CN109929790A - 一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产4‑羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于基因工程领域。本发明在L‑异亮氨酸生产菌中将两种不同物种来源的异亮氨酸双加氧酶编码基因Btido、Bwido进行共表达，提高异亮氨酸双加氧酶的酶活，促进菌体自身积累的L‑异亮氨酸更快地发生4‑羟化反应，生成更多的4‑羟基异亮氨酸。使4‑HIL的产量提高至91.56mM 4‑HIL，L‑异亮氨酸向4‑HIL的转化率为86％。本发明还通过发酵培养基优化，在摇瓶水平上使基因工程菌的4‑HIL产量提高至111.11mM，L‑异亮氨酸向4‑HIL的转化率达到98％。本发明证实了双基因共表达的可行性和优势，为工业化应用打下了良好基础。

Description

一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

糖尿病是一种患病率很高的代谢紊乱疾病，目前超过4亿人受到糖尿病的困扰，而这一人数还在持续增加。(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种天然的非蛋白氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对胰岛素的抵抗，调节血脂异常等生理功能，在治理糖尿病及其并发症方面有良好的应用前景。目前4-HIL的主要制备方法是从葫芦巴种子中提取，但是产量很低，难以满足市场需求。于是从2002年开始，人们不断寻找化学-酶法合成4-HIL的方法，但是由于步骤太长、得率较低、纯度较低而没有深入下去。α-酮戊二酸依赖性异亮氨酸双加氧酶能够催化L-异亮氨酸的C4位发生羟基化反应，生成4-HIL。利用异亮氨酸双加氧酶通过微生物发酵法合成4-HIL是到目前为止发现的最简单、有效和经济的方法。

利用基因工程技术过量表达异亮氨酸双加氧酶编码基因，从而提高4-HIL产量的研究已有相关报道。在这个研究领域中，主要是将来源于苏云金芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶编码基因Btido导入到大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌中使其高效表达，利用工程菌表达出的异亮氨酸双加氧酶将L-异亮氨酸转变成4-HIL，从而生产出4-HIL。但是在大肠杆菌工程菌中需要加入大量比较昂贵的L-异亮氨酸作为底物，而在谷氨酸棒杆菌工程菌中则是利用菌体自身合成的L-异亮氨酸作为底物，因此采用谷氨酸棒杆菌工程菌生产4-HIL更为经济、有效。

谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01(保藏编号为：CCTCC NO:M2014410，记载和公布于ApplMicrobiolBiotechnol,2015,99(9):3851-3863)是一株L-异亮氨酸生产菌，在该菌株中克隆、表达Btido基因后，可以将其自身积累的L-异亮氨酸转化成4-HIL，从而实现4-HIL的一步从头合成，无需添加L-异亮氨酸等前体物质，具有明显的技术优势(Shi F,NiuTF,Fang HM(2015)4-Hydroxyisoleucine production of recombinant Corynebacteriumglutamicumssp.lactofermentum under optimal corn steep liquor limitation.ApplMicrobiolBiotechnol,99(9):3851-3863)。但是相对来说4-HIL产量还是比较低。因此，如何提高4-HIL的产量仍然是一个重要的技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，表达苏云金芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因、韦氏芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因和谷氨酸棒杆菌来源的苹果酸脱氢酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述苏云金芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因Btido含有SEQ ID NO.1所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述韦氏芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因Bwido含有SEQ ID NO.2所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述苹果酸脱氢酶基因mqo含有SEQ ID NO.3所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌敲除了异柠檬酸裂解酶的编码基因aceA，所述基因aceA含有SEQ ID NO.4所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述基因通过大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体表达。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体为pJYW-5，其构建方法公开于公开号为CN103834679B的专利中。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以谷氨酸棒杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种(C.glutamicumssp.lactofermentum)SN01，保藏编号为：CCTCC NO:M2014410，已公布于ApplMicrobiolBiotechnol,2015,99(9):3851-3863的论文中。

