CN108441525A - 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法 - Google Patents

一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108441525A
CN108441525A CN201810313578.0A CN201810313578A CN108441525A CN 108441525 A CN108441525 A CN 108441525A CN 201810313578 A CN201810313578 A CN 201810313578A CN 108441525 A CN108441525 A CN 108441525A
Authority
CN
China
Prior art keywords
corynebacterium glutamicum
glutamicum
icd
lysine
nad
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810313578.0A
Other languages
English (en)
Inventor
徐建中
张伟国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201810313578.0A priority Critical patent/CN108441525A/zh
Publication of CN108441525A publication Critical patent/CN108441525A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01041—Isocitrate dehydrogenase (NAD+) (1.1.1.41)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，替换谷氨酸棒杆菌RG中IDH编码基因icdCg为变异链球菌中IDH编码基因icdSm，从而调节其对不同氧化还原辅因子的亲和力，解决L‑赖氨酸合成过程中胞内氧化还原失衡问题，提高菌株积累L‑赖氨酸能力。重组菌经上罐实验(5L发酵罐)，L‑赖氨酸积累量达121.4g/L。此发明成功改变了谷氨酸棒杆菌中IDH的氧化还原辅因子亲和力，解决了L‑赖氨酸合成过程中胞内氧化还原失衡问题，为选育L‑赖氨酸高产菌株提供崭新的思路。

Description

一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-赖氨酸是人类和动物所必需的、自身不能合成的八大必需氨基酸之一。由于L-赖氨酸具有多种生理功能，如平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因此广泛应用于饲料工业、医药工业及食品工业中。L-赖氨酸生产方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产L-赖氨酸的主要方法。因此，选育具有自主知识产权的、高生产效率的、低副产物积累的L-赖氨酸生产菌株，对拓宽产品应用范围和提高利润空间，实现企业可持续发展具有重要意义。
研究报道，多种微生物可以用于生产L-赖氨酸，其中国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)及其亚种和大肠杆菌(Escherichia coli)的工程菌株。以葡萄糖为原料时，C.glutamicum中有5个途径参与L-赖氨酸合成：糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸(TCA)循环、补给途径(CO2固定反应)和L-赖氨酸终端合成途径(图1所示)。需要指出的是，C.glutamicum中每合成1mol L-赖氨酸需要消耗4molNADPH。因此，为了提高C.glutamicum生物合成途径中L-赖氨酸的积累，提高C.glutamicum代谢途径中NADPH量或降低L-赖氨酸合成途径中NADPH需求量是非常重要的策略。然而，我们前期研究发现，胞内过量的NADPH会阻碍细胞对糖的利用，降低菌体生长量和L-赖氨酸积累量，其原因是胞内过量的NADPH打破了胞内氧化还原平衡，从而限制了菌体生长和合成途径中关键酶活力。因此，维持胞内氧化还原平衡，对提高L-赖氨酸积累具有重要意义。
异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)在生物体内有两种形式，即以NAD+为电子受体的NAD+-依赖型IDH(NAD-IDH)和以NADP+为电子受体的NADP+-依赖型IDH(NADP-IDH)。NAD-IDH主要存在于真核生物线粒体中，也存在少数的细菌和古细菌等原核生物中，如嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)等。NAD-IDH在TCA循环中主要催化异柠檬酸氧化脱羧，生成CO2和α-酮戊二酸，同时还生成还原态辅酶NADH，所生成的NADH再通过氧化呼吸链产生大量的ATP，直接用于机体的供能。NADP-IDH广泛存在于真核生物各个细胞器(如叶绿体、线粒体、过氧化物酶体以及胞质)和原核细胞中。NADP-IDH在TCA循环中虽然也是催化异柠檬酸氧化脱羧生成CO2和α-酮戊二酸，但同时生成的是还原态辅酶NADPH，用于维持细胞内的还原状态以增强细胞抗氧化应激的能量，并且提供还原力以进行维生素、氨基酸等物质的生物合成。不同细菌的IDH对NAD+和NADP+的亲和力也不同，如E.coli中IDH对NADP+的亲和性是对NAD+亲和性的7000倍，而S.mutans中IDH在以NADP+为辅因子时不表现出酶活力。和其他已发现的生物体中的IDH一样，C.glutamicum中IDH由基因icd编码，催化异柠檬酸氧化脱羧生成CO2和α-酮戊二酸，同时生成还原态辅酶NADPH。
