepared by introducing an effective mutation into. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2002), 58, p.
  • a Corynebacterium glutamicum AK-1 (hereinafter abbreviated as AK-1 strain) strain was prepared with reference to the method described in 217-223. That is, this operation was specifically performed as follows.
  • oligonucleotide designed with reference to the nucleotide sequence of the AK gene (Accession No. BA00000036) registered in the database (GenBank) using a genomic DNA solution prepared from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 according to a conventional method as an amplification template PCR was performed using SEQ ID NOs: 4 and 5) as a primer set, and the resulting product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.3 kb containing the AK gene was excised from the gel and purified by Gene Clean Kit. did.
  • This fragment was digested with BamHI and SphI, and the resulting 1.3 kb BamHI-SphI fragment was ligated into the BamHI / SphI gap of pUC19 that had been previously digested with BamHI and SphI.
  • the obtained plasmid is designated as pTM47. It was confirmed by sequence that the obtained AK gene was the same as the gene sequence registered in the database.
  • pTM49-1 a plasmid introduced with the target mutation was obtained, and this was designated as pTM49-1.
  • This pTM49-1 was cleaved with SphI and BamHI, and then the AK gene portion (about 1.3 kb) was gel-extracted to purify the mutated AK gene.
  • PCR was performed using the bacterial cells of Bacillus subtilis IFO13719 strain as a template and the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 as primer sets to amplify the sacB gene.
  • the obtained PCR product was cleaved with SacI, and then ligated to pHSG298 (a pUC-type commercially available plasmid having a kanamycin resistance gene as a selection marker, manufactured by Takara Bio Inc.) that had been cleaved in advance with SacI.
  • the obtained plasmid is designated as pTM38.
  • pTM38 cleaved with SphI and BamHI was ligated with the fragment containing the AK gene.
  • the plasmid having the sacB gene and the mutant AK gene thus prepared is designated as pTM52.
  • the pTM52 produced as described above in the ATCC 13032 strain was electroporated [FEMS Microbiology Letters, 65, p. 299 (1989)] and added with kanamycin (25 ⁇ g / ml) LB (tryptone (10 g / l) (manufactured by Bacto), yeast extract (5 g / l) (manufactured by Bacto), sodium chloride ( 10 g / l)) Transformants were selected on agar medium. Subsequently, the selected kanamycin resistant corynebacterium was cultured on a sucrose-added medium, and the sucrose resistant corynebacterium was selected by double crossing over.
  • a genomic DNA solution was prepared from a strain capable of growing on a minimal medium containing 20 mM S-aminoethylcysteine (AEC) according to a conventional method.
  • AEC S-aminoethylcysteine
  • the genomic DNA was used as a template and PCR was performed using oligonucleotides (SEQ ID NOs: 4 and 5) as primer sets, the sequence of the AK gene was confirmed. The sequence from 931 to 933 was replaced with atg. I was able to confirm.
  • the AK-1 strain aspartokinase prepared in this manner is desensitized to feedback inhibition by lysine and threonine. Therefore, L-lysine can be synthesized by culture.
  • the obtained AK-1 strain was further genetically modified to produce a coryneform bacterium having 1 copy of the LDC gene derived from Escherichia coli in the chromosome and a coryneform bacterium having 2 copies by the method described below.
  • PCR was performed using pHSG298 as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 10 and 11 as primer sets to amplify the promoter of the kanamycin resistance gene.
  • this PCR product was cleaved with restriction enzymes BamHI and KpnI, followed by gel extraction to purify the promoter (Kmp) of the kanamycin resistance gene.
  • vector pUC19 was cleaved with BamHI and KpnI, and then pUC19 was purified by gel extraction.
  • the promoters of pUC19 and kanamycin resistance gene cleaved with BamHI and KpnI were ligated.
  • the plasmid thus prepared was designated as pKmp.
  • PCR was carried out using the cells of Escherichia coli JM109 strain as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 12 and 13 as primer sets to amplify the LDC gene.
  • the LDC gene was purified by gel extraction.
  • the plasmid pKmp was cut with NcoI and SacI, and then pKmp was purified by gel extraction. These pKmp and LDC genes cleaved with NcoI and SacI were ligated.
  • the plasmid thus prepared was designated as pTM24.
  • PCR was carried out using the ATCC13032 strain as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 14 and 15 as primer sets to amplify the hom gene.
  • the amplified hom gene was cleaved with restriction enzymes SphI and BamHI, followed by gel extraction to purify the hom gene.
  • pTM38 was purified by gel extraction. These pTM38 and hom genes cleaved with SphI and BamHI were ligated.
  • the plasmid thus prepared was designated as pTM44.
  • PCR was performed using plasmid pTM24 as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 as primer sets to amplify the Kmp-LDC gene fragment.
  • the amplified Kmp-LDC gene fragment was cleaved with the restriction enzyme Aor51HI, and then gel extraction was performed to purify the Kmp-LDC gene fragment.
  • PTM44 prepared as described above was cleaved with Aor51HI, and then purified by gel extraction. These pTM44 and Kmp-LDC gene fragments cleaved with Aor51HI were ligated.
  • the plasmid thus prepared was designated as pTM45.
  • plasmid pTM45 was transferred to AK-1 strain by electroporation [FEMS Microbiology Letters, 65, p. 299 (1989)] and selecting a kanamycin resistant strain, the kanamycin resistant strain was cultured on a sucrose-added medium, Biosci. Biotechnol.
  • the sucrose-resistant corynebacterium from which the sacB gene was eliminated was selected by the double crossing over method described as a method for preparing the TM45 strain in Biochem (2007), 71 (9), 2130-5.
  • a genomic DNA solution was prepared from the thus selected transformant according to a conventional method.
  • PCR was carried out using this genomic DNA as a template and oligonucleotides (SEQ ID NOs: 18 and 19) as primer sets, and the resulting product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel. One band was observed. From this, it was confirmed that the selected transformant had the LDC gene inserted into the hom locus.
  • This transformant was named Corynebacterium glutamicum TM4552 strain (abbreviated as TM4552 strain).
  • PCR was performed using the genomic DNA of the ATCC13032 strain prepared according to a conventional method as a template, and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 21 and 22 as primer sets, and Pdiv was cloned.
  • KOD-plus polymerase manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • a 50 ⁇ l reaction system was prepared so that the primer was 20 pmol / sample and KOD-Plus polymerase was 1 unit / sample.
  • the reaction solution was thermally denatured at 94 ° C.