本发明的第二个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，所述方法是将苏云金芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因、谷氨酸棒杆菌来源的苹果酸脱氢酶和韦氏芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因依次连接在大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体上，转化至宿主细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01细胞。

本发明的第三个目的是提供一种生产4-羟基异亮氨酸的方法，所述方法以上述基因工程菌为发酵微生物，一步发酵法制备4-羟基异亮氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，于29-31℃发酵120-144h。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中含有Fe²⁺、Mg²⁺和NH₄ ⁺。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中Fe²⁺的浓度为5.5～7.2mM，所述Mg²⁺的浓度为6.2～8.3mM，所述NH₄ ⁺的浓度为151～227mM。

本发明还要求保护所述基因工程菌在制备4-羟基异亮氨酸或其衍生物方面的应用。

有益效果：本发明提供了Bwido(SEQ ID NO.2所示)基因的新用途，将其与不同物种来源的异亮氨酸双加氧酶编码基因Btido(SEQ ID NO.1所示)在L-异亮氨酸生产菌中共表达，提高异亮氨酸双加氧酶的酶活，促进菌体自身积累的L-异亮氨酸更快地发生4-羟化反应，生成更多的4-羟基异亮氨酸。并通过过表达mqo基因并敲除aceA基因，使4-HIL的产量提高至91.56mM(13.46g/L)，L-异亮氨酸向4-HIL的转化率为86％。本发明还通过发酵培养基优化，在摇瓶水平上使基因工程菌的4-HIL产量提高至111.11mM(16.33g/L)，比优化前提高了21.3％，L-异亮氨酸仅剩余2.17mM，L-异亮氨酸向4-HIL的转化率达到98％。

具体实施方式

4-HIL与L-异亮氨酸的检测方法：氨基酸产量用HPLC衍生化法测定：样品经过5％的三氯乙酸稀释50倍后放置沉淀4h，12000r/min离心20min，上清用滤膜过滤后用HPLC测样。测定试剂为流动相水相buffer A(1L)：醋酸钠3.01g，三乙胺200μL，四氢呋喃5mL，用10％醋酸调pH至7.2；有机相buffer B(1L)：醋酸钠3.01g溶解后用10％醋酸调pH至7.2，加入400mL乙腈和400mL甲醇。梯度洗脱条件为：0min 8％buffer B，20min 60％buffer B，25min 100％buffer B，28.5min 8％buffer B，色谱柱温为40℃，流速为0.8mL/min。异亮氨酸双加氧酶的酶活检测方法：取5mL发酵液，4℃、4000rpm离心10min，弃上清收集菌体。加入20mL pH6.0的PBS，悬浮菌体，4℃、4000rpm离心10min，弃上清收集菌体，重复上述步骤一遍。用20mLPBS重悬细胞，加入50mg/L溶菌酶1mL，颠倒混匀，37℃静置1h。用超声破碎仪破碎细胞30min，悬浊液加入直接用于酶活测定，在30℃反应1h。酶促反应体系:30mmol/L Ile、30mmol/Lα-KG、5mmol/L抗坏血酸、1mmol/L七水合硫酸亚铁、100mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)。

实施例1构建表达苏云金芽孢杆菌来源Btido的菌株

采用化学全合成法合成SEQ ID NO.1所示的异亮氨酸双加氧酶编码基因Btido。构建包含Btido并由强启动子P_tacM控制其表达的重组表达载体pJYW-5-Btido，其中，表达载体pJYW-5已公开于公开号为CN103834679B的专利中。将重组质粒转化到L-异亮氨酸生产菌SN01(已公布于ApplMicrobiolBiotechnol,2015,99(9):3851-3863的论文中)中，获得重组工程菌株SN02。

