CN102517303B - 一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用。本发明提供的方法，为代谢途径改造并将D-乳酸脱氢酶编码基因导入蓝藻的基因组中，得到产光学纯D-乳酸的重组蓝藻；所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中的序列3。本发明的实验证明，本发明通过代谢工程改造的方法，构建了重组蓝藻，利用蓝藻可以进行光合自养的特性，即可以利用太阳能将CO2直接转化为有机物，可以在海水和污水中生长的特性及易于进行基因操作的优点，使重组蓝藻可以利用太阳能和CO2直接合成光学纯乳酸D-乳酸。

Description

一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用。
背景技术
全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源化学品的要求，而粮食短缺要求可再生清洁能源化学品的发展要实现不与人争粮、不与作物争地、不与人和作物争淡水。
蓝藻(blue-green algae)，又称蓝细菌(cyanobacteria)，是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻广泛分布在淡水、海水甚至是污水中，能够利用CO2和太阳能快速繁殖，是生物合成能源产品的理想宿主。作为原核生物，蓝藻细胞结构简单、遗传背景与大肠杆菌相似，易于基因操作。近二十年来蓝藻分子生物学的研究进展为对蓝藻进行基因改造进而合成化工产品奠定了基础，已有在蓝藻中合成乙醇的成功案例。太阳能是地球上取之不尽的能源，而CO2是导致地球变暖的温室气体，全球每年投入数以亿计资金用于CO2减排。因此，通过对蓝藻进行代谢途径改造，使蓝藻将太阳能和CO2直接转化为能源化工产品，是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。
乳酸(lactate)又称2-羟基丙酸。因分子中有一个不对称碳原子，而具有旋光性。因此乳酸有L-乳酸和D-乳酸两种旋光异构体。不同光学性质的乳酸用途不同。乳酸是生产聚乳酸的单体，而聚乳酸的性能与D-乳酸的含量相关，因此D-乳酸是生产优质聚乳酸所必须的。聚乳酸是理想的绿色高分子材料，可完全生物降解，具有良好的机械性能、物理特性、生物相容性及防腐、耐菌性等优点，是其它生物降解材料所无法比拟的。聚乳酸是传统塑料制品的理想替代品，可应用于各行各业，如生产生物可降解塑料及人工合成生物组织等。全球每年对塑料的需求量是200亿公斤，而聚乳酸的产量只有450万公斤，由此可见全球对生产聚乳酸的原料乳酸的需求。由此可见生产光学纯D-乳酸的重要性及必要性。
乳酸的生产方法有发酵法、化学合成法和酶转化法。发酵法主要是以粮食为原料，由乳酸菌对粮食淀粉发酵生产乳酸；化学发和酶法是以能源化学品为原料且污染环境。这些方法主要用于生产L-乳酸或消旋乳酸LD-乳酸，而对光学纯D-乳酸的生产是随着聚乳酸的广泛应用而兴起的。为减缓能源短缺及避免污染环境，近年来科研人员尝试通过代谢工程改造细菌用发酵法生产光学纯乳酸，该方法虽然避免了加剧化石能源短缺的问题，但以粮食为原料，如大量生产将加剧全球粮食短缺问题，无法实现可再生能源的持续发展，因此利用太阳能直接将CO2转化为有机物的光合自养细菌蓝藻是生产光学纯乳酸的理想途径。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种构建重组蓝藻的方法。
本发明提供的方法，为将D-乳酸脱氢酶编码基因导入蓝藻的基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻；上述方法为通过代谢工程改造进行。
所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中的序列3。
在上述方法中，所述D-乳酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1的自5’末端608-1788位核苷酸或序列表中序列2的自5’末端第605-1785位核苷酸。
在上述方法中，所述重组蓝藻为将双链DNA通过同源重组导入蓝藻的基因组；
其中的双链DNA为含有所述D-乳酸脱氢酶编码基因的DNA；
而蓝藻具体为淡水蓝藻集胞藻6803或海水蓝藻聚球藻7002；
上述方法中的双链DNA具体还包括上游同源臂、下游同源臂和筛选基因；
其中的上游同源臂和下游同源臂具体为如下1)或2)：
1)所示的所述上游同源臂和下游同源臂为淡水蓝藻集胞藻6803基因组中乙酰磷酸转移酶基因的上游同源臂和下游同源臂；
2)所示的所述上游同源臂和下游同源臂为海水蓝藻聚球藻7002基因组中乳酸脱氢酶基因的上游同源臂和下游同源臂；
其中的筛选基因具体为卡那霉素抗性基因；
上述的双链DNA具体为如下1)或2)：
1)所示的双链DNA依次包括所述乙酰磷酸转移酶基因的上游同源臂、D-乳酸脱氢酶编码基因、筛选基因和所述乙酰磷酸转移酶基因下游同源臂；
2)所示的双链DNA依次包括所述乳酸脱氢酶基因的上游同源臂、D-乳酸脱氢酶编码基因、筛选基因和所述乳酸脱氢酶基因的下游同源臂。
在上述方法中，1)所示的双链DNA的核苷酸序列为序列表中的序列1；