现有的谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸产量不高主要是由于NADPH含量不足，从而限制了L-赖氨酸的进一步增加，本实验室尝试将菌株中NAD+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,NAD-GADPH)替换成来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)中的NADP-GADPH，所获得的重组菌株虽然在一定程度上增加L-赖氨酸产量，但是由于胞内NADH不足以及积累了过多的NADPH，从而限制菌体生长、糖的利用率以及L-赖氨酸生产效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种合成L-赖氨酸能力提高的谷氨酸棒杆菌。为了解决上述技术问题，本发明将重组菌株C.glutamicum RG中NADP-IDH替换成来源于S.mutans中NAD-IDH，获得重组菌株。该重组菌株提高了IDH对NAD+的亲和力而降低了对NADP+的亲和力，在一定程度上增加了胞内NADH的合成，同时解除了C.glutamicum RG发酵生产L-赖氨酸过程中NADPH供应过剩的缺点，提高了菌株合成L-赖氨酸的能力。
本发明的第一个目的是提供一种提高谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸产量的方法，所述方法是将谷氨酸棒杆菌中NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶替换为变异链球菌来源的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶。
本发明的第二个目的是提供一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌将谷氨酸棒杆菌RG(C.glutamicum RG)中NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)替换为变异链球菌(S.mutans)来源的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)。
在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌RG的构建方法是将谷氨酸棒杆菌中NAD+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAD-GADPH)替换成来源于丙酮丁醇梭菌中的NADP-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NADP-GADPH)。
在本发明的一种实施方式中，所述NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以pK18-MBPMT作为载体。
本发明的第三个目的是提供所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，所述方法具体是：
(1)S.mutans中NAD-IDH编码基因icdSm的获得
根据S.mutans UA159icd的核苷酸序列，在其基因上下游加入限制性内切酶XmaIII酶切位点序列，通过基因合成获得含有目的基因的重组质粒pUC57/icdSm；
(2)整合型载体pK18-MBPMT/ΔicdCg的构建
根据C.glutamicumATCC13032icd基因序列设计icdCg基因上下游以及中间引物，以C.glutamicum RG基因组为模板，进行PCR，获得在3’端和5’端有相同限制性内切酶XmaIII的PCR产物，将以上述PCR产物与整合型载体pK18-MBPMT相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg；
(3)重组菌C.glutamicum RGI的构建
通过XmaIII酶酶切回收icdSm片段，将icdSm片段与同样经过XmaIII酶酶切后的pK18-MBPMT/ΔicdCg整合型载体相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg::icdSm，电击转化C.glutamicum RG，筛选获得重组菌C.glutamicum RGI。
本发明的第四个目的是提供所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的方法，所述方法是将重组菌C.glutamicum RGI接种到种子培养基中，28-32℃，800-1200r·min-1培养8～15h；以5～15％接种量，接种于发酵培养基中，28-32℃，800-1200r·min-1培养30～50h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基是：葡萄糖3-8g·L-1，蛋白胨8-12g·L-1，酵母膏3-8g·L-1，NaCl 8-12g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基是：葡萄糖30-50g·L-1，(NH4)2SO410-30g·L-1，尿素3-8g·L-1，KH2PO40.5-1.5g·L-1，K2HPO4·3H2O0.5-1.5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2-0.3g·L-1，3-(N-吗啡啉)-丙磺酸40-45g·L-1，L-蛋氨酸0.2-0.3g·L-1，CaCl20.005-0.015g·L-1，FeSO4·7H2O 0.005-0.015g·L-1，MnSO4·H2O 0.005-0.015g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.005-0.015g·L-1，CuSO4·5H2O0.0001-0.0003g·L-1，NiCl2·6H2O0.00001-0.00003g·L-1，生物素0.0001-0.0003g·L-1，原儿茶酸0.00002-0.00004g·L-1，发酵过程中通过添加8-12g·L-1CaCO3调节pH。
本发明的第五个目的是提供所述重组谷氨酸棒杆菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。
本发明的有益效果是：本发明通过将C.glutamicum RG中TCA循环关键酶NADP-IDH编码基因icdCg替换成S.mutans中NAD-IDH编码基因icdSm，改变IDH蛋白结构中辅因子结合域的结构，获得了更青睐利用NAD+作为辅因子的重组菌株C.glutamicum RGI，从而实现胞内辅因子平衡，获得高产L-赖氨酸的重组菌株。
附图说明
图1是以葡萄糖为原料时，C.glutamicum中参与L-赖氨酸合成的代谢途径；
