CN109402034A

CN109402034A - 只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用

Info

Publication number: CN109402034A
Application number: CN201811256402.2A
Authority: CN
Inventors: 张伟国; 钱和; 冯丽妍
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明公开了只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明敲除谷氨酸棒杆菌中BCAT编码基因ilvE，过表达来自大肠杆菌W3110的tyrB基因和谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的aspB基因，分析其对三种支链氨基酸的催化合成作用，解决发酵过程中三种氨基酸同时存在的问题。此发明通过优化转氨酶基因，成功找到两种转氨酶基因只对L‑亮氨酸有作用，消除了其他两种氨基酸作为副产物的影响，为选育只产特定支链氨基酸菌株提供了崭新的思路。

Description

只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

支链氨基酸包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸，属于必需氨基酸，高等生物体不能自身合成，需要从外界摄取。支链氨基酸在生理功能和代谢中具有重要作用，可用于膳食产品，药品和化妆品和饲料行业。另外，支链氨基酸还具有非常好的抗分解作用，有助于预防蛋白分解和肌肉丢失。由于微生物发酵法具有生产成低、反应条件温和，污染小等优点，而成为了当今工业生产支链氨基酸的主要方法。

支链氨基酸的合成途径是一个平行途径并且相互关联，在生物合成途径中，存在着多种共用酶。L-缬氨酸和L-异亮氨酸是从磷酸烯醇式丙酮酸开始分支，由乙酰羟酸合成酶(AHAS)、乙酰羟酸异构体还原酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)、支链氨基酸转氨酶(BCAT)四种共用酶催化反应；由L-缬氨酸合成途径中的α-酮基异戊酸分支一条途径，在α-异丙基苹果酸合成酶(IPMS)、α-异丙基苹果酸异构酶(IPMI)、α-异丙基苹果酸脱氢酶(IPMD)和支链氨基酸转氨酶(BCAT)酶的催化下合成L-亮氨酸。支链氨基酸转氨酶是三种氨基酸共用的最后一个酶，是催化合成氨基酸的最后一步。

由ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶(BCAT)是5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶，属于IV折叠型，涉及到三种氨基酸和酮酸之间的转氨转移。由于此酶是三种氨基酸合成中的共用酶，若过表达ilvE基因，则三种支链氨基酸会同时增加，无法得到唯一的一种氨基酸。

发明内容

基于上述问题，本发明将谷氨酸棒杆菌Cornebacterium glutamiucm支链氨基酸合成途径中的参与最后一步反应的共用酶BCAT基因敲除，获得一株支链氨基酸缺陷型的基因工程菌株C.glutamiucm△ilvE，首次将来源于大肠杆菌(E.coli)的芳香族氨基酸转氨酶(TyrB)和来自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的天冬氨酸转氨酶(AspB)，引入到该菌株中，重组菌株经发酵只产生L-亮氨酸，解决了C.glutamiucm发酵过程中同时生产三种支链氨基酸的缺点，并且得到了只产一种支链氨基酸的菌株。

本发明的第一个目的是提供只产一种支链氨基酸的谷氨酸棒杆菌重组菌，所述重组菌是在谷氨酸棒杆菌的基础上敲除了支链氨基酸转氨酶基因，并且过表达了芳香族氨基酸转氨酶或者天冬氨酸转氨酶。

在本发明的一种实施方式中，所述芳香族氨基酸转氨酶来源于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述芳香族氨基酸转氨酶基因是来源于大肠杆菌W3110的tyrB。

在本发明的一种实施方式中，芳香族氨基酸转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸转氨酶来源于谷氨酸棒杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸转氨酶基因是来源于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中的aspB基因。

在本发明的一种实施方式中，天冬氨酸转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum FA-1为宿主构建得到的。所述C.glutamicum FA-1为异亮氨酸缺陷型。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌宿主，还可以是C.glutamiucmATCC 13032，在2009年4月公开的《L-亮氨酸高产菌TGL8207的定向选育及其发酵过程研究》文献中记载并公开了的谷氨酸棒杆菌TGL8207等。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达是以pEC-XK99E作为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述支链氨基酸转氨酶基因序列与C.glutamiucmATCC 13032来源的ilvE基因序列一致(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核苷酸序列如SEQID NO:6所示)。

本发明的第二个目的是提供一种所述重组菌的构建方法。

在本发明的一种实施方式中，构建方法中，支链氨基酸转氨酶基因的敲除具体是：

(1)自杀性质粒pK18mobsacB-△ilvE的构建

根据GeneBank中C.glutamiucm ATCC 13032基因组中的ilvE基因序列设计ilvE基因的上下游以及中间引物(表1)。以C.glutamiucm FA-1或C.glutamiucm ATCC 13032基因组为模板，分别以ilvE-L-F/ilvE-L-R和ilvE-R-F和ilvE-R-R为引物进行PCR反应，获得分别在5’端和3’端有相同限制性内切酶酶切位点的PCR产物。将以上纯化后的PCR产物和线性化的整合型质粒pK18mobsacB通过酶连构建重组质粒pK18mobsacB-△ilvE。