将菌株SN02按终OD₅₆₂为1.8的接种量接种至发酵培养基中，其中，发酵培养基成分为：葡萄糖140g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，玉米浆10g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，FeSO₄0.5g/L，CaCO₃ 20g/L，pH 7.2。，于30℃发酵144h，对发酵产物进行检测，结果显示，发酵获得4-HIL的产量为58.43mM(8.59g/L)，4-HIL和L-异亮氨酸的总量为67.82mM。

将SN01菌株在相同条件下培养，结果显示，L-异亮氨酸的产量为90mM。

实施例2构建表达韦氏芽孢杆菌来源Bwido的菌株

采用化学全合成法合成SEQ ID NO.2所示的异亮氨酸双加氧酶编码基因Bwido。构建包含Bwido并由强启动子P_tacM控制其表达的重组表达载体pJYW-5-Bwido，将重组质粒转化到谷氨酸棒杆菌SN01中，获得重组工程菌株SZ01。

按实施例1相同的发酵条件进行发酵，结果显示，相同发酵时间下，SZ01发酵合成4-HIL的产量为38.42mM(5.65g/L)，4-HIL和L-异亮氨酸的总量为78.45mM。

实施例3构建共表达Btido与mqo并敲除aceA的菌株

将SEQ ID NO.1所示的Btido与SEQ ID NO.3所示的mqo与质粒pJYW-5连接，得到重组质粒pJYW-5-Btido-mqo。将aceA的上游同源臂片段、带loxP位点的卡那霉素抗性基因、aceA的下游同源臂片段依次与载体pBlueScript连接，构建敲除质粒pBS-aceA。将敲除质粒pBS-aceA转化到谷氨酸棒状杆菌SN01中，完成aceA基因敲除。再将质粒pDTW109转入敲除aceA的谷氨酸棒状杆菌SN01，去除遗留在基因组上的卡那霉素抗性基因片段。基因敲除方法与pDTW109质粒序列已公开于公开号为CN103409446A的专利中。将重组质粒pJYW-5-Btido-mqo转化到敲除aceA的谷氨酸棒杆菌SN01中，获得菌株SZ03。

将菌株SZ03按照实施例1的方法进行发酵，结果显示，在相同的发酵时间下，4-HIL产量为38.16mM(5.61g/L)，4-HIL和L-异亮氨酸的总量为110.30mM，总量比SN01和SZ01分别提高了62.6％和40.6％。

实施例4双ido表达菌株的构建

在实施例3构建的重组质粒pJYW-5-Btido-mqo上共表达Bwido，并在Bwido序列前添加强启动子P_tacM，构建双ido表达质粒pJYW-5-Btido-mqo-Bwido，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。由于韦氏芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶基因Bwido与苏云金芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶基因Btido的一致性为70％左右，二者连接在一起表达易发生同源重组而导致基因丢失，因此，需按照Btido-mqo-Bwido的顺序依次连接；将重组质粒转化到敲除aceA的谷氨酸棒杆菌SN01中，构建重组工程菌株SZ04。

将菌株SZ04按照实施例1的方法进行发酵，结果显示，在相同的发酵时间下，菌株SZ04发酵后合成出91.56mM 4-HIL(13.46g/L)，与SZ03相比，产量提高了139.9％，异亮氨酸双加氧酶的酶活则由0.05-0.10U/g DCW提高至0.18-0.26U/g DCW；SZ04剩余14.72mM L-异亮氨酸，L-异亮氨酸向4-HIL的转化率为86％。

实施例5发酵培养基的优化

发酵培养基的组成为：

(1)在实施例1的培养基基础上，分别向培养基中分别添加浓度为1.5～2.5g/L七水合硫酸亚铁、0.5～1.0g/L硫酸镁和20～30g/L硫酸铵，正交实验结果如表1所示；

表1不同发酵培养基下的4-HIL产量

(2)根据步骤(1)所得结果，通过正交设计助手分析，得出最优解。向发酵培养基中加入1.5g/L七水合硫酸亚铁、0.75g/L硫酸镁和30g/L硫酸铵，按照实施例4相同的条件接种SZ04进行发酵，结果显示，发酵相同时间下，4-HIL产量提高至111.11mM(16.33g/L)，比优化前提高了21.3％，L-异亮氨酸仅剩余2.17mM，L-异亮氨酸向4-HIL的转化率达到98％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 723