图2是出发菌株C.glutamicum RG葡萄糖代谢、菌体生长、产物积累以及胞内辅因子变化情况；其中，a-葡萄糖、菌体生长和L-赖氨酸变化曲线；b-副产物(有机酸和氨基酸)变化曲线；c-胞内辅因子(NADH和NADPH)变化情况；缩写说明：Glc葡萄糖；Lys L-赖氨酸；DCW菌体干重；Val L-缬氨酸；Leu L-亮氨酸；Ile L-异亮氨酸；Thr L-苏氨酸；Glu L-谷氨酸；Lac乳酸；Eth乙醇；
图3是重组菌株C.glutamicum RGI葡萄糖代谢、菌体生长、产物积累以及胞内辅因子变化情况；编号说明：a-葡萄糖、菌体生长和L-赖氨酸变化曲线；b-副产物(有机酸和氨基酸)变化曲线；c-胞内辅因子(NADH和NADPH)变化情况。缩写说明：Glc葡萄糖；Lys L-赖氨酸；DCW菌体干重；Val L-缬氨酸；Leu L-亮氨酸；Ile L-异亮氨酸；Thr L-苏氨酸；Glu L-谷氨酸；Lac乳酸；Eth乙醇。
具体实施方式
本实验室通过传统诱变方法，筛选得到的一株产L-赖氨酸突变菌株谷氨酸棒杆菌JL-6(C.glutamicum JL-6)，该菌经摇瓶发酵产L-赖氨酸14.5g/L。将该菌株中NAD+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,NAD-GADPH)替换成来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)中的NADP-GADPH，获得重组菌株C.glutamicum RG。以其作为出发菌株为例，实施本发明的技术方案，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：重组菌株C.glutamicum RGI的构建
根据文献报道，少数的细菌和古细菌等原核生物中存在NAD-IDH，如嗜热氢细菌(Hydrogenobacter thermophilus)、嗜酸氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)、猪链球菌(Streptococcussuis)、运动发酵单胞菌(Z.mobilis)和变异链球菌(S.mutans)。为此我们前期通过比较上述5株菌中NAD-IDH对辅因子NAD+和NADP+亲和力，发现来源于S.mutans中的NAD-IDH对辅因子NAD+亲和力要明显小于其他四株菌中的NAD-IDH。因此，我们选择来源于S.mutans中的NAD-IDH作为后期实验考查因素。
利用基因合成的方法获得来源于S.mutans中NAD-IDH编码基因icdSm，随后利用携带抗生素抗性与条件致死型标记sacB双标记的新型整合型载体pK18-MBPMT，通过两次同源重组替换C.glutamicum RG中自身基因icdCg，获得重组菌株C.glutamicum RGI：
(1)S.mutans中NAD-IDH编码基因icdSm的获得
根据GenBank中Streptococcus mutans UA159icd基因序列，在其基因上下游加入限制性内切酶XmaIII酶切位点序列，并将组合好的序列提交给通用生物系统(安徽)有限公司进行合成，获得含有目的基因的重组质粒pUC57/icdSm。
(2)整合型载体pK18-MBPMT/ΔicdCg的构建
根据GenBank中C.glutamicumATCC13032icd基因序列的上游序列(SEQ ID NO.2)和下游序列(SEQ ID NO.3)设计icdCg基因上下游以及中间引物，引物序列如表1。以C.glutamicum RG基因组为模板，分别以icdCg-L-F/icdCg-L-R和icdCg-R-F/icdCg-R-R为引物PCR，获得在3’端和5’端有相同限制性内切酶XmaIII的PCR产物。将以上述PCR产物整合型载体pK18-MBPMT相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg。
表1.PCR扩增所需引物序列(下划线为酶切位点)
(3)重组菌C.glutamicum RGI的构建
采用限制性内切酶XmaIII酶切重组质粒pUC57/icdSm。随后采用胶回收试剂盒回收icdSm片段。将icdSm片段与经相同限制性内切酶酶切后的线性化pK18-MBPMT/ΔicdCg整合型载体相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg::icdSm。将验证正确的质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg::icdSm电击转化C.glutamicum RG，经LBHIS+Km固体培养基筛选，获得第一次同源重组转化子。再分别将目标转化子在含蔗糖的培养基中进行胁迫二次重组筛选，最终在LBG平板上进行划线分离并挑取多个转化子。对发生第二次同源重组的菌株进行回复野生型/基因突变型的鉴定。提取转化子染色体，以目标基因icdSm的上下游引物进行PCR并对PCR产物进行测序鉴定。鉴定正确的转化子命名为C.glutamicum RGI。
实施例2：出发菌C.glutamicum RG和重组菌株C.glutamicum RGI的IDH酶活力测定
取冻管保藏的菌种接种含有0.25g·L-1的L-蛋氨酸和40g·L-1葡萄糖的CgXII培养基(即CgXIIMG培养基)中，30℃振荡培养过夜，并于10000r·min-1离心收集菌体。随后，将菌体悬浮于Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中并于超声波破碎法制备粗酶液。粗酶液采用比色法进行酶活测定(A340nm)。酶反应体系：20mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、1mmol·L-1DL-异柠檬酸三钠、2mmol·L-1MgCl2、0.5mmol·L-1NADP+或0.5mmol·L-1NAD+；反应温度：30℃；反应时间：≥300s。一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟生成1μmol NADPH或NADH所需的酶量。经测定，重组菌C.glutamicum RGI只有在以NAD+为辅因子时表现出IDH酶活力，而出发菌在以NADP+为辅因子时表现出很强的IDH酶活力，结果如表2所示。
表2.不同菌株的IDH酶活力测定
实施例3：出发菌C.glutamicum RG和重组菌株C.glutamicum RGI胞内辅因子的测定
