CN115124605B - 耐高温元件突变体及其在生产氨基酸中的应用 - Google Patents
耐高温元件突变体及其在生产氨基酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明利用谷氨酸棒杆菌高温适应性实验室进化，得到两株对高温胁迫耐受性增强的菌株。通过对耐高温菌株全基因组重测序，得到了2个对高温耐受性增强的元件hrca，fasr突变体。在出发菌株中分别过表达上述2个突变体，与对照菌株相比，其对42℃高温耐受性提高分别约22.5％，34.2％；两个突变体共同表达对高温耐受性提高约55.6％，并且不会影响菌体的正常生长。因此，本发明的有益突变体可以为工业化高效生产氨基酸奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及挖掘对高温胁迫耐受性增强的元件突变体及其在生产氨基酸中的应用。
背景技术
氨基酸在医药行业、婴幼儿食品、强化食品、保健食品、化学工业、动物饲料添加剂和化妆品行业中有着广泛的用途，且在过去几年里动物饲料添加剂用途成为推动国际氨基酸市场增长的最大原动力，世界氨基酸市场增量可观。过去几年，世界氨基酸市场复合增长率为5.6％，到2022预计年总销售量将达1105万吨，届时总销售额将到达惊人的354亿美元或者更高。谷氨酸棒杆菌作为工业大规模生产氨基酸的主要菌种，相较于其他微生物，具有灵活易改造的代谢网络，具有较强的遗传稳定性，对碳源及目标产物的高浓度耐受性等优势，随着合成生物学的发展，利用合成生物学技术和代谢工程把谷氨酸棒杆菌改造成高效的细胞工厂来提高氨基酸的产量逐渐成为研究的热门话题。
环境温度的变化是影响微生物生长的最重要因素之一，绝大部分工业微生物，对温度比较敏感，在较高的温度环境下发酵生产会影响其正常的生长和代谢，甚至死亡。当温度突然升高时，微生物的细胞膜会受到破坏，影响蛋白酶的活性以及细胞正常的代谢能力，为了不影响微生物正常的代谢活动，减少微生物工业发酵的成本，得到更高的生产率，需要改变其生理与生长特性使其具有更强的高温胁迫耐受性，更有利于工业发酵生产的要求，因此增强谷氨酸棒杆菌对高温耐受性是必需的。谷氨酸棒杆菌作为一种最常见的工业微生物，提高其对高温的耐受性能力对于发酵工业生产过程具有十分重要的应用价值，本发明挖掘和表征参与菌株抗高温的重要功能元件，构建具有抗高温能力的高效菌株。
发明内容
基于上述要求，本发明的首要目的在于挖掘对高温耐受性增强的元件，以使其在高温胁迫下的耐受性得到提高，利于微生物发酵生产氨基酸代谢产物。
本发明通过以下技术思路实现，野生谷氨酸棒杆菌经过连续高温胁迫适应性实验室进化得到两株对高温耐受性提高2倍的耐高温菌株WH4-1和WH59-1，为了找到对高温耐受性提高的潜在元件，对其全基因组重测序，通过测序结果分析得到13个突变元件，并以得到的耐高温谷氨酸棒杆菌C. glutamicumATCC13032基因组为模板，采用一步法高效无缝克隆技术（ClonExpress®II One Step Cloning Kit，Vazyme Biotech, China），将其构建到表达载体pXMJ19上，获得含有突变的13个元件的重组质粒。将重组质粒导入野生C. glutamicumATCC 13032中，将重组菌株接到含20 mlLBH（含氯霉素）培养基的摇瓶里活化20h，接着把活化后的菌液转接到同样含有20 mlLBH（含氯霉素）培养基的摇瓶中，转接起始OD值为0.1，摇瓶容量100 ml，在42℃高温胁迫环境下进行为期20 h的生长测试，在OD值达到0.4时加入终浓度为50 μmol/L的IPTG（诱导剂），最终测定其OD值。最终筛选获得2个对高温胁迫耐受性提高的突变元件hrca和fasr，其突变位点分别为L119P，L102F。最后，对获得的有益突变体L119P，L102F进行组合突变，得到L119P-L102F突变组合，该突变体能赋予底盘菌最高的高温耐受能力。
由此，本发明提供来自谷氨酸棒杆菌的热激蛋白hrca突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅hrca第119位由亮氨酸L突变为赖氨酸P，更具体地，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
因而提供所述的热激蛋白hrca突变体的编码基因，优选地，其核苷酸序列如SEQID No.5所示。
本发明还提供来自谷氨酸棒杆菌的转录调控因子fasr突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.4所示氨基酸序列而言，仅fasr第102位由亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，更具体地，其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
因而也提供所述的转录调控因子fasr突变体的编码基因，优选地，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
进一步提供含有所述的编码基因的表达载体、重组宿主细胞。优选地，所述的重组宿主细胞为谷氨酸棒杆菌。
本发明还提供所述的编码基因在增强重组菌的高温耐受性中的应用。
本发明进一步提供一种对高温耐受性增强的重组菌，其特征在于，其出发菌株中过表达所述的编码基因，优选地将所述热激蛋白hrca突变体的编码基因和所述转录调控因子fasr突变体的编码基因同时导入并进行过表达。
优选地，其出发菌株是谷氨酸棒杆菌。
