CN101679964B

CN101679964B - 具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用其生产腐胺的方法

Info

Publication number: CN101679964B
Application number: CN2009800003878A
Authority: CN
Inventors: 李相烨; 钱志刚; 夏晓霞; 全勇宰
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2008-04-10
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2029-03-05
Also published as: US8481293B2; RU2009144119A; AU2009234625A1; CA2700510C; CA2700510A1; ZA201007237B; JP2010535028A; EP2281880A4; JP5675353B2; BRPI0903495A2; MY175283A; WO2009125924A3; US20100203599A1; CN101679964A; EP2281880A2; EP2281880B1; BRPI0903495B1; WO2009125924A2; ES2589378T3; RU2433180C2

Abstract

本发明涉及一种具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用该微生物生产腐胺的方法，其中在微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除；以及通过培养该突变微生物高产量生产腐胺的方法。具有高产腐胺能力的突变微生物对于高产量生产在工业应用中广泛使用的腐胺来说是有用的。

Description

具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用其生产腐胺的方法

技术领域

本发明涉及一种具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用该微生物生产腐胺的方法，具体涉及具有腐胺高产能力的突变微生物，其中在腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除，以及培养该突变微生物高产量生产腐胺的方法。

背景技术

腐胺(也被称作1，4-丁二胺)，是一种用于生产多胺-4，6包括尼龙-4，6的重要原料，主要通过将氢氰酸加入到丙烯腈中产生的丙烯腈的氢化而在工业规模上生产。已知的这种化合物的化学合成工艺要求不可再生的石油化学产品作为原材料，和在多个步骤和多个反应器中相当严格的温度和压力反应条件，以及昂贵的催化剂系统的使用。此外，由于这种原料高度有毒并可燃，已知的化学合成工艺在环境污染方面存在缺陷。因此，作为对化学生产工艺的替代，需要由可再生生物质衍生的碳源生产腐胺的工艺。

腐胺是在从细菌到动物和植物的范围的多种生物中发现的一种多胺。例如，已知腐胺不仅在细胞增殖和正常细胞生长中起重要作用，而且在抗氧化应力的防御机制中起重要作用(Tkachenko等人，Arch.Microbiol.，176：155-157，2001)。同时，多胺的细胞内含量通过它们的生物合成、降解、降解、摄入和排泄而受到严密控制(Igarashi和Kashiwagi等人，J.Bacteriol.，170(7)：3131-3135，1988)。如同现有技术中已知的那样，腐胺在大肠杆菌(E.coli)中的浓度极高，大约2.8g/L。而且，微生物具有对高浓度多胺的潜在良好抗性。例如，Mimitsuka等人报导了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)甚至在超过30g/L尸胺的存在下可生长。因此，对于使用微生物生产高浓度多胺(腐胺)的研究持续进行。

EP 0726240A1公开了通过使用具有蛋白质作为主要成分的廉价工业废物或者材料进行发酵生产腐胺的方法。但是，由于公开的材料非常复杂，存在的问题在于必须进行许多纯化步骤以便得到腐胺和尸胺产品。另外，欧洲专利公开号1784496A1公开了通过在含有葡萄糖作为碳源的基本盐培养基上微生物生长生物化学合成腐胺的工艺。在该欧洲专利公开中，为了提高鸟氨酸到腐胺的转化，通过鸟氨酸脱羧酶编码基因speC或者speF的过表达来增加鸟氨酸脱羧酶的活性。但是，当腐胺含量由于鸟氨酸脱羧酶的增加而增加时，存在的问题在于腐胺的生物合成减缓，并且诱导了腐胺的降解(Igarashi和Kashiwagi等人，Biochem.J.，347：297-303，2000)。

关于微生物中腐胺的降解和利用的研究如下。Bowman等人报导了作为speE基因产物的亚精胺合成酶促进了在E.coli中由腐胺合成亚精胺(Bowman等人，J.Biol.Chem.，248：2480-2486，1973)。亚精胺生合成酶(EC：2.5.1.16)在大多数细胞系统中存在以便亚精胺合成。

Haywood等人报导了酵母Candida boidinii通过乙酰转移酶使腐胺乙酰化成N-乙酰腐胺。作为E.coli speG基因产物的亚精胺乙酰转移酶与酵母的N-乙酰转移酶具有高度的同源性，因此必须具有腐胺乙酰转移酶(Haywood和Large，Eur.J.Biochem.，148：277-283，1985)。

此外，Samsonova等人报导了另一种腐胺降解途径，其中E.coli YgjG腐胺转氨酶和YdcW脱氢酶的耦合作用在没有γ-谷氨酰基化的情况下导致腐胺转化成的γ-氨基丁酸(Samsonova等人，BMC Microbiol.，3：2，2003；Samsonova等人，FEBS Lett.，579：4107-4112，2005)。

此外，Kurihara等人报导了腐胺降解途径′Puu途径′参与E.coli.的γ-谷氨酰基化中间体。在该途径中通过腐胺的γ-谷氨酰基化，作为醛基中间体的γ-氨基丁醛可被稳定。作为puuA基因产物的γ-谷氨酰腐胺合成酶在促进该途径的第一反应的同时促进将腐胺转化成γ-谷氨酰-L-腐胺。而且，已经揭示当E.coli在含有腐胺作为唯一氮源的培养基中生长时该分解代谢途径是主要途径。另外，已经揭示，当E.coli在含有腐胺作为唯一氮源的培养基中生长时，腐胺输入者(importer)puuP参与到该分解代谢途径中并且是主要腐胺输入者(Kurihara等人，J.Biol.Chem.，280：4602-4608，2005)。

因此，本发明的发明人制备了突变微生物，其中至少一种选自在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除：编码亚精胺合成酶的基因(speE)，编码亚精胺N-乙酰转移酶的基因(speG)，编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因(argI)和编码腐胺输入者的基因(puuP)。而且，本发明的发明人已经发现，当突变微生物被培养时，它们可高产量产生腐胺，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供其中至少一种在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除并具有很高的产腐胺能力突变微生物，以及制备该突变微生物的方法。

本发明的另一目的在于提供通过培养生产突变微生物的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了突变微生物，其中至少一种选自下组的在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除，该组包括：编码亚精胺合成酶的基因(speE)，编码亚精胺N-乙酰转移酶的基因(speG)，编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因(argI)和编码腐胺输入者的基因(puuP)，本发明还提供了生产该突变微生物的方法。

本发明提供了具有产腐胺能力的突变微生物，其中至少一种选自下组的在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除，该组包括：编码亚精胺合成酶的基因(speE)，编码亚精胺N-乙酰转移酶的基因(speG)，编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因(argI)和编码腐胺输入者的基因(puuP)；并且其中至少一种选自下组的基因的启动子被替换成强启动子，该组包括：编码用于精氨酸合成的操纵子的基因(argECBH)，编码乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)的基因，以及编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体(antiporter)的基因(speF-potE)，本发明还涉及生产该突变微生物的方法。