取单菌落接种于CgXIIMG液体培养基中，30℃、100r·min-1摇床培养约10h，4℃，6000r·min-1离心收集菌体，并洗涤菌体三次，去除残留的细胞外代谢物。随后，以酸性抽提液(0.5mol·L-1HCl)提取氧化型吡啶核苷酸(NAD+和NADP+)，以碱性抽提液(0.5mol·L- 1NaOH)提取还原型吡啶核苷酸(NADH和NADPH)。随后，借助从BioVision公司购置的定量分析试剂盒，利用酶循环法测定NAD(P)+和NAD(P)H的浓度并计算NADH/NAD+和NADPH/NADP+，其中以NAD/NADH Quantification Colorimeteric Kit特异性检测NAD+和NADH，以NADP/NADPH Quantification Colorimeteric Kit特异性检测NADP+和NADPH，具体步骤参照试剂盒说明书的方法进行，结果如图2c、图3c所示。
实施例4：出发菌C.glutamicum RG和重组菌株C.glutamicum RGI发酵产L-赖氨酸
培养基：①种子培养基(g·L-1)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0，121℃灭菌20min；②发酵培养基(即CgXIIMG；g·L-1)：葡萄糖40，(NH4)2SO420，尿素5，KH2PO41，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.25，3-(N-吗啡啉)-丙磺酸42，L-蛋氨酸0.25，CaCl20.010，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，CuSO4·5H2O 0.0002，NiCl2·6H2O 0.00002，生物素0.0002，原儿茶酸0.00003，115℃灭菌10min。发酵过程中通过添加10g·L-1CaCO3调节pH。
将上述经验证的重组菌株C.glutamicum RGI和出发菌C.glutamicum RG分别进行摇瓶发酵实验，从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环菌体(对照菌及重组菌)于种子培养基中(25mL/250mL)，30℃，1000rmin-1往复式摇床培养12h；以10％接种量，接种于发酵培养基中，30℃，1000rmin-1往复式摇床培养40h，分时间区段测定L-赖氨酸、葡萄糖及生物量，结果与出发菌C.glutamicum RG相比，结果如图2a、图3a所示。
此外，分别采用高效液相色谱仪和氨基酸分析仪测定出发菌C.glutamicum RG和重组菌株C.glutamicum RGI中副产物积累情况(包括有机酸和氨基酸)，结果如图2b、图3b所示。
重组菌C.glutamicum RGI经上罐实验(5L发酵罐)，L-赖氨酸积累量达121.4g/L。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> Streptococcus mutans
<400> 1
atggcagaaa aagtaagttt tgaagaaggg aaattacagg tgcctgataa gcccgttatt 60
ccttacattg aaggagatgg tgttggtcag gatatttgga agaatgcgca aatcgttttt 120
gataaagcca ttgctaaagt ttatggaggt cacaagcagg ttatttggcg ggaggtctta 180
gctggtaaaa aagcttataa tgaaacaggc aactggctgc ctaatgagac tttagaaatt 240
atcaagacgc atttacttgc tattaaaggt ccattggaaa ctcctgttgg aggtggcatt 300
cgttccttaa atgttgccct gcgtcaagaa ttggatctct ttgcttgcgt gcgtccagtg 360
cgttatttca aaggtgtccc tagtccactt aagcatcctg aaaaaacggc tattaccatt 420
tttcgagaaa atactgaaga tatttacgca ggtatcgaat ggaatgcggg tacagcagaa 480
gttcaaaagg tcatcaactt tttacaagat gatatgcagg ttaagaaaat tcgttttcca 540
aaaagcagca gtatagggat taaacctatt tcaattgaag gcagccaacg tttgattcgt 600
gcagctatcg aatatgctct ggccaacaat ctgaccaagg taactttggt tcataaagga 660
aatattcaaa aattcactga aggtggcttt agaaaatggg gctatgaatt agcaaaacgt 720
gagtatgctg ccgaacttgc cagtggtcaa ttggtagttg atgatattat tgctgacaat 780
ttcttgcaac aaattctgct caagcctgag cgttttgatg tagttgcctt aacgaatctc 840
aatggagact atgccagcga tgccttagca gcacaagttg gcggtattgg tatttcgcca 900
ggagctaata ttaactatca aacgggacat gctatttttg aagcaaccca tggaacggct 960
ccagatattg caggtcaaga cttggccaac ccatcttctg ttttattatc aggctgcatg 1020
ctttttgact atattggttg gtcaaaagtc tcagatttaa tcatgaaagc tgttgaaaaa 1080
gctattgcaa atggtcaagt taccattgat tttgccaagg aactaggggt tgaagcattg 1140
acaacccgtc agttttctga agttctattg acttatttat ag 1182
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
cggccgcaag cacggtgaat tgttgatgga aaccctggcc ctccaccatg aagaaacaga 60
agctgcagcc acctccgaag gcgaacttgt gtgggagact cctgtgttct ccgccactgg 120
cgaacagatc acagaatcca acccacgttc aggcgactac tactggattg ctggcgaaag 180