  • PCR amplification device iCycler manufactured by BIO-RAD
  • 94 ° C. thermal denature
  • 60 ° C. primer annealing
  • 68 ° C extension of complementary strand
  • 30 cycles of 30 seconds followed by cooling to a temperature of 4 ° C.
  • the gene amplification primers (SEQ ID NOs: 21 and 22) were prepared such that a BamHI recognition sequence was added to the 5 terminal side and an NcoI recognition sequence was added to the 3 terminal side, respectively.
  • the PCR-amplified fragment was purified, and the end was phosphorylated with T4 nucleotide Kinase (manufactured by Takara Bio Inc.), and then ligated to the pUC118 vector (which was cleaved with the restriction enzyme HincII and the cut surface was dephosphorylated). Ligation was performed using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Bio Inc.). The ligation solution was transformed into competent cells of Escherichia coli DH5 ⁇ (manufactured by Takara Bio Inc.) and plated on an LB plate containing 50 ⁇ g / mL of the antibiotic ampicillin and cultured overnight.
  • plasmid DNA was collected with a miniprep, cut with restriction enzymes BamHI and NcoI, and a plasmid into which the Pdiv fragment had been inserted was selected. All of these series of operations were performed according to the attached protocol.
  • the plasmid thus prepared is designated as pCG5.
  • the LDC gene was cloned by a PCR method using Escherichia coli JM109 strain as a template.
  • the PCR amplification reaction is performed in the same manner as described above, and the NcoI recognition sequence is added to the 5 terminal side and the SacI recognition sequence is added to the 3 terminal side of the gene amplification primers (SEQ ID NOs: 23 and 24).
  • SEQ ID NOs: 23 and 24 Made.
  • the obtained PCR amplified fragment containing the LDC gene was purified and cloned into pUC118 in the same manner as described above.
  • the prepared plasmid is designated as pCG11.
  • pCG11 was cleaved with restriction enzymes NcoI and XbaI, a fragment of about 2.1 kb containing the LDC gene was excised and purified, and then ligated to pCG5 which had been cleaved with restriction enzymes NcoI and XbaI in advance.
  • the obtained plasmid having a fragment with the LDC gene linked downstream of Pdiv is designated as pCG13.
  • pCG13 was cleaved with restriction enzymes BamHI and XbaI, an approximately 2.4 kb fragment containing the Pdiv-LDC gene was excised and purified, and the above-described pTM38 was previously cleaved with restriction enzymes BamHI and XbaI. Ligated to The obtained plasmid is designated as pCG33.
  • pCG29 was cleaved with restriction enzymes SalI and SphI, and a fragment containing the 3-terminal region of the LDH gene was excised and purified, and then ligated to pCG33 that had been cleaved with restriction enzymes SalI and SphI in advance.
  • the obtained plasmid is designated as pCG37.
  • pCG28 was cleaved with restriction enzymes BglII and BamHI, a fragment containing the 5-terminal region of the LDH gene was excised and purified, and then ligated to pCG37 previously cleaved with restriction enzymes BglII and BamHI.
  • the obtained plasmid is designated as pCG41.
  • a genomic DNA solution was prepared from the thus selected transformant according to a conventional method. PCR was performed using this genomic DNA as a template and oligonucleotides (SEQ ID NO: 25, 28) as primer sets, and the resulting product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel. A single band was observed. In addition, about 2 kb fragment is obtained in the pCG41 non-introduced strain. From this, it was confirmed that the selected transformant had the Pdiv-LDC gene fragment inserted at the LDH locus. This transformant was named Corynebacterium glutamicum CG4541 strain (abbreviated as CG4541 strain).
  • One platinum loop of each of CG4541 strain (Example 3) and TM4552 strain (Comparative Example 1) was inoculated into 5 mL of the sterilized medium shown in Table 1 and cultured at 30 ° C. for 24 hours in advance.
  • the pre-culture was preincubated by inoculating the whole culture in 45 ml of the same medium as the pre-culture and culturing at 30 ° C. and 120 rpm for 24 hours.
  • the whole culture medium was inoculated into 1000 ml of the medium whose glucose concentration in the medium shown in Table 1 was changed to 150 g / L, and sterilized air was aerated at 0.07 vvm while stirring at 30 ° C. and a stirring blade speed of 800 rpm.
  • the culture was performed while adjusting the pH to 6.7.
  • As a neutralizing agent sulfuric acid aqueous solution (3M) and aqueous ammonia (3M) were used.
  • the culture results of the CG4541 strain are shown in FIG. 1, and the TM4552 strain is shown in FIG.
  • the TM4552 strain (Comparative Example 1) reached its peak in the middle of 1,5-pentanediamine accumulation, and the precursor L-lysine accumulated, whereas the CG4541 strain (Example 1). 1, the accumulation concentration of 1,5-pentanediamine was improved to 10 g / L or more, and the precursor L-lysine did not accumulate at all.
  • the culture solution of each strain cultured as described above was sampled over time, collected by centrifugation at 4000 rpm for 5 minutes, and then suspended in 2 ml of buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8).
  • buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8
  • 0.4 g / piece of glass beads 0.1 mm ⁇ , manufactured by ASONE was added, and 1 ml of the cell suspension was added thereto.
  • the supernatant is recovered by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes, and the recovered supernatant is used as a crude enzyme solution. Then, it was used for the specific activity measurement test of lysine decarboxylase. Moreover, the BCA protein assay kit was used for the measurement of protein concentration (manufactured by PIERCE). Table 2 shows the protein concentration in the crude enzyme solution of CG4541 strain, and Table 3 shows the protein concentration in the crude enzyme solution of TM4552 strain.
  • the LDC specific activity of the TM4552 strain decreased with the progress of the culture, and almost no confirmation was possible at 90 hours after the start of the culture.
  • the LDC specific activity of the CG4541 strain tended to decrease as the culture progressed, the specific activity remained at 180 mU / mg protein or more throughout the culture.
  • Table 5 shows the LDC specific activity of CG4541 strain and 1,5-pentanediamine and L-lysine concentrations in the culture solution.
  • Table 5 shows the LDC specific activity of TM4552 strain and 1,5-pentanediamine and L-lysine concentration in the culture solution. It is shown in FIG.
