CN109868254A - 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents
一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种高产泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过(1)强化大肠杆菌D‑泛酸合成途径的最后一步，增强大肠杆菌对胞外β‑丙氨酸的利用能力，(2)强化泛解酸合成途径，(3)修复ilvG基因，减弱副产物对泛解酸合成途径的反馈抑制作用，(4)根据细胞表型变化，削弱缬氨酸合成途径的通量，得到D‑泛酸高产的大肠杆菌基因工程菌株。本发明强化D‑泛酸生物生成途径中关键酶PanB、PanC、PanE和IlvC的表达，通过修复ilvG基因削弱反馈调控和强化泛解酸合成途径，使D‑泛酸和缬氨酸在胞外积累分别达到0.48g/L和0.51g/L，通过敲除avtA和敲降ilvE对竞争支路进行削弱得到一株无质粒高产菌，D‑泛酸效价从0.48g/L提高到1.54g/L。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种高产泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
(二)背景技术
D-泛酸作为辅酶A的组成物质参与调节蛋白质、糖和脂肪的代谢，改善毛发色泽并预防疾病。特别是家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成和分解，都不可缺少对泛酸钙的需求。缺乏泛酸会导致家禽、家畜生长迟缓、生殖机能发生障碍、适应性降低。D-泛酸钙作为B族维生素，在国内外广泛应用于医药工业，其单方制剂主要适应症为泛酸缺乏症，复合维生中B和多种维生素制剂主要用于补充维生素，而与不同组分配伍的复方制剂适应症更广，如胃肠道疾病、呼吸道疾病、皮肤病、精神不振、神经衰弱等。另外，泛酸钙还用于保健食品。目前国内外很多保健品都添加泛酸钙，如养生堂的“成人维生素”、“成长快乐”等。泛酸钙在此领域的消费需求增长最快。
现有的D-泛酸生产方法是化学合成法与酶法相结合，异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合形成羟基特戊醛，再添加氢氰酸，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到DL-泛解酸内酯，DL-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯水解酶水解，留下D-泛解酸内酯，产生的L-泛解酸再经化学内酯、外消旋转为DL-泛解酸内酯。得到的D-泛解酸内酯与β-氨基丙酸钙缩合直接制得D-泛酸钙。综合考虑D-泛酸现有生产方法的回收率和环境因素，以可再生的廉价基质用微生物发酵生产D-泛酸受到越来越多的关注。
随着对微生物代谢过程的不断了解，以及代谢工程技术的日益发展，使用葡萄糖等廉价可再生物为原料来生产包括D-泛酸在内的多种有机物具备广阔的生产前景。但是，由于野生型菌株因为自身的细胞经济性，胞内的D-泛酸生物合成途径受限于竞争途径以及辅因子供给，所以生物法生产D-泛酸最重要的是得到适当的D-泛酸高产微生物。高产D-泛酸微生物的获得可以通过传统诱变筛选和代谢工程技术。在代谢工程改造过程中，由于不同的代谢途径之间存在非线性的关联，以及辅因子的与主代谢途径的竞争和协作关系，往往要从多角度来进行代谢工程改造。
微生物体内的D-泛酸生物合成比较复杂，它最后一步合成是在泛酸合成酶(panC)的催化下进行：一分子泛解酸和一分子β-丙氨酸消耗一分子ATP形成一分子泛酸。其中β-丙氨酸来源于天冬氨酸脱羧酶(panD)的催化作用，而泛解酸来源于缬氨酸合成途径的中间体α-酮异戊酸，α-酮异戊酸首先在羟甲基转移酶(panB)作用下生成酮泛解酸，后者在酮泛解酸还原酶(panE)或者酮酸还原异构酶(ilvC)作用下还原生成泛解酸。α-酮异戊酸则由由丙酮酸经乙酰乳酸合成酶(ilvGM，ilvBN，ilvHI)、酮酸还原异构酶(ilvC)和二羟基酸脱水酶(ilvD)三步反应得到。除了主要合成途径(天冬氨酸到β-丙氨酸，丙酮酸到泛解酸)之外，D-泛酸的生物合成还跟NADPH和亚甲基四氢叶酸的供给相关，同时缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成支路对D-泛酸的生物合成有着强烈的竞争作用，选择削弱竞争支路是一种较好的菌种优化策略。但这种优化与通常情况下细胞为获得最大的生长速率的自我协调是矛盾的。基于以上理由，过去对D-泛酸的发酵生产尚未有深入细致的研究。但是随着技术理念的发展，以及近年来化学法生产受限于环保和成本问题，所以D-泛酸的发酵法生产也越来越具有可行性。
有关D-泛酸的发酵法生产，事实上主要是通过构建泛解酸高产菌株，然后通过外源添加β-丙氨酸的方式来生产D-泛酸，在专利EP0590857A2所述通过对一株缬氨酸高产菌株IFO3547进行紫外和亚硝基胍诱变，然后通过多种含有机酸的选择培养基筛选得到泛解酸高产菌株，仅管最终产量达到66g/L，但其遗传背景并不明朗。在Degussa AG的一系列专利US6313912、US6689592、US6686183、US6682915、US662394和US6787334中，他们选用US6171845中的一株抗缬氨酸菌株FE6进行了一系列改造，虽然未见高产菌株报道，但提出一些有利于D-泛酸积累的改造，如：panBCD的过表达有利于D-泛酸积累，一碳单位的强化也有利于D-泛酸积累。而BASF和DSM公司则选用枯草芽孢杆菌进行改造，但同样也没有高产菌株报道，但同样涉及到一碳单位的改造和关键基因的过表达。除此之外，还有很多关于α-酮异戊酸生成等相关的有利于提高D-泛酸发酵效价的专利报道。
(三)发明内容
本发明的目的在于代谢工程和基因编辑技术，提供一种高产泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种高产泛酸的基因工程菌，由如下方法构建而成：
(1)将底盘菌E.coli W3110基因组中的panC、panB、panE和ilvC基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)；
(2)在E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)基因组中修复ilvG基因，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(3)将E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中avtA基因敲除，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(4)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中上ilvE基因的起始密码子ATG替换为GTG，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)，即所述高产泛酸的基因工程菌。
优选的，所述菌株为Escherichia coli ZJB18003，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，保藏日期：2018年12月21日，保藏编号：CCTCC NO：M 2018914。该菌株D-泛酸效价可达1.54g/L。
本发明通过(1)强化大肠杆菌D-泛酸合成途径的最后一步，增强大肠杆菌对胞外β-丙氨酸的利用能力，(2)强化泛解酸合成途径，(3)修复ilvG基因，减弱副产物对泛解酸合成途径的反馈抑制作用，(4)根据细胞表型变化，削弱缬氨酸合成途径的通量，得到D-泛酸高产的大肠杆菌基因工程菌株。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)应用CRISPR-Cas9基因编辑将底盘菌E.coli W3110基因组中的panC、panB、panE和ilvC基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑在E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)基因组中修复ilvG基因，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中avtA基因敲除，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvCilvG*)中上ilvE基因的起始密码子ATG替换为GTG，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)，即所述高产泛酸的基因工程菌。
