CN102844440A - 1,5-戊二胺的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用微生物发酵的1,5-戊二胺制造方法，该微生物在染色体中具有LDC基因、并且抑制了副产物L-赖氨酸的产生。所述1,5-戊二胺的制造方法为利用了棒状杆菌的1,5-戊二胺制造方法，该棒状杆菌在染色体中具有编码赖氨酸脱羧酶的基因，所述棒状杆菌在培养中持续保持有50mU/mg蛋白以上的赖氨酸脱羧酶活性。

Description

1,5-戊二胺的制造方法
技术领域
本发明涉及利用发酵法制造1,5-戊二胺的方法。
背景技术
聚酰胺（PA）是用作汽车行业、运动行业、生活时尚行业中所使用的一系列特殊塑料的原材料的重要聚合物组，二胺是所述聚酰胺的重要原材料单体成分。二胺和二羧酸缩合形成各种聚合物，此时，聚合物的特性由二胺和二羧酸的链长决定。
通常，二胺以化学方式经过二羧酸的中间阶段而由衍生自石油的材料来制造；或者通过氨基酸的化学脱羧反应来制造（非专利文献1）。考虑到石油价格的高涨，期望快速变化为下述方法：通过发酵等生物技术方法从可再生资源来合成二胺。
这里，利用发酵来制造作为碳数为5的二胺的1,5-戊二胺的方法受到广泛关注。1,5-戊二胺别名为尸胺，是可以用作聚酰胺的原材料单体的化合物。另外，1,5-戊二胺是生物体内普遍存在的多胺，其生物合成体系正逐步被阐明（参考非专利文献2），作为其生物合成途径的一部分，已知对L-赖氨酸的脱羧反应进行催化的L-赖氨酸脱羧酶（下面简称为LDC）。
在传统的利用发酵的1,5-戊二胺制造方法中，已知有：以向微生物中导入LDC基因为基础，利用重组大肠杆菌的发酵的制造方法（参考专利文献1）；在产赖氨酸的微生物的棒状杆菌中，进一步提高赖氨酸生产能力的方法（参考专利文献2）；切断1,5-戊二胺降解体系的方法（参考专利文献3）；通过自主复制型载体提供赖氨酸脱羧酶的方法（参考非专利文献3）。
但是，在利用发酵的1,5-戊二胺制造方法中需要解决的问题较多，例如有这样的问题：在对向产L-赖氨酸的微生物的棒状杆菌中导入了LDC基因的微生物进行培养时，会生成副产物赖氨酸（参考非专利文献4）。就是说，赖氨酸虽然是即将生物合成1,5-戊二胺时的前体，但是会出现未反应的赖氨酸在培养上清液中大量出现的问题。当如前所述生成副产物赖氨酸时，尽管可以制得前体，但1,5-戊二胺的发酵产率没有提高，从而造成经济上的问题。另外，在专利文献3和非专利文献3中，通过自主复制型载体提供LDC基因，但是由于在培养中需要添加昂贵的抗生物质等，因此为了在工业规模中廉价地发酵生产1,5-戊二胺，期望使用染色体中带有LDC基因的微生物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2002-223770号公报
专利文献2：日本特开2004-222569号公报
专利文献3：日本特表2009-531042号公报
非专利文献
非专利文献1：須山、金尾、「薬学雑誌」，1965年，第85卷，p.513-533
非专利文献2：セリアホワイトテ一バ一（Celia white tabor）、
另外1人，「マイクロバイオロジカルレビユ一ズ（MicrobiologicalReviews）」，1985年，第49卷，p.81-99
非专利文献3：タテノ等，アプライナマイクロバイオロジ一アンナバイオテクノロジ一（2009）、81（1）、115-21（Tateno ApplMicrobiol Biotechnol(2009),81(1),115-21）
非专利文献4：ミミツカ等，バイオサイエンスバイオテクノロジ一バイオケミカル（2007）、71（9）、2130-5（Mimitsuka BiosciBiotechnol Biochem(2007),71(9),2130-5）
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供一种1,5-戊二胺的制造方法，该制造方法利用了在染色体中具有LDC基因、并且副产物L-赖氨酸的生成得到抑制的微生物来进行发酵。
解决问题的手段
本发明人在利用发酵法的1,5-戊二胺的制造方法中，以抑制副产物L-赖氨酸的产生为目的，进行了专心的研究，结果发现，通过在1,5-戊二胺的发酵中使用棒状杆菌，副产物L-赖氨酸的生成可以得到抑制，从而完成了本发明，所述棒状杆菌在染色体中具有LDC基因，并且在培养中持续保持有50mU/mg蛋白以上的赖氨酸脱羧酶比活性。即，本发明由以下（1）至（12）构成。
（1）一种1,5-戊二胺的制造方法，其为利用了棒状杆菌的1,5-戊二胺的制造方法，该棒状杆菌在染色体中具有编码赖氨酸脱羧酶的基因，所述制造方法的特征在于，所述棒状杆菌在培养中持续保持有50mU/mg蛋白以上的赖氨酸脱羧酶活性。
（2）一种1,5-戊二胺的制造方法，其为利用了棒状杆菌的1,5-戊二胺的制造方法，该棒状杆菌在染色体中具有编码赖氨酸脱羧酶的基因，所述制造方法的特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的基因被连接至在对数增殖期中起作用的启动子的下游。
（3）上述（2）所述的方法，其特征在于，所述启动子为divIVA基因启动子。
（4）上述（2）或（3）所述的方法，其特征在于，所述启动子为选自下列（A）至（D）中任一项的启动子：
（A）由序列号2中所记载的碱基序列形成的启动子；
（B）由在序列号2所记载的碱基序列中，发生1个或多个碱基的置换、缺失、插入和/或添加后的碱基序列所形成的启动子；
（C）与由序列号2中所记载的碱基序列形成的启动子或者其互补链的全体或一部分在严格条件下杂交的启动子；
（D）由与序列号2中所记载的碱基序列的序列一致性为至少80%以上的碱基序列所形成的启动子。
（5）上述（1）至（4）中任意一项所述的方法，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的基因是来源于大肠杆菌的基因。