  • the TM4552 strain had an LDC specific activity of 83 mU / mg protein at 25 hours after the start of culture, and there was no accumulation of L-lysine in the culture solution, whereas 45 hours after the start of culture. Then, the LDC specific activity decreased to 39 mU / mg protein, and accumulation of L-lysine occurred in the culture medium. Thereafter, the specific activity of LDC decreased and the accumulation of L-lysine increased. On the other hand, from the results of Table 5, the CG4541 strain maintained an LDC specific activity of 180 mU / mg protein during culture, and no L-lysine was accumulated in the culture medium during the culture.
  • the CG4541 strain uses the kanamycin resistance gene and divIVA gene promoters as LDC gene expression promoters, but the TM4552 strain using only the kanamycin resistance gene promoter has an LDC specific activity of about 80 mU / mg protein even at the highest point. Therefore, the LDC specific activity persistence of the CG4541 strain seems to be an effect of the promoter of the divIVA gene.
  • the present invention is useful as a method for producing 1,5-pentanediamine which can be a raw material for polyamide.

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Abstract

要約　染色体中にＬＤＣ遺伝子を有し、かつ、Ｌ－リジンの副生産が抑制される、微生物を用いた発酵による１，５－ペンタンジアミンの製造方法が開示されている。この１，５－ペンタンジアミンの製造方法は、染色体中にリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を有するコリネ型細菌による１，５－ペンタンジアミンの製造方法であって、前記コリネ型細菌が、培養中に５０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上のリジン脱炭酸酵素活性を有し続けている。

Description

１，５－ペンタンジアミンの製造方法
　本発明は、発酵法による１，５－ペンタンジアミンの製造方法に関する。
　ポリアミド（ＰＡ）は、自動車産業、スポーツ産業、ライフスタイル産業で使用する一連の特殊プラスチックの原料となる重要なポリマー群であり、ジアミンは、このポリアミドの重要な原料モノマー成分である。ジアミンはジカルボン酸と縮合して種々のポリマーを形成するが、この際、ジアミンとジカルボン酸の鎖長によりポリマーの特性が定まる。
　従来、ジアミンは化学的にはジカルボン酸の中間段階を径由して石油由来の素材から製造されるか、またはアミノ酸の化学的脱カルボキシ反応によって製造される(非特許文献１)。石油価格の高騰を考慮すると、発酵などのバイオテクノロジー法による再生可能資源からのジアミンの合成に速やかに切り替えることが望まれる。
　そこで、炭素数５のジアミンである１，５－ペンタンジアミンの発酵による製造方法が注目されている。１，５－ペンタンジアミンとは、別名ではカダベリンであり、ポリアミドの原料モノマーとなりえる化合物である。また、１，５－ペンタンジアミンは生体内に普遍的に存在するポリアミンであって、その生合成系が解明されつつあるが（非特許文献２参照）、その生合成経路の一部として、Ｌ－リジンの脱炭酸反応を触媒するＬ－リジン脱炭酸酵素（以下、ＬＤＣと略す）が知られている。
　従来の１，５－ペンタンジアミンの発酵による製造方法では、微生物にＬＤＣ遺伝子を導入することを基本として、組み換え大腸菌での発酵による製造方法（特許文献１参照）や、リジン生産微生物のコリネ型細菌において更にリジン生産能力を上げる方法（特許文献２参照）、１，５－ペンタンジアミン分解系を遮断する方法（特許文献３参照）、リジン脱炭酸酵素を自立複製型ベクターで供給する方法（非特許文献３参照）が知られている。
　しかしながら、１，５－ペンタンジアミンの発酵による製造方法には解決するべき課題は多く、例えば、Ｌ－リジン生産微生物のコリネ型細菌にＬＤＣ遺伝子を導入した微生物を発酵する場合、リジンを副生産してしまうという課題があった（非特許文献４参照）。すなわち、リジンは、１，５－ペンタンジアミン生合成における直前の前駆体であるが、未反応のリジンが培養上清中に多く出てくるという問題があった。このようにリジンが副生産すると、前駆体までが製造されているにも関わらず、１，５－ペンタンジアミンの発酵収率が向上せず、経済的に問題となっていた。また、特許文献３，非特許文献３ではＬＤＣ遺伝子を自律複製型ベクターで供給しているが、培養中に高価な抗生物質等を添加する必要があることから、産業スケールで１，５－ペンタンジアミンを安価に発酵生産するには、ＬＤＣ遺伝子を染色体中に有する微生物を用いることが望まれている。
特開２００２－２２３７７０号公報 特開２００４－２２２５６９号公報 特表２００９－５３１０４２号公報
須山、金尾、「薬学雑誌」，１９６５年，第８５巻，ｐ．５１３－５３３ セリアホワイトテーバー（Ｃｅｌｉａ　ｗｈｉｔｅ　ｔａｂｏｒ）、他１名，「マイクロバイオロジカルレビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）」，１９８５年，第４９巻，ｐ．８１－９９ タテノら、アプライド　マイクロバイオロジー　アンド　バイオテクノロジー（２００９）、８１（１）、１１５－２１（Ｔａｔｅｎｏ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００９），８１（１），１１５－２１） ミミツカら、バイオサイエンス　バイオテクノロジー　バイオケミカル（２００７）、７１（９）、２１３０－５（Ｍｉｍｉｔｓｕｋａ　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００７），７１（９），２１３０－５）
　本発明は、染色体中にＬＤＣ遺伝子を有し、かつＬ－リジンの副生産が抑制される微生物を用いた発酵による１，５－ペンタンジアミンの製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、１，５－ペンタンジアミンの発酵法による製造方法において、Ｌ－リジンの副生産の抑制を目的として鋭意研究した結果、染色体中にＬＤＣ遺伝子を有し、かつ、培養中に５０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上のリジン脱炭酸酵素比活性を有し続けているコリネ型細菌を１，５－ペンタンジアミンの発酵に用いることで、Ｌ－リジンの副生産の抑制が可能であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の（１）～（１２）で構成される。
（１）　染色体中にリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を有するコリネ型細菌による１，５－ペンタンジアミンの製造方法であって、前記コリネ型細菌が培養中に５０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上のリジン脱炭酸酵素活性を有し続けていることを特徴とする、１，５－ペンタンジアミンの製造方法。
（２）　染色体中にリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を有するコリネ型細菌による１，５－ペンタンジアミンの製造方法であって、該リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が対数増殖期に機能するプロモーター下流に連結されていることを特徴とする、１，５－ペンタンジアミンの製造方法。
（３）　前記プロモーターがｄｉｖＩＶＡ遺伝子プロモーターであることを特徴とする、（２）に記載の方法。
（４）前記プロモーターが下記（Ａ）～（Ｄ）のいずれかから選ばれるプロモーターであることを特徴とする、（２）または（３）に記載の方法。
（Ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるプロモーター
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるプロモーター
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるプロモーターもしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするプロモーター
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列との配列同一性が少なくとも８０％以上の塩基配列からなるプロモーター
（５）　前記リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が大腸菌由来の遺伝子であることを特徴とする、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）　前記リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が下記（Ａ）～（Ｄ）のいずれかから選ばれる遺伝子であってリジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなる遺伝子