本发明提供了具有产腐胺能力的突变微生物，其中至少一种选自下组的在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除，该组包括：编码亚精胺合成酶的基因(speE)，编码亚精胺N-乙酰转移酶的基因(speG)，编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因(argI)和编码腐胺输入者的基因(puuP)；并且其中至少一种选自下组的基因的启动子被替换成强启动子，该组包括：编码用于精氨酸生物合成的操纵子的基因(argECBH)，编码乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)的基因以及编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体(antiporter)的基因(speF-potE)；并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的基因(specC)的基因被引入或扩增，本发明还涉及生产该突变微生物的方法。

本发明还提供了生产腐胺的方法，该方法包括培养所述突变微生物以生产腐胺，然后从培养液中收集腐胺。

通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将是容易想到的。

附图说明

图1是显示由葡萄糖合成腐胺的途径的示意图；

图2是显示在使用葡萄糖分批发酵中由XQ37/pKKSpeC细胞生产腐胺的示意图；

图3是显示在使用葡萄糖分批发酵中由XQ39细胞生产腐胺的示意图；

图4是显示在使用葡萄糖分批发酵中由XQ43细胞生产腐胺的示意图；

图5是显示在使用葡萄糖分批发酵中由XQ43/p15SpeC细胞生产腐胺的示意图。

具体实施方式

在本文中，术语“失活”的意思包括突变、置换或者去除部分感兴趣的基因，或者将一个或多个碱基引入到基因中，以便降低由该基因表达的酶的活性，从而阻断参与该基因的酶的部分或者大部分生物合成途径。

在本文中，术语“去除”的意思包括突变、置换或者去除部分或全部感兴趣的基因，或者将一个或多个碱基引入到基因中，使该基因不表达或者即便其被表达时也不显示酶活性，从而阻断参与该基因的酶的生物合成途径。

在本文中，术语“扩增”的意思包括突变、置换或者去除部分感兴趣的基因，或者将一个或多个碱基引入到基因中，或者引入编码同样酶的另一微生物来源的基因，以便增加相应酶的活性。

图1是显示由葡萄糖合成腐胺的途径的示意图。如图1所示，在本发明中，发现当产生腐胺的微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因(speE、speG、argI和puuP)被失活或去除时，突变微生物可高产量产生腐胺。在腐胺降解或利用途径中参与的基因(speE、speG、argI和puuP)的降低的活性可通过与各个野生型基因的那些相比降低的转录和翻译效率得到证实。

在本发明的实施例中，本发明的发明人制备了突变微生物，其中至少一种选自下组的在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除，该组包括：编码亚精胺合成酶的基因(speE)，编码亚精胺N-乙酰转移酶的基因(speG)，编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因(argI)和编码腐胺输入者的基因(puuP)。已经发现制备的突变微生物具有提高的产腐胺能力。

因此，在一个方面，本发明涉及一种能够产生腐胺的突变微生物，其中至少一种选自下组的在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除，该组包括：编码亚精胺合成酶的基因(speE)，编码亚精胺N-乙酰转移酶的基因(speG)，编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因(argI)和编码腐胺输入者的基因(puuP)，本发明还涉及生产该突变微生物的方法。

在本发明的突变微生物中，至少一种选自下组的基因可另外被失活或者去除，该组包括：编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的基因(puuA)，编码腐胺转氨酶的基因(ygjG)和编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链F-单体的基因(argF)。

编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链F-单体的基因(argF)是编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因(argI)的异构酶，并且编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的基因(puuA)是编码腐胺输入者的基因(puuP)的相邻基因。而且，编码腐胺转氨酶的基因(ygjG)是在腐胺降解中参与的基因。

在本发明的突变微生物中，编码lac操纵子抑制子的基因(lacI)也可另外被去除，使编码在腐胺合成中参与的酶的基因的表达得到加强。编码在腐胺生物合成中参与的酶的基因的例子包括gdhA，argA，argB，argC，argD，argE等。

在本发明的突变微生物中，编码鸟氨酸脱羧酶的基因(speC)也可另外被引入或者扩增。编码鸟氨酸脱羧酶的基因(speC)以含有强启动子的表达载体的形式引入。强启动子可选自下组，该组包括：trc启动子，tac启动子，T7启动子，lac启动子和trp启动子。

作为本发明中的微生物，任何微生物都可被使用而没有特别限制，只要其由葡萄糖产生腐胺。微生物的例子包括芽孢杆菌属，棒状杆菌属，埃希氏菌属，毕赤酵母属，假单胞菌属，酵母菌属等。

在本发明中，发现在其中在腐胺降解或者利用途径中参与的基因已经被去除的突变微生物的情况下，当选自下组的基因(argECBH)的启动子被替换成强启动子时得到的突变微生物以更高的产率产生腐胺，该组包括编码精氨酸生物合成的基因，编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的基因(argD)和编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的基因(speF-potE)。

在本发明的实施例中，基于其中在腐胺降解或利用途径中参与的基因(speE，speG，argI和puuP)和编码lac操纵子抑制子的基因(lacI)已经被去除的突变微生物，制备下列微生物：微生物(XQ33)，其中编码精氨酸生物合成的基因(argECBH)的启动子被替换成强启动子(trc)；微生物(XQ37)，其中基因argECBH和编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的基因(speF-potE)的启动子被替换成强启动子trc；突变微生物(XQ39)，其中基因argECBH、基因speF-potE和编码乙酰鸟氨酸转氨酶的基因(argD)的启动子被替换成强启动子trc；以及突变微生物(XQ43)，其中基因argECBH、基因speF-potE、基因argD和编码鸟氨酸脱羧酶的基因(spec)的启动子被替换成强启动子(trc)。发现这些微生物的产腐胺能力突然增加。

因此，在另一方面，本发明涉及具有产腐胺能力的突变微生物，其中至少一种选自下组的在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除，该组包括：编码亚精胺合成酶的基因(speE)，编码亚精胺N-乙酰转移酶的基因(speG)，编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因 (argI)和编码腐胺输入者的基因(puuP)；并且其中至少一种选自下组的基因的启动子被替换成强启动子，该组包括：编码用于精氨酸合成的操纵子的基因(argECBH)，编码乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)的基因，以及编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体(antiporter)的基因(speF-potE)，本发明还涉及生产该突变微生物的方法。

在本发明中，编码用于精氨酸生物合成的操纵子的基因(argECBH)是由两个会聚启动子(convergent promoter，argEp和argCBHp)位于侧面并含有操纵基因的发散操纵子(divergent operon)。两个启动子由精氨酸抑制(Charlier和Glansdorff，2004)。因此，当argECBH操纵子本身的启动子被替换成强启动子时，鸟氨酸的代谢通量可增加。基因argE是编码N-乙酰鸟氨酸酶，基因argC是编码N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，基因argB是编码N-乙酰谷氨酸激酶，并且argH是编码精氨琥珀酸裂解酶。

在低pH下编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的基因(speF-potE)编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体。因此，当speF-potE操纵子本身的启动子被替换成强启动子时，speF-potE操纵子可被组成型表达，因此产腐胺能力得到增强。

编码乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)的基因的启动子由精氨酸抑制(Charlier和Glansdorff，2004)。因此，当argD操纵子的本身启动子被替换成强启动子时，鸟氨酸的代谢通量可得到增加。