具体的，所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ilvG基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ilvE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有Amp的发酵培养基中，25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至24～48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO40.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/LCuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
通常，所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明改造了大肠杆菌的D-泛酸合成网络和竞争支路，通过用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列置换panC、panE、panB和ilvE的原有启动子，增强胞内泛解酸合成以及D-泛酸合成途径。通过对大肠杆菌由于移码突变而不能正常表达的ilvG进行修复，得到能正常表达的ilvG*，而其所编码的乙酰乳酸合酶II是对缬氨酸不敏感的，功能性ilvG使缬氨酸和泛酸都有较大积累，运用CRISPR-Cas9将基因组上ilvE基因的起始密码子ATG置换为GTG使其表达量下降，减少亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸合成途径对碳流的争夺，通过敲除avtA减少缬氨酸合成途径对D-泛酸合成途径的竞争。
本发明用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列在基因组中同时置换了panC(编码泛酸合成酶)，panB(编码羟甲基转移酶)，panE(编码酮泛解酸还原酶)和ilvC(编码酮酸还原异构酶)原有的启动子和RBS序列，强化了泛解酸合成路径和利用β-丙氨酸的能力，构建W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)。
本发明修复了ilvG(编码乙酰乳酸合成酶)，强化了泛解酸合成途径和减弱了缬氨酸对α-酮异戊酸合成途径的反馈抑制作用，构建W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)。
本发明敲除了avtA基因(编码缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶)，削弱了缬氨酸代谢支路，构建W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)。
本发明敲降了ilvE基因(编码支链氨基酸氨基转移酶)，削弱了缬氨酸，异亮氨酸和亮氨酸代谢支路，构建W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明强化D-泛酸生物生成途径中关键酶PanB、PanC、PanE和IlvC的表达，通过修复ilvG基因削弱反馈调控和强化泛解酸合成途径，使D-泛酸和缬氨酸在胞外积累分别达到0.48g/L和0.51g/L，通过敲除avtA和敲降ilvE对竞争支路进行削弱得到一株无质粒高产菌，D-泛酸效价从0.48g/L提高到1.54g/L。
(四)附图说明
图1为基因组编辑操作流程；
图2为D-泛酸代谢途径图和改造位点；
图3为W3110(Trc-panC)的OD600和D-泛酸效价变化；
图4为W3110(Trc-panCpanE)的OD600和D-泛酸效价变化；
图5为W3110(Trc-panCpanEpanB)的OD600和D-泛酸效价变化；
图6为W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)的OD600和D-泛酸效价变化；
图7为W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)的OD600和D-泛酸效价变化；
图8为W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)的OD600和D-泛酸效价变化；
图9为W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)的OD600和D-泛酸效价变化。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述氨苄霉素在培养基中终浓度为0.10mg/L。
本发明所述亲本菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli GeneticStock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US2009/0298135A1，US 2010/0248311A1中公开。
实施例1-9中使用的引物序列信息如表2所示，
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
表2：引物序列
下划线为pT-X-1(2)携带基因组上基因X所含PAM位点(NGG)前20bp序列。
实施例1：D-泛酸含量的HPLC测定
检测方法如下：
色谱条件：C18柱(250×4.6mm,particle size 5μm,Agilent Technologies Co.,Santa Clara,CA,USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
数据采集时间：18min。
实施例2：有效利用胞外β-丙氨酸菌株W3110(Trc-panC)的构建及摇瓶发酵
以Escherichia coli W3110为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术如图1(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichia coli Genome viathe CRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，用来源于pTrc99A的trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，在基因组替换panC(GeneID：12932172)的原有启动子，以增强panC的表达强度。
(1)构建pTarget-panC质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-panC-1/pTarget-panC-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-panC质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-panC质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-panC-1与pTD-panC-2为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，pTD-panC-3和pTD-panC-4为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)，胶回收纯化PCR片段得到F1和F2；pTarget-panC质粒经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-panC质粒、片段F1和F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-panC质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110中，转接单克隆到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD6000.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(MolecularCloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取200ng pTD-panC质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2-3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养12-16h，以T-panC-up和Trc-down为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段600bp左右的片段，则证明是W3110(Trc-panC)阳性菌落。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-panC质粒成功消除，挑取pTarget-panC质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒W3110(Trc-panC)。
