CN113583930B - 一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建 - Google Patents

一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建 Download PDF

Info

Publication number
CN113583930B
CN113583930B CN202110861544.7A CN202110861544A CN113583930B CN 113583930 B CN113583930 B CN 113583930B CN 202110861544 A CN202110861544 A CN 202110861544A CN 113583930 B CN113583930 B CN 113583930B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
corynebacterium glutamicum
promoter
fermentation
glta
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110861544.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113583930A (zh
Inventor
王小元
姚城镇
胡晓清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202110861544.7A priority Critical patent/CN113583930B/zh
Publication of CN113583930A publication Critical patent/CN113583930A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113583930B publication Critical patent/CN113583930B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01002—Glutamate dehydrogenase (1.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01031—Phosphoenolpyruvate carboxylase (4.1.1.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/01—Acid-ammonia (or amine)ligases (amide synthases)(6.3.1)
    • C12Y603/01002—Glutamate-ammonia ligase (6.3.1.2)

Abstract

本发明公开了一株不依赖抗生素并能高效生产γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建，属于基因工程和微生物发酵技术领域。以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，将来源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脱羧酶基因整合入谷氨酸棒杆菌基因组中，构建γ‑氨基丁酸(GABA)的生产菌株，该菌株以葡萄糖为碳源，利用直接发酵法即可得到GABA。本发明所用的基因表达调控均位于基因组中，不依赖质粒表达系统，因此不需要向培养基中额外添加抗生素。同时在本发明中，强化了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和柠檬酸合酶的共表达。最终通过分批补料发酵的方法得到GABA的产量为58.3g/L。

Description

一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆 菌的构建
技术领域
本发明涉及一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建，属于基因工程和微生物发酵技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是一种重要的天然非蛋白质氨基酸，分子式C4H9NO2，分子量103.1，广泛存在于动物、植物及微生物中。
在动物体内，GABA是一种重要的抑制性神经递质，对神经元的兴奋程度有着重要的影响；在植物体内，与植物的抗逆性及抗真菌感染有重要关系；在某些微生物如大肠杆菌细胞内，GABA支链途径是微生物重要的耐酸机制之一。
欧洲食品安全局(EFSA)、美国食品药品监督管理局(FDA)和中国卫生部等均已批准GABA的商品化使用。目前GABA被广泛应用于功能性食品添加剂、保健品、饲料添加剂、药物及临床研究中。
GABA的生产方法主要有化学合成法、酶或全细胞转化法及微生物发酵法。化学合成法生产的GABA一般被禁止使用于食品及饮料添加剂中，酶或全细胞转化法主要利用大肠杆菌或乳酸菌过表达谷氨酸脱羧酶，然后以谷氨酸或谷氨酸钠为底物转化所得，部分情况下需要额外添加磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶以调高产量，此方法GABA产量高，但是生产成本也相应较高。
微生物直接发酵法可以利用食品原料如淀粉、葡萄糖、玉米浆、木糖等作为原料，廉价易得、生产成本低，且产品可被应用于所有的GABA应用领域。目前，微生物直接发酵糖生产GABA的方法仅被报道在基因工程技术改造的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中，乳酸菌利用廉价碳源直接发酵生产方法尚未有报道，大肠杆菌发酵法的最高报道只有6.16g/L。谷氨酸棒杆菌是一种食品源安全菌株，且具有较强的前体谷氨酸合成能力，是一株潜在且理想的GABA生产菌株。目前基因工程改造谷氨酸棒杆菌生产GABA主要的方法是利用表达质粒在菌株内过表达谷氨酸脱羧酶，利用一株工业高产谷氨酸生产菌株进行改造生产GABA的最高产量为70.6g//L。利用野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032进行改造生产GABA的最高报道为38.6g/L，这种方法需要在培养基中添加抗生素以维持质粒不丢失，使生产成本增加的同时，还有可能造成抗生素对环境的污染问题，不符合绿色生产的目标。