(2)重组菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE或C.glutamiucm ATCC 13032 △ilvE的构建

将验证正确的重组质粒pK18mobsacB-△ilvE电击转化C.glutamicum FA-1或C.glutamiucm ATCC 13032，经含有25mg/L卡那霉素的LBHIS固体培养基筛选，获得第一次同源重组转化子；再将目标转化子在含有100g/L蔗糖的LBG固体培养集中进行胁迫二次重选筛选，最终在LBG平板上进行分离并挑取多个转化子以ilvE-F和ilvE-R为引物进行PCR验证，将经过PCR验证正确的转化子接入LBG液体培养基，提取基因组PCR验证及测序鉴定，获得基因工程菌C.glutamicum FA-1 △ilvE或C.glutamiucm ATCC 13032 △ilvE。

本发明的第三个目的是提供一种发酵生产L-亮氨酸的方法，所述方法利用本发明的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，培养得到的种子液按照3％-12％的接种量转接至发酵培养基进行发酵培养。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液是在28-32℃、80-200r/min培养8-16h得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液是在30℃，100r/min培养12h得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养，是在28-32℃、80-200r/min培养56-96h。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液是按照5％的接种量转接至发酵培养基，30℃，100r/min培养72h。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基(g/L)：葡萄糖30，玉米浆，酵母膏5，(NH₄)₂SO₄ 5，KH₂PO₄ 2，MgSO₄·7H₂O 0.5，MnSO₄·4H₂O 0.05，柠檬酸钠5，尿素2，L-蛋氨酸0.5，硫胺素300μg，生物素200μg，CaCO₃ 20。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基(g/L)：葡萄糖130，玉米浆25，(NH₄)₂SO₄ 15，CH₃COONH₄ 15，KH₂PO₄·3H₂O 1.3，MgSO₄·7H₂O 0.4，MnSO₄·H₂O 0.01，L-蛋氨酸0.7，L-异亮氨酸0.06，L-谷氨酸0.5，L-缬氨酸0.6，硫胺素160μg，生物素50μg，柠檬酸钠2，尿素2，CaCO₃ 30。

本发明的第四个目的是提供所述重组菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。

本发明的有益效果是：本发明通过在敲除C.glutamiucm FA-1中编码BCAT基因ilvE的菌株中，过表达来自E.coli W3110的tyrB和C.glutamiucm ATCC 13032的aspB基因，获得对L-亮氨酸有专一性的重组菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB，解决了C.glutamiucm FA-1发酵同时生产L-亮氨酸和L-缬氨酸的缺点，从而获得了只产一种支链氨基酸的菌株。

附图说明

图1：支链氨基酸的合成；

缩写说明：AHAS，乙酰羟酸合酶；AHAIR，乙酰羟酸异构还原酶；DHAD，二羟酸脱水酶；BCAT，支链氨基酸转氨酶；IPMS，异丙基苹果酸合成酶。

图2：TyrB和AspB在E.coli BL21中的表达；

泳道说明：M泳道为蛋白质分子量标准Marker；1号泳道为E.coli BL21/pEC-XK99E上清液加IPTG诱导；2号道为E.coli BL21/pEC-XK99E-aspB上清液加IPTG诱导；3号道为E.coli BL21/pEC-XK99E上清液加IPTG诱导；4号道为E.coli BL21/pEC-XK99E-tyrB上清液加IPTG诱导；5号道为E.coli BL21/pEC-XK99E上清液诱导。

图3：不同菌株转氨酶比酶活力测定；

图4：不同菌株发酵生产支链氨基酸过程曲线；

编号说明：a-菌体生长；b-葡萄糖变化曲线；c-支链氨基酸生产曲线；

图5：不同菌株发酵液副产物测定结果；

图6：大肠杆菌中的天冬氨酸转氨酶AspC和枯草芽孢杆菌的天冬氨酸转氨酶AspB对支链氨基酸的影响。

具体实施方式

实施例1：C.glutamiucm FA-1中BCAT编码基因ilvE基因的敲除

以C.glutamiucm ATCC 13032基因组为模板，先以ilvE-L-F/ilvE-L-R(表1)为引物进行PCR扩增反应，获得ilvE-L片段。将PCR产物ilvE-L胶回收后与pk18mobsacB同时用Sma I和Xba I双酶切，酶切之后纯化的产物ilvE-L和质粒pk18mobsacB通过酶连，获得重组质粒pk18mobsacB-ilvE-L；再以C.glutamiucm ATCC 13032基因组为模板，以ilvE-R-F/ilvE-R-R为引物扩增ilvE-R片段，将得到的ilvE-R片段和质粒pk18mobsacB-ilvE-L同时用Xba I和Sal I双酶切，之后将纯化后的ilvE-R片段和质粒pk18mobsacB-ilvE-L进行酶连，获得重组质粒pk18mobsacB-△ilvE。