(6)将W3110(Trc-panC)，以E.coli W3110为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1mL预培养物到装有20mL的MS培养基的500mL摇瓶中，然后在30℃、150rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液测定OD600，取1mL发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释10倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图3所示。
由图可见，基因组替换panC基因启动子，会对细胞生长有有一定抑制作用，细胞OD600从36降低到24，而D-泛酸效价从4mg/L增加到25mg/L，这说明panC表达的增强可有效增加胞内对胞外β-丙氨酸的利用，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、β-丙氨酸2.5g/L、CaCO3 10g/L(单独灭菌)、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/LCuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
实施例3：高表达酮泛解酸还原酶菌株W3110(Trc-panCpanE)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-panE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-panE-1/pTarget-panE-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-panE质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-panE质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-panE-1、pTD-panE-2、pTD-panE-3和pTD-panE-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-panE质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的W3110(Trc-panC)感受态中，W3110(Trc-panC)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(Trc-panCpanE)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(Trc-panCpanE)。
(6)将构建的W3110(Trc-panCpanE)生产菌株以实施例2构建的W3110(Trc-panC)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图4所示。
由图可见，基因组替换panE基因(GeneID：12933987)启动子对细胞生长有轻微抑制作用，但D-泛酸效价从25mg/L增加到84mg/L，这说明panE表达的强化可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例4：高表达羟甲基转移酶菌株W3110(Trc-panCpanEpanB)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-panB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-panB-1/pTarget-panB-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-panB质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-panB质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-panB-1、pTD-panB-2、pTD-panB-3和pTD-panB-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-panB质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的W3110(Trc-panCpanE)感受态中，W3110(Trc-panCpanE)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(Trc-panCpanEpanB)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(Trc-panCpanEpanB)。
(6)将构建的W3110(Trc-panCpanEpanB)生产菌株以实施例3构建的W3110(Trc-panCpanE)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图5所示。
由图可见，基因组替换panB基因(GeneID：12932389)启动子对细胞生长有轻微抑制作用，但D-泛酸效价从84mg/L增加到300mg/L，这说明panB基因在泛酸合成中扮演关键角色，其强化其表达可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例5：高表达酮酸异构还原酶菌株W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-ilvC质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ilvC-1/pTarget-ilvC-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ilvC质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvC质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvC-1、pTD-ilvC-2、pTD-ilvC-3和pTD-ilvC-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvC质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的W3110(Trc-panCpanEpanB)感受态中，W3110(Trc-panCpanEpanB)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)。
(6)将构建的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)生产菌株以实施例4构建的W3110(Trc-panCpanEpanB)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图6所示。
由图可见，基因组替换ilvC基因(GeneID：12934337)启动子对细胞生长有轻微抑制作用，但D-泛酸效价从300mg/L增加到414mg/L，这说明ilvC表达的强化可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例6：缺陷基因ilvG的修复菌株W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)的构建及摇瓶发酵
以W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichia coli Genome viathe CRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，通过在移码突变位点(979和980)附近找寻NGG得到在pTarget设计20bp序列与移码突变位点周围碱基相互匹配，在donorDNA上插入缺失的AT并用同义密码子替换包括NGG及前20bp碱基序列(替换后ilvG核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)，修复ilvG。