因而，如何实现GABA的绿色生产，并保持GABA的产量能满足工业生产的要求是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明通过对谷氨酸棒杆菌中的相关代谢途径进行改造，引入了来源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脱羧酶基因gadB2和来源于E.coli W3110谷氨酸脱氢酶基因gdhA和柠檬酸合酶基因gltA，并敲除了相关的基因，使得谷氨酸棒杆菌ATCC 13032在获得合成GABA的能力的同时，还显著提升了GABA的产量。
本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌表达了来源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脱羧酶基因gadB2、来源于E.coli W3110谷氨酸脱氢酶基因gdhA和/或来源于E.coli W3110的柠檬酸合酶基因gltA，敲除了基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、gabP、ldh、pknG和基因簇gabTD中的一个或多个基因，并且强化表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和/或谷氨酰胺合成酶基因glnA2。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌表达了来源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脱羧酶基因gadB2、来源于E.coli W3110谷氨酸脱氢酶基因gdhA和来源于E.coliW3110的柠檬酸合酶基因gltA，敲除了基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、gabP、ldh和基因簇gabTD，并且强化表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌表达了来源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脱羧酶基因gadB2、来源于E.coli W3110谷氨酸脱氢酶基因gdhA和来源于E.coliW3110的柠檬酸合酶基因gltA，敲除了基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、gabP、ldh、pknG和基因簇gabTD，并且强化表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌表达了来源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脱羧酶基因gadB2、来源于E.coli W3110谷氨酸脱氢酶基因gdhA和来源于E.coliW3110的柠檬酸合酶基因gltA，敲除了基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、gabP、ldh、pknG和基因簇gabTD，并且强化表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和谷氨酰胺合成酶基因glnA2。
在一种实施方式中，将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的启动子替换为Ptac或PtacM启动子。
在一种实施方式中，利用Ptac启动子启动所述glnA2表达。
在一种实施方式中，将E.coli W3110的柠檬酸合酶基因gltA插入ppc下游，与ppc组成操纵子模型，并利用Ptac或PtacM启动子表达gltA。
在一种实施方式中，所述基因gdhA和gadB2的拷贝数为2:3。
在一种实施方式中，将基因gadB2分别插入基因gabP、lldD和aldB2中，以敲除基因gabP、lldD和aldB2，并同时实现基因gadB2的表达。
在一种实施方式中，将基因gdhA分别插入基因eutD和poxB中，以敲除基因eutD和poxB，并同时实现基因gdhA的表达。
在一种实施方式中，所述基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、ldh、pknG、gabTD、ppc、glnA2的核苷酸序列分别如GenBank：NC_003450.2的第504325～505572位、第3119621～3120883位、第2980179～2981699位、第2936506～2937891位、第2776766～2778505位、第3112447～3113391位、第2932365～2934833位、第501577～504286位、第1677384～1680143位、第2362816～2364156位所示。
在一种实施方式中，所述基因gdhA和gltA的核苷酸序列分别如GenBank：AP009048.1的第1844085～1845428位和第753607-754890位所示。
在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株。
本发明提供了一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，所述方法是利用所述重组谷氨酸棒杆菌为发酵菌株，发酵生产γ-氨基丁酸。
在一种实施方式中，培养所述重组谷氨酸棒杆菌并获得OD562nm为40±3的种子液，将种子液按体积比10％加入反应体系中，在30℃，200rpm发酵培养不少于48小时。
在一种实施方式中，在发酵初始时添加300g/L尿素0.4mL，在发酵的10～22h期间，每3h补加300g/L尿素0.24mL。
在一种实施方式中，发酵过程中控制通气量为1L/min，溶氧在20％-30％，并利用氨水将pH控制在7.0～7.4，当葡萄糖浓度下降至20g/L以下时，补加葡萄糖，并维持葡萄糖浓度为15±5g/L，在反应体系中谷氨酸浓度达到最大时，使pH自然下降至6然后用盐酸将pH控制在5.2。
