CN108588108B - 一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用。本方法采用分子生物学技术，通过在地衣芽胞杆菌中敲除转录抑制因子基因ccpC，获得了ccpC缺失的地衣芽胞杆菌工程菌株WX‑02△ccpC，显著提高了地衣芽胞杆菌甘油代谢的速率。WX‑02△ccpC在不同培养基中的甘油消耗速率比原始菌地衣芽胞杆菌WX‑02至少提高了18.38%，最高可达32.67%。利用该菌株在聚γ‑谷氨酸发酵培养基中能够显著提高聚γ‑谷氨酸的产量，至少提高了10.7%，最高可达17.4%。说明该基因工程改造方法在提高微生物甘油代谢速率具有重要作用，并提高甘油合成生物基化学品的效率。

Description

一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用。
背景技术
甘油是生物柴油生产加工的主要副产物，每生产10吨生物柴油产生约1吨粗甘油，目前生物柴油加工业产生大量的粗甘油，产生使得粗甘油价格巨低，造成粗甘油滞销，降低了生物柴油企业利润。因此，甘油作为发酵的碳源具有更多的还原力，相同质量的甘油和葡萄糖，甘油能够产生更多的生物化合物。目前已有诸多报道利用甘油为碳源发酵合成各种生物基化学品，例如，乙醇，乳酸，琥珀酸，柠檬酸，PHA，聚γ-谷氨酸等。然而目前通过微生物转化甘油合成生物基化学品，普遍存在菌株在甘油为碳源的培养基中生长缓慢，甘油代谢速率慢，导致发酵产物的合成效率低，产率低，增加了发酵的成本和周期。提高微生物的甘油代谢速率是解决甘油作为碳源工业化生产生物基化学品的关键。
目前对甘油利用的研究主要集中在强化甘油代谢的途径和发酵产物合成途径方面，对转录因子对甘油代谢的影响报道较少。转录抑制因子CcpC在菌体的碳代谢中具有重要作用，但人们目前对此研究报道较少。之前的研究中，CcpC能够调节TCA循环基因的表达，从而调节碳代谢流的分布。甘油属于非PTS转运的碳源，到目前为止，转录抑制因子CcpC与甘油代谢之间关系的未见报道，因此CcpC的表达水平是否会影响甘油的代谢并不清楚，目前报道很多芽胞杆菌，包括枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌均能够代谢甘油，然而这些菌株甘油代谢的速率比较慢，需要进一步提高甘油的代谢能力，加快甘油的转化水平，从而实现利用廉价粗甘油高效合成有价值的化学物。本研究以地衣芽胞杆菌为例，研究发现通过在地衣芽胞杆菌中通过敲除ccpC能够显著提高甘油利用速率。本研究表明敲除转录抑制因子ccpC在芽胞杆菌高效利用甘油合成生物基化学品方面具有重要的科研意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法，通过敲除地衣芽胞杆菌中ccpC，能够显著提高地衣芽胞杆菌的甘油利用速率。
本发明的另一个目的在于提供了一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法的应用。利用本发明的方法，可用于工业化制备聚γ-谷氨酸。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法，利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中ccpC。
以上所述的方法中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02；
以上所述的方法中，具体的，包括下述步骤：
(1)根据地衣芽胞杆菌WX-02中调控因子基因ccpC序列，采用PCR的方法扩增出ccpC上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到ccpC的敲除载体T2(2)-ccpC。
(2)将T2(2)-ccpC电转化至地衣芽胞杆菌WX-02中，对阳性转化子进行菌落PCR验证和抽质粒验证；将阳性转化子转接培养数次后，得到ccpC基因的上游同源臂或ccpC基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
挑选ccpC基因的同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选双交换菌株，对于阳性克隆进行PCR验证并进行测序，得到ccpC基因敲除的地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC。
所述的ccpC基因序列为SEQ ID NO.1所示。
一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法的应用，包括利用本领域的常规方式，将获得的地衣芽孢杆菌进行工业发酵以生产聚γ-谷氨酸；或是用于制备高效代谢甘油的芽胞杆菌。
以上所述的应用中，优选的，所述发酵的培养基配方，包括：60-100g/L甘油，8-16g/L柠檬酸钠，5-15g/L NaNO3，20-40g/L谷氨酸钠。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
转录抑制因子CcpC是芽胞杆菌中一种重要的碳代谢转录因子，本研究通过缺失ccpC，显著提高了地衣芽胞杆菌利用甘油的代谢速率。该研究结果表明缺失转录抑制因子基因ccpC是一种十分有效的提高微生物利用甘油速率的方法，利用本发明提供的方法获得的地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC株，在不同培养基中的甘油消耗速率比原始菌地衣芽胞杆菌WX-02至少提高了18.38％，最高可达32.67％。利用该菌株在聚γ-谷氨酸发酵培养基中能够显著提高聚γ-谷氨酸的产量，至少提高了10.7％，最高可达17.4％本研究为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。
附图说明
图1为实施例1中PCR扩增转录抑制因子基因ccpC上下游同源臂
泳道1：基因ccpC上游同源臂；泳道2为5K DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道3：基因ccpC下游同源臂。
图2为实施例2中ccpC敲除菌株的构建示意图；
泳道1和2：ccpC缺失菌株的菌落PCR验证；泳道3-5野生型菌株的PCR验证：泳道6：5K DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