另外，本发明还提供利用所述的重组菌生产氨基酸的方法，包括培养所述重组菌，并收集产生的氨基酸的步骤。
本发明有益效果在于，通过高温适应性实验室进化得到耐高温菌株，对其基因组全测序找到突变元件，通过突变元件在质粒进行高温测试筛选，获得了能够对高温耐受性提高的突变元件hrca和fasr，可将底盘菌株的高温耐受性分别提高约22.5％和34.2％，hrca和fasr组合突变可将底盘菌株的高温耐受性提高约55.6％。因此，本发明提供的高温耐受性元件hrca，fasr为高效发酵生产氨基酸及下游产物奠定了良好基础。
附图说明
图1 耐高温谷氨酸棒杆菌在不同温度环境的生长测试。
图2 谷氨酸棒杆菌13个突变元件在pXMJ19质粒上过表达高温耐受性生长测试。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明，但并不应理解为对本发明的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1高温胁迫适应性实验室进化野生谷氨酸棒杆菌
所述的谷氨酸棒杆菌是以野生谷氨酸棒杆菌（C.glutamicumATCC13032）为出发菌株，通过连续高温胁迫适应性实验室进化筛选得到的对高温耐受性提高约2倍的耐高温菌株WH4-1和WH59-1。具体步骤如下：取实验室保存的野生谷氨酸棒杆菌在LBH固体培养基平板上划线，将平板上已长好的菌接到含20 ml LBH液体培养基摇瓶里活化，摇瓶容量100ml，将已活化的谷氨酸棒杆菌按5％的接种量转接到含20 mlLBH培养基摇瓶里，摇瓶容量100 ml（同上），放置在40℃的摇床中培养24 h，作为第一代菌，将第一代传代菌依然按5％转接到同样含有20 mlLBH培养基的摇瓶里，作为第二代菌，依次重复上述操作，每隔3代保存一次菌株。每隔6代重新在平板上划线，选取较大的单菌落接到摇瓶里活化，活化后的菌液按5％的接种量转接到摇瓶里，继续放置在40℃摇床培养。经过30代后发现菌株在40℃的生长耐受性提高，从第31代菌开始在41℃摇床中培养，重复上述操作。经过120天的传代培养，最终得到在42℃环境下对高温耐受性提高约2倍的耐高温菌株，并测得其在各个温度下（30℃，32℃，35℃，37℃，40℃，42℃，43℃）的生长情况，如图1所示，不同温度下的生长试验表明，与非适应菌株相比，两种适应菌株对40°C以上高温度的耐受性显著提高。特别是，当细胞在42°C下生长时，两种适应菌株的生物量约为野生型菌株的2.5倍。
实施例2全基因组重测序得到突变元件的重组质粒构建
本发明通过将实施例1的经过高温传代的耐高温菌株全基因组重测序分析得到13个突变元件，将这些元件在pXMJ19质粒上过表达，构建13个突变元件的重组质粒。其中hrca核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2，hrca突变体核苷酸序列为SEQ IDNo.5，氨基酸序列为SEQ ID No.6；fasr核苷酸序列为SEQ ID No.3，氨基酸序列为SEQ IDNo.4，fasr突变体核苷酸序列为SEQ ID No.7，氨基酸序列为SEQ ID No.8。具体构建方法：采用高保真性的Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶，分别以获得的耐高温谷氨酸棒杆菌基因组和pXMJ19质粒为模板，设计目的基因和pXMJ19的上下游引物，利用PCR方法获得突变目的基因片段和质粒骨架，利用goldengate方法连接pXMJ19质粒骨架和目的基因，获得含有目的编码基因不同突变体的重组表达质粒。为了保证质粒骨架扩增中的序列正确性，采用目前商用的高效超保真DNA聚合酶进行PCR反应，本发明采用的PCR体系为：10 μL 5 ×Phusion HF缓冲液、0.5 μM上游引物P1、0.5 μM上游引物P2，200 μM dNTPs、3% DMSO、50 ng模板DNA、0.5 μLPhusion High-Fidelity DNA聚合酶 (Thermo Scientific, USA)，加入无菌的水补齐至50 μL体系。PCR反应程序为：98℃预变性1 min；98℃变性10 s；62℃退火20s；72℃延伸3 min，循环35次；72℃延伸 5 min，4℃保存。goldengate连接体系为：T4 DNALegase buffer 1.5μL，T4 DNA Legase 1μL，BsaI 1μL，10×BSA 1.5μL，质粒骨架、片段（摩尔比为1:1，共10μL）,总体积为15μL。PCR连接条件：37℃ 3min，22℃ 4min（40个循环）；22℃30min（1个循环）；80℃5min（1个循环）；4℃10min（1个循环）。然后将上述获得的质粒文库按照常规的大肠杆菌热激转化法，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
质粒骨架引物：
pXMJ19-F：5'-CACCAGGTCTCACTAAGGATCCCCGGGTACCGAGC-3'
pXMJ19-R：5'-CACCAGGTCTCAAAGCTTAATTAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTA-3'
突变目的基因引物：
rp1D-F-BsaI：5'-CACCAGGTCTCAAAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAATCTGAAGCTGGA-3'
rp1D-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCTTAGTTCTGCTCCTCCTGTGCC-3'
cg0892-F-BsaI
5'-CACTACTGGTCTCAAAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATTTGCCTTGTAGATTGGTAAA-3'
cg0892-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCATACCTTAGTTCTTGTCGGAGGTTCCTTCAG-3'
cg0938-F-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATGTGCCTGTCGGAACAGTGAAGTG-3'
cg0938-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCTTAAGACTCAAGCTCCTTCGCAACAACGC-3'
gltA-F-BsaI
5'-CACTACTGGTCTCAAAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGTTTGAAAGGGATATCG-3'
gltA-R-BsaI
5'-CACTACTGGTCTCAATCCTTAGCGCTCCTCGCGAGGAA-3'
leuc-F-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCAGCCCCGTGGAGAACAG-3'
leuc-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCTTAGATATCTGCAGGTGAGGACAGGGTGCC-3'
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cg2106-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCTTAAGCTTCCGGAGTTTCTTTGTGATCC-3'
hrcA-F-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTGAGTGCAACAGAGAAAC-3'
hrcA-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCCTATTCGCCAGCGAGCACAC-3'
cg2614-F-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCGACATCACGTCGAG-3'
cg2614-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCTTAGTTTTCGAACACGTCCGTAT-3'
cg2737-F-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGCCTCGCCGCCGTC-3'
cg2737-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCCTATCCAGTAGCCACGGAGAAGAGGTAAG-3'
cg3078-F-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATGTGGGCAAGCAGGAAAAG-3'
cg3078-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCCTATAACGCCCTGAAAATTACCCCCTGAG-3'
dnaK-F-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAAAGCTTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGACGTGCAGTAGGAA-3'
dnaK-R-BsaI：5'-CACTACTGGTCTCAATCCTTACTTCTTGTCCTCACCATTGTCA-3'。
实施例3高温胁迫耐受性提高的突变元件筛选
高温胁迫耐受性突变元件的筛选主要依据是C. glutamicumATCC13032在高温胁迫的生长测试，对比含空pXMJ19质粒的野生菌株与实施例2中的重组质粒的OD值，得到对高温耐受性提高的突变元件。
具体筛选步骤为：通过电转化法将已构建完成的重组质粒导入野生谷氨酸棒杆菌C. glutamicumATCC13032中，将重组菌株接到含20 mlLBH（含氯霉素）培养基的摇瓶里活化20 h，接着把活化后的菌液转接到同样含有20 mlLBH（含氯霉素）培养基的摇瓶中，转接起始OD值为0.1，摇瓶容量100 ml，在OD值达到0.4时加入终浓度为50 μmol/L的IPTG（诱导剂），在42℃高温胁迫环境下进行为期20h的生长测试，测定其OD值。如图2所示，hrca和fasr与对照菌株（含pXMJ19空质粒的谷氨酸棒杆菌）相比，其42℃高温耐受性分别提高约22.5％和34.2％，最终确定hrca-L119P和fasr-L102F是对高温耐受性提高的功能元件。基于谷氨酸棒杆菌的基因组注释，谷氨酸棒杆菌在KEGG和NCBI数据库中，hrcA编码热诱导转录抑制因子，参与负调控热休克基因的表达，如grpE-dnaK-dnaJ和groELS操纵子；fasR编码一种tetr型转录调控因子，控制脂质合成的表达。
