CN110438058A - 一种产l-色氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可用于产L‑色氨酸的重组菌株，通过对大肠杆菌菌株中trpE基因的启动子进行替换改造，插入强启动子，和/或对xylA基因进行敲除或者弱化表达，获得单一修饰或者双重修饰的重组菌株。重组后的菌株与未改造的菌株相比，进一步提高了L‑色氨酸的产量，产量达到20g/L以上，并且为进一步代谢工程改造生产L‑色氨酸菌株奠定了基础。本发明提供的重组菌株构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

Description

一种产L-色氨酸的重组菌株及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种产L-色氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，广泛应用于饲料行业中。
L-色氨酸的生产最早主要依靠蛋白质水解法和化学合成法，但是随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法又可分为直接发酵法、微生物转化法和酶法，目前L-色氨酸生产主要以微生物发酵法生产为主。微生物发酵法具有原料价格低廉、工艺控制简单、产品质量可靠等优点。但随着发酵工业的快速发展，发酵法生产L-色氨酸对培养基营养成分和发酵调控的合理性提出了更高的要求。优良的L-色氨酸生产菌株、合理的培养基组成和适当的发酵调控策略有利于提高L-色氨酸的产酸水平。
通过微生物生产L-色氨酸是从PEP(磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate))与E4P(赤藓糖-4-磷酸(Erythrose-4-Phosphate))的聚合产生的DAHP(3-脱氧D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-DeoxyD-arabino-heptulosonate-7-phosphate))起始的，PEP是糖酵解(glycolysis)的中间产物，E4P是磷酸戊糖途径的中间产物。然后，从分支酸(chorismate)经共同的芳香族生物合成途径来生物合成L-色氨酸。目前，获得L-色氨酸高产菌株的方法主要包括诱变筛选育种或者基因工程育种，如何有目的地获得L-色氨酸高产菌株将对于提高L-色氨酸产量有重大意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种产L-色氨酸的重组菌株及其构建方法与应用，所述重组菌株通过引入强启动子和特定基因弱化或敲除，实现了L-色氨酸产量的提高。
本发明采用如下技术方案实现：
本发明的第一方面，提供一种重组菌株，所述重组菌株是在宿主菌株中trpE基因的编码核苷酸序列前插入Ptac强启动子。
根据本发明，所述Ptac强启动子包括如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；优选地，所述Ptac是含有SEQ ID NO:1和其互补序列SEQ ID NO:2的双链启动子。
根据本发明，所述宿主菌株可以为本领域已知的能够代谢产生L-色氨酸的微生物，例如选自野生型或者经改造的大肠杆菌。
在本发明的一个实施方式中，所述产生L-色氨酸的微生物为大肠杆菌E.coliK12、E.coli K12 W3110、E.coli 1-1703中的至少一种。
根据本发明，所述trpE基因的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明的第二方面，提供一种重组菌株，是宿主菌株经xylA基因弱化或敲除改造。
根据本发明，所述宿主菌株可以为本领域已知的能够代谢产生L-色氨酸的微生物，例如选自野生型或者经改造的大肠杆菌。
根据本发明，所述重组菌株进一步包括trpE基因，且包括Ptac强启动子作为trpE基因的启动子。
根据本发明，所述Ptac强启动子包括如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
优选地，所述Ptac是含有SEQ ID NO:1和其互补序列SEQ ID NO:2的双链启动子。
本发明还提供上述重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)在宿主菌株的trpE基因的编码核苷酸序列前插入Ptac强启动子；和/或
(2)弱化或敲除xylA基因。
根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括如下步骤：
S1.1将所述Ptac强启动子与trpE基因上游、下游同源臂片段融合，引入所述Ptac强启动子，得到重组片段up-Ptac-down片段；
S1.2将所述重组片段与质粒载体连接，构建重组质粒；
S1.3以所述产L-色氨酸菌株为宿主菌株，转化至所述重组质粒，得到所述包含Ptac强启动子的重组菌株。
在本发明的一个实施方案中，所述重组菌株中保留野生型tac启动子序列(SEQ IDNO：17)，且插入Ptac强启动子，形成双启动子。根据本发明的构建方法，所述步骤S1.1中，所述融合是指将所述强启动子的核苷酸序列与上游、下游同源臂片段分别连接；在本发明的一个实施方式中，可通过重叠延伸PCR方法进行连接。
根据本发明的构建方法，所述步骤S1.1中，所述trpE基因的上下游同源臂序列是以野生型的trpE基因编码序列为基础设计引物，经PCR扩增得到。
在本发明的一个实施方式中，trpE基因上游、下游同源臂引物设计如下：
P1:5'cgggatcc gccgcactcaacaaggaaac 3'(SEQ ID NO:4)
P2:5'gccggatgattaattgtcaatgttattctctaattttgttc 3'(SEQ ID NO:5)
P3:5'ttcacacaag gagatataccatgcaaacac aaaaaccgactctc 3'(SEQ ID NO:6)
P4:5'aaggaaaaaa gcggccgctatgcggcacggaaaccac 3'(SEQ ID NO:7)。
在本发明的一个实施方式中，以宿主菌株基因组为模板，以引物P1和P2，P3和P4进行PCR扩增，分别获得trpE基因上游、下游同源臂序列。具体地，所述同源臂序列为长度分别为750bp和740bp的两条DNA片段(trpE Up和trpE Down片段)。