将验证正确的质粒pk18mobsacB-△ilvE电击转化C.glutamiucm FA-1或C.glutamiucm ATCC 13032，经LBHIS+Km固体培养基筛选，获得第一次同源重组转化子。再将转化子在含有10％蔗糖的培养基中进行胁迫发生第二次同源重组，最终在LBG平板上进行划线分离并挑取多个转化子，以ilvE基因的上下游引物对其进行PCR鉴定，鉴定正确的转化子提取基因组进一步PCR鉴定，并将PCR产物进行测序鉴定。鉴定正确的转化子，命名为C.glutamiucm FA-1 △ilvE或C.glutamiucm ATCC 13032 △ilvE。

表1 PCR扩增所需引物序列(下划线为酶切位点)

实施例2：重组菌株C.glutamicum FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamicumFA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB的构建

(1)tyrB和aspB的获得

片段tyrB和aspB的获得，是分别以E.coli W3110和C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以tyrB-F和tyrB-R、aspB-F和aspB-R为引物，通过PCR反应扩增1251bp的tyrB片段和1281bp的aspB片段，在tyrB片段和aspB片段5’和3’端分别引入EcoR I和BamH I、KpnI和Xba I限制性酶切位点。

(2)重组质粒pEC-XK99E-tyrB和pEC-XK99E-aspB的构建

将经过EcoR I和BamH I双酶切纯化后的tyrB片段和经过Kpn I和Xba I双酶切纯化后的aspB片段分别与质粒pEC-XK99E连接，反应体系如下：质粒pEC-XK99E：tyrB/aspB基因＝1:3/1:4，T₄DNA连接酶1μL，T₄DNA Ligation Buffer 1μL，加dd H₂O至10μL，混合反应液，将其置于16℃金属浴中连接10h以上，转化E.coli JM109感受态细胞中，并涂布于50μg·mL^-1卡那霉素抗性平板中，从相应的抗性平板中挑取转化子进行PCR验证，将PCR验证正确的转化子分别提取质粒单、双酶切验证并测序鉴定，获得重组质粒pEC-XK99E-tyrB和pEC-XK99E-aspB。

(3)重组菌株C.glutamicum FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamicum FA-1△ilvE/pEC-XK99E-aspB的构建

将验证正确的重组质粒pEC-XK99E-tyrB和pEC-XK99E-aspB电击转化C.glutamicum FA-1 △ilvE，经含有25μg/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基筛选，再分别将转化子在含有50μg/mL卡那霉素的LBG固体培养基再次筛选，最终分别挑取转化子进行PCR验证，将验证正确的转化子分别接入LBG液体培养基，提取质粒验证，获得重组菌株C.glutamicum FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamicum FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB。

基于类似的方法，构建得到了重组菌株C.glutamicum ATCC 13032 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamicum ATCC 13032 △ilvE/pEC-XK99E-aspB。

实施例3：tyrB或aspB基因在E.coli BL21中的表达

分别将菌株E.coli BL21/pEC-XK99E-tyrB、E.coli BL21/pEC-XK99E-aspB和E.coli BL21/pEC-XK99E接种至液体培养基LB，IPTG诱导后收集菌体经超声波破碎后，上清液跑SDS-PAGE，检测到分子量约44kDa和47kDa的特异性条带(图2)，与报道的目标蛋白大小一致，说明tyrB和aspB基因可以在大肠杆菌中正确表达。

实施例4：不同菌株转氨酶酶活力的测定

转氨酶酶活力的测定：将C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamicum FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基中，培养至OD₆₀₀≈0.6时，添加终浓度为1mM IPTG于30℃振荡诱导培养8h。C.glutamiucm FA-1和C.glutamiucm FA-1 △ilvE接种于LBG液体培养基中，培养结束后，于4℃，12,000r/min冷冻离心20min收集菌体，随后将菌体悬浮于200mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中再次离心收集菌体，添加终浓度为20mg/mL的溶菌酶，37℃处理1h，菌悬液经超声破碎法制备粗酶液。加入30μL 50g/L高氯酸+38％(V/V)乙醇混合液来终止反应。反应体系：100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.25mmol/L PLP，5mmol/Lα-酮异己酸或α-酮异戊酸，10mmol/L谷氨酸钠；反应温度：30℃，反应时间20min。加入30μL 50g/L高氯酸终止反应。一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟催化生成1μmol L-亮氨酸所需的酶量。通过加入20mmol/L K₂CO₃离心样品以除去蛋白质和盐(12,000r/min，10min，4℃)。随后，通过高压液相色谱(HPLC)测定L-亮氨酸和L-缬氨酸。结果如图3所示，从图中可以看出菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamicum FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB具有亮氨酸酶活没有缬氨酸酶活，说明了基因tyrB和aspB在C.glutamicum FA-1 △ilvE中成功表达并具有亮氨酸活性。