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子もしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性が少なくとも８０％以上の塩基配列からなる遺伝子。
（７）　前記コリネ型細菌が、Ｌ－リジン生産性の向上したコリネ型細菌であることを特徴とする、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）　前記コリネ型細菌が、配列番号３に記載のアミノ酸配列において３１１番目のアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸に置換された変異型アスパラギン酸キナーゼを有することを特徴とする、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）　前記コリネ型細菌のホモセリンデヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損していることを特徴とする、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）　前記コリネ型細菌が、遺伝子挿入変異によってホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることを特徴とする、（９）に記載の方法。
（１１）　前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌であることを特徴とする、（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）　前記コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌がコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であることを特徴とする、（１１）に記載の方法。
本発明の実施例において作製したコリネ型細菌ＣＧ４５４１株を培養した際の培養上清中のグルコース濃度、リジン濃度および１，５－ペンタンジアミン(1,5-PD)濃度の経時変化を示す図である。 本発明の比較例において作製したコリネ型細菌ＴＭ４５５２株を培養した際の培養上清中のグルコース濃度、リジン濃度および１，５－ペンタンジアミン(1,5-PD)濃度の経時変化を示す図である。 本発明の実施例において作製したコリネ型細菌ＣＧ４５４１株の培養中のリジン脱炭酸酵素比活性の経時変化を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明におけるリジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）とは、Ｌ－リジンを基質として脱炭酸反応により１，５－ペンタンジアミンへの変換しうる酵素のことを意味しており、その他の酵素作用を併せて有していてもよい。
　本発明において使用されるＬＤＣに特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ；大腸菌）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｒｕｍｉｎａｍｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、またはピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）由来のものが好ましく用いられる。さらに好ましくは大腸菌由来のものである。
　本発明で使用されるリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子は、前述の生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が具体例として挙げられ、その際、使用する微生物のコドン使用頻度に応じて塩基配列を再設計してもよい。なお、前述の生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている。これらの中での好ましくは、大腸菌由来の遺伝子であり、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子である。
　次にＬＤＣの比活性について説明する。１分間に１μモルの１，５－ペンタンジアミンを生成するＬＤＣ量を１ユニット（Ｕ）と定義すると、ＬＤＣ活性とは下記式１で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　これより、ＬＤＣのタンパク質量あたりの活性、すなわち比活性は下記式２により算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　また、本発明におけるＬＤＣ比活性は、コリネ型細菌が有する総タンパク質あたりの比活性を意味しており、コリネ型細菌から抽出した総タンパク質を用いた比活性測定により算出することができる。なお、測定操作は下記実施例に具体的に記載されている。
　コリネ型細菌からタンパク質を抽出する方法としては限定されなく、超音波によって菌を破砕する方法、ガラスビーズを用いてボルテックスなどの攪拌によって菌を破砕する方法、高圧力をかけて菌を破砕する方法さらにはこれらを組み合わせて行う方法を用いることができるが、好ましくはガラスビーズを用いた方法である。
　本発明における染色体中にリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を有するコリネ型細菌は、５０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上のＬＤＣ比活性を有していることを特徴とし、好ましくは８０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上のＬＤＣ比活性を有し、より好ましくは１８０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上のＬＤＣ比活性を有する。また、実施例で後述するが、培養中のある時点で５０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉ以上のＬＤＣ比活性を有しても、その後比活性が低下すると、前駆体Ｌ－リジンの蓄積が起きることから、本発明で用いるコリネ型細菌は、上記のＬＤＣ比活性を培養の間中有し続けているものである。培養の間とは、コリネ型細菌を発酵培地に植菌してから基質糖を消費している期間のことを意味し、その期間中の任意の点における比活性を測定することで確認できる。好ましくは、上記ＬＤＣ比活性を維持する培養時間は、培養開始後５時間以上であり、より好ましくは１０時間以上であり、さらに好ましくは２０時間以上である。上記比活性を維持できる培養時間の上限は特にない。
　上記のようなＬＤＣ比活性をコリネ型細菌に付与する方法に制限はないが、コリネ型細菌の染色体に導入するリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させる方法や染色体に導入するリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子のプロモーターとして強力なプロモーターを用いる方法、また、酵素活性を向上させたリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を用いる方法などがあり、どれも好ましく用いることができるが、染色体に導入するリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子のプロモーターとして強力なプロモーターを用いる方法が好ましい。
　本発明で使用されるプロモーターは特に限定されず、コリネ型細菌内で機能し得るプロモーターであれば一般に使用でき、更に異種由来のプロモーターであってもよいが、好ましいプロモーターの例として、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の２－イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル－ＡＴＰピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系、例えばホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグアニル酸合成酵素遺伝子の各プロモーター、また細胞分裂に関係のあるｄｉｖＩＶＡ遺伝子などのプロモーターならびにｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターやＨＣＥプロモーター等の強力なプロモーターや、対数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｐｈａｓｅ）に機能するプロモーターが挙げられるが、より好ましくは対数増殖期に機能するプロモーターである。対数増殖期に機能するプロモーターの具体例としては、ｄｉｖＩＶＡ、ｇａｐ、ｌｄｈＡ、ｆｄａ、ｇｌｙＡ、ｃｙｓＫ、ａｒｏＦ、ｇｐｍＡ、ｅｎｏ、ｆｕｍＣ、ｐｆｋ、ｓｄｈＡ、ｍｄｈ、ａｒｇＦ、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＣ、ａｃｅＥ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＥ、ｎｉｆＳ１、ｔｐｉ、ａｃｅＤ、ｃｙｓＤ、ｓｄｈＢまたはｐｃｋ遺伝子のプロモーターが挙げられるが、なかでもｄｉｖＩＡ遺伝子プロモーターが好ましく、具体的には配列番号２に記載の塩基配列を有するプロモーターが特に好ましい。
