CN109370974B - 一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法 - Google Patents

一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产L‑赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。本发明是以谷氨酸棒杆菌CICC 23604作为出发菌株，采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术，异源表达来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，提高胞内NADPH供给；敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB，减少发酵过程副产物苏氨酸的积累，得到积累L‑赖氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，产量达到42g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L‑赖氨酸奠定了基础。

Description

一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。
背景技术
L-赖氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-赖氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。
目前，L-赖氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。目前生产L-赖氨酸的常用菌株包括大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌，其中谷氨酸棒杆菌为食品安全级菌株，但其在摇瓶水平的L-赖氨酸产量一直未得到大幅提升。
谷氨酸棒杆菌CICC 23604已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸，其产品被FDA 认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒杆菌是生产食品安全级L-赖氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径中关键性酶基因的过表达是对谷氨酸棒杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在谷氨酸棒杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对谷氨酸棒杆菌进行遗传改造的方法，对于生产食品安全级L-赖氨酸有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，引入了外源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，并敲除了谷氨酸棒杆菌基因组上高丝氨酸激酶编码基因thrB。
在本发明的一种实施方式中，所述的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，是在丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824来源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列的基础上，进行了密码子优化。
在本发明的一种实施方式中，所述高丝氨酸激酶编码基因thrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，以谷氨酸棒杆菌CICC 23604为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，在NCgl1144基因的启动子下游引入了磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC。
本发明的第二个目的是提供上述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建磷酸甘油醛脱氢酶重组片段以及高丝氨酸激酶敲除片段：合成外源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，与位点上下游同源臂片段融合得到片段GA1，合成内源高丝氨酸激酶编码基因thrB上下游同源臂片段融合得到片段TH2；
(2)构建重组质粒：分别将GA1和TH2与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到含GA1的重组质粒和含TH2的重组质粒；
(3)构建高产L-赖氨酸重组谷氨酸棒杆菌：将含cas9蛋白的质粒转化谷氨酸棒杆菌CICC 23604，得到重组谷氨酸棒杆菌CGC9；随后将含GA1的重组质粒转化谷氨酸棒杆菌CGC9，得到重组谷氨酸棒杆菌CGC9-EGA，将含TH2的重组质粒转化谷氨酸棒杆菌CGC9-EGA，得到重组谷氨酸棒杆菌CGC9-EGT，去除外源质粒，得到重组谷氨酸棒杆菌CGGA0T；所述外源质粒包括含cas9蛋白的质粒、含GA1的重组质粒和含TH2的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述线性化载体包括pEC-XK99-G或pEC-XK99-T。
在本发明的一种实施方式中，pEC-XK99-G的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，pEC-XK99-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述含cas9蛋白的质粒包括pFSC质粒。