实施例5：发酵生产支链氨基酸

菌株C.glutamiucm FA-1、C.glutamiucm FA-1 △ilvE、C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB发酵生产支链氨基酸。

培养基：①种子培养基(g/L)：葡萄糖30，玉米浆25，(NH₄)₂SO₄ 5，KH₂PO₄·3H₂O1.3，MgSO₄·7H₂O 0.4，MnSO₄·H₂O 0.01，L-蛋氨酸0.4，VB1 300μg，VH 200μg，柠檬酸钠10，尿素2，酵母膏10，CaCO₃ 20，pH 7.0，121℃灭菌20min；②发酵培养基(g/L)：葡萄糖135，玉米浆25，(NH₄)₂SO₄ 15，CH₃COONH₄，KH₂PO₄·3H₂O 1.3，MgSO₄·7H₂O 0.4，MnSO₄·H₂O 0.01，L-蛋氨酸0.7，L-异亮氨酸0.06，L-谷氨酸0.5，VB1 160μg，VH 50μg，柠檬酸钠2，尿素2，CaCO₃30，pH 7.0，115℃灭菌10min。

所述发酵培养基中添加0.6g/L L-缬氨酸和0.6g/L L-亮氨酸培养C.glutamiucmFA-1 △ilvE、C.glutamiucm FA-1△ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamiucm FA-1△ilvE/pEC-XK99E-aspB。

将上述经验证的重组菌C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB、C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB及C.glutamiucm FA-1和C.glutamiucm FA-1△ilvE分别进行摇瓶发酵实验，从新鲜活化的LBG液体培养基中以1％接种量于种子培养基中(50mL/500mL)，30℃，100r/min往复式摇床培养12-18h；种子培养基以5％接种量，接种于发酵培养基中，30-32℃，100r/min往复式摇床培养72h，分时间区段测定支链氨基酸、葡萄糖及生物量，结果与对照菌株C.glutamiucm FA-1相比，结果如图4所示。从图4中可以看出菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE的葡萄糖消耗能力下降，由于葡萄糖到氨基酸的通路受到阻碍，发酵液中残留较多的葡萄糖。菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamiucm FA-1△ilvE/pEC-XK99E-aspB发酵结束后，均有亮氨酸产量并且残留的葡萄糖较少，L-亮氨酸产量分别达18.55±0.45和20.81±0.02g/L，高于敲除菌株C.glutamiucmFA-1 △ilvE的3.63±0.72g/L；另外这两株重组菌株的L-缬氨酸产量为分别为0.92±0.04和0.81±0.02g/L，与敲除菌株相比没有什么变化，说明了基因tyrB和aspB的参与亮氨酸的合成，对缬氨酸没有催化活性。

此外，分别采用高效液相色谱仪和氨基酸分析仪测定重组菌C.glutamiucm FA-1△ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB及菌株C.glutamiucm FA-1和C.glutamiucm FA-1 △ilvE中副产物积累情况(包括有机酸和氨基酸)，结果如图5所示，原始菌株C.glutamiucm FA-1发酵液中杂酸较少，由于ilvE基因的敲除导致杂酸含量有不同程度的增加，两株重组菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB发酵液中也含有较多的丙氨酸，说明在C.glutamiucm FA-1 △ilvE中过表达转氨酶基因，不同菌株的葡萄糖代谢能力得到强化，亮氨酸产量有所提高，但是会影响副产物的合成。

采用相同的方法，分析了重组菌株C.glutamicum ATCC 13032 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamicum ATCC 13032 △ilvE/pEC-XK99E-aspB发酵生产支链氨基酸的情况。结果显示：菌株C.glutamiucm ATCC 13032 △ilvE/pEC-XK99E-tyrB和C.glutamiucmATCC 13032△ilvE/pEC-XK99E-aspB发酵结束后，均有亮氨酸产量并且残留的葡萄糖较少，L-亮氨酸产量分别达12.22±0.23和13.56±0.04g/L，高于敲除菌株C.glutamiucm ATCC13032 △ilvE的2.99±0.48g/L。