　前記プロモーター配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、その機能を有する限りにおいては、それぞれ各塩基配列において、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列も含まれる。ここで、「数個」とは、通常１～４０個、好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個程度である。また、前記プロモーター配列、リジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列としては、その機能を有する限りにおいては、該塩基配列もしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列が挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を１つあるいは複数個選択した塩基配列をプローブとして、公知のハイブリダイセーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　６．３－６．４）などを用いて、ハイブリダイズする塩基配列である。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。また、前記プロモーターおよびリジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列としては、その機能を有する限りにおいては、配列同一性が、通常８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上を有する塩基配列であってもよい。ここで、配列同一性は、一致する塩基の数が最大となるように（必要に応じてギャップを挿入する）、２つの塩基配列を並べ、一致した塩基の数を完全長の配列の塩基数（２つの配列間で全塩基の数が異なる場合、長い方の配列の塩基数）で除することよって求めた値を意味する。そのような相同性の計算は、ＢＬＡＳＴのような周知のソフトウェアによって容易に行うことができる。
　このようなプロモーターおよびリジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列は、コリネ型細菌以外からも取得され得るし、コリネ型細菌から得られた塩基配列を、当業者に周知のインビトロ変異処理、あるいは部位特異的変異処理することによっても取得され得る。
　前記プロモーターおよびリジン脱炭酸酵素をコードする塩基配列のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８９），７，１０６７－１０７０）により導入することができる。
　また、コリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在、コリネバクテリウム属に統合された細菌も含まれる（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８１）４１,ｐ．２２５）。また、コリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｙｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エッフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アルバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）、ブレビバクテリウム・セリヌム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｅｒｉｎｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）が挙げられる。
　また、各コリネ型細菌の具体的な菌株として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム　ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム　ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカム　ＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエ　ＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウム　ＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラ　ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・エッフィシエンス　ＡＪ１２３４０（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリス　ＡＴＣＣ１３８６８、ブレビバクテリウム・ディバリカタム　ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム　ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７，ＡＪ１２４１８（寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２０５）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム　ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム　ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム　ＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム　ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス　ＡＴＣＣ１９２４０、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス　ＡＴＣＣ６８７１，ＡＴＣＣ６８７２、ブレビバクテリウム・アルバム　ＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌム　ＡＴＣＣ１５１１２、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス　ＡＴＣＣ１５３５４が挙げられる。
　前述のコリネ型細菌は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載され、この番号を参照して各菌株の分譲を受けることができる。
　本発明の１，５－ペンタンジアミンの製造方法に用いる染色体中にリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を有するコリネ型細菌は、１，５－ペンタンジアミンの前駆体であるＬ－リジン生産性の向上したコリネ型細菌であることが好ましい。コリネ型細菌のＬ－リジン生産性を向上させる方法に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、特開２００４－２２２５６９号公報に記載されているようにＳ－アミノエチルシステイン（ＡＥＣ）に対する耐性株を取得する方法やＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００６，３３（７）６１０－５）や特表２００９－５３１０４２号公報に記載されているようにゲノム育種法によりＬ－リジン生産性を向上させる方法があるが、どちらも好適に採用することができる。
　本発明のＬ－リジンの生産性の向上したコリネ型細菌の好ましい態様によれば、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパラギン酸キナーゼを有することが好ましく、配列番号３に記載のアミノ酸配列において３１１番目のアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸に置換された変異型アスパラギン酸キナーゼを有することがより好ましい。
　本発明のＬ－リジンの生産性の向上したコリネ型細菌の別の好ましい態様によれば、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性が低下もしくは欠損していることが好ましく、遺伝子挿入変異によってホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊または分断され、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることがより好ましい。
　培養方法としては、回分培養、流加培養または連続培養を用いることができる。連続培養の場合、例えば特開２００８－１０４４５３号公報に記載のような連続培養を行うことが好ましい。
　培養培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを含む通常の栄養培地を用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ビタミンＢ６等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
　培養条件には特に制限はなく、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２５℃～４２℃に、好ましくは２８℃～３８℃である。培養時間は、通常１日から１０日間である。
　培養ｐＨ調整にはアンモニア、塩酸またはジカルボン酸を使用することが好ましく、ジカルボン酸を使用することがより好ましい。これら中和剤を用いて培養ｐＨを５～８に、好ましくはｐＨ６．５～７．５に制御するのがよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用される。特に好ましくは水溶液である。
　中和剤として好ましく使用されるジカルボン酸には特に制限はないが、好ましくは、前記２つのカルボキシル基以外には、実質上、官能基が存在しないジカルボン酸である。ここでいう官能基とは、ポリアミド重合反応（反応条件としては、例えば、反応温度２５０～２７０℃、圧力１０～２０ｋｇ／ｃｍ２で反応時間１から５時間）の際にアミノ基やカルボキシル基等と反応して、ポリマーの分岐を引き起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下（結晶化度８０％以下）させるような反応基であり、例えば、アミノ基やカルボキシル基がこれに該当するが、それ以外には、酸性基（スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等）や塩基性基（ヒドラジノ基等）やプロトニックな極性基（水酸基等）や開裂性を有する基（エポシキ基、過酸化基等）やその他反応性の高い基（イソシアナート基等）が該当する。一方、ハロゲン置換基や芳香族性置換基、エーテル基、エステル基、アミド基等は反応性が低く、ここでいう官能基には該当しない。