<212> DNA

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 1

atgaaaatga gtggctttag catagaagaa aaggtacatg aatttgaatc taaaggattc 60

cttgaaattt caaatgaaat ctttttacaa gaggaagaga atcatcgtct attaacacaa 120

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taa 723

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> Bacillus weihenstephanensis

<400> 2

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taa 723

<210> 3

<211> 1503

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ssp. lactofermentum

<400> 3

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taa 1503

<210> 4

<211> 1299

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ssp. lactofermentum

<400> 4

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gcaaacaccc caactgttgt tatcgcacgt accgacgctg aggcagcaac cctgatcacc 720

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gcagatatga tctggatgga gaccggcacc cctgacctgg agctcgctaa gaagttcgct 900

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ttcgacctgg cttacggata cgctcgcgaa ggcatgacct ccttcgttga cctgcagaac 1140

cgtgagttca aggcagctga agagcgtggc ttcaccgctg ttaagcacca gcgtgaggtt 1200

ggcgcaggct acttcgacca gatcgcaacc accgttgacc cgaactcttc taccaccgct 1260

ttgaagggtt ccactgaaga aggccagttc cacaactag 1299

<210> 5

<211> 10118

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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tgccccagga cgcgaggtgt cgcaaagttt ggtggtagta cttgatggat ttcatccagt 120

cgtggccgaa agctacacct gggatgccgt cgccttctgc tggggtgtag attttgcccg 180

ggatgccggc gtagttcata tcgcctacca gcacgcggtg cggtccgcgc ttggacagtt 240

tggacaggtg tttgttcaga ttctcagcca cgtgtttaag gatagttgaa agcgtggggc 300

aatactggca ctaaccccgg caccaatcgt atttctgtcc gcggttggtg gcacaatagt 360

tcaacatgaa cttgctgacc accaaaattg acctggatgc catcgcccat aacacgaggg 420

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gttggatttg gacaccggag caggatttcc gcgccgccat tgatcgcaat attgatttgg 660

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tgtccatcaa gattgattct gggttgcatc gttcgggtgt ggatgagcag gagtgggagg 780

gcgtgttcag cgcgttggct gctgccccgc acattgaggt cacgggcatg ttcacgcact 840

tggcgtgcgc ggatgagcca gagaatccgg aaactgatcg ccaaattatt gcttttcgac 900

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ttgggcgcgt atgcatggat cagttcgtta tttctttggg cgacaatcca cacggcgtgg 1320

aagctggggc gaaggccgtg atattcggtg agaatgggca tgacgcaact gattttgcgg 1380

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catatgttta agtgaatacg tttaaggagc agcaatgaaa tctgagtttc cggtatccgg 1500

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ctaaaggatt ccttgaaatt tcaaatgaaa tctttttaca agaggaagag aatcatcgtc 1800

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atagtaatga ttacttccaa tctaaagaat ataactatga cgatggcggg aaagttagac 1980

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ggttacataa agatgatgaa ccagtagtgt ttttacacct tatgaattta agtaatacag 2220