在本发明的一种实施方式中，pFSC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第三个目的是提供上述的重组谷氨酸棒杆菌在生产L-赖氨酸中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括将重组谷氨酸棒杆菌在30-34℃下培养22-26 h后，接种至发酵培养基，于30-34℃、180-200rpm条件下培养58-72h。
本发明是以谷氨酸棒杆菌CICC 23604作为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，异源表达来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，提高胞内NADPH供给；敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB，减少发酵过程副产物苏氨酸的积累，得到积累L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其摇瓶水平产量达42g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产食品安全级L-赖氨酸奠定了基础。本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1：在不同的碳源、氮源条件下发酵重组谷氨酸棒杆菌CGC9-EGT生产L-赖氨酸。
图2：仅在谷氨酸棒杆菌基因组中引入丙酮丁醇菌来源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因 gapC，利用葡萄糖与糖蜜发酵得到的重组菌生产L-赖氨酸。
图3：仅在谷氨酸棒杆菌基因组中引入丙酮丁醇菌来源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因 gapC，利用葡萄糖与糖蜜发酵得到的重组菌生产L-赖氨酸。
图4：在谷氨酸棒杆菌基因组中引入其他来源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因，同时敲除谷氨酸棒杆菌基因组中的高丝氨酸激酶编码基因thrB，利用葡萄糖与糖蜜发酵得到的重组菌生产L-赖氨酸。
具体实施方式
重组谷氨酸棒杆菌种子培养及发酵：
平板培养基(g/L)：蔗糖10，酵母粉5，NaCl 2.5，牛肉浸膏5，蛋白胨10，醋酸铵3，尿素2，琼脂粉20，pH调至6.8。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖90，糖蜜20，硫酸铵45，豆粕水解液20，七水硫酸镁1.2，磷酸二氢钾1.1，醋酸铵3，碳酸钙20，MgSO4·7H2O 0.25，CaCl2 0.01，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，CuSO4·5H2O 0.0002g/L，NiCl2·6H2O 0.0002，生物素0.0002。
L-赖氨酸含量的测定方法：
1)发酵液先用离心机离心(转速≥4000rpm)15min，取上清液约稀释100倍，赖氨酸的浓度必须稀释到0.2-0.5g/L的范围内。
2)量取稀释液1.0mL，加茚三酮显色液1.0mL，加盖锡帽后于100℃水浴加热15min后，即可用流水冷却，加蒸馏水8.0mL，摇匀，用分光光度计在460nm波长处测定OD，在标准曲线查相应的赖氨酸值M。
L-赖氨酸含量C(g/L)＝M×稀释倍数
下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规的分子生物学实验方法。
实施例1重组片段的构建
人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC。根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，设计引物gapC-1-F、gapC-1-R、gapC-3-F和gapC-3-R(见表1)，使用上述引物从谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组中扩增插入gapC引入位置两侧同源臂基因序列，将所得3段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段GA1。
根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，设计引物thrB-1-F、thrB-1-R、thrB-2-F和thrB-2-R，使用上述引物从谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组中扩增thrB基因两侧同源臂基因序列各800bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段TH2。
表1引物表
引物名称 引物序列
gapC-1-F GACCCATGGGCCCATGAACT
gapC-1-R TAGCTATCTTTGCCATCAATTTCTCCTCAAG
gapC-3-F GCCCGCACAGAACAAAAACC
gapC-3-R TCCTGTCTCTTGATCAGATCTTGTTGATGGCGCAGTTGACG
ztgap-F GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATC
ztgap-R GTTCATGGGCCCATGGGTCGATCTTGATCCCCTGCGCCA
thrB-1-F CGGCTATTTCTGCTCGCGT
thrB-1-R GCACCTCAAGTGTTGTTGTGGCACACCACTCGC
thrB-2-F TGCCACAACAACACTTGAGGTGCAGGACAATATTCG
thrB-2-R CCAAAGCACTTTCCATCGGAACC