tggtgtcgtg accagcattc gtcgatctct agtgaaagag aaaggcctcg accgttccca 240
agtggcattc atggggtatt ggaaacacgg cgtttccatg cggggctgaa actgccacca 300
taggcgccag caattagtag aacactgtat tctaggtagc tgaacaaaag agcccatcaa 360
ccaaggagac tcatggctaa gatcatctgg acccgcaccg acgaagcacc gctgctcgcg 420
acctactcgc tgaagccggt cgtcgaggca tttgctgcta ccgcgggcat tgaggtcgag 480
acccgggaca tttcactcgc tggacgcatc ctcgcccagt tcccagagcg cctcaccgaa 540
gatcagaagg taggcaacgc actcgcagaa ctcggcgagc ttgctaagac tcctgaagca 600
aacatcatta agcttccaaa catctccgct tctgttccac agctcaaggc tgctattaag 660
gaactgcagg accagggcta cgacatccca gaactgcctg ataacgccac caccgacgag 720
<210> 3
<211> 900
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
gagttcctcg cactggctga gtccttccgc cacgagctca acaacaacgg caacaccaag 60
gccggcgttc tggctgacgc tctggacaag gcaactgaga agctgctgaa cgaagagaag 120
tccccatccc gcaaggttgg cgagatcgac aaccgtggct cccacttctg gctgaccaag 180
ttctgggctg acgagctcgc tgctcagacc gaggacgcag atctggctgc taccttcgca 240
ccagtcgcag aagcactgaa cacaggcgct gcagacatcg atgctgcact gctcgcagtt 300
cagggtggag caactgacct tggtggctac tactccccta acgaggagaa gctcaccaac 360
atcatgcgcc cagtcgcaca gttcaacgag atcgttgacg cactgaagaa gtaaagtctc 420
ttcacaaaaa gcgctgtgct tcctcacatg gaagcacagc gctttttcat atttttattg 480
ccataatggg cacatgcgtt tttctcgagt tcttcccgca cttcttatca ccaccgccgt 540
gagcatccca acagcatctg ctgccacact caccgccgac accgacaagg aattgtgcat 600
cgccagcaac accgacgatt ccgcggtggt taccttctgg aactccattg aagactccgt 660
gcgcgaacaa cgcctcgacg aactagacgc ccaagatcca ggaatcaaag cggcgattga 720
aagctacatc gcccaagatg acaacgcccc aactgctgct gaactgcaag tacgcctcga 780
tgccatcgaa tccggcgaag gcctagccat gctcctccca gacgatccca cgctggcaga 840
ccccaacgcc gaggaaagtt tcaaaacgga gtacacatac gacgaagcca aagacatcat 900
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
cggaattccg gccgcaagca cggtg 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
cgggatccct cgtcggtggt ggcg 24
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
cgggatccga gttcctcgca ctggctg 27
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
cccaagctta tgatgtcttt ggcttcgc 28
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
atggcagaaa aagtaag 17
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
ctataaataa gtcaatag 18

Claims (10)

1.一种提高谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法是将谷氨酸棒杆菌中NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶替换为变异链球菌来源的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶。
2.一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是利用权利要求1所述的方法获得，所述重组谷氨酸棒杆菌将谷氨酸棒杆菌RG中NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶替换为变异链球菌来源的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶。
3.根据权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌RG的构建方法是将谷氨酸棒杆菌中NAD+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶替换成来源于丙酮丁醇梭菌中的NADP-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