在本发明的一个实施方式中，所述PCR反应按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。
根据本发明的构建方法，所述步骤S1.1中，强启动子Ptac和trpE基因上游、下游同源臂序列通过重叠延伸PCR方法融合。在本发明的一个实施方式中，合成强启动子的扩增引物，然后以所述上游同源臂序列和强启动子序列为模板，进行PCR扩增，得到重组片段up-Ptac片段；再进一步以up-Ptac片段和下游同源臂序列为模板，进行PCR扩增，得到重组up-Ptac-down片段。
在本发明的一个实施方式中，所述Ptac启动子的扩增引物如下：
P5:5'ttgacaattaatcatccggctcg 3'(SEQ ID NO:8)
P6:5'ggtatatctccttgtgtgaaattg 3'(SEQ ID NO:9)。
在本发明的一个实施方式中，所述up-Ptac片段是以P1和P6为引物扩增得到；所述up-Ptac-down片段是以P1和P4为引物扩增得到。
根据本发明的构建方法，所述步骤S1.2的质粒载体为pKOV质粒；所构建的重组载体为pKOV-up-Ptac-down载体。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤S1.3的转化为电转化法；示例性地，所述步骤S1.3中，是将重组质粒转化至宿主菌株。
根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括以下步骤：
S2.1设计并合成两对扩增xylA基因上游、下游同源臂片段的引物；
S2.2采用步骤S2.1所述的引物通过PCR扩增得到与xylA基因具有同源性的DNA片段，并构建重组载体；
S2.3将步骤2.2得到的重组载体导入宿主菌株或步骤(1)所获得的重组菌株中，通过同源重组敲除宿主菌株中的xylA基因(SEQ ID NO:18)，获得xylA基因表达水平减弱或者xylA基因敲除的重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述步骤S2.1的引物为：
P7:5'cg ggatcc cttggcgttgttatctac 3'(SEQ ID NO:10)；
P8:5'gatgcaccggagacaaatga cgcgggtgatggatgatgtc 3'(SEQ ID NO:11)；
P9:5'gacatcatccatcacccgcg tcatttgtctccggtgcatc 3'(SEQ ID NO:12)；
P10:5'aaggaaaaaa gcggccgc acgctttcgcaacttcagg 3'(SEQ ID NO:13)。
根据本发明的构建方法，所述步骤S2.2包括：以宿主菌株基因组为模板，以引物P7和P8，P9和P10进行PCR扩增，获得长度分别为830bp和810bp的两条DNA片段(xylA Up和xylADown片段)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P7和P10为引物，通过重叠PCR扩增得到DNA片段(xylA-up-down)。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸120s(30个循环)。
所述重叠PCR扩增按如下方式进行94℃变性30s秒，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。
根据本发明的构建方法，所述步骤S2.2还包括构建重组载体的步骤：将扩增得到的DNA片段(xylA-up-down)和质粒用BamHI/NotI双酶切，然后用DNA连接酶连接，获得含有xylA上下游同源臂的载体。具体地，所述质粒为pKOV质粒，所述重组载体为pKOV-xylA-up-down。
根据本发明的构建方法，所述步骤S2.3为将步骤S2.2得到的含有xylA上下游同源臂的重组载体电转化至宿主菌株；优选地，所述宿主菌株为E.coli1-1703。
作为本发明的一个实施方案，所述构建方法包括步骤(1)和步骤(2)，例如将所述pKOV-xylA-up-down重组载体导入步骤(1)所获得的重组菌株中，形成双重修饰的重组菌株。
本发明还提供如上所述的构建方法所获得的重组载体。
本发明进一步提供如上所述的重组菌株在L-色氨酸制备中的应用。
根据本发明所述的重组菌株在L-色氨酸制备中的应用，或者提供一种提高L-色氨酸发酵量的方法；或者提供一种生产L-色氨酸的方法。
根据本发明所述的应用和方法，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-色氨酸。根据本发明所述的应用和方法，可以单独使用本发明的重组菌株，也可以和其他产L-色氨酸的细菌混合使用。
有益效果
本发明通过在产L-色氨酸的菌株中插入强启动子作为trpE基因的启动子，获得trpE基因表达增强的重组型菌株，并且还可针对xylA基因进行弱化表达或者敲除。无论是单一修饰还是双重修饰的重组菌株，与未改造的菌株相比，均提高了L-色氨酸的产量，产量达到20g/L以上，并且双重修饰的重组菌株有更加优异的L-色氨酸生产能力，为进一步代谢工程改造生产L-色氨酸菌株奠定了基础。且本发明提供的重组菌株构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为重组载体pKOV-up-Ptac-down的质粒图谱。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。
实施例1Ptac启动子基因敲入载体的构建
Ptac启动子是应用于大肠杆菌中蛋白表达的强启动子，以携带有Ptac启动子的质粒pSCBe(GenBank登录号为MH144609.1)序列为参考，设计并合成Ptac启动子的寡核苷酸链Ptac1、Ptac2，序列如下(由上海invitrogen公司合成)：
Ptac1：5’ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggataacaatttcac acaaggagat atacc 3’