ctattggtgg agataattta atagctaatt ctcctcggga aattaatcag tttataagtt 2280

tgaaggagcc tttagaaact ttagtatttg gacaaaaggt cttccatgcc gtaacgccac 2340

ttggaacaga atgtagtacg gaggcttttc gtgatatttt attagtaaca ttttcttata 2400

aggagacaaa ataacgttaa cggatccaga aggagatatt gcatgtcaga ttccccgaag 2460

aacgcaccga ggattaccga tgaggcagat gtagttctca ttggtgccgg tatcatgagc 2520

tccacgctgg gtgcaatgct gcgtcagctg gagccaagct ggactcagat cgtcttcgag 2580

cgtttggatg gaccggcaca agagtcgtcc tccccgtgga acaatgcagg aaccggccac 2640

tctgctctat gcgagctgaa ctacacccca gaggttaagg gcaaggttga aattgccaag 2700

gctgtaggaa tcaacgagaa gttccaggtt tcccgtcagt tctggtctca cctcgttgaa 2760

gagggagtgc tgtctgatcc taaggaattc atcaaccctg ttcctcacgt atctttcggc 2820

cagggcgcag atcaggttgc atacatcaag gctcgctacg aagctttgaa ggatcaccca 2880

ctcttccagg gcatgaccta cgctgacgat gaagctacct tcaccgagaa gctgcctttg 2940

atggcaaagg gccgtgactt ctctgatcca gtagcaatct cttggatcga tgaaggcacc 3000

gacatcaact acggtgctca gaccaagcag tacctggatg cagctgaagt tgaaggcact 3060

gaaatccgct atggccacga agtcaagagc atcaaggctg atggcgcaaa gtggatcgtg 3120

accgtcaaga acgtacacac tggcgacacc aagaccatca aggcaaactt cgtgttcgtc 3180

ggcgcaggcg gatacgcact ggatctgctt cgcagcgcag gcatcccaca ggtcaagggc 3240

ttcgctggat tcccagtatc cggcctgtgg cttcgttgca ccaacgagga actgatcgag 3300

cagcacgcag ccaaggtata tggcaaggca tctgttggcg ctcctccaat gtctgttcct 3360

caccttgaca cccgcgttat cgagggtgaa aagggtctgc tctttggacc ttacggtggc 3420

tggaccccta agttcttgaa ggaaggctcc tacctggacc tgttcaagtc catccgccca 3480

gacaacattc cttcctacct tggcgttgct gctcaggaat ttgatctgac caagtacctt 3540

gtcactgaag ttctcaagga ccaggacaag cgtatggatg ctcttcgcga gtacatgcca 3600

gaggcacaaa acggcgattg ggagaccatc gttgccggac agcgtgttca ggttattaag 3660

cctgcaggat tccctaagtt cggttccctg gaattcggca ccaccttgat caacaactcc 3720

gaaggcacca tcgccggatt gctcggtgct tcccctggag catccatcgc accttccgca 3780

atgatcgagc tgcttgagcg ttgcttcggt gaccgcatga tcgagtgggg cgacaagctg 3840

aaggacatga tcccttccta cggcaagaag cttgcttccg agccagcact gtttgagcag 3900

cagtgggcac gcacccagaa gaccctgaag cttgaggaag cctaagtcga ctggggaaga 3960

attaggcagg catctagaag ctggcgatgt ggtgattttg gacgtttgag ctgttgacaa 4020

ttaatcatcg tgtggtacca tgtgtggaat tgtgagcgga taacaattgc ggccgcctta 4080

aggggcccag aaggaggtat aggatgaaga cctcttcttt cgacgttgag cagaaggttc 4140

acgagttcga gtccaacggc tacatccaga tcttcaacga catcttcctg caggaccagg 4200

aggaccaggc tctgctgacc aaggctcagc tggactacta ctccctgcag aacgacgctt 4260

acggcgagtg ccgcgctcgc gcttactccc gctacatcaa gtacgctggc tcctccgact 4320

acgttctgga caccgacaac ggctacttcc agtccgagga gtacaactac gacgacggcg 4380

gcaagatccg caacttcaac tccatcaccg acgagttcct gcacaactcc ctgatcgaga 4440

agatcgttcg cttcgactcc gagttcgctt ccaacaccaa catcctggac acctccaagg 4500

acctggttat cggcctgcac caggttcgct acaaggctac ccgcgagaac ccatccttct 4560

cctccccaat ctggctgcac aaggacgacg agccaatcgt tttcctgcac ctgatgaacc 4620

tgtccaacac cgctctgggc ggcgacaacc tgatcgctaa ctccccacgc gagatcaaca 4680

agctgatctc cctgaaggac ccactggaga ccctggtatt cggccagaag gtcttccacg 4740

cggttacccc actgggcacc gagtgcaaca ccgaggctct gcgcgacatc ctgctggtta 4800

ccttctccta caaggagcca aaataagtat acctgcaggc atgcaagctt ggctgttttg 4860

gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga agcggtctga 4920

taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc atgccgaact 4980

cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga 5040

actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc 5100

tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac 5160

gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat 5220

caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactcttttt 5280

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gaattaattc cgctagatga 5340

cgtgcggctt cgacctcctg ggcgtggcgc ttgttggcgc gctcgcggct ggctgcggca 5400

cgacacgcgt ctgagcagta ttttgcgcgc cgtcctcgtg ggtcaggccg gggtgggatc 5460

aggccaccgc agtaggcgca gctgatgcga tcctccacta ctgcgcgtcc tcctggcgct 5520

gccgagcacg cagctcgtcg gccagctctt caaggtcggc cacaagcgtt tctaggtcgc 5580

tcgcggcact tgcccagtcg cgtgatgctg gcgcgtctgt cgtatcgagg gcgcggaaaa 5640

atccgatcac cgtttttaaa tcgacggcgg catcgagtgc gtcggactcc agcgcgacat 5700

cggagagatc caccgctgat gcttcaggcc agttttggta cttcgtcgtg aaggtcatga 5760

caccattata acgaacgttc gttaaaaatt ctagccccaa ttctgataat ttcttccggc 5820

actcctgcga aaacctgcga gacttcttgc ccagaaaaaa cgccaagcgc agcggttacc 5880

gcactttttt tccaggtgat ttcaccctga ccagcgaagc ggcactttag tgcatgaggt 5940

gtgcccctgg tttcccctct ttggagggtt caacccaaaa aagcacacaa gcaaaaatga 6000

aaatcatcat gagcaagttg gtgcgaagca gcaacgcgct agctccaaaa aggtctccag 6060

gatctcgagg agatttttga gggggaggga gtcgaggaag agccagagca gaaggcgggg 6120

aaccgttctc tgccgacagc gtgagccccc cttaaaaatc aggccgggga ggaaccgggg 6180

agggatcaga gctaggagcg agacacccta aaggggggga accgttttct gctgacggtg 6240

tttcgtttat tagttttcag cccgtggata gcggagggtg agggcaagtg agagccagag 6300

caaggacggg acccctaaag gggggaaccg ttttctgctg acggtgtttc gtttattagt 6360

tttcagcccg tggacggccg cgtttagctt ccattccaag tgcctttctg acttgttgga 6420

tgcgcctttc actgacacct agttcgcctg caagctcacg agtcgaggga tcagcaaccg 6480

attgagaacg ggcatccagg atcgcagttt tgacgcgaag ttcgagcaac tcgcctgtca 6540

tttctcggcg tttgtttgct tccgctaatc gctgtcgcgt ctcctgcgca tacttacttt 6600

ctgggtcagc ccatctgcgt gcattcgatg tagctgcgcc ccgtcgcccc atcgtcgcta 6660

gagctttccg ccctcggctg ctctgcgttt ccacccgacg agcagggacg actggctggc 6720

ctttagccac gtagccgcgc acacgacgcg ccatcgtcag gcgatcacgc atggcgggaa 6780

gatccggctc ccggccgtct gcaccgaccg cctgggcaac gttgtacgcc acttcatacg 6840

cgtcgatgat cttggcatct tttaggcgct caccagcagc tttgagctgg tatcccacgg 6900

tcaacgcgtg gcgaaacgcg gtctcgtcgc gcgctcgctc tggatttgtc cagagcactc 6960

gcacgccgtc gatcaggtcg ccggacgcgt ccagggcgct cggcaggctc gcgtccaaaa 7020

tcgctagcgc cttggcttct gcggtggcgc gttgtgccgc ttcaatgcgg gcgcgtccgc 7080

tggaaaagtc ctgctcaatg tactttttcg gcttctgtga tccggtcatc gttcgagcaa 7140

tctccattag gtcggccagc cgatccacac gatcatgctg gcagtgccat ttataggctg 7200

tcggatcgtc tgagacgtgc agcggccacc ggctcagcct atgcgaaaaa gcctggtcag 7260

cgccgaaaac acgagtcatt tcttccgtcg ttgcagccag caggcgcata tttgggctgg 7320

ttttacctgc tgcggcatac accgggtcaa tgagccagat gagctggcat ttcccgctca 7380

gcggattcac gccgatccaa gccggcgctt tttctaggcg tgcccatttc tctaaaatcg 7440

cgtagacctg cgggtttacg tgctcaatct tcccgccggc ctggtggctg ggcacatcga 7500

tgtcaagcac gatcaccgcg gcatgttgcg cgtgcgtcag cgcaacgtac tggcaccgcg 7560

tcagcgcttt tgagccagcc cggtagagct ttggttgggt ttcgccggta tccgggtttt 7620

taatccaggc gctcgcgaaa tctcttgtct tgctgccctg gaagctttcg cgtcccaggt 7680

gagcgagcag ttcgcggcga tcttctgccg tccagccgcg tgagccgcag cgcatagctt 7740

cggggtgggt gtcgaacaga tcggcggaca atttccacgc gctagctgtg actgtgtcct 7800

gcggatcggc tagagtcatg tcttgagtgc tttctcccag ctgatgactg ggggttagcc 7860

gacgccctgt gagttcccgc tcacggggcg ttcaactttt tcaggtattt gtgcagctta 7920

tcgtgttttc ttcgtaaatg aacgcttaac taccttgtta aacgtggcaa ataggcagga 7980