如上所述，在本发明的突变微生物中，至少一种选自下组的基因可另外被失活或者去除，该组包括：编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的基因(puuA)，编码腐胺转氨酶的基因(ygjG)和编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链F-单体的基因(argF)。

在具有产腐胺能力的突变微生物中，编码lac操纵子抑制子的基因(lacI)可被另外去除。

在本发明中，编码鸟氨酸脱羧酶的基因(speC)优选可以含有强启动子的表达载体的形式被引入。

在本发明中，在基因启动子和编码鸟氨酸脱羧酶的基因(speC)引入中使用的强启动子优选选自下组，该组包括：trc启动子，tac启动子，T7启动子，lac启动子和trp启动子。

根据本发明的突变微生物的最优选微生物可以是具有产腐胺能力的突变微生物，其中至少一种选自下组的在产腐胺微生物的腐胺降解或利用途径中参与的基因被失活或者去除，该组包括：编码亚精胺合成酶的基因(speE)，编码亚精胺N-乙酰转移酶的基因(speG)，编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的基因(argI)和编码腐胺输入者的基因(puuP)；并且其中至少一种选自下组的基因的启动子被替换成强启动子，该组包括：编码用于精氨酸生物合成的操纵子的基因(argECBH)，编码乙酰鸟氨酸转氨酶的基因(argD)，以及编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体(antiporter)的基因(speF-potE)；并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的基因(specC)的基因被引入或扩增。

在另一方面，本发明涉及生产腐胺的方法，所述方法包括培养所述突变体以产生腐胺，然后从培养液中收集腐胺。

在本发明中，培养突变微生物和从培养液中收集腐胺的过程可使用现有发酵工艺中已知的培养方法(分批培养或者分批加料培养)和本领域已知的常规分离和纯化腐胺的方法来进行。

在本发明中，腐胺的生物合成生产可在体内或体外进行。

实施例

此后，将参照实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解，这些实施例仅仅用于说明的目的，而不解释为对本发明的范围的限制。

特别是，虽然根据本发明仅仅用于去除基因的特定种类的载体以及用作宿主细胞的产腐胺微生物埃希氏菌属在些列实施例中被示出，但使用其他类型的载体和产腐胺微生物对本领域技术人员来说容易想到的。

实施例1：其中去除了在腐胺降解或利用途径中参与的基因的突变微生物的制备

在本发明中，通过双交换同源重组(Datsenko，K.A.，& Wanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.，97：6640-6645，2000)进行染色体上基因的(puuA，puuP， ygjG，speE，speG，argF和argI)去除。lox71-氯霉素标记物(CmR)-lox66盒通过PCR利用与目标基因的上游和下游同源的含有50个核苷酸的primer来制备。包括lox71-CmR-lox66盒的pECmulox(Kim，J.M.，Lee，K.H.&Lee，S.Y.，FEMS Microbiol.Lett.，278：78-85，2008)在PCR反应中被用作模板。将PCR产物转化到含有λ重组酶的电转感受态细胞(electrocompetent cells)中。在含有34μg/ml氯霉素(Cm)的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上选择菌落(Sambrook，J.，Fritsch E.F.，&Maniatis，T.，Molecular cloning：a laboratorymanual，3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2000)。使用Cm^R成功替换基因通过直接克隆PCR来确认。抗生素标记物通过具有温度敏感复制起点并表达IPTG-诱导的cre重组酶的辅助质粒pJW168消除(Palmeros等人，Gene，247(1)：255-264，2000)。

1-1：WL3110菌株的制备

使用质体pECmulox作为模板和primer序列号：1和2进行PCR，由此得到其中lacI基因被去除的PCR产物。然后，将得到的PCR产物电穿孔到含有λ重组酶的电转感受态E.coli(W3110)中，从而制备菌株WL3110(W3110ΔlacI)。

序列1：5′-GTGAAACCAGTAACGTTATACGATRTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTAGATTGGCAGCATTACACGTCTTG-3′

序列2：5′-TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGCACTTAACGGCTGACATGGG-3′

1-2：XQ08菌株的制备

使用质体pECmulox作为模板和primer：3和4进行PCR，由此得到其中speE基因被去除的PCR产物。然后，将得到的PCR产物电穿孔到在实施例1-1中制备的W3110菌株中，从而制备菌株XQ08(W3110ΔlacIΔspeE)。

序列3：5′-CGCCTGAATAATTTCGGTTGAGAGATGGCGTAAGGCGTCGTTATCTGTCGGACACTATAGAACGCGGCCG-3′

序列4：5′-ATGTTGCGCCCTTTTTTTACGGGTGTTAACAAAGGAGGTATCAACCCATGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3′

1-3：XQ17菌株的制备

使用质体pECmulox作为模板和primer序列号：5和6进行PCR，由此得到其中puuA基因被去除的PCR产物。然后，将得到的PCR产物电穿孔到在实施例1-1中制备的W3110菌株中，从而制备菌株XQ17(W3110ΔlacIΔpuuA)。

序列5：5′-GATGAAACAACCCCGCAAGGGGTATTACGCGTTTTTCAACATCCACTC AAG ACACTATAGAACGCGGCCG-3′

序列6：5′-CGAGCGGAAAACAAACCAAAGGCGAAGAATCATGGAAACCAATATCGTTGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3′

1-4：XQ22菌株的制备

使用质体pECmulox作为模板和primer序列号：6和7进行PCR，由此得到其中puuP基因被去除的PCR产物。然后，将得到的PCR产物电穿孔到在实施例1-3中制备的XQ17菌株(W3110ΔlacIΔpuuA)中，从而制备菌株XQ22(W3110ΔlacIΔpuuPΔpuuA)。

序列7：5′-TCACCATCATACAACGGCACTTTGCGATAGCGGCGGATCAGATACCA TAAGACACTATAGAACGCGGCCG-3′

1-5：XQ23菌株的制备

使用质粒pECmulox作为模板和primer序列号：8和9进行PCR，由此得到其中speE基因被去除的PCR产物。然后，将得到的PCR产物电穿孔到在实施例1-1中制备的W3110菌株中，从而制备菌株XQ23-1(W3110ΔlacIΔspeE)。

序列8：5′-CGCCTGAATAATTTCGGTTGAGAGATGGCGTAAGGCGTCGTTATCTGTCGGACACTATAGAACGCGGCCG-3′

序列9：5′-ATGTTGCGCCCTTTTTTTACGGGTGTTAACAAAGGAGGTATCAACCCATGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3′

使用质粒pECmulox作为模板和primer序列号：10和11进行PCR，由此得到其中speG基因被去除的PCR产物。然后，将得到的PCR产物电穿孔到XQ23-1菌株(W3110ΔlacIΔspeE)菌株中，从而制备菌株XQ23-2(W3110ΔlacIΔspeEΔspeG)。