2)所示的双链DNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。
在上述1)所示的双链DNA中，淡水蓝藻集胞藻6803基因组中乙酰磷酸转移酶基因的上下游同源臂分别为序列表中序列1的自5’末端第1-601位核苷酸(Up1)和5’末端第2727-3313位核苷酸(Down1)；卡那霉素抗性基因为序列表中序列1的自5’末端第1795-2726位核苷酸(Km)；D-ldh为序列表中序列1的自5’末端第608-1788位核苷酸；
在上述2)所示的双链DNA中，海水蓝藻聚球藻7002基因组中乳酸脱氢酶基因的上下游同源臂分别为序列表中序列2的自5’末端第1-598位核苷酸(Up3)和5’末端第2723-3278位核苷酸(Down3)；卡那霉素抗性基因为序列表中序列2的自5’末端第1792-2723位核苷酸；D-ldh为序列表中序列1的自5’末端第605-1785位核苷酸。
上述的方法具体可以为如下1)或2)：
1)所示的方法为将1)所示的双链DNA通过同源重组导入淡水蓝藻集胞藻6803基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻S.M1；
2)所示的方法为将1)所示的双链DNA通过同源重组导入海水蓝藻聚球藻7002基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻S.M2。
在上述方法中，
1)所示的方法中，将1)所示的双链DNA通过同源重组导入淡水蓝藻集胞藻6803基因组中为将重组质粒1导入淡水蓝藻集胞藻6803；
其中，该重组质粒1为将1)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒；
2)所示的方法中，将2)所示的双链DNA通过同源重组导入海水蓝藻聚球藻7002基因组中为将重组质粒2导入海水蓝藻聚球藻7002；
其中，该重组质粒2为将2)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒。
由上述方法得到的重组蓝藻也是本发明保护的范围。
本发明的第二个目的是提供一种重组质粒。
本发明提供的重组质粒，为如下重组质粒1或重组质粒2：
上述重组质粒1为将上述方法中所述的1)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒；
上述重组质粒2为将上述方法中所述的2)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒。
上述的重组蓝藻或上述的重组质粒在制备D-乳酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的第三个目的是提供一种制备D-乳酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
先将上述的重组蓝藻进行光照培养，再进行暗培养，收集培养产物，即得到D-乳酸；
上述方法中，所述光照培养和暗培养的培养基均为以无机碳为唯一碳源的培养基；所述培养基具体为BG-11培养基；
该光照培养的温度具体为28℃-32℃，所述光照培养的光照强度为80μm/m2·s-120μm/m2·s，所述光照培养为振荡培养，所述振荡频率为100r/min-150r/min，所述光照培养时间为5天-8天；
上述方法中，该暗培养的温度为28℃-32℃，暗培养70小时-74小时；所述暗培养为静置培养。
本发明的实验证明，本发明通过代谢工程改造的方法，构建了重组蓝藻，利用蓝藻可以进行光合自养的特性，即可以利用太阳能将CO2直接转化为有机物，可以在海水和污水中生长的特性及易于进行基因操作的优点，使重组蓝藻可以利用太阳能和CO2直接合成光学纯乳酸D-乳酸。本发明通过蓝藻对太阳能和工业废气CO2的利用，实现大宗化学品乳酸的生产，避免了在能源再生过程中对粮食等有机物的使用，同时又可以利用海水和CO2有利于环境。因此，利用本发明的重组蓝藻来生产乳酸是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一，也为解决生产光学纯乳酸这一难题提供了新技术。
附图说明
图1为重组蓝藻S.M1鉴定图
图2为HPLC检测重组蓝藻S.M1发酵液中产物
图3为HPLC手性分析重组蓝藻S.M1发酵液中产物
图4为重组蓝藻S.M2鉴定图
图5为HPLC检测重组蓝藻S.M2发酵液中产物
图6为HPLC手性分析重组蓝藻S.M2发酵液中产物
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大肠杆菌(E.coli)DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。
载体pMD-18T：购自北京全式金生物技术有限公司。
淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)属于色球藻科、集胞藻属；参考文献：Zhang S，Spann KW，et al.Identification of two genes，sll0804and slr1306，as putativecomponents of the CO2-concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803.J Bacteriol.2008，190：8234-8237，公众可从中国科学院微生物所获得。
海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)属于色球藻科、聚球藻属；参考文献：Cantrell A and Bryant DA.Molecular cloning and nucleotide sequence of the psaAand psaB genes of the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC 7002.Plant Mol Biol.1987，9：453-468，公众可从中国科学院微生物所获得。
蓝藻表达载体pAM2770：参考文献：Wu X，Li DW，et al.The Anabaena sp.strainPCC 7120 asr1734 gene encodes a negative regulator of heterocyst.Development.Molecul Microbiol.2007，64：782-794，公众可从中国科学院微生物所获得。
BG-11培养基组成见表1。Trace metal mix A5组成见表2。
表1BG-11培养基组成
 组分   含量(/L)
 NaNO3   1.5g
 K2HPO4   0.04g
 MgSO4·7H2O   0.075g
 CaCl2·2H2O   0.036g
 柠檬酸(Citric acid)   0.006g
 柠檬酸铁铵(Ferric ammonium citrate)   0.006g
 EDTA(disodium salt)   0.001g
 Na2CO3   0.02g
 Trace metal mixA5(组成见表2)   1.0ml
 琼脂Agar   10.0g
 蒸馏水   1.0L
 pH   8.0
表2Trace metal mixA5组成
  组分   含量(/L)
  H3BO3   2.86g
  MnCl2·4H2O   1.81g
  ZnSO4·7H2O   0.222g
  NaMoO4·2H2O   0.39g
  CuSO4·5H2O   0.079g
  Co(NO3)2·6H2O   49.4mg
  蒸馏水   1.0L
实施例1、重组蓝藻S.M1的构建
在淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)中建立光学纯D-乳酸合成途径。由于蓝藻细胞中有乳酸合成的直接前体丙酮酸，所以在蓝藻细胞内过表达催化丙酮酸转化为D-乳酸的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)，可实现蓝藻产D-乳酸。
一、重组质粒pMD-Dldh(集胞藻D-ldh同源重组整合表达载体)的构建
1、D-乳酸脱氢酶编码基因Dldh的获得
D-乳酸脱氢酶编码基因Dldh根据德式乳酸菌(Lactobacillus delbrueckii)基因组数据库所提供的D-乳酸脱氢酶基因编码序列，委托上海生物工程公司进行密码子优化后合成。
D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中的序列3，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第608-1788位核苷酸。
人工合成序列1自5’末端第608-1788位核苷酸(D-乳酸脱氢酶基因编码序列)，以如下D-ldhF和D-ldhR作为引物，进行PCR扩增，得到1181bp的PCR产物，即为Dldh。
D-l dhF：5’-GCTCTAGAATGACTAAAATCTTCGCCTACGC-3’(划线部标注Xba I位点)
D-l dhR：5’-GCTCTAGAATGACTAAAATCTTCGCCTACG-3’(划线部标注Xba I位点)
2、Up-1片段和Down-1片段的获得
以淡水蓝藻集胞藻6803的基因组DNA为模板，分别用引物对Up1F、Up1R和引物对Down1F、Down1F进行PCR扩增，分别得到Up-1片段(约600bp)和Down-1片段(约600bp)。Up-1片段为蓝藻基因组DNA中乙酸合成途径第一个酶的编码基因乙酰磷酸转移酶基因(pta)基因上游DNA片段(序列表中序列1自5’末端1-601位核苷酸)，Down-1片段为蓝藻基因组DNA中pta基因下游DNA片段(自5’末端2727-3313位核苷酸)。
PCR扩增Up-1片段的引物对如下：
Up1F：5’-ATCGAGCCATGTTGCATCTA-3’；
Up1R：5’-GCTCTAGACTAAACTCACCGCTTCATGG-3’(划线部标注Xba I位点)
PCR扩增Down-1片段的引物对如下：
Down1F：5’-CCGGTAACAATACTTACAAGGC-3’；
Down1R：5’-GCTGTGGTGGGACTGTTTCA-3’。
3、卡那霉素抗性基因的制备
以蓝藻表达载体pAM2770DNA为模板，用下述引物进行PCR扩增，得到Km基因(约1000bp，为序列表中序列1自5’末端第1795-2726位核苷酸).
PCR扩增卡那霉素抗性基因的引物对如下：
5’-GACAGGATGAGGATCGTTTC-3’；
5’-AAGTTGTAACCATTTAAAACC-3’。
4、将Down-1片段和Km基因同时作为模板，用KmF、Kmdown1RF和Down1R组成的引物组合进行融合PCR，得到1519bp的PCR扩增产物，命名为DNA片段Kmdown1。
KmF：5’-GCTCTAGAGACAGGATGAGGATCGTTTC-3’(划线部标注Xba I位点)；
KmdownRF：5’-TGAAACAGTCCCACCACAGCAAGTTGTAACCATTTAAAACC-3；
Down1R：5’-GCTGTGGTGGGACTGTTTCA-3’。
5、将Up-1片段和Kmdown1片段为模板用Up1F、Up1KmRF和Down1R组成的引物组合进行融合PCR，得到2121bp的PCR扩增产物，命名为DNA片段Up1Kmdown1。
Up1Kmdown1RF：5’-GAAACGATCCTCATCCTGTCTCTAGACTAAACTCACCGCTTCATGG-3’(划线部标注Xba I位点)。
6、将上述5得到的PCR扩增产物Up1Kmdown1与载体pMD-18T连接，得到重组载体，命名为pMD-upkmdown。
7、用XbaI酶切步骤1得到的Dldh，与经过同样酶切的上述步骤6得到的pMD-upkmdown的骨架片段连接，得到连接产物，连接产物转入大肠杆菌，得到转化子。
提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中序列1自5’末端第608-1788位核苷酸插入pMD-upkmdown的XbaI位点间得到的载体，命名为pMD-Dldh，即为将序列表中的序列1插入pMD-18T的多克隆位点间得到的。
二、重组蓝藻S.M1的制备及鉴定
1、重组蓝藻S.M1的制备
用重组质粒pMD-Dldh转化淡水蓝藻集胞藻6803，使用10μg/ml卡那霉素筛选重组菌(转化子)，将其命名为重组蓝藻S.M1。
2、基因水平鉴定
以重组蓝藻S.M1及野生型淡水蓝藻集胞藻6803的基因组DNA为模板，用DldhF和DldhR组成的引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图1。
电泳结果显示重组蓝藻S.M1基因组中扩增到约1000bp的DNA片段，而野生蓝藻集胞藻6803(S.6803)基因组中没有扩增到DNA片段，与预期片段大小相符合，证明合成D-乳酸所需酶的编码基因Dldh已成功转入重组蓝藻S.M1中。
将重组蓝藻S.M1的基因组DNA送去测序，结果为将D-乳酸脱氢酶的编码基因Dldh取代了乙酸合成途径的第一个酶的编码基因pta基因。因此，在重组蓝藻S.M1中，乙酸合成途径已被干扰。
实施例2、重组蓝藻S.M1生产光学纯D-乳酸
一、光学纯D-乳酸制备
方法一、
通常在发酵时才会产乳酸，因此，在正常培养条件下培养细胞，当生物量积累到一定程度，采用暗发酵培养进行诱导。
1、光照培养
将上述由实施例1得到的重组蓝藻S.M1置于光照培养箱中振荡培养至对数生长后期(使其细胞密度达到OD730＝1.5)；培养时间为7天；温度为30℃，光强为100μm/m2·s，振荡频率为130r/min，培养基为BG-11(以无机碳为唯一碳源)，得到光照培养产物。
2、暗培养
然后将光照培养产物进行黑暗静止培养72小时，暗培养的温度为30℃，使其进行自发酵，得到发酵液。
方法二、
1、光照培养
与方法一基本相同，不同的是培养时间为5天；温度为28℃，光强为80μm/m2·s，振荡频率为100r/min；
2、暗培养
与方法一基本相同，黑暗静止培养70小时，暗培养的温度为28℃。
方法三、
1、光照培养
与方法一基本相同，不同的是培养时间为8天；温度为32℃，光强为150μm/m2·s，振荡频率为150r/min；
2、暗培养
与方法一基本相同，黑暗静止培养74小时，暗培养的温度为32℃。
二、检测
将上述方法一得到的发酵液离心(14000rpm，2mins)，取上清液，用液相色谱检测乳酸的产生及光学纯度分析(手性分析)。
色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad Aminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H2SO4溶液，流速0.5ml/min。标准品为乳酸(Wako、日本和光公司及产品目录号CDH5485)；
结果见图2，乳酸出峰时间在15分钟左右(与标准品的出峰时间一致)，说明得到乳酸。
根据标准曲线计算出S.M1D的乳酸产量为1g/L(发酵液)。
手性分析的色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，紫外检测器；MCI GEL CRSLOW手性柱(4.6*50mm)，柱温25℃；上样量10μl；流动相为2mM H2SO4溶液，流速0.5ml/min。标准品为D-乳酸(Wako、日本和光公司及产品目录号CDH5485)；
结果见图3，D-乳酸出峰时间在9分钟左右(与标准品的出峰时间一致)，说明得到D-乳酸。
根据标准曲线计算出S.M1的D-乳酸产量为1g/L(发酵液)。
采用同样的方法检测方法二、三得到的发酵液，结果与方法一无显著差异。
实施例3、重组蓝藻S.M2的构建
在海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)中建立光学纯D-乳酸合成途径。由于蓝藻细胞中有乳酸合成的直接前体丙酮酸，所以在蓝藻细胞内过表达催化丙酮酸转化为D-乳酸的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)，可实现蓝藻产D-乳酸。由于聚球藻7002中有乳酸脱氢酶(LDH)编码基因ldh，因此以ldh为插入位点，表达D-乳酸脱氢酶即可实现海水蓝藻产光学纯乳酸D-乳酸。
一、重组质粒pMD-Dldh(聚球藻D-ldh同源重组整合表达载体)的构建
1、D-乳酸脱氢酶编码基因Dldh的获得
D-乳酸脱氢酶编码基因D-ldh根据德式乳酸菌(Lactobacillus delbrueckii)基因组数据库所提供的D-乳酸脱氢酶基因编码序列，委托上海生物工程公司进行密码子优化并合成。
D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中的序列3，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第605-1785位核苷酸。
人工合成序列2自5’末端第605-1785位核苷酸(D-乳酸脱氢酶基因编码序列)，以如下D-ldhF和D-ldhR作为引物，进行PCR扩增，得到1181bp的PCR产物，即为Dldh。
D-l dhF：5’-GCTCTAGAATGACTAAAATCTTCGCCTACGC-3’(划线部标注Xba I位点)
D-ldhR：5’-GCTCTAGAATGACTAAAATCTTCGCCTACG-3’(划线部标注Xba I位点)
2、Up-3片段和Down-3片段的获得
以海水蓝藻聚球藻7002的基因组DNA为模板，分别用引物对Up3F、Up3R和引物对Down3F、Down3F进行PCR扩增，分别得到Up-3片段(约600bp，序列表中序列2自5’末端第1-598位核苷酸)和Down-3片段(约600bp，序列表中序列2自5’末端第2724-3279位核苷酸)。Up-3片段为聚球藻7002基因组DNA中乳酸脱氢酶的编码基因ldh上游DNA片段，Down-3片段为聚球藻7002基因组DNA中乳酸脱氢酶的编码基因ldh下游DNA片段。
PCR扩增Up-3片段的引物对如下：
Up3F：5’-CTGCGCCAAG AATAGCTCAC-3’；
Up3R：5’-GCTCTAGA AGTCTGGGTG CCCTAGGG-3’(划线部标注Xba I位点)PCR扩增Down-3片段的引物对如下：
Down3F：5’-AGACATTTCCCACAGACCAC-3’；
Down3R：5’-TGGTGCTTTG GGGTAATGGA-3’。
3、卡那霉素抗性基因的制备
以蓝藻表达载体pAM2770DNA为模板，用下述引物进行PCR扩增，PCR扩增得到Km基因(约1000bp，序列表中序列2自5’末端第1792-2723位核苷酸)。
PCR扩增卡那霉素抗性基因的引物对如下：
5’-GACAGGATGAGGATCGTTTC-3’；
5’-AAGTTGTAACCATTTAAAACC-3’。
4、将Down-3片段和Km基因同时作为模板，用KmF、Kmdown3RF和Down3R组成的引物组合进行融合PCR，得到1487bp的PCR扩增产物，命名为DNA片段Kmdown3。
KmF：5’-GCTCTAGAGACAGGATGAGGATCGTTTC-3’(划线部标注Xba I位点)；
KmdownRF：5’-GTGTCTGTGGGAAATGTCT AAGTTGTAACCATTTAAAACC-3’。
5、将Up-3片段和Kmdown3片段为模板用Up3F、Up3KmRF和Down3R组成的引物组合进行融合PCR，得到2085bp的PCR扩增产物，命名为DNA片段Up3Kmdown3。
Up3Kmdown3RF：5’-GAAACGATCCTCATCCTGTCTCTAGAAGTCTGGGTG CCCTAGGG-3’(划线部标注Xba I位点)。
6、将上述5得到的PCR扩增产物Up3Kmdown3与载体pMD-18T连接，得到重组载体，经过测序，该载体为将Up3Kmdown3插入到载体pMD-18T的TA克隆位点得到的载体，命名为pMD-upkmdown3。
7、用XbaI酶切步骤1得到的Dldh，与经过同样酶切的上述步骤6得到的pMD-upkmdown3的骨架片段连接，得到连接产物，连接产物转入大肠杆菌，得到转化子。
提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中序列2自5’末端第605-1785位核苷酸插入pMD-upkmdown3的XbaI位点间得到的载体，命名为pMD-Dldh2，即为将序列表中的序列2插入pMD-18T的多克隆位点间得到的。
二、重组蓝藻S.M2的制备及鉴定
1、重组蓝藻S.M2的制备
用重组质粒pMD-Dldh2转化海水蓝藻聚球藻7002，使用10μg/ml卡那霉素筛选重组菌(转化子)，将其命名为重组蓝藻S.M2。
2、基因水平鉴定
以重组蓝藻S.M2及野生型海水蓝藻聚球藻7002的基因组DNA为模板，用DldhF和DldhR组成的引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图4。
电泳结果显示重组蓝藻S.M2基因组中扩增到约1000bp的DNA片段，与预期片段大小相符合，而野生蓝藻聚球藻7002基因组中没有扩增到DNA片段，证明合成D-乳酸所需酶的编码基因Dldh已成功转入重组蓝藻S.M2中。
实施例4、重组蓝藻S.M2生产光学纯D-乳酸
一、光学纯D-乳酸制备
方法一、
通常在发酵时才会产乳酸，因此，在正常培养条件下培养细胞，当生物量积累到一定程度，采用暗发酵培养进行诱导。
1、光照培养
将上述由实施例3得到的重组蓝藻S.M2置于光照培养箱中振荡培养至对数生长后期(使其细胞密度达到OD730＝1.5)；培养时间为7天；温度为30℃，光强为100μm/m2·s，振荡频率为130r/min，培养基为BG-11(以无机碳为唯一碳源)，得到光照培养产物。
2、暗培养
然后将光照培养产物黑暗静止培养72小时，暗培养的温度为30℃，使其进行自发酵，得到发酵液。
方法二、
1、光照培养
与方法一基本相同，不同的是培养时间为5天；温度为28℃，光强为80μm/m2·s，振荡频率为100r/min；
2、暗培养
与方法一基本相同，黑暗静止培养70小时，暗培养的温度为28℃。
方法三、
1、光照培养
与方法一基本相同，不同的是培养时间为8天；温度为32℃，光强为150μm/m2·s，振荡频率为150r/min；
2、暗培养
与方法一基本相同，黑暗静止培养74小时，暗培养的温度为32℃。
二、检测
将上述方法一得到的发酵液离心(14000rpm，2mins)，取上清液，用液相色谱检测乳酸的产生及光学纯度分析(手性分析)。
色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad Aminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H2SO4溶液，流速0.5ml/min。标准品为标准品为乳酸(Wako、日本和光公司及产品目录号CDH5485)；
结果见图5，乳酸出峰时间在15分钟左右(与标准品的出峰时间一致)，说明得到乳酸。
根据标准曲线计算出S.M2D的乳酸产量约1g/L(发酵液)。
手性分析的色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，紫外检测器；MCI GEL CRSLOW手性柱(4.6*50mm)，柱温25℃；上样量10μl；流动相为2mM H2SO4溶液，流速0.5ml/min。标准品为标准品为乳酸(Wako、日本和光公司及产品目录号CDH5485)；
结果见图6，D-乳酸出峰时间在9分钟左右(与标准品的出峰时间一致)，说明得到D-乳酸。
根据标准曲线计算出S.M2的D-乳酸产量为1g/L(发酵液)。
采用同样的方法检测方法二、三得到的发酵液，结果与方法一无显著差异。
Figure IDA0000111964860000011
Figure IDA0000111964860000021
Figure IDA0000111964860000041
Figure IDA0000111964860000051
Figure IDA0000111964860000061

Claims (9)

1.一种构建重组蓝藻的方法，为将D-乳酸脱氢酶编码基因导入蓝藻的基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻；
所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中的序列3；
所述蓝藻为淡水蓝藻集胞藻6803或海水蓝藻聚球藻7002。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述D-乳酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1的自5’末端第608-1788位核苷酸或序列表中序列2的自5’末端第605-1785位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述重组蓝藻为将双链DNA通过同源重组导入蓝藻的基因组；
所述双链DNA的核苷酸序列为如下1)或2)：
1)序列表中的序列1；
2)序列表中的序列2。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述方法为如下1)或2)：
1)将1)所示的双链DNA通过同源重组导入淡水蓝藻集胞藻6803基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻1；
2)将2)所示的双链DNA通过同源重组导入海水蓝藻聚球藻7002基因组中，得到产D-乳酸的重组蓝藻2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
1)将1)所示的双链DNA通过同源重组导入淡水蓝藻集胞藻6803基因组中为将重组质粒1导入淡水蓝藻集胞藻6803；
所述重组质粒1为将1)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒；
2)将2)所示的双链DNA通过同源重组导入海水蓝藻聚球藻7002基因组中为将重组质粒2导入海水蓝藻聚球藻7002；
所述重组质粒2为将2)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒。
6.由权利要求1-5任一所述方法得到的重组蓝藻。
7.一种重组质粒，为如下重组质粒1或重组质粒2：
所述重组质粒1为将权利要求3-5任一所述方法中所述的1)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒；
所述重组质粒2为将权利要求3-5任一所述方法中所述的2)所示的双链DNA插入pMD-18T中，得到表达所述D-乳酸脱氢酶的质粒。
8.权利要求6所述的重组蓝藻或权利要求7所述的重组质粒在制备D-乳酸中的应用。
9.一种制备D-乳酸的方法，包括如下步骤：
先将权利要求6所述的重组蓝藻进行光照培养，再进行暗培养，收集培养产物，即得到D-乳酸；
所述光照培养和暗培养的培养基均为以无机碳为唯一碳源的培养基；所述培养基具体为BG-11培养基；
所述光照培养的温度为28℃-32℃，所述光照培养的光照强度为80μm/m2·s-120μm/m2·s，所述光照培养为振荡培养，所述振荡频率为100r/min-150r/min，所述光照培养时间为5天-8天；
所述暗培养的温度为28℃-32℃，暗培养70小时-74小时；所述暗培养为静置培养。
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