(1)构建pTarget-ilvG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ilvG-1/pTarget-ilvG-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ilvG质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvG质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvG-1、pTD-ilvG-2、pTD-ilvG-3和pTD-ilvG-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvG质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例5获得的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)感受态中，W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(Trc-panCpanEpanBilvCilvG*)。
(6)将构建的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)生产菌株以实施例5构建的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图7所示。
由图可见，在基因组修复缺陷基因ilvG(GeneID：12933612)对细胞生长有一定促进作用，ilvG的正常表达可以减轻一部分代谢压力，可有效增强胞内α-酮异戊酸的合成且受较小的反馈抑制作用，增加D-泛酸合成中间体α-酮异戊酸的合成从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成，D-泛酸最终效价由0.41g/L增加到0.49g/L。
实施例7：缬氨酸合成弱化菌株W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-avtA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-avtA-1/pTarget-avtA-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-avtA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-avtA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-avtA-1、pTD-avtA-2、pTD-avtA-3和pTD-avtA-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-avtA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例6获得的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)感受态中，W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)。
(6)将构建的W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)生产菌株以实施例6构建的W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图8所示。
由图可见，基因组敲除avtA基因(GeneID：12930377)对细胞生长有轻微抑制作用，实施例6对ilvG基因进行修复导致α-酮异戊酸合成旺盛，而avtA的敲除将减少α-酮异戊酸往竞争支路缬氨酸合成途径的通量，从而增加泛解酸通路的碳流，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成，D-泛酸最终效价由0.49g/L增加到0.91g/L。。
实施例8：支链氨基酸合成弱化菌株W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)的制备
以W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，通过在起始密码子ATG附近找寻NGG得到在pTarget设计20bp序列与移码突变位点周围碱基相互匹配，在donorDNA上将ATG替换换为GTG并用同义密码子替换包括NGG及前20bp碱基序列(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，降低ilvE的表达。
(1)构建pTarget-ilvE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ilvE-1/pTarget-ilvE-2为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ilvE质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvE质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvE-1、pTD-ilvE-2、pTD-ilvE-3和pTD-ilvE-4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvE质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例7获得的W3110(△avtATrc-panCpanEpanBilvC ilvG*)感受态中，W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)。
(6)将构建的W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)生产菌株(CCTCCNO：M 2018914)以实施例7构建的W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)为对照组，按照实施例2方法进行摇瓶测试及检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图9所示。
由图可见，基因组敲降ilvE基因(GeneID：12932278)对细胞生长有轻微抑制作用，可有效弱化泛解酸合成途径的竞争支路(缬氨酸合成途径、亮氨酸合成途径和异亮氨酸合成途径)，增加泛解酸通路的碳流，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成，D-泛酸最终效价由0.91g/L增加到1.54g/L。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 2
<211> 1647
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgaatggcg cacagtgggt ggtacatgcg ttgcgggcac agggtgtgaa caccgttttc 60
ggttatccgg gtggcgcaat tatgccggtt tacgatgcat tgtatgacgg cggcgtggag 120
cacttgctat gccgacatga gcagggtgcg gcaatggcgg ctatcggtta tgctcgtgct 180
accggcaaaa ctggcgtatg tatcgccacg tctggtccgg gcgcaaccaa cctgataacc 240
gggcttgcgg acgcactgtt agattccatc cctgttgttg ccatcaccgg tcaagtgtcc 300
gcaccgttta tcggcactga cgcatttcag gaagtggatg tcctgggatt gtcgttagcc 360
tgtaccaagc acagctttct ggtgcagtcg ctggaagagt tgccgcgcat catggctgaa 420
gcattcgacg ttgcctgctc aggtcgtcct ggtccggttc tggtcgatat cccaaaagat 480
atccagttag ccagcggtga cctggaaccg tggttcacca ccgttgaaaa cgaagtgact 540
ttcccacatg ccgaagttga gcaagcgcgc cagatgctgg caaaagcgca aaaaccgatg 600
ctgtacgttg gcggtggcgt gggtatggcg caggcagttc cggctttgcg tgaatttctc 660