（6）上述（1）至（5）中任意一项所述的方法，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的基因为选自下列（A）至（D）中任一项的基因，并且为编码具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质的基因：
（A）由序列号1中所记载的碱基序列形成的基因；
（B）由在序列号1所记载的碱基序列中，发生1个或多个碱基的置换、缺失、插入和/或添加后的碱基序列形成的基因；
（C）与由序列号1中所记载的碱基序列形成的基因或者其互补链的全体或一部分在严格条件下杂交的基因；
（D）由与序列号1中所记载的碱基序列的序列一致性为至少80%以上的碱基序列所形成的基因。
（7）上述（1）至（6）中任意一项所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌为提高了L-赖氨酸的生产性的棒状杆菌。
（8）上述（1）至（7）中任意一项所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌具有突变型天冬氨酸激酶，该突变型天冬氨酸激酶是序列号3所记载的氨基酸序列中的第311位的氨基酸残基被苏氨酸以外的氨基酸置换而得到的。
（9）上述（1）至（8）中任意一项所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌的高丝氨酸脱氢酶活性降低或者缺失。
（10）上述（9）所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌通过基因插入突变而缺失高丝氨酸脱氢酶活性。
（11）上述（1）至（10）中任意一项所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌为属于棒状杆菌属（Genus Corynebacterium）的细菌。
（12）上述（11）所述的方法，其特征在于，所述属于棒状杆菌属（Genus Corynebacterium）的细菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。
附图简要说明
[图1]为示出了在对本发明实施例中所制作的棒状杆菌CG4541
菌株进行培养时，培养上清液中的葡萄糖浓度、赖氨酸浓度以及1,5-戊二胺（1,5-PD）浓度随时间变化的图。
[图2]为示出了在对本发明的比较例中所制作的棒状杆菌TM4552菌株进行培养时，培养上清液中的葡萄糖浓度、赖氨酸浓度以及1,5-戊二胺（1,5-PD）浓度随时间变化的图。
[图3]为示出了在本发明的实施例中所制作的棒状杆菌CG4541菌株的培养中，赖氨酸脱羧酶比活性随时间变化的图。
具体实施方式
下面对本发明的实施方案进行详细说明。
本发明中的赖氨酸脱羧酶（LDC）是指以L-赖氨酸为底物，通过脱羧反应能够将其转换为1,5-戊二胺的酶，也可以同时具有其它的酶作用。
对本发明中使用的LDC没有特别限定，但是优选使用来源于（例如）耐盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli；大肠杆菌）、反刍月形单胞菌（Selenomonas ruminamtium）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）、毛链霉菌（Streptomyces pilosus）、侵蚀艾肯菌（Eikenellacorrodens）、噬氨基酸真杆菌（Eubacterium acidaminophilum）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia Alvei）、脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）、嗜酸热原体（Thermoplasmaacidophilum）、或者深海热球菌（Pyrococcus abyssi）的LDC。更优选为来源于大肠杆菌的LDC。
关于本发明所使用的编码赖氨酸脱羧酶的基因，作为具体例子可以举出编码来源于上述生物的赖氨酸脱羧酶的基因，此时，根据所用微生物的密码子使用频率，可以对碱基序列进行再设计。需要说明的是，编码来源于上述生物的赖氨酸脱羧酶的碱基序列登记在数据库（GenBank）中。在它们之中，优选的是来源于大肠杆菌的基因，其是由序列号1中所记载的碱基序列形成的基因。
接下来对LDC的比活性进行说明。在将1分钟内生成1μ摩尔1,5-戊二胺的LDC量定义为1单位（U）时，LDC活性可以由下式1表示。
[数学式1]
(式1)
由此，LDC的每单位蛋白质质量的活性，即比活性，可以由下式2算出。
[数学式2]
Figure BDA00002247455900062
(式2)
另外，本发明中的LDC比活性是指相对于棒状杆菌所具有的总蛋白质的比活性，可以使用从棒状杆菌中提取的总蛋白质通过比活性测定来算出。而且测定操作具体记载在下述实施例中。
对从棒状杆菌中提取蛋白质的方法没有限定，可以使用利用超声波破碎菌的方法、使用玻璃珠通过进行漩涡式等搅拌破碎菌的方法、施加高压力来破碎菌的方法、以及将这些方法组合进行的方法，但优选使用玻璃珠的方法。
本发明中，在染色体中具有编码赖氨酸脱羧酶的基因的棒状杆菌的特征在于，具有50mU/mg蛋白以上的LDC比活性，优选具有80mU/mg蛋白以上的LDC比活性，更优选具有180mU/mg蛋白以上的LDC比活性。另外，如后面的实施例中所述，即使在培养过程中的某一时刻具有50mU/mg蛋白以上的LDC比活性，如果之后比活性下降，也会引起前体L-赖氨酸的蓄积，因此本发明所使用的棒状杆菌在培养期间持续具有上述LDC比活性。培养期间是指棒状杆菌接种在发酵培养基中之后消耗基质糖的期间，可以通过测定该期间中的任意点的比活性来进行确认。优选的是，维持上述LDC比活性的培养时间为培养开始之后5小时以上，更优选10小时以上，进一步优选20小时以上。能够维持上述比活性的培养时间并没有特别的上限。