　ジカルボン酸として、より好ましくは、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸である。
　ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯＨ　（１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０～１６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （但し、一般式（２）において、ｎ，ｏ＝０～１６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （但し、一般式（３）において、ｐ，ｑ＝０～１６）。
　また、ジカルボン酸として、更に好ましくは、アジピン酸、セバシン酸、１，１２－ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸、テレフタル酸である。
　培養液中の１，５－ペンタンジアミンは１，５－ペンタンジアミンのフリー体または１，５－ペンタンジアミン塩として存在する。培養液中の１，５－ペンタンジアミンを採取する方法として、まず、培養液中から微生物を除去する。その際、微生物が増殖し、発酵が十分進んで１，５－ペンタンジアミンが生成した後、菌体と培養上清を分離（分離方法としては、菌体を沈殿除去・遠心分離・膜ろ過分離）しても良いし、あるいは始めから菌体を保持材等で分離・保持あるいは固定化していても良い。このようにして菌体が除去された１，５－ペンタンジアミンを含む培養液から１，５－ペンタンジアミンを採取する方法としては、特開２００９－２０７４９５号公報に記載のように１，５－ペンタンジアミン・ジカルボン酸塩として晶析して採取することもできる。また特開２００９－２９８７２号公報に記載のようにＮＦ膜を利用して１，５－ペンタンジアミンを精製し採取することもできる。また、特開２００９－２８０４５号公報に記載のように極性有機溶媒で抽出し、蒸留することにより１，５－ペンタンジアミンを採取することもできる。
　以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは本発明の例示であり本発明を制限するものではない。
１，５－ペンタンジアミンおよびＬ－リジン濃度のＨＰＬＣによる分析方法
　使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８（資生堂）
　移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
　検出：ＵＶ３６０ｎｍ
　サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として１，４－ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４－ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
実施例１、比較例１
(1)　Ｌ－リジンを発酵生産できるコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
　１，５－ペンタンジアミンの前駆体であるＬ－リジンを合成できるコリネバクテリウム・グルタミカムを作製するため、アスパルトキナーゼ（ＡＫ）への有効変異導入によるＬ－リジン発酵菌を作製した。Ａｐｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００２），５８，ｐ．２１７－２２３に記載の方法を参考に、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＫ－１（以下ＡＫ-１株と略す）株を作製した。すなわち、この操作は具体的に次のようにして行った。
　コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型とし、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＡＫ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＡ００００３６）の塩基配列を参考に設計したオリゴヌクレオチド（配列番号：４，５）をプライマーセットとしてＰＣＲを行い、得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ＡＫ遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで切断し、得られた１．３ｋｂのＢａｍＨＩ－ＳｐｈＩ断片を、予めＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで切断しておいたｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ間隙にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＴＭ４７とする。なお、得られたＡＫ遺伝子がデータベースに登録されている遺伝子配列と同じであることをシーケンスにより確認した。
　次に、クローニングしたＡＫ遺伝子の９３１番目から９３３番目のａｃｃ（Ｔｈｒ）をａｔｇ（Ｉｌｅ）に変異させるために、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。詳細の実験方法については本製品のマニュアルに従い実施した。ｐＡＫ１を増幅鋳型、配列番号６，７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、ｐＡＫ１全長を増幅した。このＰＣＲ産物をＤｐｎＩで処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。プラスミドを抽出し、ＡＫ遺伝子配列を確認したところ目的の変異が導入されているプラスミドが取得でき、これをｐＴＭ４９－１とした。このｐＴＭ４９－１をＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断した後、ＡＫ遺伝子部分（約１．３ｋｂ）のゲル抽出を行い変異導入ＡＫ遺伝子を精製した。
　次に、バチルス・サブチリス　ＩＦＯ１３７１９株の菌体を鋳型にし、配列番号８，９に示す塩基配列をプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｓａｃＢ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳａｃＩで切断後、同じくＳａｃＩで予め切断しておいたｐＨＳＧ２９８（選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を持つｐＵＣタイプの市販のプラスミド、タカラバイオ社製）にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＴＭ３８とする。次にＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＴＭ３８と上記ＡＫ遺伝子を含む断片とをライゲーションした。こうして作製したｓａｃＢ遺伝子および変異型ＡＫ遺伝子を有するプラスミドをｐＴＭ５２とする。
　ＡＴＣＣ１３０３２株に上記のようにして作製したｐＴＭ５２を電気穿孔法［ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，ｐ．２９９（１９８９）］により導入し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）が添加されているＬＢ（トリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、酵母エキス（５ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、塩化ナトリウム（１０ｇ／ｌ））寒天培地上で形質転換体を選択した。続いて選択したカナマイシン耐性コリネ菌をスクロース添加培地上で培養し、ダブルクロッシングオーバーによりスクロース耐性コリネ菌を選択した。こうして選択された形質転換体のうち、Ｓ－アミノエチルシステイン（ＡＥＣ）を２０ｍＭ含有する最小培地で生育可能な株から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行ってＡＫ遺伝子の配列を確認したところ、９３１番目から９３３番目の配列がａｔｇに置換されていることが確認できた。このようにして作製したＡＫ－１株のアスパルトキナーゼは、リジンおよびスレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。そのためＬ－リジンを培養により合成できるようになっている。
　次に、得られたＡＫ－１株を更に遺伝子組換えにより、大腸菌由来のＬＤＣ遺伝子を染色体中に1コピー有するコリネ型細菌、２コピー有するコリネ型細菌を以下に記載する方法により作製した。
(2)　ＬＤＣ遺伝子１コピー染色体導入コリネ菌の作製（比較例１）
　ＡＫ－１株を１，５－ペンタンジアミン発酵菌に改良するために、大腸菌由来のＬＤＣ遺伝子をホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子座に導入するためのプラスミドｐＴＭ４５を作製した。すなわち、この操作は具体的に次のようにして行った。
　ｐＨＳＧ２９８を鋳型にし、配列番号１０，１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターを増幅した。次に、このＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断した後、ゲル抽出を行いカナマイシン耐性遺伝子のプロモーター（Ｋｍｐ）を精製した。一方、ベクターｐＵＣ１９をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断した後、ゲル抽出によりｐＵＣ１９を精製した。これらＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断されているｐＵＣ１９およびカナマイシン耐性遺伝子のプロモーターをライゲーションした。こうして作製したプラスミドをｐＫｍｐとした。