具体实施方式
结合以下实例，对本发明进行进一步说明，本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
地衣芽胞杆菌ccpC敲除载体的构建
步骤1：根据地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA序列中的ccpC基因(SEQ ID NO.1所示)的上、下游序列，设计ccpC基因的上游同源臂引物(A-F和A-R)、下游同源臂引物(B-F和B-R)；并以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，分别以ccpC基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ccpC基因的上游同源臂(833bp)和ccpC基因的下游同源臂(885bp)；
其中，A-F、A-R、B-F、B-R的序列为：
A-F：GCTCTAGAAAATGTGGATAGCCTGAC、
A-R：GAGTCCTGCCTTTCTAGTGTGGACATTCCTCATTCCAATAAGT、
B-F：ACTTATTGGAATGAGGAATGTCCACACTAGAAAGGCAGGACTC、
B-R：TGCGAGCTCCAAAGCCGTCCGTTCTCC；
步骤2：通过重叠延伸PCR将ccpC基因的上游同源臂和ccpC基因的下游同源臂连接到一起(所用引物为A-F和B-R)，构成目的基因片段(1718bp)；
步骤3：采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段和T2(2)-ori质粒进行双酶切得到酶切基因片段(1718bp),其中，所述的限制性内切酶BamHI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
将步骤(3)得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1851bp处出现电泳条带，说明整合表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子，命名为整合表达载体T2(2)-ccpC；
T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA
T2-R：GCAAGCAGCAGATTACGC。
实施例2：
ccpC敲除菌株的构建：
步骤1:将整合表达载体T2(2)-ccpC转入地衣芽胞杆菌WX-02中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1918bp处出现电泳条带，证明：整合表达载体T2(2)-ccpC成功转入地衣芽胞杆菌WX-02中，此时，该转化子为阳性转化子(即转入了整合表达载体T2(2)-ccpC的地衣芽胞杆菌WX-02)；
步骤2：将步骤1得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F与ccpC-YR为引物进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1851bp或2727bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，ccpC-YF和ccpC-YR的序列为:
ccpC-YF:CCATGAGTATGCCGTAGA、
ccpC-YR:AACGGCTTGACGACTTTC；
步骤3：将步骤2得到的PCR检测出现1851bp条带的单交换菌株接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为ccpC-YF和ccpC-YR)。若转化子的PCR验证结果为：在2727bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽胞杆菌WX-02；在1851bp处出现电泳条带时，说明ccpC基因成功敲除。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的ccpC敲除菌株，即地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC。
实施例3：
地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC对甘油的高效代谢：
1)种子发酵：平板上活化地衣芽胞杆菌WX-02及地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC，挑菌接至分别接种至含有50mL液体LB的250mL三角瓶中，37℃，180rpm培养10h。然后随后以1％(体积比)的接种量接种至发酵培养基中；
所述的发酵培养基申请人选择了两种培养基配方，编号1-9的为基本培养基，编号10-18的为聚γ-谷氨酸发酵培养基(表1)。
基本培养基的培养条件为37℃，180rpm培养24h。
聚γ-谷氨酸发酵培养基的培养条件为37℃，180rpm培养48h，发酵结束后测定甘油浓度。
采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中甘油进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1260液相色谱仪-蒸发光检测器(ELSD)检测；HPLC-ELSD检测条件：色谱柱Inertsil NH2(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为80％乙腈；流速为1mL/min；洗脱15min；柱温30℃；蒸发光检测器(ELSD)参数：N2流量1.6L/min，漂移管温度50℃。根据甘油标准品制作的标准曲线计算出发酵液中甘油的含量(见表2)。
所述聚γ-谷氨酸测定方法如下：
发酵液前处理：利用去离子水将发酵液稀释30倍，离心除菌体，再经0.22μm水相滤膜过滤后进行凝胶渗透色谱检测。凝胶渗透色谱检测条件为：采用TSK Gel G6000PWXL凝胶渗透色谱柱，检测波长220nm，进样量10μL，流动相为25mM的无水硫酸钠和乙腈的混合液，体积比8:1，流速0.5mL/min。根据聚γ-谷氨酸的标准品制作的标准曲线计算出发酵液中聚γ-谷氨酸的含量(表3)。
表1