对给棒状杆菌赋予上述这样的LDC比活性的方法没有限制，有：使对导入到棒状杆菌的染色体中的赖氨酸脱羧酶进行编码的基因的拷贝数增加的方法，或者使用强启动子作为对导入到染色体中的赖氨酸脱羧酶进行编码的基因的启动子的方法；另外，还有使用对使酶活性提高的赖氨酸脱羧酶进行编码的基因的方法等，可以优选使用任意一种方法，但是优选的是，使用强启动子作为对导入到染色体中的赖氨酸脱羧酶进行编码的基因的启动子的方法。
对本发明所使用的启动子没有特别限定，只要是能够在棒状杆菌中起作用的启动子，一般都能使用，还可以是来源于异种的启动子，但是作为优选启动子的例子，可以举出：各种氨基酸生物合成体系，例如谷氨酸生物合成体系的谷氨酸脱氢酶基因，谷氨酸合成体系的谷氨酸合成酶基因，赖氨酸生物合成体系的天冬氨酸激酶基因，苏氨酸生物合成体系的高丝氨酸脱氢酶基因，异亮氨酸和缬氨酸生物合成体系的乙酰羟基酸合成酶基因，亮氨酸生物合成体系的2-异丙基苹果酸合成酶基因，脯氨酸和精氨酸生物合成体系的谷氨酸激酶基因，组氨酸生物合成体系的磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶基因，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸生物合成体系的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP）合成酶基因；肌苷酸和鸟苷酸这样的核酸生物合成体系，例如磷酸核糖焦磷酸（PRPP）氨基转移酶基因，肌苷酸脱氢酶基因和鸟苷酸合成酶基因的各个启动子；还有与细胞分裂有关的divIVA基因等的启动子，以及tac启动子、trc启动子或HCE启动子等强启动子，或者作用于对数增殖期（exponential phase）的启动子；更优选的是作用于对数增殖期的启动子。作为作用于对数增殖期的启动子的具体例子，可以举出：divIVA、gap、ldhA、fda、glyA、cysK、aroF、gpmA、eno、fumC、pfk、sdhA、mdh、argF、proA、proC、aceE、serA、metE、nifS 1、tpi、aceD、cysD、sdhB或pck基因的启动子，其中优选divIA基因的启动子，具体来说，特别优选具有序列号2中所记载的碱基序列的启动子。
作为上述启动子序列和编码赖氨酸脱羧酶的基因的碱基序列，在具有其功能的范围内，还包括在各碱基序列中，发生1个或多个碱基的置换、缺失、插入或添加的核酸序列。这里，“多个”通常为1至40个的程度，优选1至30个，更优选1至20个，进一步优选1至9个，更进一步优选1至5个。另外，作为上述启动子序列和编码赖氨酸脱羧酶的碱基序列，在具有其功能的范围内，可以列举出与所述碱基序列或者其互补链的全体或一部分在严格条件下杂交的碱基序列。这里，“在严格条件下杂交的多核苷酸”是指（例如）将选自原来的碱基序列中任意至少20个、优选为25个、更优选为至少30个连续序列中的1个或多个碱基序列作为探针，使用公知的杂交技术（CurrentProtocols I Molecular Biology edit.Ausbel等，(1987)Publish.JohnWily & Sons Section 6.3-6.4）等进行杂交的碱基序列。此处作为严格条件，例如在50%甲酰胺的存在下，在杂交温度为37℃、作为更加严格的条件为42℃、作为进一步更严格的条件为65℃时，通过用0.1至2倍浓度的SSC溶液（1倍浓度的SSC溶液的组成：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠）洗涤，由此可实现杂交。另外，作为上述启动子和编码赖氨酸脱羧酶的碱基序列，在具有其功能的范围内，也可以为序列一致性通常在80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、进一步优选为99%以上的碱基序列。此处，序列一致性是指将2个碱基序列排列以使它们一致的碱基数最多（根据需要插入间隙），用一致的碱基数除以序列全长的碱基数（当2个序列间总碱基数不同时，序列长的一方的碱基数）所求得的值。这样的同源性计算可以容易地通过BLAST这样的众所周知的软件来进行。
这样的启动子和编码赖氨酸脱羧酶的碱基序列也可以从棒状杆菌以外取得，还可以通过对从棒状杆菌得到的碱基序列进行本领域技术人员众所周知的体外突变处理、或者部位特异性突变处理而取得。
对上述启动子和编码赖氨酸脱羧酶的碱基序列导入到棒状杆菌中的方法没有特别限定，可以通过电穿孔法（Bio/Technology，(1989)，7，1067-1070）导入。
另外，棒状杆菌为好氧性革兰氏阳性杆菌，传统上分类为短杆菌属，但是现在也被包括在统一为棒状杆菌属的细菌中（Int.J.Syst.Bacteriol.,(1981)41,p.225）。另外，包括与棒状杆菌属非常接近的短杆菌属细菌。作为这样的棒状杆菌的例子，可以列举出：嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophylum）、醋谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium  acetoglutamicum）、解烷棒状杆菌（Corynebacterium alkanolyticum）、帚石南棒状杆菌（Corynebacteriumcallunae）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、百合花棒杆菌（Corynebacterium lilium）、栖糖蜜棒杆菌（Corynebacteriummellassecola）、热产氨棒状杆菌（Corynebacteriumthermoaminogenes）、有效棒杆菌（Corynebacterium efficiens）、力士棒杆菌（Corynebacterium herculis）、叉开短杆菌（Brevibacteriumdivaricatum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム·インマリオフイラム（Brevibacterium immariophilum）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、玫瑰色短杆菌（Brevibacterium roseum）、解糖短杆菌（Brevibacteriumsaccharolyticum）、生硫短杆菌（Brevibacterium thiogenitalis）、产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）、白短杆菌（Brevibacteriumalbum）、ブレビバクテリウム·セリヌム（Brevibacterium cerinum）、嗜氨微杆菌（Microbacterium ammoniaphilum）。