对比例1：大肠杆菌中的天冬氨酸转氨酶AspC对支链氨基酸的影响

以E.coli W3110基因组为模板，以aspC-F/aspC-R为引物进行PCR扩增反应，获得aspC片段。将PCR产物aspC胶回收后与pEC-XK99E同时用EcoR I和BamH I双酶切，酶切之后纯化的产物aspC和质粒pEC-XK99E通过酶连，获得重组质粒pEC-XK99E-aspC。将构建成功的质粒电转入C.glutamiucm FA-1 △ilvE，验证正确的重组菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspC分别进行摇瓶发酵实验，分时间区段测定支链氨基酸、葡萄糖及生物量，结果发现在C.glutamiucm FA-1 △ilvE菌株中过表达来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶，发酵结束后，亮氨酸和缬氨酸的产量相对于C.glutamiucm FA-1 △ilvE没有变化，说明该酶对亮氨酸和缬氨酸没有催化作用(图6)。

上述所使用的大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶序列如SEQ ID NO:7所示。

对比例2：枯草芽孢杆菌的天冬氨酸转氨酶AspB对支链氨基酸的影响

以B.subtilis168基因组为模板，以aspB-F/aspB-R为引物进行PCR扩增反应，获得aspB片段。将PCR产物aspB胶回收后与pEC-XK99E同时用Kpn I和Xba I双酶切，酶切之后纯化的产物aspB和质粒pEC-XK99E通过酶连，获得重组质粒pEC-XK99E-aspB。将构建成功的质粒电转入C.glutamiucm FA-1 △ilvE，验证正确的重组菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE/pEC-XK99E-aspB分别进行摇瓶发酵实验，分时间区段测定支链氨基酸、葡萄糖及生物量，结果与对照菌株C.glutamiucm FA-1 △ilvE相比，结果如图6所示，在C.glutamiucm FA-1 △ilvE菌株中过表达来自枯草芽孢杆菌的天冬氨酸转氨酶，亮氨酸和缬氨酸的产量相对于C.glutamiucm FA-1 △ilvE没有变化，说明该酶对亮氨酸和缬氨酸没有催化活性。

上述所使用的枯草芽孢杆菌的天冬氨酸转氨酶序列如SEQ ID NO:8所示。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 397

<212> PRT

<213> tyrB

<400> 1

Val Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu

1 5 10 15

Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser

20 25 30

Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gln Leu Gln Ala

35 40 45

Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser

50 55 60

Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala Ile Ala

65 70 75 80

Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gln Gln Arg Val

85 90 95

Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala

100 105 110

Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp

115 120 125

Pro Thr Trp Glu Asn His Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu

130 135 140

Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe

145 150 155 160

Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val

165 170 175

Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn

180 185 190

Asp Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile

195 200 205

Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu

210 215 220

Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu

225 230 235 240

Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val

245 250 255

Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val

260 265 270

Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro

275 280 285

Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu

290 295 300

Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu

305 310 315 320

Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Lys Val Leu Ser Thr Glu Met Pro Glu

325 330 335

Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr

340 345 350

Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val

355 360 365

Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Thr Ala

370 375 380

Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met

385 390 395

<210> 2

<211> 1194

<212> DNA

<213> tyrB

<400> 2

gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt 60

aaagaagacc ctcgcagcga caaagtgaat ttaagtatcg gtctgtacta caacgaagac 120

ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct 180

catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg 240

ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa 300

acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg 360

gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc acgtagcaat attcgccggg 420

gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt 480

aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca 540

tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa 600

attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc 660

ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg 720

gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct 780

gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt 840

cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat 900

gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg 960

gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat 1020

tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac 1080

cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg 1140

ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa 1194

<210> 3

<211> 426

<212> PRT

<213> aspB

<400> 3

Met Ser Ser Val Ser Leu Gln Asp Phe Asp Ala Glu Arg Ile Gly Leu

1 5 10 15

Phe His Glu Asp Ile Lys Arg Lys Phe Asp Glu Leu Lys Ser Lys Asn

20 25 30

Leu Lys Leu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Pro Ser Ser Glu Gln Leu Asp

35 40 45

Phe Ala Asp Glu Leu Leu Ala Leu Pro Gly Lys Gly Asp Phe Lys Ala

50 55 60

Ala Asp Gly Thr Asp Val Arg Asn Tyr Gly Gly Leu Asp Gly Ile Val

65 70 75 80

Asp Ile Arg Gln Ile Trp Ala Asp Leu Leu Gly Val Pro Val Glu Gln

85 90 95

Val Leu Ala Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asn Ile Met Phe Asp Val Ile