Ptac2：5’ggtatatctc cttgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacattatacgagccgg atgattaatt gtcaa 3’
Ptac1、Ptac2序列是一对反向互补链，经过退火就形成了双链的Ptac启动子。
表1退火反应体系
无核酸酶水 40μL
Annealing Buffer For DNA Oligos(5×) 20μL
Ptac1(50μM) 20μL
Ptac2(50μM) 20μL
总计 100μL
表2退火反应条件表
步骤 温度 时间
1 95℃ 2min
2 每90s下降1℃，降至25℃ 约90min
3 4℃ 长期保存
退火后获得的Ptac启动子保存备用。
trpE基因编码TRPE酶(邻氨基苯甲酸合酶组分I)。在E.coli K12菌株及其衍生菌株(如W3110等)中，野生型的trpE基因ORF序列如Genbank登录号为AP009048.1中第1323098-1324660位所示。依据该基因序列及其上游和下游的序列设计并合成两对引物，分别用于扩增trpE基因上游、下游同源臂片段，通过同源重组将Ptac启动子敲入进去，在菌株E.coli1-1703(购自中科院微生物研究所，其为经E.coli K12 W3110诱变突变得到的L-色氨酸生产工程菌，经测序保留了trpE基因的野生型启动子)基因组中的trpE基因(序列2)前插入Ptac启动子。trpE基因上游、下游同源臂引物设计如下(由上海invitrogen公司合成)：
P1:5'cgggatcc gccgcactcaacaaggaaac 3'(BamHI)(SEQ ID NO:4)
P2:5'gccggatgattaattgtcaatgttattctctaattttgttc 3'(SEQ ID NO:5)
P3:5'ttcacacaag gagatataccatgcaaacac aaaaaccgactctc 3'(SEQ ID NO:6)
P4:5'aaggaaaaaa gcggccgctatgcggcacggaaaccac 3'(NotI)(SEQ ID NO:7)
设计并合成Ptac启动子的扩增引物如下：
P5:5'ttgacaattaatcatccggctcg 3'(SEQ ID NO:8)
P6:5'ggtatatctccttgtgtgaaattg 3'(SEQ ID NO:9)
以工程宿主菌E.coli 1-1703基因组为模板，以引物P1和P2，P3和P4进行PCR扩增，获得长度分别为750bp和740bp的两条DNA片段(trpE Up和trpE Down片段)。PCR反应按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以trpE Up和保存的Ptac启动子为模板，以P1和P6为引物，通过Overlap PCR扩增长约810bp的片段(up-Ptac片段)。PCR体系：10×Ex Taq Buffer5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸120s(30个循环)。以琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的up-Ptac和trpE down为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增长约1640bp的片段(up-Ptac-down片段)。PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸120s(30个循环)。将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的up-Ptac-down和pKOV质粒(购至Addgene公司)分别用BamH I/Not I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接，获得含有trpE基因上、下游同源臂和Ptac启动子的载体pKOV-up-Ptac-down，并将载体pKOV-up-Ptac-down送测序公司进行测序鉴定，鉴定正确后将载体保存备用。
实施例2Ptac启动子敲入菌株的构建
将构建好的质粒pKOV-up-Ptac-down电转化转入工程宿主菌E.coli 1-1703菌株中。具体筛选过程为：在30℃、100rpm，复苏2h，涂布于氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基上，30℃培养18h，挑选长出的单克隆菌体，接种于LB液体培养及中，37℃、200rpm培养8h后，涂布于氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基上，42℃培养12h。挑选1-5个单菌落接种于1mL LB液体培养基，涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基上，30℃培养24h，挑选单克隆，并分别划线于固体LB培养基和氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基。对于在固体LB培养基上生长，同时在氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基不能生长的菌株进行PCR扩增鉴定。PCR扩增采用引物P1、P6或P5、P4，通过琼脂糖凝胶电泳比较PCR产物条带的大小，如果可以分别扩增出810bp或780bp的片段，通过测序发现序列与预测序列一致，表明宿主菌的trpE基因前已经插入了Ptac启动子。最终得到了替换了启动子的trpE基因的菌株，该菌株命名为YPTrp01。测序结果如SEQ ID NO:19所示。
实施例3色氨酸摇瓶发酵实验
将构建菌株YPTrp01从平板培养基挑取接种在含有25mL种子培养基(配方见表3)的250mL带有挡板的三角瓶(corner-baffled flask)中，放置于37℃、转速为220rpm的摇床中培养8h。然后从中取出1mL种子培养液转接到含有24mL具有生产培养基(配方见表3)的250mL带有角挡板的三角瓶中，放置于37℃、转速为220rpm的摇床中继续培养36h。当培养完成时，通过HPLC测定L-色氨酸的产生。以工程宿主菌E.coli 1-1703作为对照组，实验重复三次，结果如表4所示。
表3培养基配方
表4色氨酸发酵实验结果