另外，作为各棒状杆菌的具体菌株，可以举出：嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，醋谷氨酸棒状杆菌ATCC15806，解烷棒状杆菌ATCC21511，帚石南棒状杆菌ATCC15991，谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13020、ATCC13060，百合花棒杆菌ATCC15990，栖糖蜜棒杆菌ATCC17965，有效棒杆菌AJ12340（保藏编号：FERMBP-1539），力士棒杆菌ATCC13868，叉开短杆菌ATCC14020，黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418（保藏编号：FERMBP-2205），ブレビバクテリウム·インマリオフイラムATCC14068，乳糖发酵短杆菌ATCC13869，ブレビバクテリウム·ロゼウムATCC13825，解糖短杆菌ATCC14066，生硫短杆菌ATCC19240，产氨棒杆菌ATCC6871、ATCC6872，白短杆菌ATCC15111，ブレビバクテリウム·セリヌムATCC15112，嗜氨微杆菌ATCC15354。
上述棒状杆菌可以从（例如）美国典型培养物保藏中心处购买获得。也就是说，每个菌株都附带有对应的登记号，该登记号记载在美国典型培养物保藏中心的目录中，可以参考该登记号购买获得各菌株。
在本发明的1,5-戊二胺制造方法中使用的、在染色体中具有编码赖氨酸脱羧酶的基因的棒状杆菌，优选为提高了1,5-戊二胺的前体即L-赖氨酸的生产性的棒状杆菌。对棒状杆菌提高L-赖氨酸生产性的方法没有限制，可以使用公知的方法。例如有：如日本特开2004-222569号公报中所记载的获取对于S-氨乙基半胱氨酸（AEC）的抗性菌株的方法，或者如Journal of industrial Microbiol Biotechnol(2006,33(7)610-5)或日本特表2009-531042号公报中所记载的通过基因组育种法来提高L-赖氨酸生产性的方法，可以适当采用任一者。
根据本发明的提高了L-赖氨酸生产性的棒状杆菌的优选实施方案，优选具有解除了因L-赖氨酸引起的反馈抑制的天冬氨酸激酶，更优选具有突变型天冬氨酸激酶，该突变型天冬氨酸激酶是序列号3中所记载的氨基酸序列中的第311位的氨基酸残基被苏氨酸以外的氨基酸置换而得到的。
根据本发明的提高了L-赖氨酸生产性的棒状杆菌的其它优选实施方案，优选高丝氨酸脱氢酶活性降低或者缺失，更优选通过基因插入突变来破坏或者切断高丝氨酸脱氢酶基因，从而使高丝氨酸脱氢酶活性缺失。
作为培养方法，可以使用分批培养、流加培养或连续培养。在连续培养时，优选进行（例如）日本特开2008-104453号公报所记载的连续培养。
作为培养用的培养基，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类等的普通的营养培养基。作为碳源，可以使用例如葡糖糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉水解产物等糖类，乙醇等醇类，醋酸、乳酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨水，氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵等各种无机和有机铵盐类，尿素，其它含氮化合物，以及肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、大豆水解产物等含氮有机物。作为无机盐，可以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、碳酸钙等。此外，根据需要，可以添加生物素、硫胺素、维生素B6等微量营养源。这些微量营养源也可以用肉类提取物、酵母提取物、玉米液、酪蛋白氨基酸等培养基添加物来替代。
对培养条件没有特别的限制，在振荡培养、深部通气搅拌培养等好氧条件下进行培养。培养温度一般为25℃至42℃，优选为28℃至38℃。培养时间通常为1天至10天。
培养pH的调节优选使用氨水、盐酸或二羧酸，更优选使用二羧酸。使用这些中和剂将培养pH调节到5至8，优选最好控制在pH6.5至7.5。此外，对中和剂的状态并没有限制，以气体、液体、固体或水溶液形式使用。特别优选水溶液。
对优选用作中和剂的二羧酸没有特别限定，但是优选的是，除了上述2个羧基以外，实质上不存在其它官能团的二羧酸。这里所说的官能团为在聚酰胺聚合反应（作为反应条件，例如，反应温度250至270℃，压力10至20kg/cm2，反应时间1至5小时）时，与氨基或羧基等反应，造成聚合物的分支、或使聚合物的结晶度下降（结晶度80%以下）的反应基团，例如，氨基或羧基就符合该官能团，另外，酸性基团（磺酸基、磷酸基、酚羟基等）、碱性基团（肼基等）、质子极性基（羟基等）、具有断裂性的基团（环氧基、过氧化基等）或者其它反应性高的基团（异氰酸根基）也符合该官能团。另一方面，卤素取代基、芳香性取代基、醚基、酯基、酰胺基等反应性低，不符合这里所说的官能团。
作为二羧酸，更优选的是由下列通式（1）、（2）或（3）所表示的二羧酸。