本发明提供了所述重组谷氨酸棒杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
本发明的优点和效果：
本实验发明的菌株所涉及的基因表达全部位于基因组中，因此不需要在发酵培养基中额外添加抗生素，可以利用葡萄糖、玉米浆及氨水/尿素等廉价原料直接发酵法生产GABA，产能稳定、生产成本低且避免了抗生素对环境的污染。本发明构建得到的菌株在摇瓶发酵条件下产量为37.39～41.18g/L，在发酵罐补料分批发酵条件下，GABA的产量为58.3g/L。
附图说明
图1为谷氨酸棒杆菌中GABA合成途径的总构建示意图。
图2为谷氨酸棒杆菌中GABA合成途径的构建及摇瓶发酵结果。
图3为谷氨酸棒杆菌基因组中ppc、gltA操纵子模型设计及摇瓶发酵结果。
图4为基因ldh、pknG和glnA2对GABA合成的影响。
图5为菌株CGY-PG-304在2.4L生物反应器中分批补料发酵结果。
具体实施方式
1.谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组的编辑方法。基因的编辑采用CRISPR/Cas9方法，质粒pCCG1为Cas9的载体，质粒pBS-sgRNA为sgRNA片段的载体，作为克隆特定基因sgRNA的模板。质粒pBS-sgRNA、pCCG1及具体操作过程详见文献：Yao C,Hu X,WangX.2021.Construction and application of a CRISPR/Cas9-assisted genomic editingsystem for Corynebacterium glutamicum.AMB Expr 11。
2.质粒pJYW-5-gadB2-gadB1mut序列公开于文献Shi F,Luan M,LiY.2018.Ribosomal binding site sequences and promoters for expressingglutamate decarboxylase and producing gamma-aminobutyrate in Corynebacteriumglutamicum.AMB Expr 8:61。
3.基因gadB2完整序列、启动子和RBS序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。
4.基因gdhA和gltA来源于E.coli W3110，分别为核苷酸序列GenBank：AP009048.1的第1844085～1845428位和第753607-754890位所示。
5.谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组核苷酸序列见GenBank：NC_003450.2，gabP位于谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组第504325～505572位，lldD位于第3119621～3120883位，aldB2位于第2980179～2981699位，eutD位于第2936506～2937891位，poxB位于第2776766～2778505位，ldh位于第3112447～3113391位，pknG位于第2932365～2934833位，基因簇gabTD位于第501577～504286位，ppc位于第1677384～1680143位，glnA2位于第2362816～2364156位。
6.启动子Ptac、人工设计的RBS序列、启动子PtacM分别如SEQ ID NO.4～6所示。
7.表达质粒pJYW-4和pJYW-5全序列见专利公布号CN 103834679 A。
8.培养基配方
(1)种子活化培养基LBHIS(g/L)：D-山梨糖醇91，脑心浸液18.5，蛋白胨5，酵母提取物2.5，NaCl 5。
(2)种子培养基(g/L)：一水葡萄糖25，尿素5，酵母提取物2，玉米浆20，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.4，PPE 0.01，pH 7.2-7.4。
(3)发酵培养基(g/L)：一水葡萄糖110，酵母提取物0.2，玉米浆1，KH2PO4 2，MgSO4·7H2O 0.8，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.01，PPE 0.1，pH 7.2-7.4。
培养基灭菌115℃，15min。
9.生化参数的测定。发酵液中的氨基酸采用OPA柱前衍生法-HPLC检测。具体过程参考文献：Shi F,Li K,Huan X,Wang X.2013.Expression of NAD(H)kinase andglucose-6-phosphate dehydrogenase improve NADPH supply and L-isoleucinebiosynthesis in Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum.ApplBiochemBiotechnol 171(2)。生物量的测定：将发酵液用去离子水稀释100倍，以去离子水为对照，使用分光光度计测定OD562nm值作为生物量。葡萄糖浓度的测定使用SBA-40E生物传感分析仪测定。
10.本发明所设计的引物见表1。
表1本发明所用到的主要引物
实施例1：重组质粒的构建
(1)将gadB2插入gabP中的重组质粒的构建：
利用引物gabPsg-F/sgRNA-R、gabP-U-F/gabP-U-R和gabP-D-F/gabP-D-R，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，扩增得到3个片段；以PgadB2-F1/PgadB2-R为引物，以质粒pJYW-5-gadB2-gadB1mut为模板克隆得到含有启动子PtacM的gadB2基因，利用引物gabP-F/gabP-D-R将以上四个片段采用融合PCR融合为一个片段，将此片段与BamH I-Afl II酶切得到的pCCG1质粒用II One Step Cloning Kit连接，连接产物用化学转化法导入E.coli DH5α中，将转化液涂布于含有30mg/L卡那霉素的LB平板，在37℃下培养至长出单菌落，挑取单菌落进行PCR验证并进行测序，测序验证正确的质粒即为pCCG1-gabP::gadB2。
(2)将gdhA插入eutD中的重组质粒的构建：