结果如表4所示，原始工程宿主菌中色氨酸产量为11.5g/L，改造后的菌株YPT01在培养基中产生20.5g/L的L-色氨酸，与改造前的菌株相比，产量提高了78.3％。因此，在大肠杆菌中对trpE基因的启动子进行替换后，增强了trpE基因的表达，有助于L-色氨酸产量的提高。
实施例4xylA基因敲除载体的构建
xylA酶(D-木糖异构酶)由xylA基因编码。在E.coli K12菌株及其衍生菌株(如W3110等)中，野生型的xylA基因ORF序列如Genbank登录号为AP009048.1中第3909650-3910972位所示。依据该序列及其上游和下游序列设计并合成两对扩增xylA基因上游、下游同源臂片段的引物，通过同源重组将xylA置换敲除下来，将菌株E.coli 1-1703(购自中科院微生物研究所，其为经E.coli K12 W3110诱变突变得到的L-色氨酸生产工程菌，经测序保留了野生型的xylA基因)基因组中的xylA基因(序列1)进行敲除。引物设计如下(由上海invitrogen公司合成)：
P7:5'cg ggatcc cttggcgttgttatctac 3'(BamHI)(SEQ ID NO:10)
P8:5'gatgcaccggagacaaatga cgcgggtgatggatgatgtc 3'(SEQ ID NO:11)
P9:5'gacatcatccatcacccgcg tcatttgtctccggtgcatc 3'(SEQ ID NO:12)
P10:5'aaggaaaaaa gcggccgc acgctttcgcaacttcagg 3'(NotI)(SEQ ID NO:13)
以工程宿主菌E.coli 1-1703基因组为模板，以引物P7和P8，P9和P10进行PCR扩增，获得长度分别为830bp和810bp的两条DNA片段(xylA Up和xylA Down片段)。PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，ExTaq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；PCR按如下方式进行：94℃变性30s(秒)，52℃退火30s(秒)，以及72℃延伸30s(秒)(30个循环)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P7和P10为引物，通过Overlap PCR扩增长约1640bp的片段(up-down片段)。PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；PCR按如下方式进行：94℃变性30s(秒)，52℃退火30s(秒)，以及72℃延伸120s(秒)(30个循环)。将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的xylA-up-down和pKOV质粒(购至Addgene公司)分别用BamHI/NotI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接，获得含有xylA上下游同源臂的载体pKOV-xylA-up-down，并将载体pKOV-xylA-up-down送测序公司进行测序鉴定，鉴定正确后将载体保存备用。
实施例5xylA敲除菌株的构建
将构建好的质粒pKOV-xylA-up-down电转化转入工程宿主菌E.coli 1-1703菌株中。具体筛选过程为：在30℃、100rpm，复苏2h，涂布于氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基上，30℃培养18h，挑选长出的单克隆菌体，接种于LB液体培养及中，37℃、200rpm培养8h后，涂布于氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基上，42℃培养12h。挑选1-5个单菌落接种于1mL LB液体培养基，涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基上，30℃培养24h，挑选单克隆，并分别划线于固体LB培养基和氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基。对于在固体LB培养基上生长，同时在氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基不能生长的菌株进行PCR扩增鉴定。PCR扩增采用如下引物(上海invitrogen公司合成)：
P11：5'ggagatcatcaatcgccatac 3'(SEQ ID NO:14)
P12:5'gctgaacccatagcaatttag 3'(SEQ ID NO:15)
通过琼脂糖凝胶电泳比较PCR产物条带的大小，如果扩增片段比野生型的基因片段小(原片段大小2275bp，敲除后片段大小为1005bp)，通过测序发现序列为敲除后的结果，测序结果如SEQ ID NO:16所示，表明宿主菌的xylA基因已经缺失。最终得到敲除了xylA基因的菌株，该菌株命名为YPTrp02。
实施例6色氨酸发酵实验
从平板培养基挑取构建菌株YPTrp02的菌种接种在含有25mL种子培养基(配方见表5)的250mL带有挡板的三角瓶(corner-baffledflask)中，放置于37℃、转速为220rpm的摇床中培养8h。然后从中取出1mL种子培养液转接到含有24mL具有生产培养基(配方见表5)的250mL带有角挡板的三角瓶中，放置于37℃、转速为220rpm的摇床中继续培养36h。当培养完成时，通过HPLC测定L-色氨酸的产生。以工程宿主菌E.coli1-1703作为对照组，实验重复三次，结果如表6所示。
表5培养基配方
成分 种子配方g/L 发酵配方g/L
葡萄糖 20 7.5
磷酸氢二钾 5.6 7.5
七水硫酸镁 1.6 2
柠檬酸钠 1.6 -
柠檬酸 - 2
酵母提取物 1.1 1
硫酸铵 1.2 1.6
维生素B1 0.0013 0.0013
生物素 0.003 0.0003
硫酸亚铁 0.028 0.075
硫酸锰 0.012 0.0016
硫酸钠 - 0.05
硫酸锌 - 0.003
氯化钴 - 0.0004
硫酸铜 - 0.002
表6色氨酸发酵实验结果