　次に、大腸菌ＪＭ１０９株の菌体を鋳型にし、配列番号１２，１３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行いＬＤＣ遺伝子を増幅した。この増幅したＬＤＣ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切断した後、ゲル抽出によりＬＤＣ遺伝子を精製した。一方、プラスミドｐＫｍｐをＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切断した後、ゲル抽出によりｐＫｍｐを精製した。これらＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切断されているｐＫｍｐおよびＬＤＣ遺伝子をライゲーションした。こうして作製したプラスミドをｐＴＭ２４とした。
　次にＡＴＣＣ１３０３２株の菌体を鋳型にし、配列番号１４，１５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行いｈｏｍ遺伝子を増幅した。この増幅したｈｏｍ遺伝子を制限酵素ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断した後、ゲル抽出を行いｈｏｍ遺伝子を精製した。一方、上述したｐＴＭ３８をＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断した後、ゲル抽出によりｐＴＭ３８を精製した。これらＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断されているｐＴＭ３８およびｈｏｍ遺伝子をライゲーションした。こうして作製したプラスミドをｐＴＭ４４とした。
　次に、プラスミドｐＴＭ２４を鋳型にし、配列番号１６，１７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、Ｋｍｐ－ＬＤＣ遺伝子断片を増幅した。この増幅したＫｍｐ－ＬＤＣ遺伝子断片を制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩで切断した後、ゲル抽出を行いＫｍｐ－ＬＤＣ遺伝子断片を精製した。上記のようにして作製したｐＴＭ４４をＡｏｒ５１ＨＩで切断した後、ゲル抽出によりｐＴＭ４４を精製した。これらＡｏｒ５１ＨＩで切断されているｐＴＭ４４およびＫｍｐ－ＬＤＣ遺伝子断片をライゲーションした。こうして作製したプラスミドをｐＴＭ４５とした。
　次に、ＡＫ-１株にプラスミドｐＴＭ４５を、電気穿孔法［ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，ｐ．２９９（１９８９）］により導入してカナマイシン耐性株を選抜した後に、カナマイシン耐性株をスクロース添加培地上で培養し、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００７），７１（９），２１３０－５のＴＭ４５株作製方法として記載されているダブルクロッシングオーバー法により、ｓａｃＢ遺伝子が脱落したスクロース耐性コリネ菌を選択した。こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号１８，１９）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、３．５ｋｂの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、ｈｏｍ遺伝子座に、ＬＤＣ遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＴＭ４５５２株（ＴＭ４５５２株と略す）と命名した。
(3)　ＬＤＣ遺伝子２コピー保有コリネ菌の作製（実施例１）
　次にＬＤＣ遺伝子を乳酸脱水素酵素遺伝子（ＬＤＨ遺伝子）座に導入するためのプラスミドを作製した。
(i)　ＬＤＣ遺伝子発現カセットの作製
　ＬＤＣ遺伝子の発現プロモーターとしてＡＴＣＣ１３０３２株のｄｉｖＩＶＡ遺伝子（配列番号２０）のプロモーター（配列番号２、Ｐｄｉｖと略す）を用いた。
　まず、常法に従い調整したＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１，２２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、Ｐｄｉｖのクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応には、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。プライマーを２０ｐｍｏｌ／サンプル、およびKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、６０℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：３０秒を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２１、２２）には、５末端側にはＢａｍＨＩ認識配列、３末端側にはＮｃｏＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
　ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＢａｍＨＩ，ＮｃｏＩで切断し、Ｐｄｉｖ断片が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。このようにして作製したプラスミドをｐＣＧ５とする。
　次に、大腸菌ＪＭ１０９株の菌体を鋳型としたＰＣＲ法によりＬＤＣ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応は上記と同様な方法で行い、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２３，２４）には、５末端側にはＮｃｏＩ認識配列、３末端側にはＳａｃＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。得られたＬＤＣ遺伝子を含むＰＣＲ増幅断片を精製し、上記と同様な方法でｐＵＣ１１８にクローニングした。作製したプラスミドをｐＣＧ１１とする。
　次にｐＣＧ１１を制限酵素ＮｃｏＩ，ＸｂａＩで切断し、ＬＤＣ遺伝子を含む約２．１ｋｂの断片を切り出して精製した後、予め制限酵素ＮｃｏＩ，ＸｂａＩで切断しておいたｐＣＧ５にライゲーションした。得られたＰｄｉｖ下流にＬＤＣ遺伝子が連結された断片を有するプラスミドをｐＣＧ１３とする。
（ii）ＬＤＨ遺伝子座導入用プラスミドの作製
　ＬＤＨ遺伝子座に導入するための相同領域として、それぞれ５００ｂｐのＬＤＨ遺伝子５末端および３末端領域のクローニングを行った。それぞれ、ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムを鋳型として、配列番号２５，２６（５末端領域）および配列番号２７，２８（３末端領域）をプライマーセットとして、上記と同様な方法でＰＣＲを行った。なお、５末端領域増幅用プライマー（配列番号２５，２６）には、５末端側および３末端側にＢｇｌII認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製し、３末端領域増幅用プライマー（配列番号２７，２８）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、３末端側にはＳｐｈＩ認識配列が負荷されるようにして作製した。得られたＬＤＨ遺伝子の５末端および３末端領域を含む約５００ｂｐのＰＣＲ増幅断片をそれぞれ精製し、上記と同様な方法でｐＵＣ１１８にそれぞれクローニングした。作製したプラスミドをｐＣＧ２８（５末端領域）およびｐＣＧ２９（３末端領域）とする。
　次に、ｐＣＧ１３を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断し、Ｐｄｉｖ－ＬＤＣ遺伝子を含む約２．４ｋｂの断片を切り出して精製した後に、上述したｐＴＭ３８を予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断しておいたものにライゲーションした。得られたプラスミドをｐＣＧ３３とする。
　次に、ｐＣＧ２９を制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで切断し、ＬＤＨ遺伝子の３末端領域を含む断片を切り出して精製した後に、予め制限酵素ＳａｌＩ，ＳｐｈＩで切断しておいたｐＣＧ３３にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＣＧ３７とする。
　最後に、ｐＣＧ２８を制限酵素ＢｇｌＩＩ，ＢａｍＨＩで切断し、ＬＤＨ遺伝子の５末端領域を含む断片を切り出して精製した後に、予め制限酵素ＢｇｌＩＩ，ＢａｍＨＩで切断しておいたｐＣＧ３７にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＣＧ４１とする。
(iii)　ｐＣＧ４１の染色体への導入
　先に作製した上記ＴＭ４５５２株に上記のようにして作製したｐＣＧ４１を導入し、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）が添加されているＬＢ（トリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、酵母エキス（５ｇ／ｌ）（Ｂａｃｔｏ社製）、塩化ナトリウム（１０ｇ／ｌ））寒天培地上で形質転換体を選択した。続いて選択したカナマイシン耐性コリネ菌をスクロース添加培地上で培養し、実施例１と同様にダブルクロッシングオーバーによりスクロース耐性コリネ菌を選択した。こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号２５，２８）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、約３．３ｋｂの単一のバンドが観察された。なお、ｐＣＧ４１未導入株では約２ｋｂの断片が得られる。このことから、選択された形質転換体が、ＬＤＨ遺伝子座に、Ｐｄｉｖ－ＬＤＣ遺伝子断片が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＧ４５４１株（ＣＧ４５４１株と略す）と命名した。