Figure BDA0001650629900000051
Figure BDA0001650629900000061
表2
Figure BDA0001650629900000062
Figure BDA0001650629900000071
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽胞杆菌WX-02来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC对甘油的利用有了大幅提升(提高18.38％以上)，提高幅度最高的可达32.67％。说明：敲除ccpC提高了地衣芽胞杆菌的甘油利用速率。
申请人同时测定了在上述培养基编号为10-18中聚γ-谷氨酸的产量。从表3中可知，在在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，采用本发明的地衣芽胞杆菌WX-02ΔccpC能够显著提高菌株利用甘油合成聚γ-谷氨酸，提高幅度最低达10.7％，最高可达17.4％。本发明的技术方案在芽胞杆菌利用甘油高效合成生物基化学品方面具有重要的科研意义和应用价值。
表3WX-02ΔccpC和对照菌WX-02的聚γ-谷氨酸产量对比
Figure BDA0001650629900000072
Figure BDA0001650629900000081
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcagcttc aagagcttca catgcttgtc gttctggcgg aagaattaaa tatgcggaaa 60
gcggctgaac gtctgtttgt ttcccagccg gcattatccc agcggctgca gaccatcgag 120
aaatcatggg gaacgaaaat ttttttaaga tcgcaaaaag ggctgactgt cacgtctgcc 180
ggagaaaaaa ttatccagtt tgcaaaagat gtaacattgg aacaggaaaa agtgagagag 240
aatatagatg agctggaggg cgagatacac ggtacgctca aattggcggc cgcttcgatt 300
atcgggcagc attggcttcc gaacgttctg aaaacctacg ttaaacaata tccgaacgtc 360
aaaatctccc tcgtcaccgg ctggagcagc gaaatgctga aaagcctcta cgaagaccat 420
gttcatattg gcattatcag gggaaacccg gaatggaaag gccctaagca ctacttgatg 480
cgggacgaat tgtacctcgt cgatacagag atccgaaaca ttgaggacat tgccaaaacg 540
gaacggccgt tcatccagtt caaaagcgac agcacgtact atcaggaaat tcagcactgg 600
tggcaccaaa agttcaaaac atcgccgaaa caaaccatta ttgtcgacca aattgaaaca 660
tgcaaacaga tggctttcca cggaatcggt tatgcgatcc ttccatcggt gacgcttcac 720
ggaagcggga gccatgttca ccaaatccct ttgcttgatg ctaaaggaaa agcaatcggc 780
agagatacgt ggctgctcgg ttatgagccg gctttccagc tgaagcaagt acaggcgttt 840
gtagaagttg tgaaagaatg tacggcaatg gaa 873

Claims (6)

1.一种高效代谢甘油的地衣芽胞杆菌的制备方法，其特征在于：利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中ccpC。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）为地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
（1）根据地衣芽胞杆菌WX-02中调控因子基因ccpC序列，采用PCR的方法扩增出ccpC上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到ccpC的敲除载体T2(2)-ccpC；
所述的同源臂序列A的扩增引物为A-F和A-R、同源臂序列B的扩增引物为B-F和B-R，A-F、A-R、B-F、B-R的序列为：
A-F ：GCTCTAGAAAATGTGGATAGCCTGAC、
A-R ：GAGTCCTGCCTTTCTAGTGTGGACATTCCTCATTCCAATAAGT、
B-F ：ACTTATTGGAATGAGGAATGTCCACACTAGAAAGGCAGGACTC、
B-R ：TGCGAGCTCCAAAGCCGTCCGTTCTCC；
（2）将T2(2)-ccpC电转化至地衣芽胞杆菌WX-02中，对阳性转化子进行菌落PCR验证和抽质粒验证；将阳性转化子转接培养数次后，得到ccpC基因的上游同源臂或ccpC基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
挑选ccpC基因的同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株接种于37°C、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选双交换菌株，对于阳性克隆进行PCR验证并进行测序，得到ccpC基因敲除的地衣芽胞杆菌WX-02△ccpC。
4.权利要求1所述的制备方法在制备高效代谢甘油的地衣芽胞杆菌中的应用。
5.权利要求1所述的制备方法在生产聚γ-谷氨酸中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，应用过程中所用的发酵培养基配方： 60-100 g/L甘油，8-16 g/L柠檬酸钠，5-15 g/L NaNO3，20-40 g/L谷氨酸钠。
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