按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物eutDsg-F/sgRNA-R、eutD-U-F/eutD-U-R和eutD-D-F/eutD-D-R，分别扩增得到3个片段，以PgdhA-F1/PgdhA-R1为引物，pJYW-5-gdhA(gdhA插入pJYW-5NotI-PstI酶切位点之间)为模板，克隆得到含有启动子PtacM+RBS序列+gdhA基因的序列。利用引物eutD-F/eutD-D-R将以上四个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-eutD::gdhA。
(3)将gdhA插入poxB中的重组质粒的构建：
按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物poxBsg-F/sgRNA-R、poxB-U-F/poxB-U-R和poxB-D-F/poxB-D-R，分别扩增得到3个片段，以PgdhA-F2/PgdhA-R2为引物，pJYW-5-gdhA为模板，克隆得到含有启动子PtacM+RBS序列+gdhA基因的序列，利用引物poxB-F/poxB-D-R将以上四个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-poxB::gdhA。
(4)将gadB2插入lldD中的重组质粒的构建：
按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物lldDsg-F/sgRNA-R、lldD-U-F/lldD-U-R和lldD-D-F/lldD-D-R，分别扩增得到3个片段，以PgadB2-F2/PgadB2-R为引物，pJYW-5-gadB2-gadB1mut为模板，克隆得到含有启动子PtacM的gadB2基因，利用引物lldD-F/lldD-D-R将以上四个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-lldD::gadB2。
(5)将gadB2插入aldB2中的重组质粒的构建：
按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物aldB2sg-F/sgRNA-R、aldB2-U-F/aldB2-U-R和aldB2-D-F/aldB2-D-R，分别扩增得到3个片段，以PgadB2-F3/PgadB2-R为引物，pJYW-5-gadB2-gadB1mut为模板，克隆得到含有启动子PtacM的gadB2基因，利用引物aldB2-F/aldB2-D-R将以上四个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-aldB2::gadB2。
(6)基因ldh敲除质粒的构建
按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物ldhsg-F/sgRNA-R、ldh-U-F/ldh-U-R和ldh-D-F/ldh-D-R，分别扩增得到3个片段，利用引物ldh-F/ldh-D-R将以上三个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-ldh。
(7)基因pknG敲除质粒的构建
按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物pknGsg-F/sgRNA-R、pknG-U-F/pknG-U-R和pknG-D-F/pknG-D-R，分别扩增得到3个片段，利用引物pknG-F/ldh-D-R将以上三个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-pknG。
(8)将ppc的启动子替换为Ptac的质粒的构建
将ppc的启动子替换为Ptac，启动子后接SEQ ID NO.5所示的RBS序列，按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物ppcsg-F/sgRNA-R、ppc-U-F/ppc-U-R和ppc-D-F/ppc-D-R，分别扩增得到3个片段，以Promoter-F/Promoter-R为引物，以质粒pJYW-4为模板，克隆得到启动子Ptac(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，以引物ppc-F/ppc-D-R将以上四个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-Ptac-ppc。
(9)将ppc的启动子替换为PtacM的质粒的构建：
将ppc的启动子替换为PtacM，启动子后接SEQ ID NO.5所示的RBS序列，按照与(1)相同的方法，以Promoter-F/Promoter-R为引物，以质粒pJYW-5为模板，克隆得到启动子PtacM(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，其他操作方法与(8)完全相同，得到pCCG1-PtacM-ppc。
(10)将Ptac-gltA插入基因组中的重组质粒的构建：
启动子Ptac后接SEQ ID NO.5所示的RBS序列，按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物gltAsg-F/sgRNA-R、gltA-U-F/gltA-U-R和gltA-D-F/gltA-D-R，分别扩增得到3个片段，以PgltA-F/PgltA-R为引物，pJYW-4-gltA(gltA插入pJYW-5的NotI-PstI酶切位点之间)为模板，克隆得到含有启动子Ptac+RBS序列+gltA基因的序列，启动子及RBS序列见SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。利用引物gltA-F/gltA-D-R将以上四个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-Ptac-gltA。
(11)将PtacM-gltA插入基因组中的重组质粒的构建：
启动子PtacM后接SEQ ID NO.5所示的RBS序列，按照与(1)相同的方法，以PgltA-F/PgltA-R为引物，pJYW-5-gltA(gltA插入pJYW-5的NotI-PstI酶切位点之间)为模板，克隆得到含有启动子PtacM+RBS序列+gltA基因的序列。其他操作方法与(10)完全相同，得到pCCG1-PtacM-gltA。