100 105 110

Ser Trp Ser Tyr Ile Phe Gly Asn Asn Asp Ser Val Gln Pro Trp Ser

115 120 125

Lys Glu Glu Thr Val Lys Trp Ile Cys Pro Val Pro Gly Tyr Asp Arg

130 135 140

His Phe Ser Ile Thr Glu Arg Phe Gly Phe Glu Met Ile Ser Val Pro

145 150 155 160

Met Asn Glu Asp Gly Pro Asp Met Asp Ala Val Glu Glu Leu Val Lys

165 170 175

Asn Pro Gln Val Lys Gly Met Trp Val Val Pro Val Phe Ser Asn Pro

180 185 190

Thr Gly Phe Thr Val Thr Glu Asp Val Ala Lys Arg Leu Ser Ala Met

195 200 205

Glu Thr Ala Ala Pro Asp Phe Arg Val Val Trp Asp Asn Ala Tyr Ala

210 215 220

Val His Thr Leu Thr Asp Glu Phe Pro Glu Val Ile Asp Ile Val Gly

225 230 235 240

Leu Gly Glu Ala Ala Gly Asn Pro Asn Arg Phe Trp Ala Phe Thr Ser

245 250 255

Thr Ser Lys Ile Thr Leu Ala Gly Ala Gly Val Ser Phe Phe Leu Thr

260 265 270

Ser Ala Glu Asn Arg Lys Trp Tyr Thr Gly His Ala Gly Ile Arg Gly

275 280 285

Ile Gly Pro Asn Lys Val Asn Gln Leu Ala His Ala Arg Tyr Phe Gly

290 295 300

Asp Ala Glu Gly Val Arg Ala Val Met Arg Lys His Ala Ala Ser Leu

305 310 315 320

Ala Pro Lys Phe Asn Lys Val Leu Glu Ile Leu Asp Ser Arg Leu Ala

325 330 335

Glu Tyr Gly Val Ala Gln Trp Thr Val Pro Ala Gly Gly Tyr Phe Ile

340 345 350

Ser Leu Asp Val Val Pro Gly Thr Ala Ser Arg Val Ala Glu Leu Ala

355 360 365

Lys Glu Ala Gly Ile Ala Leu Thr Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Pro Leu