HOOC-(CH2)m-COOH  （1）
（通式（1）中，m=0至16）。
[化学式1]
Figure BDA00002247455900121
（通式（2）中，n、o=0至16）。
[化学式2]
Figure BDA00002247455900122
（通式（3）中，p、q=0至16）。
另外，作为二羧酸，进一步优选己二酸、癸二酸、1,12-十二烷二羧酸、琥珀酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸。
培养液中的1,5-戊二胺以1,5-戊二胺的游离体或1,5-戊二胺盐的形式存在。作为收集培养液中的1,5-戊二胺的方法，首先从培养液中除去微生物。此时，微生物增殖，发酵充分进行以生成1,5-戊二胺，之后可以将菌体和培养上清液分离（作为分离方法，将菌体沉淀除去、离心分离、膜过滤分离），或者可以从最初就利用保持材料等将菌体分离、保持或者固定化。作为从以这种方式除去了菌体的含有1,5-戊二胺的培养液中收集1,5-戊二胺的方法，还可以如日本特开2009-207495号公报中所记载的那样，以1,5-戊二胺·二羧酸盐的形式结晶析出并进行收集。另外，也可以如日本特开2009-29872号公报中所记载的那样，利用NF膜来精制并收集1,5-戊二胺。另外，还可以如日本特开2009-28045号公报中所记载的那样，通过用极性有机溶剂提取、并蒸馏，从而收集1,5-戊二胺。
实施例
下面利用实施例来对本发明的实施方案进行说明，这些实施例是本发明的示例性例子，并不对本发明进行限制。
1,5-戊二胺和L-赖氨酸浓度的HPLC分析方法
使用柱子：CAPCELL PAK C18（資生堂）
流动相：0.1%(w/w)磷酸水溶液:乙腈=4.5:5.5
检测：UV360nm
样品预处理：在25μl分析样品中添加25μl的1,4-丁二胺（0.03M）作为内标物，添加150μl碳酸氢钠（0.075M）以及2,4-二硝基氟苯（0.2M）的乙醇溶液加以混合，在37℃下保温1小时。将50μl上述反应溶液溶解在1ml乙腈中，然后以10,000rpm的转速离心5分钟，取10μl上清液进行HPLC分析。
实施例1、对比例1
（1）能够发酵生产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的制作
为了制作能够合成1,5-戊二胺的前体即L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，通过向天冬氨酸激酶（AK）中导入有效突变来制作L-赖氨酸发酵菌。参考Apppl.Microbiol.Biotechnol.,(2002),58,p.217-223中所记载的方法，制作了谷氨酸棒杆菌AK-1菌株（以下简称AK-1菌株）。即，此操作具体按以下方式进行。
将来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的、根据常规方法配制的基因组DNA溶液作为扩增模板，将参考在数据库（GenBank）中登记的AK基因（登记号：BA000036）的碱基序列而设计的寡核苷酸（序列编号：4、5）作为引物组进行PCR，所得产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有AK基因的大约1.3kb的DNA片段，然后利用Gene Clean Kit进行精制。将该片段用BamHI和SphI切断，将所得的1.3kb的BamHI-SphI片段连接到预先使用BamHI和SphI切断的pUC19的BamHI/SphI间隙中。将所得质粒称作pTM47。需要说明的是，由序列确认了所得到的AK基因与数据库中登记的基因序列相同。
接下来，为了使克隆的AK基因的第931位至第933位的acc(Thr)突变为atg（Ile），使用了QuickChange Multi Site-Directed MutagenesisKit（トラタジ一ン株式会社制）。关于详细的试验方法，参照该商品的操作手册来实施。将pAK1用作扩增模板，将由序列号6、7中示出的碱基序列构成的寡核苷酸用作引物组，对pAK1全长进行扩增。将所得PCR产物用DpnI处理后，对大肠杆菌JM109菌株进行转化。提取质粒，确认AK基因的序列，此时得到了导入有目标突变的质粒，将所得质粒称作pTM49-1。将该pTM49-1用SphI和BamHI切断后，进行AK基因部分（约1.3kb）的凝胶提取，以对导入突变的AK基因进行精制。
接下来，以枯草芽孢杆菌IFO13719菌株的菌体为模板，以序列号8、9中所示碱基序列为引物组进行PCR，对sacB基因进行扩增。将所得的PCR产物用SacI切断后，将其连接至同样被SacI预先切断的pHSG298（具有卡那霉素抗性基因作为选择标记的pUC型市售质粒，タカラバイオ株式会社制）。将所得的质粒称作pTM38。接下来将用SphI和BamHI切断的pTM38与含有上述AK基因的片段进行连接。将这样所制得的具有sacB基因和突变型AK基因的质粒称作pTM52。
通过电穿孔法［FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)］将上述所制得的pTM52导入ATCC13032菌株，在添加了卡那霉素（25μg/ml）的LB（胰蛋白胨（10g/l）（Bacto公司制）、酵母提取物（5g/l）（Bacto公司制）、氯化钠（10g/l））琼脂培养基上选取转化株。接下来将所选的卡那霉素抗性棒状杆菌在添加了蔗糖的培养基上进行培养，通过双交换法选择蔗糖抗性棒状杆菌。在这样选取的转化株中，从在包含20mM的S-氨乙基半胱氨酸（AEC）的基本培养基中能够生长发育的菌株中，利用常规方法配制基因组DNA溶液。以此基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号4、5）为引物组进行PCR法，确认AK基因的序列，此时能够确认从第931位到第933位的序列被置换为atg。这样所制得的AK-1菌株的天冬氨酸激酶解除了由赖氨酸和苏氨酸引起的反馈抑制。因此这样就能通过培养来合成L-赖氨酸。