ztthr-F TGGCGCAGGGGATCAAGATCCGGCTATTTCTGCTCGCGT
ztthr-R TCCTGTCTCTTGATCAGATCCCAAAGCACTTTCCATCGGAACC
实施例2重组质粒的构建
根据载体pEC-XK99序列信息，设计引物ztgap-F、ztgap-R、ztthr-F和ztthr-R，使用上述引物进行PCR，分别得到含有sgRNA的线性化载体pEC-XK99-G(核苷酸序列如SEQ IDNO.3 所示)和pEC-XK99-T(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)后，分别与重组片段GA1、TH2连接构建重组质粒。经过Eco32I、XmaJI双酶切验证及测序，确认重组质粒pEC-XK99GA1 和pEC-XK99TH2构建成功。
实施例3重组GA1片段谷氨酸棒杆菌的构建
将含有cas9蛋白的pFSC质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)转化谷氨酸棒杆菌CICC 23604。采用kana抗性板筛选转化成功的重组谷氨酸棒杆菌，命名为CGC9，随后将重组质粒pEC-XK99GA1转化谷氨酸棒杆菌CGC9，得到表达来源于丙酮丁醇菌磷酸甘油醛脱氢酶，选用引物gapC-2-F与gapC-2-R挑选转化子进行菌落PCR，出现1005bp条带，构建成功重组谷氨酸棒杆菌，命名为CGC9-EGA。
实施例4重组TH2片段谷氨酸棒杆菌的构建
将重组质粒pEC-XK99TH2转化谷氨酸棒杆菌CGC9-EGA，得到表达来源于丙酮丁醇菌磷酸甘油醛脱氢酶并敲除高丝氨酸激酶的重组谷氨酸棒杆菌CGC9-EGT，选用引物thrB-1-F 和thrB-2-R挑选转化子进行菌落PCR，检测出现1600bp条带，测序验证重组谷氨酸棒杆菌 CGC9-EGT构建成功。
加入0.01M IPTG诱导，在30℃条件下培养24h可以去除pEC-XK99TH2、pEC-XK99GA1质粒，随后37℃培养24h即可去除pFSC质粒，得到高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌CGGA0T。
实施例5利用硫酸铵与大豆蛋白胨作氮源发酵生产L-赖氨酸
将重组谷氨酸棒杆菌CGGA0T在平板培养基中30℃下培养24h，挑取单菌落至发酵培养基(将发酵培养基中的豆粕水解液替换为5g/L大豆蛋白胨)，于30℃、200rpm条件下培养60h时不再耗糖。利用茚三酮与赖氨酸特异结合显色反应，结合分光光度计法，测得发酵液上清中含有L-赖氨酸31g/L。
实施例6利用蔗糖与糖蜜作碳源发酵生产L-赖氨酸
将重组谷氨酸棒杆菌CGGA0T在平板培养基中30℃下培养24h，挑取单菌落至发酵培养基(将发酵培养基中的葡萄糖去除，添加蔗糖45g/L)，于30℃、200rpm条件下培养48 h时不再耗糖。利用茚三酮与赖氨酸特异结合显色反应，结合分光光度计法，测得发酵液上清中含有L-赖氨酸36g/L。
实施例7利用蔗糖与甜菜碱作碳源发酵生产L-赖氨酸
将重组谷氨酸棒杆菌CGGA0T在平板培养基中30℃下培养24h，挑取单菌落至发酵培养基(将发酵培养基中的葡萄糖与糖蜜去除，添加蔗糖80g/L，甜菜碱16g/L)，于30℃、200rpm条件下培养48h时不再耗糖。利用茚三酮与赖氨酸特异结合显色反应，结合分光光度计法，测得发酵液上清中含有L-赖氨酸38g/L
实施例8利用葡萄糖与糖蜜发酵生产L-赖氨酸
将重组谷氨酸棒杆菌CGGA0T在平板培养基中30℃下培养24h，挑取单菌落至发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养66h。利用茚三酮与赖氨酸特异结合显色反应，结合分光光度计法，测得发酵液上清中含有L-赖氨酸42g/L，如图1所示。
对比例1仅在谷氨酸棒杆菌基因组中引入丙酮丁醇菌来源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因 gapC，利用葡萄糖与糖蜜发酵得到的重组菌生产L-赖氨酸
人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC；根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，设计引物gapC-1-F、gapC-1-R、gapC-3-F和gapC-3-R，使用上述引物从谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组中扩增插入gapC位点两侧同源臂基因序列，将所得3段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段GA1。
将pEC-XK99-G与重组片段GA1连接构建重组质粒。经过Eco32I、XmaJI双酶切验证及测序，确认重组质粒pEC-XK99GA1构建成功。
将含有cas9蛋白的pFSC质粒转化谷氨酸棒杆菌CICC 23604。采用kana抗性板筛选转化成功的重组谷氨酸棒杆菌，命名为CGC9，随后将重组质粒pEC-XK99GA1转化谷氨酸棒杆菌CGC9，得到表达来源于丙酮丁醇菌磷酸甘油醛脱氢酶，选用引物gapC-2-F与gapC-2-R 挑选转化子进行菌落PCR，出现1005bp条带，构建成功重组谷氨酸棒杆菌，命名为 CGC9-EGA。去除质粒pFSC、pEC-XK99GA1，得到重组谷氨酸棒杆菌CGGA1T。
将重组谷氨酸棒杆菌CGGA1T在平板培养基中30℃下培养24h，挑取单菌落至发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养66h。利用茚三酮与赖氨酸特异结合显色反应，结合分光光度计法，测定发酵液上清中L-赖氨酸的含量。如图2所示，L-赖氨酸终产量为19g/L。
对比例2仅敲除谷氨酸棒杆菌基因组中的高丝氨酸激酶编码基因thrB，利用葡萄糖与糖蜜发酵得到的重组菌生产L-赖氨酸