370 375 380

Arg Gln Asp Pro Glu Asn Lys Asn Leu Arg Leu Ala Pro Ser Leu Pro

385 390 395 400

Pro Val Glu Glu Leu Glu Val Ala Met Asp Gly Val Ala Thr Cys Val

405 410 415

Leu Leu Ala Ala Ala Glu His Tyr Ala Asn

420 425

<210> 4

<211> 1281

<212> DNA

<213> aspB

<400> 4

atgagttcag tttcgctgca ggattttgat gcagagcgaa ttggtttgtt ccacgaggac 60

attaagcgca agtttgatga gctcaagtca aaaaatctga agctggatct tactcgcggt 120

aagccttcgt cggagcagtt ggatttcgct gatgagttgt tggcgttgcc tggtaagggt 180

gatttcaagg ctgcggatgg tactgatgtc cgtaactatg gcgggctgga tggcatcgtt 240

gatattcgcc agatttgggc ggatttgctg ggtgttcctg tggagcaggt cttggcgggg 300

gatgcttcga gcttgaacat catgtttgat gtgatcagct ggtcgtacat tttcggtaac 360

aatgattcgg ttcagccttg gtcgaaggaa gaaaccgtta agtggatttg ccctgttccg 420

ggctatgatc gccatttctc catcacggag cgtttcggct ttgagatgat ttctgtgcca 480

atgaatgaag acggccctga tatggatgct gttgaggaat tggtgaagaa tccgcaggtt 540

aagggcatgt gggttgttcc ggtgttttct aacccgactg gtttcacggt gacagaagac 600

gtcgcaaagc gtctaagcgc aatggaaacc gcagctccgg acttccgcgt tgtgtgggat 660

aatgcctacg ccgttcatac gctgaccgat gaattccctg aggttatcga tatcgtcggg 720

cttggtgagg ccgctggcaa cccgaaccgt ttctgggcgt tcacttctac ttcgaagatc 780

actctcgcgg gtgcgggcgt gtcgttcttc ctcacctctg cggagaaccg caagtggtac 840

accggccatg cgggtatccg tggcattggc cctaacaagg tcaatcagtt ggctcatgcg 900

cgttactttg gcgatgctga gggagtgcgc gcggtgatgc gtaagcatgc tgcgtcgttg 960

gctccgaagt tcaacaaggt tctggagatt ctggattctc gccttgctga gtacggtgtc 1020

gcgcagtgga ctgtccctgc gggcggttac ttcatttccc ttgatgtggt tcctggtacg 1080

gcgtctcgcg tggctgagtt ggctaaggaa gccggcatcg cgttgacggg tgcgggttct 1140

tcttacccgc tgcgtcagga tccggagaac aaaaatctcc gtttggcacc gtcgctgcct 1200

ccagttgagg aacttgaggt tgccatggat ggcgtggcta cctgtgtgct gttggcagca 1260

gcggagcatt acgctaacta a 1281

<210> 5

<211> 367

<212> PRT

<213> ilvE

<400> 5

Met Thr Ser Leu Glu Phe Thr Val Thr Arg Thr Glu Asn Pro Thr Ser

1 5 10 15

Pro Asp Arg Leu Lys Glu Ile Leu Ala Ala Pro Lys Phe Gly Lys Phe

20 25 30

Phe Thr Asp His Met Val Thr Ile Asp Trp Asn Glu Ser Glu Gly Trp

35 40 45

His Asn Ala Gln Leu Val Pro Tyr Ala Pro Ile Pro Met Asp Pro Ala

50 55 60

Thr Thr Val Phe His Tyr Gly Gln Ala Ile Phe Glu Gly Ile Lys Ala

65 70 75 80

Tyr Arg His Ser Asp Glu Thr Ile Lys Thr Phe Arg Pro Asp Glu Asn

85 90 95

Ala Glu Arg Met Gln Arg Ser Ala Ala Arg Met Ala Met Pro Gln Leu

100 105 110

Pro Thr Glu Asp Phe Ile Lys Ala Leu Glu Leu Leu Val Asp Ala Asp

115 120 125

Gln Asp Trp Val Pro Glu Tyr Gly Gly Glu Ala Ser Leu Tyr Leu Arg

130 135 140

Pro Phe Met Ile Ser Thr Glu Ile Gly Leu Gly Val Ser Pro Ala Asp

145 150 155 160

Ala Tyr Lys Phe Leu Val Ile Ala Ser Pro Val Gly Ala Tyr Phe Thr

165 170 175

Gly Gly Ile Lys Pro Val Ser Val Trp Leu Ser Glu Asp Tyr Val Arg

180 185 190

Ala Ala Pro Gly Gly Thr Gly Asp Ala Lys Phe Ala Gly Asn Tyr Ala

195 200 205

Ala Ser Leu Leu Ala Gln Ser Gln Ala Ala Glu Lys Gly Cys Asp Gln

210 215 220

Val Val Trp Leu Asp Ala Ile Glu His Lys Tyr Ile Glu Glu Met Gly

225 230 235 240

Gly Met Asn Leu Gly Phe Ile Tyr Arg Asn Gly Asp Gln Val Lys Leu

245 250 255

Val Thr Pro Glu Leu Ser Gly Ser Leu Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys

260 265 270

Ser Leu Leu Gln Val Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Val Glu Glu Arg