(12)将Ptac-glnA2插入porB中的重组质粒的构建：
按照与(1)相同的方法，以质粒pBS-sgRNA和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，利用引物porBsg-F/sgRNA-R、porB-U-F/porB-U-R和porB-D-F/porB-D-R，分别扩增得到3个片段，以PglnA2-F/glnA2-R为引物，pJYW-4-glnA2(glnA2插入pJYW-4的NotI-PstI酶切位点之间)为模板，克隆得到启动子Ptac+RBS序列+glnA2基因的序列。利用引物porB-F/porB-D-R将以上四个片段采用融合PCR融合为一个片段，再将其与质粒pCCG1进行连接，转化至E.coli DH5α中，培养、经验证正确，得到pCCG1-porB::(Ptac-glnA2)。本发明构建的质粒见表2。
表2构建的质粒名称及用途
质粒 用途
pCCG1-gabP::gadB2 将gadB2插入gabP中
pCCG1-eutD::gdhA 将gdhA插入eutD中
pCCG1-poxB::gdhA 将gdhA插入poxB中
pCCG1-lldD::gadB2 将gadB2插入lldD中
pCCG1-aldB2::gadB2 将gadB2插入aldB2中
pCCG1-ldh 敲除基因ldh
pCCG1-pknG 敲除基因pknG
pCCG1-Ptac-ppc 替换ppc的启动子为Ptac
pCCG1-PtacM-ppc 替换ppc的启动子为PtacM
pCCG1-Ptac-gltA 将Ptac-gltA插入基因ppc下游
pCCG1-PtacM-gltA 将PtacM-gltA插入基因ppc下游
pCCG1-porB::(Ptac-glnA2) 将Ptac-glnA2插入porB中
实施例2：重组菌株的构建
(1)将实施例1构建得到的质粒pCCG1-gabP::gadB2采用电转化的方法转入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，进行基因组编辑，得到重组菌CGY100(ATCC 13032,gabP::gadB2)。详细感受态制作过程及分子操作见本实验室文献：Yao C,Hu X,Wang X.2021.Constructionand application of a CRISPR/Cas9-assisted genomic editing system forCorynebacterium glutamicum.AMB Expr 11。
(2)按照与(1)相同的方法，采用质粒pCCG1-△gabTD(Yao et al.2021)将基因gabTD敲除，得到菌株CGY101。
(3)按照与(1)相同的方法，采用质粒pCCG1-eutD::gdhA，pCCG1-poxB::gdhA，pCCG1-lldD::gadB2，pCCG1-aldB2::gadB2连续编辑CGY101，得到菌株CGY700。
(4)按照与(1)相同的方法，采用质粒pCCG1-Ptac-ppc，pCCG1-PtacM-ppc，pCCG1-Ptac-gltA，pCCG1-PtacM-gltA四种组合编辑CGY700，分别得到菌株CGY-PG-100(pCCG1-Ptac-ppc和pCCG1-Ptac-gltA)，CGY-PG-200(pCCG1-Ptac-ppc和pCCG1-PtacM-gltA)，CGY-PG-300(pCCG1-PtacM-ppc和pCCG1-Ptac-gltA)，CGY-PG-400(pCCG1-PtacM-ppc和pCCG1-PtacM-gltA)。
(5)按照与(1)相同的方法，采用质粒pCCG1-ldh，pCCG1-pknG，pCCG1-porB::(Ptac-glnA2)组合编辑CGY-PG-300，得到菌株CGY-PG-301，CGY-PG-302，CGY-PG-303，CGY-PG-304。本发明构建的菌见表3。
表3本发明构建的菌株
实施例3：重组菌发酵生产GABA
(1)摇瓶发酵生产GABA方法
将实施例2中构建得到的菌株接种于液体LBHIS试管中，30℃，200rpm培养12-14小时，然后取0.2mL培养物接种于含有30mL种子培养基的500mL规格挡板三角瓶中，30℃，200rpm培养8-10小时至光密度值达到OD562nm 40±3，获得种子液。取3mL(10％)种子液接种于含有30mL发酵培养基的500mL规格挡板三角瓶中，30℃，200rpm发酵培养72小时。在发酵的0、10、13、16、19、22小时分别补加300g/L的尿素0.4，0.24，0.24，0.24，0.24，0.24mL。尿素为发酵的主要氮源及pH调节剂，摇瓶发酵总尿素添加量16g/L。
结果如图2和图3所示：
菌株CGY100摇瓶发酵72小时，GABA产量为3.88g/L(图2)，基因簇gabTD敲除后，GABA产量提高至7.14g/L。野生菌株ATCC 13032在72小时内GABA产量均为零，说明在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中成功构建了GABA的合成途径，gabTD敲除(CGY101)可以降低GABA的降解能力，有利于GABA的积累。经过强化前体谷氨酸和GABA的合成途径构建的菌株CGY700摇瓶发酵72小时，GABA产量提高至20.10g/L。
在菌株CGY700中，将基因ppc启动子替换为组成型强启动子Ptac/PtacM，并将使用启动子Ptac/PtacM表达的E.coli W3110gltA插入ppc下游，构成ppc-gltA操纵子模型。构建的菌株为CGY-PG-100，CGY-PG-200，CGY-PG-300，CGY-PG-400，摇瓶发酵72小时，GABA产量分别为22.71g/L，22.11g/L，23.63g/L，21.31g/L(图3)。说明PtacM-ppc-Ptac-gltA表达模型(CGY-PG-300)对GABA合成最有利。