根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA序列信息，设计引物thrB-1-F、thrB-1-R、thrB-2-F和thrB-2-R，使用上述引物从谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组中扩增thrB基因两侧同源臂基因序列各800bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段TH2。
将pEC-XK99-T与重组片段TH2连接构建重组质粒。经过Eco32I、XmaJI双酶切验证及测序，确认重组质粒pEC-XK99TH2构建成功。
将含有cas9蛋白的pFSC质粒转化谷氨酸棒杆菌CICC 23604。采用kana抗性板筛选转化成功的重组谷氨酸棒杆菌，命名为CGC9，随后将重组质粒pEC-XK99 TH2转化谷氨酸棒杆菌CGC9，选用引物挑选转化子进行菌落PCR验证，构建成功的重组谷氨酸棒杆菌，命名为CGC9-EGT2。去除质粒pFSC、pEC-XK99TH2，得到重组谷氨酸棒杆菌CGGA2T。
将重组谷氨酸棒杆菌CGGA2T在平板培养基中30℃下培养24h，挑取单菌落至发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养66h。利用茚三酮与赖氨酸特异结合显色反应，结合分光光度计法，测定发酵液上清中L-赖氨酸的含量。结果如图3所示，L-赖氨酸终产量为20.7g/L。
对比例3：在谷氨酸棒杆菌基因组中引入其他来源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因，同时敲除谷氨酸棒杆菌基因组中的高丝氨酸激酶编码基因thrB，利用葡萄糖与糖蜜发酵得到的重组菌生产L-赖氨酸
根据Shigella flexneri 2a str.301菌基因组DNA序列信息，经过密码子优化后得磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC-SF(如SEQ ID NO.6所示)。根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组 DNA序列信息，设计引物gapC-1-F、gapC-1-R、gapC-3-F和gapC-3-R，使用上述引物从谷氨酸棒杆菌CICC 23604基因组中扩增插入gapC-SF引入位置两侧同源臂基因序列，将所得3 段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段GA-SF。
根据谷氨酸棒杆菌序列信息，设计引物thrB-1-F、thrB-1-R、thrB-2-F和thrB-2-R，使用上述引物从谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中扩增thrB基因两侧同源臂基因序列各800bp，将所得3段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段TH2。
将pEC-XK99-G和pEC-XK99-T分别与重组片段GA-SF、TH2连接构建重组质粒。经过Eco32I、XmaJI双酶切验证及测序，确认重组质粒pEC-XK99GA-SF和pEC-XK99TH2构建成功。
将含有cas9蛋白的pFSC质粒转化谷氨酸棒杆菌CICC 23604。采用kana抗性板筛选转化成功的重组谷氨酸棒杆菌，命名为CGC9，随后将重组质粒pEC-XK99GA-SF转化谷氨酸棒杆菌CGC9，得到表达来源于丙酮丁醇菌磷酸甘油醛脱氢酶，挑选转化子进行菌落PCR验证，构建成功的重组谷氨酸棒杆菌，命名为CGC9-EGA-SF。
将重组质粒pEC-XK99TH2转化谷氨酸棒杆菌CGC9-EGA-SF，得到表达来源于Shigella flexneri 2a str.301的磷酸甘油醛脱氢酶并敲除高丝氨酸激酶的重组谷氨酸棒杆菌 CGC9-EGT-SF，选用引物thrB-1-F和thrB-2-R挑选转化子进行菌落PCR，检测出现1600bp 条带，测序验证重组谷氨酸棒杆菌CGC9-EGT-SF构建成功。去除质粒pFSC、 pEC-XK99GA-SF、pEC-XK99TH2，得到重组谷氨酸棒杆菌CGGA3T。
将重组谷氨酸棒杆菌CGGA3T在平板培养基中30℃下培养24h，挑取单菌落至发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养60h。利用茚三酮与赖氨酸特异结合显色反应，结合分光光度计法，测定发酵液上清中L-赖氨酸的含量。结果如图4所示，L-赖氨酸终产量为16.1 g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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cttgaagtac ctggattgga agttgttgca ataaacgact taactgatgc aaaaatgtta 120
gcacacttat ttaaatatga ttcatcacaa ggaagattca atggagaaat tgaagttaaa 180
gaaggagctt tcgtagtaaa cggaaaagaa gttaaagttt tcgctgaagc agatcctgaa 240
aaattacctt ggggagatct tggaatagac gttgttcttg agtgcacagg tttcttcaca 300
aagaaagaaa aagcagaagc tcacgtaaga gcaggcgcta aaaaagttgt tatatcagct 360
ccagctggaa acgacttaaa gacaatagtt ttcaacgtta ataatgaaga tcttgatgga 420
acagaaacag ttatatcagg tgcatcatgc acaactaact gcttagctcc aatggctaaa 480
gtattaaatg ataaatttgg aatagaaaaa ggattcatga ctacaattca tgcgttcact 540