接下来，通过对所得到的AK-1菌株进一步进行基因重组，按照下面所记载的方法制作来源于大肠杆菌的、在染色体中含有1个拷贝的LDC基因的棒状杆菌，以及含有2个拷贝的LDC基因的棒状杆菌。
（2）染色体中导入1个拷贝的LDC基因的棒状杆菌的制作（对比例1）
为了将AK-1菌株改良为1,5-戊二胺发酵菌，制作了用于将来源于大肠杆菌的LDC基因导入到高丝氨酸脱氢酶基因座中的质粒pTM45。即，此操作具体按以下方式进行。
以pHSG298为模板，以具有序列号10、11所示碱基序列的寡核苷酸为引物组进行PCR，对卡那霉素抗性基因的启动子进行扩增。接下来，将所得PCR产物用限制性酶BamHI和KpnI切断后，进行凝胶提取，以对卡那霉素抗性基因的启动子（Kmp）进行精制。另一方面，将载体pUC19用BamHI和KpnI切断后，通过凝胶提取对pUC19进行精制。将这些被BamHI和KpnI切断的pUC19和卡那霉素抗性基因的启动子进行连接。将这样制得的质粒称作pKmp。
接下来，以大肠杆菌JM109菌株的菌体为模板，以具有序列号12、13所示碱基序列的寡核苷酸为引物组进行PCR，以对LDC基因进行扩增。将这样扩增的LDC基因用限制性酶NcoI和SacI切断后，通过凝胶提取对LDC基因进行精制。另一方面，将质粒pKmp用NcoI和SacI切断后，通过凝胶提取对pKmp进行精制。将这些被NcoI和SacI切断的pKmp和LDC基因进行连接。将这样制得的质粒称作pTM24。
接下来，以ATCC13032菌株的菌体为模板，以具有序列号14、15所示碱基序列的寡核苷酸为引物组进行PCR，以对hom基因进行扩增。将这样扩增的hom基因用限制性酶SphI和BamHI切断后，进行凝胶提取以对hom基因进行精制。另一方面，将上述pTM38用SphI和BamHI切断后，通过凝胶提取对pTM38进行精制。将这些被SphI和BamHI切断的pTM38和hom基因进行连接。将这样制得的质粒称作pTM44。
接下来，以质粒pTM24为模板，以具有序列号16、17所示碱基序列的寡核苷酸为引物组进行PCR，对Kmp-LDC基因片段进行扩增。将这样扩增的Kmp-LDC基因片段用限制性酶Aor51HI切断后，进行凝胶提取，以对Kmp-LDC基因片段进行精制。将上述那样制得的pTM44用Aor51HI切断后，通过凝胶提取对pTM44进行精制。将这些被Aor51HI切断的pTM44和Kmp-LDC基因片段进行连接。将这样制得的质粒称作pTM45。
接下来，通过电穿孔法［FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)］将质粒pTM45导入AK-1菌株中并选取卡那霉素抗性菌株之后，将卡那霉素抗性菌株在添加了蔗糖的培养基上培养，通过在Biosci.Biotechnol.Biochem(2007),71(9),2130-5中作为TM45菌株的制作方法而记载的双交换法，选取sacB基因脱落的蔗糖抗性棒状杆菌。从这样选取的转化株中按照常规方法配制基因组DNA溶液。以此基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号18、19）为引物组进行PCR法，将所得产物用1.0%琼脂糖凝胶来进行电泳，此时观察到3.5kb的单一的带。由此能够确认，关于所选取的转化株，LDC基因被插入到hom基因座中。将该转化株命名为谷氨酸棒状杆菌TM4552菌株（简称为TM4552菌株）。
（3）保有2拷贝LDC基因的棒状杆菌的制作（实施例1）
接下来制作了用于将LDC基因导入到乳酸脱氢酶基因（LDH基因）座中的质粒。
（i）LDC基因表达盒的制作
作为LDC基因的表达启动子，使用了ATCC13032菌株的divIVA基因（序列号20）的启动子（序列号2，简称为Pdiv）。
首先，将利用常规方法制备的ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板，将具有序列号21、22所示碱基序列的寡核苷酸作为引物组进行PCR，并进行Pdiv的克隆。在PCR扩增反应中，使用了KOD-plus polymerase（东洋纺株式会社制），并使用了附带的反应缓冲液、dNTPmix等。配制成50μl的反应体系，使得引物为20pmol/样品，并且KOD-Plus polymerase为1单位/样品。使用PCR扩增装置iCycler（BIO-RAD公司制）将反应溶液在94℃的温度下进行5分钟热变性后，以94℃（热变性）：30秒、60℃（引物退火）：30秒、68℃（互补链的延长）：30秒为一个循环，进行30个循环，之后冷却为4℃的温度。需要说明的是，关于基因扩增用引物（序列号21、22），以分别在5末端侧附加了BamHI识别序列、在3末端侧附加了NcoI识别序列的方式进行制作。
对PCR扩增片段进行精制，将其末端用T4多核苷酸激酶（タカラバイオ株式会社制）进行磷酸化，然后连接到pUC118载体（经限制性酶HincII切断，并且切断面经过脱磷酸化处理）上。连接采用DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ株式会社制）来进行。将连接溶液转化进大肠杆菌DH5α的感受态细胞（タカラバイオ株式会社制），接种到含有50μg/mL的抗生素氨比西林的LB培养皿中，培养一个晚上。对于生长发育的菌落，以小量提取试剂盒来回收质粒DNA，并用限制性酶BamHI、NcoI切断，选取插入有Pdiv片段的质粒。这一系列的操作都是按照附带的操作说明来进行的。将这样制作的质粒称为pCG5。
接下来，以大肠杆菌JM109菌株的菌体为模板，利用PCR进行LDC基因的克隆。PCR扩增反应按照与上述同样的方法进行，关于基因扩增用引物（序列号23、24），以分别在5末端侧附加了NcoI识别序列、在3末端侧附加了SacI识别序列的方式进行制作。对所得到的含有LDC基因的PCR扩增片段进行精制，再利用与上述同样的方法克隆到pUC118中。将制作的质粒称为pCG11。