结果如表6所示，原始工程宿主菌中色氨酸产量为11.4g/L，改造后的菌株YPT02在培养基中产生12.3g/L的L-色氨酸，与改造前的菌株相比，产量有所提高。因此，在大肠杆菌中对xylA基因敲除后，有助于L-色氨酸产量的提高。
实施例7插入强启动子并且敲除xylA基因的突变株的构建。
将构建好的质粒pKOV-xylA-up-down电转化入重组菌株YPTrp01菌株中。具体筛选过程为：在30℃、100rpm，复苏2h，涂布于氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基上，30℃培养18h，挑选长出的单克隆菌体，接种于LB液体培养及中，37℃、200rpm培养8h后，涂布于氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基上，42℃培养12h。挑选1-5个单菌落接种于1mLLB液体培养基，涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基上，30℃培养24h，挑选单克隆，并分别划线于固体LB培养基和氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基。对于在固体LB培养基上生长，同时在氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基不能生长的菌株进行PCR扩增鉴定。PCR扩增采用如下引物(上海invitrogen公司合成)：
P11：5'GGAGATCATCAATCGCCATAC 3'(SEQ ID NO:14)
P12:5'GCTGAACCCATAGCAATTTAG 3'(SEQ ID NO:15)
通过琼脂糖凝胶电泳比较PCR产物条带的大小，如果扩增片段比野生型的基因片段小(原片段大小2275bp，敲除后片段大小为1005bp)，通过测序发现序列为敲除后的结果，表明宿主菌的xylA基因已经缺失。最终得到在trpE前插入Ptac启动子同时敲除了xylA基因的菌株，该菌株命名为YPTrp03。
实施例8色氨酸发酵实验
将构建菌株YPTrp01、YPTrp02、YPTrp03接种在含有25mL种子培养基(配方见表5)的250mL带有挡板的三角瓶(corner-baffledflask)中，放置于37℃、转速为220rpm的摇床中培养8h。然后从中取出1mL种子培养液转接到含有24mL具有生产培养基(配方见表5)的250mL带有角挡板的三角瓶中，放置于37℃、转速为220rpm的摇床中继续培养36h。当培养完成时，通过HPLC测定L-色氨酸的产生。以工程宿主菌E.coli1-1703作为对照组，实验重复三次，结果如表8所示。
表7培养基配方
表8色氨酸发酵实验结果
结果如表8所示，原始工程宿主菌中色氨酸产量为11.4g/L，改造后的菌株YPT01、YPT02、YPT03在培养基中产生L-色氨酸与原始工程菌株相比产量均有所提高，特别是YPT03菌株，为两个位点整合的菌株，高于两个位点单独改造的菌株，而YPT01、YPT02的重复发酵实验也表明其可以保持稳定的产L-色氨酸能力。因此，在大肠杆菌中对xylA基因敲除以及整合Ptac启动子在trpE位点来增强该基因的表达后，有助于L-色氨酸产量的提高。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> 一种产L-色氨酸的重组菌株及其构建方法与应用
<130> CPCN19110497
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaaggagat atacc 75
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtatatctc cttgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacatta tacgagccgg 60
atgattaatt gtcaa 75
<210> 3
<211> 1563
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaactg ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaat 60
cccaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaattt 120
gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctgc tggtagacag tgcgctgcgc 180
attacagctt taggtgacac tgtcacaatc caggcacttt ccggcaacgg cgaagccctc 240
ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa gtgaacaatc accaaactgc 300
cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgcccg cttatgctcc 360
ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420
cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480
ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540
ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600
aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660
gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcata tgcgttgtga atgtaatcag 720
agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780
attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840
tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat 900
ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960
attgagatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020
gacagagatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080
gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140
agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200
tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260
atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320
gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380
gatctcgaca cctgcattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440
caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500
aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560
tga 1563
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgggatccgc cgcactcaac aaggaaac 28
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccggatgat taattgtcaa tgttattctc taattttgtt c 41
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcacacaag gagatatacc atgcaaacac aaaaaccgac tctc 44
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaggaaaaaa gcggccgcta tgcggcacgg aaaccac 37
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgacaatta atcatccggc tcg 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtatatctc cttgtgtgaa attg 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgggatccct tggcgttgtt atctac 26
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatgcaccgg agacaaatga cgcgggtgat ggatgatgtc 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacatcatcc atcacccgcg tcatttgtct ccggtgcatc 40
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaggaaaaaa gcggccgcac gctttcgcaa cttcagg 37
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggagatcatc aatcgccata c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctgaaccca tagcaattta g 21
<210> 16
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctgaaccca tagcaattta ggcgcagtaa atccgggcat catcaggttg ccggtaatca 60
cccgcgattg cggaactcgc gcttccagca aagtgcactc ttgcgcacag cgcccgtcgt 120
tccacaaaat ggcagggcgt aacacccgtt gctgagcatc cagcaaggtt gctccgtgca 180
tctggccggc aatacccaat gctttaacgt cctgcagaga atgctgatcg cccagagctt 240
tcattgcgcg atcagttgcc tgccaccact gttccgggtc ttgttccgac cagagtggat 300
gcgggcgcga aacggtcagc ttttccgttt gcgcagcaac cacctcaccc tgctcgttga 360
gcaaaataac ttttacgccc gaggtgccaa gatctatccc gatatacata tcgatcgttc 420
cttaaaaaaa tgcccggtat cgctaccgat aaccgggcca acggactgca cagttagccg 480
ttatttgtcg aacagataat ggtttaccag attttccagt tgttcctggc gaccactctg 540
atgcaccgga gacaaatgac gcgggtgatg gatgatgtcg taatattggg cactcccttt 600
cagttgctca attatgttat ttcacactgc tattgagata attcacaagt gtgcgctcgc 660
tcgcaaaata aaatggaatg atgaaactgg gtaattcctc gaagagaaaa atgcaataag 720
tacaattgcg caacaaaagt aagatctcgg tcataaatca agaaataaac caaaaatcgt 780