序列10：5′-GAATGTAAGGACACGTTATGCCAAGCGCCCACAGTGTTAAGCTACGCCCGGACACTATAGAACGCGGCCG-3′

序列11：5′-CTATTGTGCGGTCGGCTTCAGGAGAGTCTGACCCGGTGTTTTGTGCTCTGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3′

使用质粒pECmulox作为模板和primer序列号：12和13进行PCR，由此得到其中argI基因被去除的PCR产物。然后，使用得到的PCR产物作为模板和primer序列号：14和15进行PCR，将得到的最终PCR产物电穿孔到XQ23-2菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeG)，从而制备菌株XQ23(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargI)。

序列12：5′-TAATGTGATGCCGGGATGGTTTGTATTTCCCGGCATCTTTATAGCGATAGGACACTATAGAACGCGGCCG-3′

序列13：5′-CCATATAAATTGAATTTTAATTCATTGAGGCGTTAGCCACAGGAGGGATCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3′

序列14：5′-ATAGCAATAGAACACTTTGGGTGGAAGAATAGACCTATCACTGCATAAAATAATGTGATGCCGGGATGGTT-3′

序列15：5′-CCACCTTTGTGACAAAGATTTATGCTTTAGACTTGCAAATGAATAATCATC CATATAAATTGAATTTTAA-3′

1-6：XQ26菌株的制备

将在实施例1-3中制备的其中puuA已经被去除的PCR产物和在实施例1-4中制备的其中puuP基因已经被去除的PCR产物电穿孔到XQ23菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargI)中，从而制备菌株XQ26(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargIΔpuuPΔpuuA)。

1-7：XQ27菌株的制备

使用质粒pECmulox作为模板和primer序列号：16和17进行PCR，由此得到其中ygiG基因被去除的PCR产物。然后，将得到的PCR产物电穿孔到在实施例1-5中制备的XQ23-2(W3110ΔlacIΔspeEΔspeG)中，从而XQ27-1(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔygiG)。然后，将在实施例1-3中制备的其中puuA已经被去除的PCR产物和在实施例1-4中制备的其中puuP基因已经被去除的PCR产物电穿孔到XQ27-1菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔygiG)中，从而制备菌株XQ27(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔygiGΔpuuPΔpuuA)中。

序列16：5′-CTGCAATACTTAAATCGGTATCATGTGATACGCGAGCCTCCGGAGCATATGACACTATAGAACGCGGCCG-3′

序列17：5′-CGTCGTATCGCCATCCGATTTGATATTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3′

1-8：XQ29菌株的制备

将在实施例1-7制备的其中ygiG已经被去除的PCR产物电穿孔到在实施例1-6中制备XQ26菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargIΔpuuPΔpuuA)中，从而制备菌株XQ29(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔygiGΔargIΔpuuPΔpuuA)。

使用质粒pECmulox作为模板和primer序列号：1和2进行PCR，由此得到其中lacI基因被去除的PCR产物。然后，将得到的PCR产物电穿孔到含有λ重组酶的电转感受态E.coli(W3110)中，从而制备菌株WL3110(W3110ΔlacI)。

实施例2：启动子的替换

为了提高生产腐胺的能力，在实施例1中制备的突变菌株(XQ26)的启动子被替换成强启动子(trc)。

2-1：XQ33菌株的制备

argECBH操纵子本身的启动子替换成trc启动子以下列方式进行。融合的1ox71-氯霉素标记物抗生素标记物-lox66的DNA片段通过使用序列号18和19为primer并使用pECmulox作为模板的第一次PCR反应生成。

序列18：5′-TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTGACACTATAGAACGCGGCCG-3′

序列19：5′-TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3′

为了诱导trc启动子，使用序列号：20和21为primer并使用第一次PCR产物作为模板进行第二次PCR反应。为了将同源区引入到PCR终产物中，使用primer序列号：22和23并使用第二次PCR产物作为模板进行第三次PCR反应。

序列20：5′-CGCTGGCACCCACAATCAGCGTATTCAACATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3′

序列21：5′-TCTCGATAAATGGCGGTAATTTGTTTTTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3′

序列22：5′-ATGTTCATATGCGGATGGCGATTTACATAGGTCACTAGCTCTGCGCCAGCGTAGCCGCTGGCACCCACAATCAGC-3′

序列23：5′-TCGAGTGCCTCTTCCGTGGCGCTTATTGAAGGTGTGGCAATCAGAGCGCGGTAAATCTCGATAAATGGCGGTAAT-3′

将PCR终产物电穿孔到在实施例1-1中制备的XQ26菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargIΔpuuPΔpuuA)中，从而构建重组微生物。然后，将突变微生物细胞在含有氯霉素的琼脂平板上培养，通过将其中发生双同源重组的细胞在琼脂平板上进行选择，从而制备XQ33菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargIΔpuuPΔpuuA PargECBH::Ptrc)。然后，使用trc启动子替换的制备菌株通过DNA序列分析确认。

2-2：XQ37菌株的制备

将speF-potE操纵子本身的启动子替换成trc启动子以下列方式进行。使用序列号：19和24为primer并使用质粒pECmulox作为模板进行第一次PCR反应。

序列24：5′-ACTAAGGGCACTTCAGCGTACAGGTCTTCCTGACTCTCTGTAGACACTATAGAACGCGGCCG-3′

使用序列号：25和26为primer并使用第一次PCR产物作为模板进行第二次PCR反应。使用序列号：27和28为primer并使用第二次PCR产物作为模板进行第三次PCR反应。

序列25：5′-AGCTTCGACTTTCACTTCTTCAATGCCCGTTAGTCTACCGACTAAGGGCACTTCAGCGTA-3′

序列26：5′-AATCACTAACCGCAATTTTTAATTTTGACATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3′

序列27：5′-AAGGCGGACAACTCATATTATGAAGTTTGCTCATCGCAATAGCTTCGACTTTCACTTCTT-3′

序列28：5′-CGACTTTCATTAATGTAGATACATTCTCGCTGCGTGGTAAAACAGTCCGGGCAAGAATCACTAACCGCAATTTTTAA-3′

将PCR终产物电穿孔到在实施例2-1中制备的XQ33菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargIΔpuuPΔpuuA PargECBH::Ptrc)中，从而构建重组微生物。然后，将重组微生物细胞在含有氯霉素的琼脂平板上培养，通过将其中发生双同源重组的细胞在琼脂平板上进行选择，从而制备XQ37菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargIΔpuuPΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc)。然后，使用trc启动子替换的制备菌株通过DNA序列分析确认。

2-3：XQ39菌株的制备

将argD操纵子本身的启动子替换成trc启动子以下列方式进行。使用序列号：19和29为primer并使用质粒pECmulox作为模板进行第一次PCR反应。

序列29：5′-CAACTGCTGGCTAATTTCCTGCATCGCTGATTTCTGATTGGACACTA TAGAACGCGGCCG-3

使用序列号：30和31为primer并使用第一次PCR产物作为模板进行第二次PCR反应。使用序列号：32和33为primer并使用第二次PCR产物作为模板进行第三次PCR反应。

序列30：5′-GCAGTTCCATCCAGAAAGTATTCTTAGCGAACAAGGACATCAACTGCTGGCTAATTTCCT-3′

序列31：5′-CGCGTGTAATTGCTGTTTGTTCAATTGCCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3′