在菌株CGY-PG-300中考察了敲除ldh，pknG，或过表达glnA2对GABA合成的影响，构建了菌株CGY-PG-301，CGY-PG-302，CGY-PG-303，CGY-PG-304。摇瓶发酵72小时，GABA的产量分别为37.39g/L，21.74g/L，39.56g/L，41.18g/L(图4)，说明敲除ldh有利于GABA的合成，敲除pknG后对GABA的产量没有明显影响，但是可以提高其前期合成速度。共敲除ldh和pknG(CGY-PG-303)可进一步提高GABA产量。glnA2表达产物为谷氨酰胺合成酶，在本发明中过表达glnA2可以使GABA的合成有少量增加，同时谷氨酰胺浓度也降低(CGY-PG-304)。
(2)补料分批发酵方法
选取菌株摇瓶发酵GABA产量最高的菌株CGY-PG-304进行补料分批发酵，发酵罐为T&J-Minibox 2.4L,T&J Bio-engineering,Co.,Ltd.,China，种子液获取方法同(1)，发酵罐中装液量为1L，将种子液按照体积比10％加入发酵罐中。培养温度30℃，通气量1L/min(1atm)，溶氧控制20％-30％，与转速关联。培养过程中当葡萄糖浓度降至20g/L以下时(约18-20小时)，补加葡萄糖，将葡萄糖浓度维持在15±5g/L。发酵过程中补加12.5％的氨水维持pH7.2。采用生物传感分析仪跟踪检测糖及谷氨酸浓度，当谷氨酸浓度达到最大时，停止补加氨水，使其pH值自然降至6以下，然后补加6M HCl控制pH5.2。此后谷氨酸将被大量消耗，GABA开始积累。发酵期间每隔6小时取发酵液，测定OD562nm、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、葡萄糖及GABA浓度。
结果如图5所示：
前期通过补加氨水维持pH 7.2，发酵48小时，谷氨酸浓度达到最大值72.3g/L，此后，降低pH值至5.2，GABA开始大量合成，至72小时产量达到最大值58.3g/L，GABA的生产效率为0.30g/g葡萄糖。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建
<130> BAA210976A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1450
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaataaaa acgatcagga aacacagcag atgattaata atgtgggttt agaaaaaacg 60
tttttaggca gtgtcgaagc cgggcaatcc ttacccacca atacattacc agatgatccc 120
atggcaccgg atgttgccgc tcaattggtg gaacactatc gtttaaatga agccaaggct 180
aatcaaaacc tggcgacctt ctgtaccaca caaatggaac cacaagccga tgaattaatg 240
aagaacgcgt tgaataccaa tgcgattgat aaatcggaat accctaagac cgcggcaatg 300
gaaaattact gtgtcagcat gattgctcac ctatggggaa ttcctgacaa tgaaaagatt 360
tacgatgatt tcattgggac ctcaacggta ggttcttctg aaggatgtat gttaggcggc 420
ttggcgctac tacatagttg gaagcaccgg gccaaggcag ctggttttga tattgaagac 480
ctgcatagcc acaagcccaa cttggtcatc atgtcaggtt accaagttgt ttgggaaaag 540
ttctgtacct attggaatgt cgagatgcgc caagtgccaa ttaatggtga ccaagtttcc 600
ttagatatgg atcatgtgat ggattatgtt gatgaaaata cgattgggat tatcggaatt 660
gagggcatta cgtacacagg ctccgttgat gatattcaaa cgctagataa cctcgtgacc 720
gaatataata agaccgcgac gatgccggta cggattcacg ttgatgctgc ctttggtggc 780
ctgttcgcgc cgttcgtcga tggctttaac ccgtgggact tccggttgaa gaacgtggtt 840
tccattaacg tttcgggcca taagtacggg atggtttacc ctgggttggg gtggattgtt 900
tggcggcaca acacggctga tattttaccc gcagaaatgc gattccaagt gccatatcta 960
ggtaagaccg ttgattcaat cgccattaac ttctcacaca gtggtgccca tatcagtgcg 1020
caatactaca atttcattcg atttggattg tcaggttaca agacgatcat gcaaaatgtt 1080
cggaaggtgt cattgaagct gacggcagct ctgaaaacgt atgggatttt cgatatttta 1140
gttgatgggt cacagctacc aattaactgt tggaaactag cggacgatgc gccggttggt 1200
tggacgttgt atgatttgga gtccgagctg gctaagtatg gttggcaagt tccggcatat 1260
ccactgccga agaatcgcga cgatgtgaca attagccgga tcgtggtacg cccatccatg 1320
accatgacga ttgccgatga tttcttggat gatttgaaat tagcaattga tggattaaat 1380
cacacatttg gcgtgacgac caccgttgat caagataaca agaccaccgt tcgaagttaa 1440
ggatccgtcg 1450
<210> 2
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggacgtttga gctgttgaca attaatcatc gtgtggtacc atgtgtggaa ttgtgagcgg 60
ataacaattg cggccgcctt aag 83