aatcgaaaga taaaaatctg taattgtttt cccctgttta gttgctaaaa attggttacg 840
tttatcgcgg tgattgttac ttattaaaac tgtcctctaa ctacagaagg ccctacacca 900
tgaaaataaa gaacattcta ctcacccttt gcacctcact cctgcttacc aacgttgctg 960
cacacgccaa agaagtcaaa ataggtatgg cgattgatga tctcc 1005
<210> 17
<211> 75
<212> DNA
<213> tac启动子(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaaggagat atacc 75
<210> 18
<211> 1323
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 18
atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg aaggctcaaa atcctcaaac 60
ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt tgggtaagcg tatggaagag 120
cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac accttctgct ggaacggggc ggatatgttt 180
ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg aggcactggc gttggcgaag 240
cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac atgtgccatt ttattgcttc 300
cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag agtacatcaa taattttgcg 360
caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg gcgtgaagct gctgtgggga 420
acggccaact gctttacaaa ccctcgctac ggcgcgggtg cggcgacgaa cccagatcct 480
gaagtcttca gctgggcggc aacgcaagtt gttacagcga tggaagcaac ccataaattg 540
ggcggtgaaa actatgtcct gtggggcggt cgtgaaggtt acgaaacgct gttaaatacc 600
gacttgcgtc aggagcgtga acaactgggc cgctttatgc agatggtggt tgagcataaa 660
cataaaatcg gtttccaggg cacgttgctt atcgaaccga aaccgcaaga accgaccaaa 720
catcaatatg attacgatgc cgcgacggtc tatggcttcc tgaaacagtt tggtctggaa 780
aaagagatta aactgaacat tgaagctaac cacgcgacgc tggcaggtca ctctttccat 840
catgaaatag ccaccgccat tgcgcttggc ctgttcggtt ctgtcgacgc caaccgtggc 900
gatgcgcaac tgggctggga caccgaccag ttcccgaaca gtgtggaaga gaatgcgctg 960
gtgatgtatg aaattctcaa agcaggcggt ttcaccaccg gtggtctgaa cttcgatgcc 1020
aaagtacgtc gtcaaagtac tgataaatat gatctgtttt acggtcatat cggcgcgatg 1080
gatacgatgg cactggcgct gaaaattgca gcgcgcatga ttgaagatgg cgagctggat 1140
aaacgcatcg cgcagcgtta ttccggctgg aatagcgaat tgggccagca aatcctgaaa 1200
ggccaaatgt cactggcaga tttagccaaa tatgctcagg aacatcattt gtctccggtg 1260
catcagagtg gtcgccagga acaactggaa aatctggtaa accattatct gttcgacaaa 1320
taa 1323
<210> 19
<211> 774
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaaggagat ataccatgca aacacaaaaa ccgactctcg aactgctaac ctgcgaaggc 120
gcttatcgcg acaatcccac cgcgcttttt caccagttgt gtggggatcg tccggcaacg 180
ctgctgctgg aatttgcaga tatcgacagc aaagatgatt taaaaagcct gctgctggta 240
gacagtgcgc tgcgcattac agctttaggt gacactgtca caatccaggc actttccggc 300
aacggcgaag ccctcctggc actactggat aacgccctgc ctgcgggtgt ggaaagtgaa 360
caatcaccaa actgccgtgt gctgcgcttc ccccctgtca gtccactgct ggatgaagac 420
cccgcttatg ctccctttcg gtttttgacg ctttccgttt attgcagaat ctgttgaatg 480
taccgaagga agaacgagaa gccatgttct tcggcggcct gttctcttat gaccttgtgg 540
cgggatttga agatttaccg caactgtcag cggaaaataa ctgccctgat ttctgttttt 600