序列32：5′-TTATGGGGATTCGCCATCGCCAGTGGGATCTGGAAGGTGTGCAGTTCCATCCAGAAAGTA-3′

序列33：5′-CGGAGCATAAATCGGCAGGATCACTTCATCGAAAGTCGCGCGTGTAATTGCTGTTTGT-3′

将PCR终产物电穿孔到在实施例2-2中制备的XQ37菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargIΔpuuPΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc)中，从而制XQ39菌株(W3110ΔlacIΔspeEΔspeGΔargIΔpuuPΔpuuA PargECBH::PtrcPspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc)。然后，将突变微生物细胞在含有氯霉素的琼脂平板上培养，通过将其中发生双同源重组的细胞在琼脂平板上进行选择。使用trc启动子替换的制备菌株通过DNA序列分析确认。

2-4：XQ43菌株的制备

将speC基因本身的启动子替换成trc启动子以下列方式进行。使用序列号：19和36为primer并使用质粒pECmulox作为模板进行第一次PCR反应。

序列36：5′-TTTGCCCGATGCACGCCATCTCCTTACATTCTCTCGCTTATCGCCGTTTCGACACTATAGAACGCGGCCG-3

使用序列号：37和38为primer并使用第一次PCR产物作为模板进行第二次PCR反应。使用序列号：39和40为primer并使用第二次PCR产物作为模板进行第三次PCR反应。

序列37：5′-TGCCATGATTGCGCGAATTTTCTCCTCTCTGTACGGAGTTTGCCCGATGCACGCCAT-3′

序列38：5′-TACTGGCGGCAATATTCATTGATTTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAT-3′

序列39：5′-GATGGCTTGTTTGTTCGCAAAGTCCTGGCTTGCACGCTTTAGCGAAAGGTGCCATGATTGCGCGAATTT-3′

序列40：5′-ATCTCCCAACGCCACCACGCGACGATGAGAAGAAAGTCGGGATACCAGTTCACTACTGGCGGCAATATTCATTGA-3′

将PCR终产物电穿孔到在实施例2-3中制备的XQ39菌株(W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::PtrcPargD::Ptrc)中，从而制备XQ43菌株(W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuPΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc PspeC::Ptrc)。然后，将重组微生物细胞在含有氯霉素的琼脂平板上培养，通过将其中发生双同源重组的细胞在琼脂平板上进行选择。使用trc启动子替换的制备菌株通过DNA序列分析确认。

实施例3：使用突变微生物制备腐胺

将在实施例1和2中制备的表1中的每个突变菌株(E.coli K12WL3110突变体)在含有4g/L(NH₄)₂HPO₄、13.5g/L KH₂PO₄、1.7g/L柠檬酸、0.7g/LMgSO₄·7H₂O和0.5％(v/v)痕量金属溶液的少量R培养基(Lee，S.Y.&Chang，H.N.，Biotechnol.Lett.，15：971-974，1993)中培养。痕量金属溶液含有(每升)：5M HCl，10g FeSO₄·7H₂O，2.25g ZnSO₄·7H₂O，1gCuSO₄·5H₂O，0.5g MnSO₄·5H₂O，0.23g Na₂B₄O₇·10H₂O，2g CaCl₂·2H₂O和0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄。将含有葡萄糖(100g/l)的溶液单独灭菌并加入到灭菌培养基中至终浓度10g/l。

将在LB培养基中活化的每种细胞培养物100μL接种到基本培养基中，然后30℃下220rpm培养24小时，直到最大OD₆₀₀达到5。然后，将1ml培养液加到含有50mL相同培养基的350-mL三角烧瓶中，然后30℃下220rpm培养15小时。通过离心分离细胞，并通过HPLC对上清液进行分析。使用C18-反相柱(缓冲液A：45％0.1M醋酸钠，pH 7.2；缓冲液B：甲醇，分析在如下条件下进行：1-6min 100％平衡缓冲液A(buffer Aequilibration)，6-10min从0到30％缓冲液B的线性梯度，10-15min从30％到50％缓冲液B的梯度，15-19min从50％到100％缓冲液B的梯度，19-23min100％的缓冲液B梯度，以及23-25min100％到30％缓冲液B的梯度，流速为0.8ml/min的25-28min 30％B到100％A)通过在Hewlett Packard1100Series系统(230nm)中推导的邻苯二醛(ophthaldialdehyde，OPA)测定在上清液中含有的胺。这里，标准被用作校准，并且测定的腐胺浓度在下表1中显示。

表1

菌株	基因型	腐胺浓度 (mg/L)
			WL3110	W3110ΔlacI	0
XQ08	W3110ΔlacI ΔspeE	0.65
			XQ17	W3110ΔlacI ΔpuuA	0
XQ22	W3110ΔlacI ΔpuuP ΔpuuA	0.6
			XQ23	W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI	1.8
XQ26	W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA	8.5
			XQ27	W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA	4.2
XQ29	W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA	8.5
			XQ33	W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc	28.3
XQ37	W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc	510
			XQ39	W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc	820
XQ43	W3110ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuP ΔpuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc PspeC::Ptrc	827

如同从表1中看到的那样，在其中在腐胺降解或利用途径中参与的基因(puuP，puuA，speE，speG，and argI)已经被去除的突变微生物中，突变为生物产生腐胺的能力基于去除基因的种类和数目而增加。而且，可以看出，当编码用于精氨酸合成的操纵子的基因(argECBH)、编码乙酰鸟氨酸转氨酶的基因、编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的基因(speF-potE)和编码鸟氨酸脱羧酶的基因(speC)的启动子被替换成强启动子时，突变微生物的产腐胺能力进一步增强。

实施例4：编码鸟氨酸脱羧酶的基因(speC)的扩增

4-1：质粒pKKSpeC的制备

将编码组成型生物合成E.coli W3110的speC基因的鸟氨酸脱羧酶克隆到使用tac启动子用于基因表达的pKK223-3表达载体(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)中。使用E.coli W3110(来自E.coli K-12，λ-，F-，原养型)的基因组DNA作为模板与序列号：34和35为primer进行PCR，从而制备speC片段(2156bp)。

序列34：5′-CAGCGAATTCATGAAATCAATGAATATTGCC-3′

序列35：5′-CATTCTGCAGTTACTTCAACACATAACCGTA-3′

接着，使用限制酶(EcoRI和PstI)处理speC片段(2156bp)和pKK223-3质粒，然后使用T4DNA连接酶处理，并且将使用限制酶分解的speC片段和pKK223-3质粒彼此融合，从而制备高拷贝数的重组质粒载体pKKSpeC。

4-2：质粒p15SpeC的制备

将编码组成型生物合成E.coli W3110的speC基因的鸟氨酸脱羧酶克隆到使用tac启动子用于基因表达的pTac15K表达载体(p15A来源，低拷贝，KmR；KAISTMBEL母株)中。使用E.coli W3110(来自E.coli K-12，λ-，F-，原养型)的基因组DNA作为模板以序列号：34和35为primer进行PCR，从而制备speC片段(2156bp)。