gctgccacaa aaatgcctgc cacctgtacg ctgaaagggc tgggcgcagt agaagcagat 720
tatccgtact atctgggcat gctggggatg cacggcacca aagcggcaaa cttcgcggtg 780
caggagtgtg acctgctgat cgccgtgggc gcacgttttg atgaccgggt gaccggcaaa 840
ctgaacacct tcgcgccaca cgccagtgtt atccatatgg atatcgaccc ggcagaaatg 900
aacaagctgc gtcaggcaca tgtggcatta caaggtgatt taaatgctct gttaccagca 960
ttacagcagc cgctgaacat taacgattgg cagcaacact gcgcgcagct gcgtgatgaa 1020
cattcctggc gttacgacca tcccggtgac gctatctacg cgccgttgtt gttaaaacaa 1080
ctgtcggatc gtaaacctgc ggattgcgtc gtgaccacag atgtggggca gcaccagatg 1140
tgggctgcgc agcacatcgc ccacactcgc ccggaaaatt tcatcacctc cagcggttta 1200
ggtaccatgg gttttggttt accggcggcg gttggcgcac aagtcgcgcg accgaacgat 1260
accgttgtct gtatctccgg tgacggctct ttcatgatga atgtgcaaga gctgggcacc 1320
gtaaaacgca agcagttacc gttgaaaatc gtcttactcg ataaccaacg gttagggatg 1380
gttcgacaat ggcagcaact gttttttcag gaacgataca gcgaaaccac ccttactgat 1440
aaccccgatt tcctcatgtt agccagcgcc ttcggcatcc atggccaaca catcacccgg 1500
aaagaccagg ttgaagcggc actcgacacc atgctgaaca gtgatgggcc atacctgctt 1560
catgtctcaa tcgacgaact tgagaacgtc tggccgctgg tgccgcctgg cgccagtaat 1620
tcagaaatgt tggagaaatt atcatga 1647
<210> 3
<211> 930
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
gtgaccacca aaaaggcaga ctatatctgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60
gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120
cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180
ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240
gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat ccgtccgctg 300
atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360
attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420
gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480
gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540
caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600
tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660
attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720
gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatgtccgg tacggcggca 780
gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840
gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900
tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930
Claims (8)
1.一种高产泛酸的基因工程菌，由如下方法构建而成：
(1)将底盘菌E.coli W3110基因组中的panC、panB、panE和ilvC基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)；
(2)在E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)基因组中修复ilvG基因，得到E.coliW3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(3)将E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中avtA基因敲除，得到E.coliW3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(4)将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中上ilvE基因的起始密码子ATG替换为GTG，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)，即所述高产泛酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的高产泛酸的基因工程菌，其特征在于所述菌株为Escherichiacoli ZJB18003，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，保藏日期：2018年12月21日，保藏编号：CCTCC NO：M2018914。
3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)应用CRISPR-Cas9基因编辑将底盘菌E.coli W3110基因组中的panC、panB、panE和ilvC基因的启动子替换为trc启动子，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑在E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC)基因组中修复ilvG基因，得到E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110(Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)中avtA基因敲除，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*)；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvCilvG*)中上ilvE基因的起始密码子ATG替换为GTG，得到E.coli W3110(△avtA Trc-panCpanEpanBilvC ilvG*ilvE*)，即所述高产泛酸的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ilvG基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ilvE基因核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
5.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有Amp的发酵培养基中，25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至24～48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
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