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaaaggagag gattg 15
<210> 4
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attttgggga agaattaggc aggcatctag aagctggcga tgtggtgatt ttggacgttt 60
gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 120
tgcggc 126
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaaaggactt gaacg 15
<210> 6
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
attttgggga agaattaggc aggcatctag aagctggcga tgtggtgatt ttggacgttt 60
gagctgttga caattaatca tcgtgtggta ccatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 120
tgcggc 126

Claims (6)

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032，表达了来源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脱羧酶基因gadB2、来源于E. coliW3110 谷氨酸脱氢酶基因gdhA和来源于E. coli W3110的柠檬酸合酶基因gltA，敲除了基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、ldh、pknG和基因簇gabTD，并且强化表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和谷氨酰胺合成酶glnA2；所述基因gdhA、gadB2、gltA、glnA2插入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组中，所述基因gdhA的拷贝数为2，gadB2的拷贝数为3，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的启动子替换为启动子Ptac或启动子PtacM；利用Ptac启动子启动所述基因glnA2表达，所述基因gltA插入ppc下游，利用启动子Ptac或启动子PtacM表达gltA；
所述基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、ldh、pknG、gabTD、ppc、glnA2的核苷酸序列分别如GenBank：NC_003450.2的第504325~505572位、第3119621~3120883位、第2980179~2981699位、第2936506~2937891位、第2776766~2778505位、第3112447~3113391位、第2932365~2934833位、第501577~504286位、第1677384~1680143位和第2362816~2364156位所示；基因gadB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；启动子P tacM的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述基因gdhA和gltA的核苷酸序列分别如GenBank：AP009048.1的第1844085~1845428位和第753607-754890位所示。
2.一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述重组谷氨酸棒杆菌为发酵菌株，发酵生产γ-氨基丁酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养所述重组谷氨酸棒杆菌并获得OD562nm为40 ± 3的种子液，将种子液按体积比5~10%加入反应体系中，在28~37℃，150~200 rpm发酵培养不少于48小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在摇瓶发酵初始时添加300 g/L尿素0.3~0.5 mL，在发酵的10~22小时期间，每3小时补加300 g/L尿素0.2~0.3 mL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，补料分批发酵过程中控制通气量为1 L/min，溶氧在20%-30%，并利用氨水将pH控制在7.2~7.4，当葡萄糖浓度下降至20 g/L以下时，补加葡萄糖，并维持葡萄糖浓度为15 ± 5 g/L，在反应体系中谷氨酸浓度达到最大时，使pH自然下降至6以下，然后用盐酸将pH控制在5.0~5.5。
6.权利要求1所述重组谷氨酸棒杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
CN202110861544.7A 2021-07-29 2021-07-29 一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建 Active CN113583930B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110861544.7A CN113583930B (zh) 2021-07-29 2021-07-29 一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110861544.7A CN113583930B (zh) 2021-07-29 2021-07-29 一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113583930A CN113583930A (zh) 2021-11-02
CN113583930B true CN113583930B (zh) 2023-08-08

Family