4.根据权利要求2～3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组菌是以pK18-MBPMT作为载体。
6.权利要求2～5任一所述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法具体是：
(1)S.mutans中NAD-IDH编码基因icdSm的获得
根据S.mutans UA159icd的核苷酸序列，在其基因上下游加入限制性内切酶XmaIII酶切位点序列，通过基因合成获得含有目的基因的重组质粒pUC57/icdSm；
(2)整合型载体pK18-MBPMT/ΔicdCg的构建
根据C.glutamicumATCC13032icd基因序列设计icdCg基因上下游以及中间引物，以C.glutamicum RG基因组为模板，进行PCR，获得在3’端和5’端有相同限制性内切酶XmaIII的PCR产物，将以上述PCR产物与整合型载体pK18-MBPMT相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg；
(3)重组菌C.glutamicum RGI的构建
通过XmaIII酶酶切回收icdSm片段，将icdSm片段与同样经过XmaIII酶酶切后的pK18-MBPMT/ΔicdCg整合型载体相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg::icdSm，电击转化C.glutamicum RG，筛选获得重组菌C.glutamicum RGI。
7.权利要求2～5任一所述的重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将重组菌C.glutamicum RGI接种到种子培养基中，28-32℃，800-1200r·min-1培养8～15h；以5～15％接种量，接种于发酵培养基中，28-32℃，800-1200r·min-1培养30～50h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养基是：葡萄糖3-8g·L-1，蛋白胨8-12g·L-1，酵母膏3-8g·L-1，NaCl 8-12g·L-1。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基是：葡萄糖30-50g·L-1，(NH4)2SO410-30g·L-1，尿素3-8g·L-1，KH2PO40.5-1.5g·L-1，K2HPO4·3H2O 0.5-1.5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2-0.3g·L-1，3-(N-吗啡啉)-丙磺酸40-45g·L-1，L-蛋氨酸0.2-0.3g·L-1，CaCl2 0.005-0.015g·L-1，FeSO4·7H2O 0.005-0.015g·L-1，MnSO4·H2O 0.005-0.015g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.005-0.015g·L-1，CuSO4·5H2O 0.0001-0.0003g·L-1，NiCl2·6H2O0.00001-0.00003g·L-1，生物素0.0001-0.0003g·L-1，原儿茶酸0.00002-0.00004g·L-1，发酵过程中通过添加8-12g·L-1CaCO3调节pH。
10.权利要求2～5任一所述的重组谷氨酸棒杆菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。
CN201810313578.0A 2018-04-10 2018-04-10 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法 Pending CN108441525A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810313578.0A CN108441525A (zh) 2018-04-10 2018-04-10 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810313578.0A CN108441525A (zh) 2018-04-10 2018-04-10 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108441525A true CN108441525A (zh) 2018-08-24

Family

ID=63199532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810313578.0A Pending CN108441525A (zh) 2018-04-10 2018-04-10 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108441525A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182239A (zh) * 2018-09-14 2019-01-11 江南大学 一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法
CN109370974A (zh) * 2018-12-03 2019-02-22 江南大学 一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法
CN112481288A (zh) * 2020-12-03 2021-03-12 江南大学 促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950524A (zh) * 2016-04-27 2016-09-21 齐鲁工业大学 一种高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法
CN107858318A (zh) * 2017-11-17 2018-03-30 江南大学 异源表达大肠杆菌中dhdpr提高赖氨酸产量的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950524A (zh) * 2016-04-27 2016-09-21 齐鲁工业大学 一种高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法