接下来用限制性酶NcoI、XbaI将pCG11切断，切割出含有LDC基因的约2.1kb的片段并进行精制后，与预先用限制性酶NcoI、XbaI切断了的pCG5进行连接。将所得到的质粒称作pCG13，该质粒具有在Pdiv下游连接有LDC基因的片段。
（ii）LDH基因座导入用质粒的制作
作为向LDH基因座中进行导入的相同区域，分别对500 bp的LDH基因5末端和3末端区域进行了克隆。分别以ATCC13032菌株的基因组为模板，以序列号25、26（5末端区域）和序列号27、28（3末端区域）为引物组，采用与上述同样的方法进行PCR。需要说明的是，关于5末端区域扩增用引物（序列号25、26），以分别在其5末端侧和3末端侧附加BglII识别序列的方式进行制作，关于3末端区域扩增用引物（序列号27、28），以在其5末端侧附加SalI识别序列、在其3末端侧附加SphI识别序列的方式进行制作。对所得到的含有LDH基因的5末端和3末端区域的大约500bp的PCR扩增片段分别进行精制，并且采用与上述同样的方法分别克隆到pUC118中。将所制作的质粒称为pCG28（5末端区域）和pCG29（3末端区域）。
接下来，用限制性酶BamHI和XbaI切断pCG13，切割出含有Pdiv-LDC基因的约2.4kb的片段并进行精制后，与预先用限制性酶BamHI和XbaI切断的上述pTM38进行连接。将所得到的质粒称作pCG33。
接下来，用限制性酶SalI和SphI切断pCG29，切割出含有LDH基因的3末端区域的片段并进行精制后，与预先用限制性酶SalI、SphI切断的pCG33进行连接。将所得到的质粒称作pCG37。
最后，用限制性酶BglII、BamHI切断pCG28，切割出含有LDH基因的5末端区域的片段并进行精制后，与预先用限制性酶BglII、BamHI切断的pCG37进行连接。将所得到的质粒称作pCG41。
（iii）pCG41向染色体的导入
向之前制作的上述TM4552菌株中导入上述那样制作的pCG41，在添加了卡那霉素（25μg/ml）的LB（胰蛋白胨（10g/l）（Bacto公司制）、酵母提取物（5g/l）（Bacto公司制）、氯化钠（10g/l））琼脂培养基上，选取转化株。继续将选取的卡那霉素抗性棒状杆菌在添加了蔗糖的培养基上培养，并通过与实施例1相同的双交换法选取蔗糖抗性棒状杆菌。从这样选取的转化株中按照常规方法配制基因组DNA溶液。以此基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号25、28）为引物组进行PCR法，将所得产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，此时观察到约3.3kb的单一的带。需要说明的是，在未导入pCG41的菌株中得到大约2kb的片段。由此能够确认，关于所选取的转化株，Pdiv-LDC基因片段被插入到LDH基因座中。将该转化株命名为谷氨酸棒状杆菌CG4541菌株（简称为CG4541菌株）。
（4）1,5-戊二胺发酵试验
使用如上所述制作的TM4552菌株（对比例1）和CG4541菌株（实施例1）来进行1,5-戊二胺发酵试验。
向5mL灭过菌的表1所示培养基中分别接种1白金环的CG4541菌株（实施例3）和TM4552菌株（对比例1），在30℃下振荡24小时以进行初步预培养。将该初步预培养液全部接种到45ml的与初步预培养相同的培养基中，在30℃、120rpm的条件下培养24小时以进行预培养。接下来，将预培养液全部接种到1000ml的、将表1所示培养基的葡萄糖浓度变为150g/L的培养基中，将灭过菌的空气以0.07vvm的流速进行通气，同时在30℃、搅拌桨转速800rpm、pH被调节为6.7的条件下进行培养。中和剂使用硫酸水溶液（3M）和氨水（3M）。
[表1]
  葡萄糖   50g/L
  (NH4)2SO4   20g/L
  NH4Cl   1g/L
  MgSO4·7H2O   0.4g/L
  NaCl   0.525g/L
  KH2PO4   3g/L
  Na2HPO4   6g/L
  CaCl2·2H2O   7.35mg/L
  FeSO4·7H2O   20mg/L
  MgSO4·4H2O   2mg/L
  ZnSO4·7H2O   0.02mg/L
  CuSO4·5H2O   0.54mg/L
(NH4)6Mo7O24·4H2O   0.08mg/L
  Na2MoO4·2H2O   0.176mg/L
  Na2B4O7·7H2O   0.176mg/L
  FeCl3·6H2O   1.74mg/L
  MnCl2·4H2O   0.0144mg/L
  硫胺素·HCl   1mg/L
  生物素   30μg/L
  原儿茶酸   15mg/L
  高丝氨酸   mg/L
CG4541菌株的培养结果如图1所示，TM4552菌株如图2所示。其结果是，关于TM4552菌株（对比例1），1,5-戊二胺的蓄积浓度在途中达到最大值，并且作为前体的L-赖氨酸也发生蓄积，与此相对，关于CG4541菌株（实施例1），1,5-戊二胺的蓄积浓度提高到10g/L以上，而且完全没有发生前体L-赖氨酸的蓄积。
（5）赖氨酸脱羧酶的比活性测定
测定了如上所述培养的CG4541菌株（实施例1）和TM4552菌株（对比例1）随时间变化的LDC比活性。
将如上所述培养的各菌株的培养液按时间点取样10ml，并在4000rpm下离心5分钟后收集菌，然后使其悬浊在2ml缓冲液（50mMTris-HCl，pH8）中。向2ml的螺旋盖式试管（WATSON公司制）中装入0.4g/管的玻璃珠（
Figure BDA00002247455900201
アズワン株式会社制），然后向其中添加1ml的菌体悬浊液。接下来使用珠式匀浆器（TOMY精工株式会社制），在4000rpm下进行1分钟的破碎操作，重复5次后，在12000rpm下离心5分钟，回收上清液，将所回收的上清液作为粗酶液，接下来用于赖氨酸脱羧酶的比活性测定试验。另外，蛋白质浓度的测定使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（PIERCE公司制）。CG4541菌株的粗酶液中的蛋白质浓度如表2所示，TM4552菌株的粗酶液中的蛋白质浓度如表3所示。