275 280 285

Lys Ile Thr Thr Thr Glu Trp Glu Glu Asp Ala Lys Ser Gly Ala Met

290 295 300

Thr Glu Ala Phe Ala Cys Gly Thr Ala Ala Val Ile Thr Pro Val Gly

305 310 315 320

Thr Val Lys Ser Ala His Gly Thr Phe Glu Val Asn Asn Asn Glu Val

325 330 335

Gly Glu Ile Thr Met Lys Leu Arg Glu Thr Leu Thr Gly Ile Gln Gln

340 345 350

Gly Asn Val Glu Asp Gln Asn Gly Trp Leu Tyr Pro Leu Val Gly

355 360 365

<210> 6

<211> 1104

<212> DNA

<213> ilvE

<400> 6

atgacgtcat tagagttcac agtaacccgt accgaaaatc cgacgtcacc cgatcgtctg 60

aaggaaattc ttgccgcacc gaagttcggt aagttcttca ccgaccacat ggtgaccatt 120

gactggaacg agtcggaagg ctggcacaac gcccaattag tgccatacgc gccgattcct 180

atggatcctg ccaccaccgt attccactac ggacaggcaa tttttgaggg aattaaggcc 240

taccgccatt cggacgaaac catcaagact ttccgtcctg atgaaaacgc cgagcgtatg 300

cagcgttcag cagctcgaat ggcaatgcca cagttgccaa ccgaggactt tattaaagca 360

cttgaactgc tggtagacgc ggatcaggat tgggttcctg agtacggcgg agaagcttcc 420

ctctacctgc gcccattcat gatctccacc gaaattggct tgggtgtcag cccagctgat 480

gcctacaagt tcctggtcat cgcatcccca gtcggcgctt acttcaccgg tggaatcaag 540

cctgtttccg tctggctgag cgaagattac gtccgcgctg cacccggcgg aactggtgac 600

gccaaatttg ctggcaacta cgcggcttct ttgcttgccc agtcccaggc tgcggaaaag 660

ggctgtgacc aggtcgtatg gttggatgcc atcgagcaca agtacatcga agaaatgggt 720

ggcatgaacc ttgggttcat ctaccgcaac ggcgaccaag tcaagctagt cacccctgaa 780

ctttccggct cactacttcc aggcatcacc cgcaagtcac ttctacaagt agcacgcgac 840

ttgggatacg aagtagaaga gcgaaagatc accaccaccg agtgggaaga agacgcaaag 900

tctggcgcca tgaccgaggc atttgcttgc ggtactgcag ctgttatcac ccctgttggc 960

accgtgaaat cagctcacgg caccttcgaa gtgaacaaca atgaagtcgg agaaatcacg 1020

atgaagcttc gtgaaaccct caccggaatt cagcaaggaa acgttgaaga ccaaaacgga 1080

tggctttacc cactggttgg ctaa 1104

<210> 7

<211> 1191

<212> DNA

<213> aspC

<400> 7

atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60

cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120

ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180

accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240

ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300

ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360

aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420

ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480

gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540

tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600

tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660

ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720

gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780

gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840

gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900

gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960

atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020

atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080

ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140

acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191

<210> 8

<211> 1182

<212> DNA

<213> AspB

<400> 8

ttgaaactgg caaaaagagt atccgcatta acaccatcaa ccacactggc aatcacagcg 60

aaagcgaaag aactgaaagc cgcaggccat gatgtcatcg gcttaggagc aggcgagcct 120

gacttcaata caccgcagca tattattgat gccgctgtgc gttcgatgaa cgagggccat 180

acgaaataca cgccttccgg tggtttggct gaactgaaaa acagcattgc agagaaattt 240

aaacgcgacc agaatattga atacaaaccg tctcaaatta ttgtctgcac tggtgccaaa 300

catgctctgt ataccctttt ccaagtgatt ttggatgaag aagatgaagt tattattcca 360

acgccttact gggtaagcta cccggagcag gtgaaactcg ctggcggaaa gcctgtttat 420

gtagaagggc ttgaggaaaa tcacttcaaa atttcgcctg agcagctgaa aaatgcaatt 480

acggaaaaaa caaaagcaat cgttattaac tctccaagca acccgactgg tgtcatgtat 540

acggaagaag aactatctgc gctcggtgaa gtgtgccttg aacatgatat cttgattgtg 600

tcagatgaaa tttatgaaaa acttacatac ggcggaaaga aacatgtttc cattgcacag 660

ctgtcagaca gactgaaaga gcaaacggtc attataaacg gcgtatcgaa gtcccacagc 720

atgacaggct ggagaatcgg ttatgcggca ggctctgaag acattattaa agcgatgacg 780

aaccttgcaa gccacagcac gtcaaacccg acatcaatcg cacaatacgg agcgattgct 840

gcttataacg ggccttctga gccattggaa gaaatgagag aagcatttga acatagatta 900

aatacgatct atgcaaagct catagaaatc ccagggttca gctgcgtgaa gccggaaggt 960

gctttttact tgttcccaaa tgcaaaagag gcagctcaat cttgcggttt caaagatgta 1020

gatgaatttg ttaaagcgct tctcgaggag gaaaaagttg cgattgttcc aggatccgga 1080

tttggctctc ctgagaatgt ccgtctttct tatgcaacat cgttagatct tcttgaagaa 1140

gccattgaaa gaatcaagcg ttttgtagaa aaacatagct aa 1182

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tcccccgggc aagcctagcc attcctc 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gctctagacg tctaccagca gttcaag 27

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gctctagatg ggatacgaag tagaagagc 29

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acgcgtcgac tttccaaccg tcagctg 27

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

atgacgtcat tagagttca 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ggtcttaaaa ccggttgat 19

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ggaattctgg agaaccatcg catgtttc 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

cgggatccta atttcactgc aggctggg 28

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ggggtaccat gagttcagtt tcgctgc 27

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gctctagatc tccgctgtat tcacttttag 30

Claims

1.只产一种支链氨基酸的谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是在谷氨酸棒杆菌的基础上敲除了支链氨基酸转氨酶基因，并且过表达了芳香族氨基酸转氨酶或者天冬氨酸转氨酶。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述芳香族氨基酸转氨酶来源于大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述天冬氨酸转氨酶来源于谷氨酸棒杆菌。

4.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述芳香族氨基酸转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求1或3所述的重组菌，其特征在于，所述天冬氨酸转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum FA-1为宿主构建得到的。

7.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述过表达是以pEC-XK99E作为表达载体。

8.一种发酵生产L-亮氨酸的方法，所述方法利用权利要求1-7任一所述的重组菌。

9.权利要求1-7任一所述的重组菌的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是应用在饲料工业、医药工业或食品工业中。