ID=78251535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110861544.7A Active CN113583930B (zh) 2021-07-29 2021-07-29 一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113583930B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154345A (zh) * 2011-01-18 2011-08-17 江南大学 谷氨酸脱羧酶基因及其应用
CN103555779A (zh) * 2013-08-01 2014-02-05 江南大学 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154345A (zh) * 2011-01-18 2011-08-17 江南大学 谷氨酸脱羧酶基因及其应用
CN103555779A (zh) * 2013-08-01 2014-02-05 江南大学 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Feng Shi，et al.Ribosomal binding site sequences and promoters for expressing glutamate decarboxylase and producing γ-aminobutyrate in Corynebacterium glutamicum.AMB Express.2018,第8卷(第1期),第1-17页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113583930A (zh) 2021-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2615454C1 (ru) Способ получения L-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать L-лизин
CN101679964B (zh) 具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用其生产腐胺的方法
US11512333B2 (en) Method for producing tetrahydropyrimidine by fermenting recombinant Corynebacterium glutamicum
US8058036B2 (en) Microorganism of Corynebacterium genus having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same
CN104245921B (zh) 可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生l-赖氨酸的方法
CN105492616A (zh) 使用含有可通过丙酸盐诱导的ilvbn操纵子的重组棒杆菌生产L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸或α-酮异己酸的方法
JP2021500914A5 (zh)
CN110249054A (zh) 产生imp的微生物和使用其产生imp的方法
US9758771B2 (en) Microorganism with enhanced L-lysine productivity and method for producing L-lysine by using same
JP6375391B2 (ja) Ｏ−アセチル−ホモセリンを生産する微生物及びこれを用いてｏ−アセチル−ホモセリンを生産する方法
CN113774075B (zh) 一株大肠杆菌基因工程菌及其发酵生产l-茶氨酸的方法
CN109536428A (zh) 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN109456987B (zh) 高产l-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用
CN112375726B (zh) 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用
CN111321100B (zh) 一株产l-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌
CN113583930B (zh) 一株不依赖抗生素并能高效生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建
CN114426983B (zh) 敲除谷氨酸棒杆菌中转录调控因子Ncgl0580生产5-氨基乙酰丙酸的方法
CN116333953A (zh) 一种高产胞嘧啶核苷的基因工程菌及其应用
CN111286520A (zh) 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
US20220340940A1 (en) Novel promoter and method for producing desired substance using same
CN107674855A (zh) 一种产γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用
CN111518820B (zh) 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
US20210292716A1 (en) D-xylose dehydrogenase from coryneform bacteria and process for preparing d-xylonate
CN116987649A (zh) 一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用
CN116334112A (zh) 氨基酸生产菌株的构建方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant