CN103555779A

CN103555779A - 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法

Info

Publication number: CN103555779A
Application number: CN201310331785.6A
Authority: CN
Inventors: 史锋; 江君君; 李永富; 李烨
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-08-01
Also published as: CN103555779B

Abstract

本发明公开了利用一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，是将两种谷氨酸脱羧酶基因gadB1，gadB2构建共表达载体导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用基因工程菌表达的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出γ-氨基丁酸。通过对种子培养基、发酵培养基和发酵条件优化，尤其是尿素在6-24小时内间断补加，大大提高了GABA的产量和谷氨酸转化率。本发明不仅将谷氨酸的积累和GABA的合成简化为一步发酵，简化了GABA生产过程、降低了生产成本；而且后期发酵优化明显提高了GABA的产量，使得L-谷氨酸的转化率达到74%，再次验证此生产方法的可行性和优势，为工业化应用打下良好基础。

Description

一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，特别是一种使用基因工程菌高效生产γ-氨基丁酸的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，简称GABA），由谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,简称GAD）催化谷氨酸（Glutamic acid，Glu）的α-脱羧反应生成，为哺乳动物中枢神经系统一种重要的抑制性神经递质，广泛存在自然界中，具有多种生理功能。目前已报道的生理功能包括调节血压与心率、辅助治疗哮喘、促使精神安定、增进脑活力、促进生长激素分泌、活化肝肾功能、促进乙醇代谢（醒酒）、改善更年期综合症等多种功效。鉴于GABA具有众多的生理功能，现在GABA已被作为一种新型功能因子广泛应用于食品、医药和农业等行业。

目前工业上GABA作为一种安全级食品添加剂主要是通过植物富集和生物法合成获得。由于植物富集的含量很低，因此通过筛选安全级菌株，并利用其生物体内的谷氨酸脱羧酶作为催化剂来合成GABA具有获得高产的优势，在这个领域中目前很多工业生产集中于将筛选的乳酸菌进行一系列处理，GABA的产量可达130g/L。此外，利用基因工程技术过量表达谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量的研究已有相关报道。在这个研究领域中，主要是将这些来源于GABA积累菌株的谷氨酸脱羧酶基因导入到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的某个野生型菌株中，并使谷氨酸脱羧酶在宿主菌中得到高效表达，从而增强宿主菌生产GABA的能力。不管是乳酸菌发酵还是基因工程菌表达生产GABA，需要加入大量L-谷氨酸或L-谷氨酸钠作为前体物质，而L-谷氨酸或L-谷氨酸钠通常由谷氨酸棒杆菌发酵产生。因此，现有技术生产GABA的过程复杂且生产成本高。

此外，之前研究过将短乳杆菌来源的谷氨酸脱羧酶基因导入到谷氨酸棒杆菌中构建基因工程菌pDXW8-gadB1/ATCC13032，经检测具有GABA合成能力，发酵60h结束后检测γ-氨基丁酸的含量为5.6mM（专利申请号201110020606.8；Shi F,Li YX(2011)Synthesis of gamma-aminobutyric acid by expressing Lactobacillus brevis-derived glutamate decarboxylase in the Corynebacterium glutamicum strain ATCC13032.Biotechnol Lett33:2469–2474），相对来说产量还是比较低。如何提高GABA的产量是一个重要的技术问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，采用本研究组构建的大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体pDXW-10（专利申请号200910260991.6）与短乳杆菌来源的谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2构建共表达重组质粒，导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用工程菌表达的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成γ-氨基丁酸，通过发酵策略的优化获得较高GABA产量。

具体方法如下：采用本实验室构建的大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体pDXW-10（专利申请号200910260991.6），将从短乳杆菌Lactobacillus brevis Lb85（保藏编号：CCTCC NO：M2010367）上扩增出的目的基因gadB1、gadB2分别连接到载体上，构建出谷氨酸脱羧酶重组表达质粒pDXW10-gadB1、pDXW10-gadB2。然后将gadB2连同其前面的tac-M启动子序列一起扩增下来连接到已构建好的pDXW10-gadB1上，得到共表达重组质粒pDXW10-gadB1-gadB2。最后，将重组质粒pDXW10-gadB1-gadB2通过电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW10-gadB1-gadB2/ATCC13032，使得重组菌利用异源表达谷氨酸脱羧酶gadB1和gadB2将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出γ-氨基丁酸。

所述谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2的核苷酸序列分别NCBI公布的LVIS_1847和LVIS_0079所示。

将上述谷氨酸棒杆菌工程菌在平板上活化36h，接入到种子培养基，带生长到对数生长期后，按照发酵起始浓度2.0接入发酵培养基，发酵起始6h-24h进行尿素间隔补加6次，发酵120h，收集发酵液测定γ-氨基丁酸产量达27g/L，谷氨酸的转化率达74%。

具体方案如下：

1)出发菌株：上述构建的谷氨酸棒杆菌工程菌pDXW10-gadB1-gadB2/ATCC13032。

2)活化培养基（培养基质量分数%：牛肉膏1，蛋白胨1，葡萄糖0.1，NaCl0.5，酵母粉0.5，琼脂1.8，以去离子水配制，控制pH7.2。将该谷氨酸棒杆菌工程菌在平板上活化，30℃静置培养36h，挑取一环转接入种子培养基，进行种子预培养。

3)种子培养基（种子培养基质量分数%：葡萄糖2.5，玉米浆3，尿素0.8，K₂HPO₄·3H₂O0.1，MgSO₄0.02，pH7.2）的优化，采用四因素三水平L⁹（3³）实验设计，四因素三水平，共九个实验组，记为L⁹（3³）：因素1为葡萄糖，设2%，2.5%，3%三水平；因素2为玉米浆，设2.5%，3%，3.5%三水平；因素3为尿素，设0.4%，0.6%，0.8% 三水平；因素4为K₂HPO₄·3H₂O，设0.1%，0.15%，0.2%三水平；MgSO₄0.02，pH7.2不变。通过四因素三水平优化实验确定了种子培养基最佳组分，在此基础上测定了谷氨酸棒杆菌工程菌的生长曲线，确定转接发酵的时间。如图1所示，转接对数生长后期即7-8h的种子液进行发酵最好。

4）发酵培养基及尿素补加方式的优化（发酵培养基质量分数%：葡萄糖10，玉米浆0.4，尿素1.6，K₂HPO₄·3H₂O0.2，MgSO₄0.04，MnSO₄·7H₂O0.02，FeSO₄·7H₂O0.029，pH7.2）：进行单因素实验，因素1为葡萄糖，设9%，10%，11%，12%，13%五个水平；因素2为玉米浆，设0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%五个水平；因素3为尿素补加方式，四种补加方式尿素总量一样均为1.6%，而且控制尿素起始浓度相同，均为0.4%：方式1是在10-24h之间进行3次补加，每隔7h补加尿素0.4%；方式2是在10-24h之间进行4次补加，每隔4.5h补加尿素0.3%；方式3是在10-24h之间进行5次补加，每隔3.5h补加尿素0.24%；方式4是在6-24h之间进行6次补加，每隔3h补加尿素0.2%。如图2所示，当发酵培养基中控制葡萄糖10%，玉米浆0.4%，发酵84h结束时，尿素在6h-24h进行6次补加得到GABA18g/L，产量最高，谷氨酸转化率达70%。

5）装液量和发酵起始浓度的优化：装液量的确定设立5梯度确定，250mL锥形瓶：10mL，15mL，500mL锥形瓶：20mL，25mL，30mL，测定不同装液量对GABA产量的影响；发酵起始浓度的确定设立5个梯度确定，起始OD₅₆₂分别控制为1.2，1.4，1.6，1.8，2.0。

6）最优条件验证：采用优化的种子培养基（各成分质量分数%：葡萄糖2.5，玉米浆3，尿素0.8，K₂HPO₄·3H₂O0.1，MgSO₄0.02，pH7.2），优化的发酵培养基（各成分质量分数%：葡萄糖10，玉米浆0.4，尿素1.6，K₂HPO₄·3H₂O0.2，MgSO₄0.04，MnSO₄·7H₂O0.02，FeSO₄·7H₂O0.029，pH7.2），种子液培养7h-8h左右按照发酵起始菌浓OD₅₆₂=2.0转接到500mL内置20mL发酵液的三角瓶中，于往复式摇床110rpm，温度30℃进行培养，发酵前期6-24h补加6次尿素，延时发酵到120h，结束后测定发酵液中GABA含量和谷氨酸含量，最终得到GABA含量达27g/L，L-谷氨酸的转化率高达74%。

发酵液中GABA的精确定量：HPLC测定。用5%三氯乙酸将发酵液稀释25倍后4℃冰箱静置过夜，12000rpm离心10min沉淀蛋白，取上清液，用Agilent1200HPLC进行测定。

本发明利用谷氨酸棒杆菌共表达异源的谷氨酸脱羧酶，将发酵过程产生的L-谷氨酸直接转变成γ-氨基丁酸，具有如下优点：

1）在谷氨酸生产菌种表达异源的谷氨酸脱羧酶，可以在谷氨酸合成的同时实现GABA的合成，无需外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸钠作为前体物质，简化了GABA的合成过程，大大降低了生产成本；

2）将短乳杆菌来源的两个谷氨酸脱羧酶进行共表达积累的GABA的产量明显高于之前的单个基因表达，而且发酵优化过程中通过合理控制尿素的补加次数最终使GABA的产量升高至27g/L，L-谷氨酸的转化率也达到70%。

附图说明

图1谷氨酸棒杆菌工程菌pDXW10-gadB1-gadB2/ATCC13032种子生长曲线测定

图2尿素补加方式对GABA合成的影响

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

材料和试剂：

所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌JM109购自天根生物公司；引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；电转仪购自Bio-Rad公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。

对照实施例

在本课题组之前申请的专利，专利号ZL201110020575.6中，将gadB2克隆到pDXW-8的差别，转化ATCC13032后，获得重组菌pDXW8-gadB2/ATCC13032，其γ-氨基丁酸的发酵产量为7.25mM，转化效率为25%。

在专利号201110020606.8中，gadB1克隆到pDXW-8的差别，转化ATCC13032后，获得重组菌pDXW8-gadB1/ATCC13032，其γ-氨基丁酸的发酵产量为5.6mM，19%。

在本专利中将gadB2、gadB1分别克隆到pDXW-10后转化ATCC13032后，获得重组菌pDXW10-gadB2/ATCC13032及pDXW10-gadB1/ATCC13032。其发酵条件和实施例3一致，其γ-氨基丁酸的发酵产量分别为82mM，49.5mM。将上述两个基因分别通过表达质粒转化 ATCC13032，发酵条件与实施例3一致，其γ-氨基丁酸的发酵产量可达到116.2mM，转化效率为49%。

实施例1：谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2的获得

通过化学全合成或PCR的方式获得gadB1、gadB2基因，其两端加限制性酶切位点。

实施例2：重组谷氨酸棒杆菌pDXW10-gadB1-gadB2/ATCC13032的构建：

1)首先，将实施例1获得的gadB1与pDXW-10用同样的两种限制性内切酶EcoRI、NotI进行酶切，分别回收1.43kb和9.48kb酶切片段，然后将这两个片段用T4DNA连接酶连接，并转化到大肠杆菌JM109中完成pDXW10-gadB1重组质粒的构建；与此操作类似，gadB2与pDXW-10用同样的两种限制性内切酶NheI、PstI进行酶切，连接和转化，最终得到重组质粒pDXW10-gadB1和pDXW10-gadB2；

2)然后将gadB2连同其前面的tac-M启动子序列一起扩增下来，扩增引物分别为：

上游引物tac-M(+)：

5’-AAATATGCGGCCGCTCGGAAGCTGTGGTATGG-3’

下游引物gadB2(-)：

5’-ATCTCTGCAGTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3’

3)将gadB2-tac-M与pDXW10-gadB1用同样的两种限制性内切酶NotI、PstI进行酶切，连接，转化，最终得到共表达重组质粒pDXW10-gadB1-gadB2；

4)将重组质粒pDXW10-gadB1-gadB2经电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW10-gadB1-gadB2/ATCC13032。

谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态的制备：将谷氨酸棒杆菌ATCC13032单菌落于液体LBG培养基（各成分质量分数%：蛋白胨1，酵母粉0.5，NaCl1，葡萄糖0.5）中30℃培养过夜，随后按起始菌浓0.2-0.3转接至30mL感受态培养基（各成分质量分数%：蛋白胨1，酵母粉0.5，NaCl1，甘氨酸3，Tween-800.1）中，30℃，200rpm培养3-5h至菌浓达0.6-0.9，之后将菌液冰浴15min，离心弃上清，悬浮于30mL冰浴的10%甘油中，重复洗涤3次，最后用400μL10%的冷甘油重悬细胞，分装后于-70℃保存或直接用于电转化。

实施例3：谷氨酸棒杆菌工程菌发酵优化生产GABA

1、菌株：谷氨酸棒杆菌工程菌pDXW10-gadB1-gadB2/ATCC13032

2、培养基(培养基质量分数%)：

1)活化培养基：牛肉膏1，蛋白胨1，葡萄糖0.1，NaCl0.5，酵母粉0.5，琼脂1.8，pH7.2；

2)种子培养基：葡萄糖2.5，玉米浆3，尿素0.8，K₂HPO₄·3H₂O0.1，MgSO₄0.02，pH7.2）

3)发酵培养基：葡萄糖10，玉米浆0.4，尿素1.6，K₂HPO₄·3H₂O0.2，MgSO₄0.04，MnSO₄·7H₂O0.02，FeSO₄·7H₂O0.029，pH7.2；尿素在6h-24h进行6次补加(每隔3h补加0.2%的尿素）

3、种子培养基优化和生长曲线测定：

1)种子培养基主要采取四因素三水平实验进行优化（如表1），将活化好的工程菌挑取一环接入到不同配比的种子培养基中，于往复式摇床110rpm，30℃培养8h测定各个实验组的OD₅₆₂（如表2）。

表1L₉(3⁴)正交实验设计（g/L）

因素	A葡萄糖	B玉米浆	C尿素	D K₂HPO₄
					水平1	20	25	4	1
水平2	25	30	6	1.5
					水平3	30	35	8	2.0

表2L₉(3⁴)正交实验设计及结果分析

由8h测定的OD₅₆₂可以得出，最佳种子培养基组合为C₃A₂B₂D₁。因此种子培养及中最佳培养基配方为(培养基质量分数%)：种子培养基：葡萄糖2.5，玉米浆3，尿素0.8，K₂HPO₄·3H₂O0.1，MgSO₄0.02，pH7.2。

2）种子液生长曲线测定：将活化好的菌株以相同的接种量接入到优化好的种子培养基，30℃，110rpm培养，设立三次重复，每隔2h取样测定种子液菌浓OD₅₆₂。根据测定结果绘制生长曲线如图1，种子培养7-8h进行发酵最好。

4、最终GABA发酵方案：将谷氨酸棒杆菌pDXW10-gadB1-gadB2/ATCC13032在平板上进行划线活化，于30℃静置培养36。然后挑取一环菌株接入到种子培养及中进行预培养，于30℃，110rpm往复式摇床上培养7-8左右测定OD₅₆₂。将培养好的种子液转接到500mL锥形瓶中，内置20mL发酵培养基中，控制转接后的起始OD₅₆₂为2，于30℃，110rpm往复式摇床进行培养，从6h开始进行尿素补加，每隔3h补加0.2%尿素到24h。发酵120h结束后分别测定发酵液上清的GABA和L-谷氨酸含量，最终得到GABA含量达27g/L，L-谷氨酸的转化率高达74%。

Claims

1.一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于以表达谷氨酸脱羧酶的基因工程菌为生产菌株，经种子培养基活化，菌株浓度到达对数生长中后期后，接种到发酵培养基，控制尿素起始浓度为0.4%，发酵起始6h-24h补加尿素0.2%/次，直到其浓度为1.6%停止；调节发酵温度为30℃，往复式摇床110rpm，连续培养120小时；所述表达谷氨酸脱羧酶的基因工程菌的构建方法为化学全合成或PCR方法获得谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2，将其通过表达载体共同导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2核苷酸序列分别如NCBI公布的LVIS_1847和LVIS_0079所示。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述表达载体为pDXW-10。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基组成为：种子培养基质量分数%：葡萄糖2.5，玉米浆3，尿素0.8，K₂HPO₄·3H₂O0.1，MgSO₄0.02，pH7.2。

5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为：发酵培养基质量分数%：葡萄糖10，玉米浆0.4，尿素1.6，K₂HPO₄·3H₂O0.2，MgSO₄0.04，MnSO₄·7H₂O0.02，FeSO₄·7H₂O0.029，pH7.2。