[表2]
[表3]
Figure BDA00002247455900203
使用如上所述得到的粗酶液，测定了以L-赖氨酸为底物的赖氨酸脱羧酶活性。反应溶液的组成如表4所示。反应在37℃下进行30分钟，之后为了中止反应，对其煮沸10分钟。使用离心后的上清液，如上所述采用HPLC测定L-赖氨酸和生成的1,5-戊二胺的浓度，根据式1算出每单位质量蛋白质的LDC比活性。LDC比活性随时间的变化如图3所示。
[表4]
  溶液 容量（μL）
  粗酶液   395
  500mM 的L-赖氨酸溶液   100
  5mM 的5-磷酸吡哆醛溶液   5
  总计   500
图3的结果显示，TM4552菌株的LDC比活性随着培养的进行而降低，培养开始后90个小时时已经变得几乎无法确认了。与此相对，CG4541菌株的LDC比活性随着培养的进行有降低的倾向，但是在整个培养过程中比活性保持为180mU/mg蛋白以上。
CG4541菌株的LDC比活性和培养液中的1,5-戊二胺、L-赖氨酸的浓度如表5所示，TM4552菌株的LDC比活性和培养液中的1,5-戊二胺、L-赖氨酸的浓度如表6所示。
[表5]
[表6]
表6的结果显示，TM4552菌株在培养开始后25小时时LDC比活性为83mU/mg蛋白，培养液中没有L-赖氨酸的蓄积；与此相对，培养开始后45小时时LDC比活性降为39mU/mg蛋白，并且培养液中发生L-赖氨酸的蓄积。之后，LDC的比活性降低，L-赖氨酸的蓄积增加。另一方面，表5的结果显示，在CG4541菌株中，培养中LDC比活性维持在180mU/mg蛋白质，并且在整个培养过程中培养液中根本没有发生L-赖氨酸的蓄积。
CG4541菌株将卡那霉素抗性基因和divIVA基因的启动子用作LDC基因的表达启动子，而TM4552菌株只使用卡那霉素抗性基因的启动子，其LDC比活性即使在最高的时候也只是80mU/mg蛋白的程度，因此认为CG4541菌株的LDC比活性持续性是divIVA基因的启动子的效果。
工业实用性
本发明可用作制造可成为聚酰胺原材料的1,5-戊二胺的方法。

Claims (12)

1.一种1,5-戊二胺的制造方法，其为利用了棒状杆菌的1,5-戊二胺的制造方法，该棒状杆菌在染色体中具有编码赖氨酸脱羧酶的基因，所述制造方法的特征在于，所述棒状杆菌在培养中持续保持有50mU/mg蛋白以上的赖氨酸脱羧酶活性。
2.一种1,5-戊二胺的制造方法，其为利用了棒状杆菌的1,5-戊二胺的制造方法，该棒状杆菌在染色体中具有编码赖氨酸脱羧酶的基因，所述制造方法的特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的基因被连接至在对数增殖期中起作用的启动子的下游。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述启动子为divIVA基因启动子。
4.权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述启动子为选自下列（A）至（D）中任一项的启动子：
（A）由序列号2中所记载的碱基序列形成的启动子；
（B）由在序列号2所记载的碱基序列中，发生1个或多个碱基的置换、缺失、插入和/或添加后的碱基序列所形成的启动子；
（C）与由序列号2中所记载的碱基序列形成的启动子或者其互补链的全体或一部分在严格条件下杂交的启动子；
（D）由与序列号2中所记载的碱基序列的序列一致性为至少80%以上的碱基序列所形成的启动子。
5.权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的基因是来源于大肠杆菌的基因。
6.权利要求1至5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的基因为选自下列（A）至（D）中任一项的基因，并且为编码具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质的基因：
（A）由序列号1中所记载的碱基序列形成的基因；
（B）由在序列号1所记载的碱基序列中，发生1个或多个碱基的置换、缺失、插入和/或添加后的碱基序列形成的基因；
（C）与由序列号1中所记载的碱基序列形成的基因或者其互补链的全体或一部分在严格条件下杂交的基因；
（D）由与序列号1中所记载的碱基序列的序列一致性为至少80%以上的碱基序列所形成的基因。
7.权利要求1至6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌为提高了L-赖氨酸的生产性的棒状杆菌。
8.权利要求1至7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌具有突变型天冬氨酸激酶，该突变型天冬氨酸激酶是序列号3所记载的氨基酸序列中的第311位的氨基酸残基被苏氨酸以外的氨基酸置换而得到的。
9.权利要求1至8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌的高丝氨酸脱氢酶活性降低或者缺失。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌通过基因插入突变而缺失高丝氨酸脱氢酶活性。
11.权利要求1至10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌为属于棒状杆菌属（Genus Corynebacterium）的细菌。
12.权利要求11所述的方法，其特征在于，所述属于棒状杆菌属（Genus Corynebacterium）的细菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）。
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