atctcgctga aacgctgatg gtgattgacc atcagaaaaa aagcacccgt attcaggcca 660
gcctgtttgc tccgaatgaa gaagaaaaac aacgtctcac tgctcgcctg aacgaactac 720
gtcagcaact gaccgaagcc gcgccgccgc tgccagtggt ttccgtgccg cata 774

Claims (10)

1.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将宿主菌株中trpE基因编码核苷酸序列前插入Ptac强启动子；
优选地，所述Ptac强启动子包括如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；优选地，所述Ptac强启动子是含有SEQ ID NO:1和其互补序列SEQ ID NO:2的双链启动子。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主菌株为能够代谢产生L-色氨酸的微生物，例如野生型或者经改造的大肠杆菌；
例如大肠杆菌E.coli K12、E.coli K12 W3110、E.coli 1-1703中的至少一种。
优选地，所述trpE基因的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将宿主菌株经xylA基因弱化表达或敲除改造得到；
优选地，宿主菌株为能够代谢产生L-色氨酸的微生物，例如野生型或者经改造的大肠杆菌，例如大肠杆菌E.coli K12、E.coli K12 W3110、E.coli 1-1703中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株进一步包括trpE基因，且包括Ptac强启动子作为trpE基因的启动子；
优选地，所述Ptac强启动子包括如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；优选地，所述Ptac是含有SEQ ID NO:1和其互补序列SEQ ID NO:2的双链启动子。
5.如权利要求1-4任一项所述的重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)在宿主菌株的trpE基因中插入Ptac强启动子；和/或
(2)弱化或敲除xylA基因；
优选地，所述步骤(1)包括如下步骤：
S1.1将所述Ptac强启动子与trpE基因上游、下游同源臂片段融合，引入所述Ptac强启动子，得到重组片段up-Ptac-down片段；
S1.2将所述重组片段与质粒载体连接，构建重组质粒；
S1.3以所述产生L-色氨酸的菌株为宿主菌株，转化所述重组质粒，得到所述包含Ptac强启动子的重组菌株。
6.根据权利要求5所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，所述trpE基因上游、下游同源臂引物如P1、P2、P3和P4，所述引入序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示；
所述trpE基因上游、下游同源臂序列是以宿主菌株基因组为模板，以引物P1和P2，P3和P4进行PCR扩增，分别获得；例如所述同源臂序列为长度分别为750bp和740bp的两条DNA片段，分别为上游同源臂trpE Up和下游同源臂trpE Down片段；
优选地，所述步骤S1.1中，所述Ptac强启动子和trpE基因上游、下游同源臂序列通过重叠延伸PCR方法融合；例如，合成所述Ptac强启动子的扩增引物P6，所述P6序列为SEQ IDNO:9所示，然后以所述trpE Up片段和Ptac强启动子序列为模板，进行PCR扩增，得到重组片段up-Ptac片段；再进一步以up-Ptac片段和下游同源臂trpE Down片段为模板，进行PCR扩增，得到重组up-Ptac-down片段；
优选地，所述up-Ptac片段是以P1和P6为引物扩增得到；所述up-Ptac-down片段是以P1和P4为引物扩增得到；
优选地，所述步骤S1.2的质粒载体为pKOV质粒；所构建的重组载体为pKOV-up-Ptac-down载体。
7.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)包括以下步骤：
S2.1设计并合成两对扩增xylA基因上游、下游同源臂片段的引物；
S2.2采用步骤S2.1所述的引物通过PCR扩增得到与xylA基因具有同源性的DNA片段，并构建重组载体；
S2.3将步骤2.2得到的重组载体导入宿主菌株中，通过同源重组敲除宿主菌株中的xylA基因，获得xylA基因弱化或敲除的重组菌株；
优选地，所述步骤S2.1的引物为P7、P8、P9和P10，分别为SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示的引物序列；
优选地，所述步骤S2.2包括：以宿主菌株基因组为模板，以引物P7和P8，P9和P10进行PCR扩增，获得长度分别为830bp和810bp的两条DNA片段，为xylA Up和xylA Down片段，将以上述所述两条DNA片段为模板，以P7和P10为引物，通过重叠PCR扩增得到重组DNA片段up-down片段；
优选地，所述步骤S2.2包括：将up-down片段和质粒分别用BamHI/NotI双酶切，然后连接，获得含有xylA上下游同源臂的载体；例如，所述质粒为pKOV质粒，所述重组载体为pKOV-xylA-up-down。
8.根据权利要求5-7任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括步骤(1)和步骤(2)，优选将步骤2的重组载体导入步骤(1)所获得的重组菌株中，形成双重修饰的重组菌株。
9.如权利要求1-4任一项所述的重组菌株在L-色氨酸制备中的应用。
10.根据权利要求9所述的重组菌株在L-色氨酸制备中的应用，是采用所述重组菌株提高L-色氨酸发酵量的方法，或者生产L-色氨酸的方法；
例如，采用所述重组菌株和任选地其他菌株进行发酵，制备得到L-色氨酸。
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