接着，使用限制酶(EcoRI和PstI)处理以制备的speC片段(2156bp)和pTac15K质粒，然后使用T4DNA连接酶处理，并且将使用限制酶消解的speC片段和pTac15K质粒彼此融合，从而制备低拷贝数的重组质粒载体p15SpeC。

4-3：WL3110/pKKSpeC菌株的制备

将在实施例4-1中制备的pKKSpeC载体引入到在实施例1-1中制备的WL3110菌株中，由此制备WL3110/pKKSpeC菌株。然后，将制备的菌株在含有氨苄青霉素的琼脂固体培养基上培养，同时选择突变微生物。

4-4：XQ17/pKKSpeC菌株的制备

将在实施例4-1中制备的pKKSpeC载体引入到在实施例1-3中制备的 XQ17菌株中，从而制备XQ22/pKKSpeC菌株。然后，将制备的菌株在含有氨苄青霉素的琼脂固体培养基上培养，同时选择重组突变微生物。

4-5：XQ22/pKKSpeC菌株的制备

将在实施例4-1中制备的pKKSpeC载体引入到在实施例1-4中制备的XQ22菌株中，从而制备XQ17/pKKSpeC菌株。然后，将制备的菌株在含有氨苄青霉素的琼脂固体培养基上培养，同时选择重组突变微生物。

4-6：XQ26/pKKSpeC菌株的制备

将在实施例4-1中制备的pKKSpeC载体引入到在实施例1-6中制备的XQ26菌株，从而制备XQ26/pKKSpeC菌株。然后，将制备的菌株在含有氨苄青霉素的琼脂固体培养基上培养，同时选择重组突变微生物。

4-7：XQ33/pKKSpeC菌株的制备

将在实施例4-1中制备的pKKSpeC载体引入到在实施例2-1中制备的XQ33菌株，从而制备XQ33/pKKSpeC菌株。然后，将制备的菌株在含有氨苄青霉素的琼脂固体培养基上培养，同时选择重组突变微生物。

4-8：XQ37/pKKSpeC菌株的制备

将在实施例4-1中制备的pKKSpeC载体引入到在实施例2-2中制备的XQ37菌株，从而制备XQ37/pKKSpeC菌株。然后，将制备的菌株在含有氨苄青霉素的琼脂固体培养基上培养，同时选择重组突变微生物。

4-9：XQ39/pKKSpeC菌株的制备

将在实施例4-1中制备的pKKSpeC载体引入到在实施例2-3中制备的XQ39，从而制备XQ39KKSpeC菌株。然后，将制备的菌株在含有氨苄青霉素的琼脂固体培养基上培养，同时选择重组突变微生物。

4-10：XQ43/pKKSpeC菌株的制备

将在实施例4-2制备的p15eC载体引入到在实施例2-4中制备的XQ43菌株，从而制备XQ43/pKKSpeC菌株。然后，将制备的菌株在含有氨苄青霉素的琼脂固体培养基上培养，同时重组选择突变微生物。

实施例5：使用其中编码鸟氨酸脱羧酶的基因(speC)已经被扩增的突变微生物生产腐胺

将在实施例4中制备的各种突变菌株在含有实施例3中描述的相同培养基的震荡培养瓶中培养。将在LB培养基中活化的每种细胞培养物100μL接种到基本培养基中，然后30℃下220rpm培养24小时，直到最大OD₆₀₀达到5。接着，将1ml培养液加到含有50mL相同培养基的350-mL三角烧瓶中，然后30℃下220rpm培养27小时。通过离心分离细胞，并通过HPLC在实施例3中相同的条件下对上清液进行分析。分析结果在下表2中显示。

表2

菌株/质粒	腐胺浓度(mg/L)
		WL3110/pKKSpeC	220
XQ17/pKKSpeC	368
		XQ22/pKKSpeC	400
XQ26/pKKSpeC	433
		XQ33/pKKSpeC	910
XQ37/pKKSpeC	1100
		XQ39/pKKSpeC	1189
XQ43/p15SpeC	1317

如同从表2中看到的那样，当它们与鸟氨酸脱羧酶speC共表达时，与其中既没有引入pKKSpeC也没有引入p15SpeC的表1的突变微生物(WL3110，XQ17，XQ22，XQ26，XQ33，XQ37，XQ39and XQ43)相比，具有降低腐胺降解和利用活性的突变微生物(WL3110/pKKSpeC，XQ17/pKKSpeC，XQ22/pKKSpeC，XQ26/pKKSpeC，XQ33/pKKSpeC，XQ37/pKKSpeC，XQ39/pKKSpeC和XQ43/p15SpeC)的产腐胺能力显著增加，

实施例6：通过分批加料培养制备XQ37/pKKSpeC菌株

降低的腐胺降解和利用活性的可能性与分批加料发酵中脱羧酶活性一同被分析。在将10g/l葡萄糖加入到2升基本R培养基中之后，在6.6-升发酵罐(Bioflo 3000；New Brunswick Scientific Co.，Edison，NJ)中进行分批加料培养。将在LB培养基中活化的1ml XQ37/pKKSpeC培养物加入到含有50mL相同培养基的350-mL三角烧瓶中，然后30℃下220rpm培养24小时，直到最大OD₆₀₀达到5。将200ml预培养物随后用于接种到发酵罐中。通过自动增加850rpm搅拌速度，在发酵液中溶解的氧以20％饱和空气保持。当发酵液的pH由于葡萄糖耗尽从固定pH 6.8增加大约0.2pH单位时，自动加入含葡萄糖溶液以便将葡萄糖浓度增加到超过3g/l。含葡萄糖溶液包括500g/l葡萄糖和200g/l(NH4)₂SO₄。在除了当pH由于葡萄糖耗尽而增加的很短的时间以外的整个发酵过程中，发酵液的pH通过加入28％(v/v)氨溶液而保持在pH 6.8。对发酵液进行取样并离心分离细胞，然后以在实施例3中相同的方式通过HPLC对上清液进行分析。分析结果在图2中显示。如图2所示，在接种后55.8小时过程中XQ37/pKKSpeC菌株产生14.3g/l腐胺，并且在接种47小时之后最大腐胺产率为0.28g L^-1h^-1。

实施例7：通过XQ39菌株的分批加料培养生产腐胺

以与实施例6中相同的方式进行分批加料发酵，但使用XQ39菌株代替XQ37/pKKSpeC。发酵液通过HPLC进行分析，并且分析结果在图3中显示。如图3所示，在接种后36小时过程中XQ39菌株产生14.7g/l，接种31小时后并且最大腐胺产率为0.42g L^-1h^-1。