aatgaccaaa acacattaga tggtccacac agaaaaggag atttaagaag agctagagct 600
gctgctgtaa gtatcatccc taactcaact ggtgctgcta aagctataag ccaagttatt 660
cctgacttag ctggaaaatt agacggaaac gctcaaagag ttccagttcc aactggttca 720
ataactgaat tagtttcagt tcttaagaaa aaagttacag ttgaagaaat caacgctgct 780
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gtagtaggaa tcaactacgg atcattattt gatgcaactt taactaaaat tgttgatgtt 900
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ccagctggaa acgacttaaa gacaatagtt ttcaacgtta ataatgaaga tcttgatgga 420
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gtattaaatg ataaatttgg aatagaaaaa ggattcatga ctacaattca tgcgttcact 540
aatgaccaaa acacattaga tggtccacac agaaaaggag atttaagaag agctagagct 600
gctgctgtaa gtatcatccc taactcaact ggtgctgcta aagctataag ccaagttatt 660
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ataactgaat tagtttcagt tcttaagaaa aaagttacag ttgaagaaat caacgctgct 780
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
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taacggtgct tcgcagtttg agggtctgca aaactctcac tctcgctggg ggtcacctct 9480
ggctgaattg gaagtcatgg gcgaacgccg cattgagctg gctattgcta ctaagaatca 9540
cttggcggcg ggtggcgcgc tcatgatgtt tgtgggcact gttcgacaca accgctcaca 9600
gtcatttgcg caggttgaag cgggtattaa gactgcgtac tcttcgatgg tgaaaacatc 9660
tcagtggaag aaagaacgtg cacggtacgg ggtggagcac acctatagtg actatgaggt 9720
cacagactct tgggcgaacg gttggcactt gcaccgcaac atgctgttgt tcttggatcg 9780
tccactgtct gacgatgaac tcaaggcgtt tgaggattcc atgttttccc gctggtctgc 9840
tggtgtggtt aaggccggta tggacgcgcc actgcgtgag cacggggtca aacttgatca 9900
ggtgtctacc tggggtggag acgctgcgaa aatggcaacc tacctcgcta agggcatgtc 9960
tcaggaactg actggctccg ctactaaaac cgcgtctaag gggtcgtaca cgccgtttca 10020
gatgttggat atgttggccg atcaaagcga cgccggcgag gatatggacg ctgttttggt 10080
ggctcggtgg cgtgagtatg aggttggttc taaaaacctg cgttcgtcct ggtcacgtgg 10140
ggctaagcgt gctttgggca ttgattacat agacgctgat gtacgtcgtg aaatggaaga 10200
agaactgtac aagctcgccg gtctggaagc accggaacgg gtcgaatcaa cccgcgttgc 10260
tgttgctttg gtgaagcccg atgattggaa actgattcag tctgatttcg cggttaggca 10320
gtacgttctc gattgcgtgg ataaggctaa ggacgtggcc gctgcgcaac gtgtcgctaa 10380
tgaggtgctg gcaagtctgg gtgtggattc caccccgtgc atgatcgtta tggatgatgt 10440
ggacttggac gcggttctgc ctactcatgg ggacgctact aagcgtgatc tgaatgcggc 10500
ggtgttcgcg ggtaatgagc agactattct tcgcacccac taaaagcggc ataaaccccg 10560
ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 10620
tgttgttggc gtcccggaaa acgattccga agcccaacct ttcatagaag gcggcggt 10678
<210> 6
<211> 252
<212> DNA
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<400> 6