CN107858318A (zh) * 2017-11-17 2018-03-30 江南大学 异源表达大肠杆菌中dhdpr提高赖氨酸产量的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANZHONG XU,ET AL.: "Metabolic engineering Corynebacterium glutamicum for the L-lysine production by increasing the flux into L-lysine biosynthetic pathway", 《AMINO ACIDS》 *
JUNKO OHNISHI ET AL.: "A novel gnd mutation leading to increased L-lysine production in Corynebacterium glutamicum", 《FEMS MICROBIOL LETT》 *
张伟国 等: "L-赖氨酸合成代谢中NADPH代谢的研究进展", 《食品与生物技术学报》 *
陈宏文 等: "工业微生物还原型辅酶II的代谢调控研究进展", 《化工进展》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182239A (zh) * 2018-09-14 2019-01-11 江南大学 一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法
CN109370974A (zh) * 2018-12-03 2019-02-22 江南大学 一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法
CN109370974B (zh) * 2018-12-03 2020-12-01 江南大学 一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法
CN112481288A (zh) * 2020-12-03 2021-03-12 江南大学 促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法
CN112481288B (zh) * 2020-12-03 2024-01-30 江南大学 促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6961819B2 (ja) Ｌ−リジンを生産する組換え菌、その構築方法およびｌ−リジンの生産方法
CN101679964B (zh) 具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用其生产腐胺的方法
CN103981203B (zh) 5‑氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
Neuner et al. Mixed glucose and lactate uptake by Corynebacterium glutamicum through metabolic engineering
JP2021500914A5 (zh)
CN106544284B (zh) 一种重组解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用
Gokarn et al. Expression of pyruvate carboxylase enhances succinate production in Escherichia coli without affecting glucose uptake
CN105813625A (zh) 生产酰基氨基酸的方法
CN108060114B (zh) 一种发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌及其应用
CN105950529B (zh) 产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用
CN108441525A (zh) 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
CN102994539A (zh) 加强钝齿棒杆菌nad激酶表达在高低供氧条件下提高该菌株l-精氨酸生产能力的方法
CN106434510A (zh) 一株发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌
CN113278641B (zh) 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌、其构建方法及其应用
CN113278568A (zh) 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌及其应用
Hu et al. Efficient production of d-1, 2, 4-butanetriol from d-xylose by engineered Escherichia coli whole-cell biocatalysts
CN110229774B (zh) 一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
CN113073074B (zh) 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用
CN116286703B (zh) L-丙氨酸脱氢酶突变体、工程菌及应用
CN108504617A (zh) 一种高产l-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法
CN102517303A (zh) 一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用
CN100392075C (zh) 谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与应用
CN107586814A (zh) 一种发酵生产谷胱甘肽的方法
CN104232553A (zh) 一株在低pH值下产丁二酸工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180824