ttgatgggga tctagcttca cgctgccgca agcactcagg gcgcaagggc tgctaaagga 8040

agcggaacac gtagaaagcc agtccgcaga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct 8100

actgggctat ctggacaagg gaaaacgcaa gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg 8160

ggcttacatg gcgatagcta gactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc 8220

cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct 8280

tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat 8340

cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 8400

ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 8460

ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga 8520

atgaactcca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg 8580

cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc 8640

cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 8700

atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga 8760

aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc 8820

tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgga 8880

tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 8940

tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct 9000

atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg 9060

accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc 9120

gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gcggaatcat gaccaaaatc 9180

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 9240

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 9300

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 9360

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 9420

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 9480

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 9540

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 9600

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 9660

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 9720

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 9780

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 9840

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 9900

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 9960

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg 10020

atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc 10080

agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagta 10118

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，表达苏云金芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因、韦氏芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因和谷氨酸棒杆菌来源的苹果酸脱氢酶基因。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，采用启动子P_tacM强化所述异亮氨酸双加氧酶基因的表达。

3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，还敲除了异柠檬酸裂解酶的编码基因aceA。

4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌为宿主。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体pJYW-5进行基因的表达。

6.一种构建权利要求1～5任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法是将苏云金芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因、谷氨酸棒杆菌来源的苹果酸脱氢酶和韦氏芽孢杆菌来源的异亮氨酸双加氧酶基因依次连接在大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体上，转化至谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01细胞中。

7.一种生产4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1～5任一基因工程菌为发酵微生物，发酵制备4-羟基异亮氨酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵是在29-31℃发酵120-144h。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，发酵体系中含有Fe²⁺、Mg²⁺和NH₄ ⁺；其中，Fe²⁺的浓度为5.5～7.2mM；Mg²⁺的浓度为6.2～8.3mM；NH₄ ⁺的浓度为151～227mM。

10.权利要求1～5任一所述基因工程菌或权利要求7～9任一所述方法在生产4-羟基异亮氨酸或其衍生物方面的应用。