gttaccgctg aggaggttaa caacgctctg aagcaggcta ccaccaacaa cgagtccttc 60
ggctacaccg acgaggagat cgtttcctcc gacatcatcg gctcccactt cggctccgtt 120
ttcgacgcta cccagaccga gatcaccgct gttggcgacc tgcagctggt taagaccgtt 180
gcttggtacg acaacgagta cggcttcgtt acccagctga tccgcaccct ggagaagttc 240
gctaagctgt aa 252
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gacccatggg cccatgaact 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tagctatctt tgccatcaat ttctcctcaa g 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gcccgcacag aacaaaaacc 20
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tcctgtctct tgatcagatc ttgttgatgg cgcagttgac g 41
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gatctgatca agagacagga tgaggatc 28
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gttcatgggc ccatgggtcg atcttgatcc cctgcgcca 39
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cggctatttc tgctcgcgt 19
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gcacctcaag tgttgttgtg gcacaccact cgc 33
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tgccacaaca acacttgagg tgcaggacaa tattcg 36
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tggcgcaggg gatcaagatc cggctatttc tgctcgcgt 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tcctgtctct tgatcagatc ccaaagcact ttccatcgga acc 43

Claims (6)

1.一种产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌CICC 23604为出发菌株，引入了外源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，并敲除了谷氨酸棒杆菌基因组上高丝氨酸激酶编码基因thrB，所述的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在NCgl1144基因的启动子下游引入了磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC。
3.一种重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌为：以谷氨酸棒杆菌CICC 23604为出发菌株，引入了外源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，并敲除了谷氨酸棒杆菌基因组上高丝氨酸激酶编码基因thrB，所述的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法包括以下步骤：
（1）构建磷酸甘油醛脱氢酶重组片段以及高丝氨酸激酶敲除片段：合成外源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，与gapC引入位置上下游同源臂片段融合得到片段GA1，合成内源高丝氨酸激酶编码基因thrB上下游同源臂片段融合得到片段TH2；
（2）构建重组质粒：分别将GA1和TH2与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到含GA1的重组质粒和含TH2的重组质粒；所述线性化载体核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；
（3）构建产L-赖氨酸重组谷氨酸棒杆菌：将含cas9蛋白的质粒转化谷氨酸棒杆菌CICC23604，得到重组谷氨酸棒杆菌CGC9；随后将含GA1的重组质粒转化谷氨酸棒杆菌CGC9，得到重组谷氨酸棒杆菌CGC9-EGA，将含TH2的重组质粒转化谷氨酸棒杆菌CGC9-EGA，得到重组谷氨酸棒杆菌CGC9-EGT，去除外源质粒，得到重组谷氨酸棒杆菌CGGA0T。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述含cas9蛋白的质粒包括pFSC质粒。
5.权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌在生产L-赖氨酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括将重组谷氨酸棒杆菌在30-34℃下培养22-26 h后，接种至发酵培养基，于30-34 ℃、180-200 rpm条件下培养58-72 h。
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