(4)　１，５－ペンタンジアミン発酵試験
　上記のとおり作製したＴＭ４５５２株（比較例１）およびＣＧ４５４１株（実施例１）を用いて１，５－ペンタンジアミン発酵試験を行った。
　滅菌した表１に示す培地５ｍＬにＣＧ４５４１株（実施例３）およびＴＭ４５５２株（比較例１）をそれぞれ１白金耳分植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地４５ｍｌに全量植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に、表１に示す培地のグルコース濃度を１５０ｇ／Ｌに変更した培地１０００ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．０７ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを６．７に調整しながら培養を行った。中和剤として硫酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＣＧ４５４１株の培養結果を図１、ＴＭ４５５２株を図２に示す。その結果、ＴＭ４５５２株（比較例１）は１，５－ペンタンジアミン蓄積濃度が途中で頭打ちになり、また前駆体であるＬ－リジンの蓄積も起きたのに対し、ＣＧ４５４１株（実施例1）では１，５－ペンタンジアミンの蓄積濃度が１０ｇ/Ｌ以上まで向上し、また前駆体Ｌ－リジンの蓄積はまったく起きていなかった。
(5)　リジン脱炭酸酵素の比活性測定
　上記のとおり培養したＣＧ４５４１株（実施例１）およびＴＭ４５５２株（比較例1）のＬＤＣ比活性を経時的に測定した。
　上記のとおり培養した各株の培養液を経時的に１０ｍｌサンプリングして４０００ｒｐｍで５分遠心して集菌した後、２ｍｌのバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８）に懸濁した。２ｍｌのスクリューキャップ式チューブ（ＷＡＴＳＯＮ社製）に０．４ｇ／本のガラスビーズ（０．１ｍｍφ、アズワン社製）を入れ、そこに１ｍｌの菌体懸濁液を加えた。次にビーズ式ホモジナイザー（ＴＯＭＹ精工社製）にて、４０００ｒｐｍで１分間の破砕操作を５回繰り返し行った後、１２０００ｒｐｍで５分遠心して上清を回収し、回収した上清を粗酵素液として、続くリジン脱炭酸酵素の比活性測定試験に用いた。また、タンパク質濃度の測定にはＢＣＡプロテインアッセイキットを用いた（ＰＩＥＲＣＥ社製）。ＣＧ４５４１株の粗酵素液中のタンパク質濃度を表２、ＴＭ４５５２株の粗酵素液中のタンパク質濃度を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記のようにして得られた粗酵素液を用いて、Ｌ－リジンを基質としたリジン脱炭酸酵素活性を測定した。反応溶液の組成を表４に示す。反応は３７℃で３０分間行い、その後反応を終了させるために１０分間煮沸した。遠心後の上清を用いて、Ｌ－リジンおよび生成した１，５－ペンタンジアミンの濃度を上記のようにＨＰＬＣで測定し、タンパク質当たりのＬＤＣ比活性を式１によって算出した。ＬＤＣ比活性の経時的変化を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　図３の結果から、ＴＭ４５５２株のＬＤＣ比活性は培養の経過とともに低下していき、培養開始後９０時間時点ではほとんど確認できなくなった。それに対しＣＧ４５４１株のＬＤＣ比活性は、培養の経過とともに減少傾向にはあるものの、培養中に渡って比活性が１８０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上を保持していた。
　ＣＧ４５４１株のＬＤＣ比活性および培養液中の１，５－ペンタンジアミン、Ｌ－リジン濃度を表５、ＴＭ４５５２株のＬＤＣ比活性および培養液中の１，５－ペンタンジアミン、Ｌ－リジン濃度を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表６の結果から、ＴＭ４５５２株は培養開始後２５時間の時点のＬＤＣ比活性は８３ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、培養液中にはＬ－リジンの蓄積がなかったのに対し、培養開始後４５時間の時点ではＬＤＣ比活性が３９ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎに低下し、また培養液中にはＬ－リジンの蓄積が起きていた。それ以降、ＬＤＣの比活性は低下しＬ－リジンの蓄積は増加していった。一方、表５の結果からＣＧ４５４１株では培養中ＬＤＣ比活性が１８０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎを維持しており、培養中に渡って培養液中にはＬ－リジンの蓄積は一切おきていなかった。
　ＣＧ４５４１株はＬＤＣ遺伝子の発現プロモーターとして、カナマイシン耐性遺伝子とｄｉｖＩＶＡ遺伝子のプロモーターを用いているが、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターのみを用いているＴＭ４５５２株のＬＤＣ比活性は最も高い時点でも８０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ程度であることから、ＣＧ４５４１株のＬＤＣ比活性持続性はｄｉｖＩＶＡ遺伝子のプロモーターの効果であると思われる。
　本発明はポリアミドの原料となりうる１，５－ペンタンジアミンを製造する方法として有用である。

Claims (12)

  1. 　染色体中にリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を有するコリネ型細菌による１，５－ペンタンジアミンの製造方法であって、前記コリネ型細菌が培養中に５０ｍＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上のリジン脱炭酸酵素活性を有し続けていることを特徴とする、１，５－ペンタンジアミンの製造方法。
  2. 　染色体中にリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を有するコリネ型細菌による１，５－ペンタンジアミンの製造方法であって、該リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が対数増殖期に機能するプロモーター下流に連結されていることを特徴とする、１，５－ペンタンジアミンの製造方法。
  3. 　前記プロモーターがｄｉｖＩＶＡ遺伝子プロモーターであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記プロモーターが下記（Ａ）～（Ｄ）のいずれかから選ばれるプロモーターであることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
    （Ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるプロモーター
    （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるプロモーター
    （Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるプロモーターもしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするプロモーター
    （Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列との配列同一性が少なくとも８０％以上の塩基配列からなるプロモーター
  5. 　前記リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が大腸菌由来の遺伝子であることを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が下記（Ａ）～（Ｄ）のいずれかから選ばれる遺伝子であってリジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
    （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子
    （Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなる遺伝子
    （Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子もしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子
    （Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性が少なくとも８０％以上の塩基配列からなる遺伝子。
  7. 　前記コリネ型細菌が、Ｌ－リジン生産性の向上したコリネ型細菌であることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記コリネ型細菌が、配列番号３に記載のアミノ酸配列において３１１番目のアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸に置換された変異型アスパラギン酸キナーゼを有することを特徴とする、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  9. 　前記コリネ型細菌のホモセリンデヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損していることを特徴とする、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　前記コリネ型細菌が、遺伝子挿入変異によってホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　前記コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌がコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
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