所述LBH培养基中含有的成分及其浓度分别为：酵母提取物2.5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，D-山梨醇91 g/L，脑心浸液18.5 g/L，加入的氯霉素终浓度为25 μg/L。
实施例4hrca和fasr组合突变进一步提高耐高温能力
针对实施例3中获得的2个有益突变体（hrca，fasr），采用定点组合突变的策略，将hrca第119位由亮氨酸L突变为赖氨酸P，fasr第102位由亮氨酸L突变为苯丙氨酸F的突变元件组合在pXMJ19质粒上一起表达，通过实施例3的测试方法测得hrca-L119P和fasr-L102F组合突变对高温耐受性。
实验结果如下：
表1谷氨酸棒杆菌hrca-L119P、fasr-L102F及hrca-L119P和fasr-L102F组合突变高温耐受性生长测试
| 平行1 | 平行2 | 平行3 | |
| WT-vector | 1.869 | 1.617 | 1.572 |
| hrcA-L119P | 2.088 | 2.005 | 2.105 |
| fasR-L102F | 2.109 | 2.386 | 2.295 |
| hrcA-L119P+fasR-L102F | 2.593 | 2.674 | 2.602 |
本发明以WT-vector为对照菌株，对hrca-L119P、fasr-L102F及hrca-L119P和fasr-L102F组合突变进行生长测试。结果如表1所示，单点突变hrca-L119P或fasr-L102F相对于对照菌株提高了高温耐受性，但hrca-L119P和fasr-L102F组合突变对高温耐受性提高约55.6％，相较于单点突变hrca-L119P或fasr-L102F进一步提高了高温耐受性。
所述组合突变引物分别如下：
hrca-F：5'-TTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGGTGAGTGCAACAGAGAA-3'
hrca-2R：5'-GCCGGACGGCGGCGAGGCATCTATTCGCCAGCGAGCACAC-3'
fasr-3F：5'-GTGTGCTCGCTGGCGAATAGATGCCTCGCCGCCGTCCGGC-3'
fasr-4R：5'-AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCTATCCAGTAGCCACGGAGA-3'。
<110>吉林大学
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ggcgaatag 1029
<210>6
<211> 342
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 6
MVSATEKRRYEVLRAIVADYIASQEPVGSKSLLERHKLNVSSATIRNDMSVLESDGFIVQ
EHASSGRVPTERGYRLFVDSIHDIKPLSLAERRAILGFLEGGVDLEDVLRRSVQLLSQPT
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YGSQGSALGGLGVVGPTYMDYSGTISKVSAVAKYVGRVLAGE 342
<210>7
<211>612
<212>DNA
<213>人工序列
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gctactggatag 612
<210>8
<211> 203
<212> PRT
<213>人工序列
<400>8
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ICELDRVDTAEAVAELKKFSDQVPALQWPDILDEFIEHLARFWRDDPSRRAVWHAIQSTP
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DFDSIVEEIKRMLISYLFSVATG 203
Claims (9)
1.来自谷氨酸棒杆菌的热激蛋白hrca突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示。
2.如权利要求1所述的热激蛋白hrca突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
3.来自谷氨酸棒杆菌的转录调控因子fasr突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.8所示。
4.如权利要求3所述的转录调控因子fasr突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。
5.含有如权利要求2或4所述的编码基因的表达载体或重组宿主细胞。
6.如权利要求5所述的重组宿主细胞为谷氨酸棒杆菌。
7.如权利要求2或4所述的编码基因在增强谷氨酸棒杆菌的高温耐受性中的应用。
8.一种对高温耐受性增强的重组菌，其特征在于，其在出发菌株中过表达如权利要求4所述的编码基因，或将权利要求2所述的热激蛋白hrca突变体的编码基因和权利要求4所述的转录调控因子fasr突变体的编码基因同时导入并进行过表达；其出发菌株是谷氨酸棒杆菌。
9.利用权利要求8所述的重组菌生产氨基酸的方法，包括培养所述重组菌，并收集产生的氨基酸的步骤。
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