实施例8：通过XQ43菌株的分批加料培养生产腐胺

将XQ43菌株在烧瓶中在添加了3g/L(NH4)₂SO₄的50ml基本R/2(含有2g/L(NH₄)₂HPO₄，6.75g/L KH₂PO₄，0.85g/L柠檬酸，0.7g/LMgSO₄·7H₂O，0.5％(v/v)痕量金属溶液)(Qian等人，Biotechnol.和Bioeng，101(3)：587-601，2008)中培养。痕量金属溶液含有(每升)：5M HCl，10gFeSO₄·7H₂O，2.25g ZnSO₄·7H₂O，1g CuSO₄·5H₂O，0.5g MnSO₄·5H₂O，0.23g Na₂B₄O₇·10H₂O，2g CaCl₂·2H₂O和0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄。含有葡萄糖的溶液(100g/l)被单独灭菌并加入到灭菌培养基中至终浓度为10g/l。将1ml在LB培养基中活化的XQ43培养物加入到含有50ml上述培养基的350-mL三角瓶中，然后在37℃下220rpm培养24小时，直到培养物的OD₆₀₀达到3.3。将200ml预培养物随后用于接种到发酵罐中。通过自动增加1000rpm搅拌速度，在发酵液中溶解的氧以20％饱和空气保持。

XQ43菌株的分批加料培养在加入10g/l葡萄糖后在6.6-升发酵罐(Bioflo 3000；New Brunswick Scientific Co.；Edison；NJ)中进行。当发酵液的pH由于葡萄糖耗尽从固定pH 6.8增加大约0.01pH单位时，自动加入含葡萄糖溶液以便将葡萄糖浓度增加到超过2g/l。含葡萄糖溶液包括522g/l葡萄糖、8g/L MgSO₄和170g/l(NH₄)₂SO₄。在除当pH由于葡萄糖耗尽而增加的很短的时间以外的整个发酵过程中，发酵液的pH通过加入10MKOH溶液而保持在pH 6.8。对发酵液进行取样并离心分离细胞，然后以在实施例3中相同的方式通过HPLC对上清液进行分析。分析结果在图4中显示。如图4所示，在接种后30小时过程中XQ43菌株产生18.0g/l腐胺，并且在接种28小时之后最大腐胺产率为0.63g L^-1h^-1。

实施例9：通过XQ43/p15SpeC菌株的分批加料培养生产腐胺

以实施例8中描述的相同方式进行分批加料培养，但使用XQ43/p15SpeC菌株代替XQ43菌株。通过HPLC对发酵液进行分析，分解结果在图5中显示。如图5所示，在接种后37小时过程中XQ43/p15SpeC菌株产生21.7g/l腐胺，并且接种后37小时最大腐胺产率0.58g L^-1h^-1。

工业实用性

如上所述，本发明提供了具有产腐胺能力的突变微生物。这些突变微生物对于在广泛范围的工业应用中使用的腐胺的高产量生产来说是有用的。

虽然已经参照特定典型实施方式对本发明进行了描述，但本发明不由这些实施方式限制，而仅仅由所附的权利要求书来限定。应当理解的是，本领域技术人员能够改变或者修改这些实施方式，都不偏离本发明的精神和范围。

FP09KR934.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>韩国科学技术院

<120>具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用其生产腐胺的方法

<130>FP09KR934

<140>PCT/KR2009/001103

<141>2009-03-05

<150>102008-0033125

<151>2008-04-10

<160>40

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>73

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 1

<400>1

gtgaaaccag taacgttata cgatrtcgca gagtatgccg gtgtctctta gattggcagc 60

attacacgtc ttg 73

<210>2

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 2

<400>2

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg cacttaacgg 60

ctgacatggg 70

<210>3

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 3

<400>3

cgcctgaata atttcggttg agagatggcg taaggcgtcg ttatctgtcg gacactatag 60

aacgcggccg 70

<210>4

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 4

<400>4

atgttgcgcc ctttttttac gggtgttaac aaaggaggta tcaacccatg ccgcataggc 60

cactagtgga 70

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 5

<400>5

gatgaaacaa ccccgcaagg ggtattacgc gtttttcaac atccactcaa gacactatag 60

aacgcggccg 70

<210>6

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>pimer 6

<400>6

cgagcggaaa acaaaccaaa ggcgaagaat catggaaacc aatatcgttg ccgcataggc 60

cactagtgga 70

<210>7

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 7

<400>7

tcaccatcat acaacggcac tttgcgatag cggcggatca gataccataa gacactatag 60

aacgcggccg 70

<210>8

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 8

<400>8

cgcctgaata atttcggttg agagatggcg taaggcgtcg ttatctgtcg gacactatag 60

aacgcggccg 70

<210>9

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 9

<400>9

atgttgcgcc ctttttttac gggtgttaac aaaggaggta tcaacccatg ccgcataggc 60

cactagtgga 70

<210>10

<211>69

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 10

<400>10

aatgtaagga cacgttatgc caagcgccca cagtgttaag ctacgcccgg acactataga 60

acgcggccg 69

<210>11

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 11

<400>11

ctattgtgcg gtcggcttca ggagagtctg acccggtgtt ttgtgctctg ccgcataggc 60

cactagtgga 70

<210>12

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 12

<400>12

taatgtgatg ccgggatggt ttgtatttcc cggcatcttt atagcgatag gacactatag 60

aacgcggccg 70

<210>13

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 13

<400>13

ccatataaat tgaattttaa ttcattgagg cgttagccac aggagggatc ccgcataggc 60

cactagtgga 70

<210>14

<211>71

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 14

<400>14

atagcaatag aacactttgg gtggaagaat agacctatca ctgcataaaa taatgtgatg 60

ccgggatggt t 71

<210>15

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 15

<400>15

ccacctttgt gacaaagatt tatgctttag acttgcaaat gaataatcat ccatataaat 60

tgaattttaa 70

<210>16

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 16

<400>16

ctgcaatact taaatcggta tcatgtgata cgcgagcctc cggagcatat gacactatag 60

aacgcggccg 70

<210>17

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 17

<400>17

cgtcgtatcg ccatccgatt tgatattacg cttcttcgac acttactcgc ccgcataggc 60

cactagtgga 70

<210>18

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 18

<400>18

tatccgctca caattccaca cattatacga gccggatgat taattgtcaa cagctgacac 60

tatagaacgc ggccg 75

<210>19

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 19

<400>19

tatccgctca caattccaca cattatacga gccggatgat taattgtcaa cagctccgca 60

taggccacta gtgga 75

<210>20

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 20

<400>20

cgctggcacc cacaatcagc gtattcaaca tggtctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 60

gctcacaatt ccaca 75

<210>21

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 21

<400>21

tctcgataaa tggcggtaat ttgtttttca tggtctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 60

gctcacaatt ccaca 75

<210>22

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 22

<400>22

atgttcatat gcggatggcg atttacatag gtcactagct ctgcgccagc gtagccgctg 60

gcacccacaa tcagc 75

<210>23

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 23

<400>23

tcgagtgcct cttccgtggc gcttattgaa ggtgtggcaa tcagagcgcg gtaaatctcg 60

ataaatggcg gtaat 75

<210>24

<211>62

<212>DNA

<213>Arttificial

<220>

<223>primer 24

<400>24

actaagggca cttcagcgta caggtcttcc tgactctctg tagacactat agaacgcggc 60

cg 62

<210>25

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 25

<400>25

agcttcgact ttcacttctt caatgcccgt tagtctaccg actaagggca cttcagcgta 60

<210>26

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 26

<400>26

aatcactaac cgcaattttt aattttgaca tggtctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 60

gctcacaatt ccaca 75

<210>27

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 27

<400>27

aaggcggaca actcatatta tgaagtttgc tcatcgcaat agcttcgact ttcacttctt 60

<210>28

<211>77

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 28

<400>28

cgactttcat taatgtagat acattctcgc tgcgtggtaa aacagtccgg gcaagaatca 60

ctaaccgcaa ttttta 77

<210>29

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 29

<400>29

caactgctgg ctaatttcct gcatcgctga tttctgattg gacactatag aacgcggccg 60

<210>30

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 30

<400>30

gcagttccat ccagaaagta ttcttagcga acaaggacat caactgctgg ctaatttcct 60

<210>31

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 31

<400>31

cgcgtgtaat tgctgtttgt tcaattgcca tggtctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 60

gctcacaatt ccaca 75

<210>32

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 32

<400>32

ttatggggat tcgccatcgc cagtgggatc tggaaggtgt gcagttccat ccagaaagta 60

<210>33

<211>58

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 33

<400>33

cggagcataa atcggcagga tcacttcatc gaaagtcgcg cgtgtaattg ctgtttgt 58

<210>34

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 34

<400>34

cagcgaattc atgaaatcaa tgaatattgc c 31

<210>35

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 35

<400>35

cattctgcag ttacttcaac acataaccgt a 31

<210>36

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 36

<400>36

tttgcccgat gcacgccatc tccttacatt ctctcgctta tcgccgtttc gacactatag 60

aacgcggccg 70

<210>37

<211>57

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 37

<400>37

tgccatgatt gcgcgaattt tctcctctct gtacggagtt tgcccgatgc acgccat 57

<210>38

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 38

<400>38

tactggcggc aatattcatt gatttcatgg tctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 60

cacaattcca cacat 75

<210>39

<211>69

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 39

<400>39

gatggcttgt ttgttcgcaa agtcctggct tgcacgcttt agcgaaaggt gccatgattg 60

cgcgaattt 69

<210>40

<211>75

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer 40

<400>40

atctcccaac gccaccacgc gacgatgaga agaaagtcgg gataccagtt cactactggc 60

ggcaatattc attga 75

Claims

1.一种具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ17/pKKSpeC，其出发菌株为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100，并且其中编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因失活或者被去除，并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因被引入或扩增。

2.一种具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ22/pKKSpeC，其出发菌株为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100，并且其中参与腐胺降解或利用途径的编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因失活或者被去除；并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因被引入或扩增。

3.一种具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ26/pKKSpeC，其出发菌株为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100，并且其中参与腐胺降解或利用途径的编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因失活或者被去除；并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因被引入或扩增。

4.一种具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ33/pKKSpeC，其出发菌株为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100，并且其中参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因失活或者被去除；并且其中编码用于精氨酸生物合成的操纵子的argECBH基因的启动子被trc启动子代替；并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因被引入或扩增。

5.一种具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ37/pKKSpeC，其出发菌株为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100，并且其中参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因失活或者被去除；并且其中编码用于精氨酸生物合成的操纵子的argECBH基因以及编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的speF-potE基因的启动子被trc启动子代替；并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因被引入或扩增。

6.一种具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ39/pKKSpeC，其出发菌株为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100，并且其中参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因失活或者被去除；并且其中编码用于精氨酸生物合成的操纵子的argECBH基因、编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的speF-potE基因以及编码乙酰鸟氨酸转氨酶的argD基因的启动子被trc启动子代替；并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因被引入或扩增。

7.一种具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ43/pKKSpeC，其出发菌株为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100，并且其中参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因失活或者被去除；并且其中编码用于精氨酸生物合成的操纵子的argECBH基因、编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的speF-potE基因、编码乙酰鸟氨酸转氨酶的argD基因以及编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因的启动子被trc启动子代替；并且其中编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因被引入或扩增。

8.一种制备具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ17/pKKSpeC的方法，所述方法包括：

a)从大肠杆菌WL3110中通过失活或去除编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因来制备突变的大肠杆菌XQ17，其中所述大肠杆菌WL3110为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100；和

b)将pKKSpeC载体引入到突变的大肠杆菌XQ17中。

9.一种制备具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ22/pKKSpeC的方法，所述方法包括：

a)从大肠杆菌WL3110中通过失活或去除参与腐胺降解或利用途径的编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因；以及通过引入或扩增编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因来制备突变的大肠杆菌XQ22，其中所述大肠杆菌WL3110为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100；和

b)将pKKSpeC载体引入到突变的大肠杆菌XQ22中。

10.一种制备具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ26/pKKSpeC的方法，所述方法包括：

a)从大肠杆菌WL3110中通过失活或去除参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因；以及通过引入或扩增编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因来制备突变的大肠杆菌XQ26，其中所述大肠杆菌WL3110为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100；和

b)将pKKSpeC载体引入到突变的大肠杆菌XQ26中。

11.一种制备具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ33/pKKSpeC的方法，所述方法包括：

a)从大肠杆菌WL3110中通过失活或去除参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因；以及进一步通过将编码用于精氨酸生物合成的操纵子的argECBH基因的启动子用trc启动子代替来制备突变的大肠杆菌XQ33，其中所述大肠杆菌WL3110为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100；和

b)将pKKSpeC载体引入到突变的大肠杆菌XQ33中。

12.一种制备具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ37/pKKSpeC的方法，所述方法包括：

a)从大肠杆菌WL3110中通过失活或去除参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因；以及进一步通过将编码用于精氨酸生物合成的操纵子的argECBH基因以及编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的speF-potE基因的启动子用trc启动子代替来制备突变的大肠杆菌XQ37，其中所述大肠杆菌WL3110为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100；和

b)将pKKSpeC载体引入到突变的大肠杆菌XQ37中。

13.一种制备具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ39/pKKSpeC的方法，所述方法包括：

a)从大肠杆菌WL3110中通过失活或去除参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因；以及进一步通过将编码用于精氨酸生物合成的操纵子的argECBH基因、编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的speF-potE基因以及编码乙酰鸟氨酸转氨酶的argD基因的启动子用trc启动子代替来制备突变的大肠杆菌XQ39，其中所述大肠杆菌WL3110为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100；和

b)将pKKSpeC载体引入到突变的大肠杆菌XQ39中。

14.一种制备具有产腐胺能力的突变大肠杆菌XQ43/pKKSpeC的方法，所述方法包括：

a)从大肠杆菌WL3110中通过失活或去除参与腐胺降解或利用途径的该编码亚精胺合成酶的speE基因、编码亚精胺N-乙酰转移酶的speG基因、编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶链I-单体的argI基因、编码腐胺输入者的puuP基因，以及编码γ-谷氨酰腐胺合成酶的puuA基因；以及进一步通过将编码用于精氨酸生物合成的操纵子的argECBH基因、编码可诱导鸟氨酸脱羧酶和腐胺/鸟氨酸逆向转运体的speF-potE基因、编码乙酰鸟氨酸转氨酶的argD基因以及编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因的启动子用trc启动子代替来制备突变的大肠杆菌XQ43，其中所述大肠杆菌WL3110为lacI基因被去除的大肠杆菌WL3100；和

b)将pKKSpeC载体引入到突变的大肠杆菌XQ43中。