CN117143900A - 敲除amtR基因的产杆菌肽工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌及其制备方法和应用，其中的产杆菌肽工程菌是采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的amtR基因，获得的敲除了amtR基因后的重组菌株，所述amtR基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中所示。本发明为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。并且，与地衣芽胞杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽胞杆菌重组菌株DW2△amtR的杆菌肽产量提高了18%以上。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和发酵工程领域，尤其涉及敲除amtR基因的产杆菌肽工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
地衣芽胞杆菌是国际公认的具有生物安全性（GRAS）的工业微生物菌株，其具有遗传背景清晰、鲁棒性强、性状稳定等优点，因而被广泛应用于发酵生产聚γ-谷氨酸、地衣素、苯乙醇、杆菌肽等生物化工产品。
杆菌肽是一种由枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌合成的多肽类抗生素，其可以强烈抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素组合使用具有协同增强效果，因而被广泛应用于饲料添加和兽药行业。杆菌肽的结构包括鸟氨酸（Orn）、D-苯丙氨酸（D-Phe）、组氨酸（His）、D-天冬氨酸（D-Asp）、天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）、D-谷氨酸（D-Glu）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）11种氨基酸。近年来，关于杆菌肽高产的策略主要集中在增强杆菌肽前体氨基酸的供给水平上；也有通过改造转录调控因子（例如PhoP、KipR、Lrps）来提高杆菌肽产量的报道，但是，PhoP、KipR、Lrps转录因子在细菌中的作用机理尚不明确，并且，也未见这些转录因子与转录因子AmtR（包括转录因子AmtR、AmtR的编码基因及AmtR的调控对象）之间关联性的任何相关报道。
并且，转录因子AmtR由amtR编码，属于TetR家族成员，其在细菌中主要参与调控氮代谢过程，包括铵利用、尿素代谢、信号转导等。然而，目前铵盐利用效率与氨基酸合成水平之间的关系也尚不可知，且由于杆菌肽合成前体氨基酸种类较多，芽胞杆菌氨基酸代谢具有严格、复杂的调控机制，并没有任何证据证明铵利用与氨基酸合成、杆菌肽产量之间存在紧密关联。此外，也没有报道表明AmtR能够调控菌体的生长。因此，关于转录因子AmtR与杆菌肽合成水平之间的关系尚不清楚，也不可预知。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌的方法，其制备的产杆菌肽工程菌发酵生产杆菌肽的能力更强。
一种敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌的方法，其是采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的amtR基因，获得敲除了amtR基因后的重组菌株（即所述产杆菌肽工程菌），所述amtR基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中所示。
本发明通过基因工程的方法在地衣芽孢杆菌的基因组内成功敲除转录调控因子AmtR的编码基因—amtR基因，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。
优选的，所述地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2（Bacillus licheniformis DW2），其已于2011年10月12日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO: M2011344，地衣芽胞杆菌DW2为现有的一种高产杆菌肽的菌株，以此作为出发菌株，所得到的重组菌株的杆菌肽产量更高。
优选的，所述采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的amtR基因，包括如下步骤：
（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组为模板，通过PCR扩增出amtR基因的上游同源臂和下游同源臂；
（2）利用重叠延伸PCR将步骤（1）的上游同源臂和下游同源臂连接在一起，得到同源臂融合片段；
（3）用限制性内切酶BamH I和Xba I对步骤（2）中得到的同源臂融合片段进行双酶切，得到酶切融合片段A；同时采用BamH I和Xba I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切后线性质粒片段；
（4）将步骤（3）得到的酶切融合片段A和线性质粒片段经 T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以卡那霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到amtR基因的敲除质粒T2(2)-ori-amtR；
（5）将步骤（4）中构建的T2(2)-ori-amtR转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那青霉素抗性筛选得到阳性转化子；
（6）将步骤（5）中菌落PCR验证正确的阳性转化子经过数次转接培养，并进行菌落PCR检测，筛选得到amtR基因的上游臂或amtR基因的下游臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（7）将步骤（6）中得到的阳性单交换结合子菌株经过数次转接培养，结合PCR法筛选得到敲除了amtR基因的地衣芽胞杆菌，命名为：DW2△amtR。
本发明的目的之二在于提供一种敲除amtR基因的产杆菌肽工程菌，其为采用本发明的目的之一的所述敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌的方法构建得到的重组菌株。
本发明的目的之三在于提供本发明的目的之二所述的产杆菌肽工程菌在杆菌肽生产中的应用，包括种子培养和发酵培养。
以上所述应用中，所述发酵培养所使用的发酵培养基配方为60-100 g/L豆粕；30-50 g/L玉米淀粉；4-8 g/L 碳酸钙和0.5-2 g/L 硫酸铵。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明首次通过在地衣芽胞杆菌中敲除amtR基因来提高杆菌肽产量，为杆菌肽高产提供了一种新策略。与地衣芽胞杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽胞杆菌重组菌株DW2△amtR的杆菌肽产量提高了18%以上。本发明的研究结果表明：通过敲除amtR基因来提高杆菌肽产量是一个十分有效且可行的方法。
附图说明
图1为步骤（1）得到的amtR基因的上游同源臂和amtR基因的下游同源臂的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M为DNA marker，泳道1为amtR基因的上游同源臂，泳道2为amtR基因的下游同源臂；
图2为步骤（2）得到的同源臂融合片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为同源臂融合片段；
图3为步骤（4）得到的敲除载体T2(2)-ori-amtR进行菌落PCR验证图，其中，泳道M为DNA marker，泳道1为敲除载体T2(2)-ori-amtR进行菌落PCR验证的条带；
图4为步骤（5）得到的阳性转化子菌株进行菌落PCR验证图，其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为阳性转化子菌株的验证条带；
图5为步骤（7）得到的敲除了amtR基因的地衣芽胞杆菌DW2△amtR的验证条带，其中，泳道M为DNA marker，泳道1为地衣芽胞杆菌DW2△amtR的验证条带；
其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp。
实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1
一种敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌的方法，其是采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的amtR基因，获得敲除了amtR基因后的重组菌株，即所述产杆菌肽工程菌，所述amtR基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中所示。其中，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2，其已于2011年10月12日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2011344。所述采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的amtR基因的具体步骤如下：
（1）根据地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA序列中的amtR基因的基因序列，设计amtR基因的上游同源臂引物（amtR-F1、amtR-R1）和下游同源臂引物（amtR-F2、amtR-R2）；并以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以amtR基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到amtR基因的上游同源臂片段和amtR基因的下游同源臂片段（如图1所示，amtR基因的上游同源臂片段为582 bp，amtR基因的下游同源臂片段为585 bp）；
其中，amtR-F1、amtR-R1、amtR-F2、amtR-R2的序列为：
amtR-F1：CGGGATCC TTTCTCATCCTTTGACCACG
amtR-R1：CATCAGAAATCCCCCTTTTGATCATCATTCCTTTTC
amtR-F2：GAAAAGGAATGATGATCAAAAGGGGGATTTCTGATG
amtR-R2：GCTCTAGA ATGTAACGGGATCTGCCG
（2）以amtR基因的上游同源臂片段和amtR基因的下游同源臂片段为模板，上游同源臂引物amtR-F1、下游同源臂引物amtR-R2为引物，通过重叠延伸PCR将amtR基因的上游同源臂和amtR基因的下游同源臂连接到一起，得到同源臂融合片段（如图2所示，同源臂融合片段为1247bp）；
（3）采用XbaI和BamHI限制性内切酶对步骤（2）中的同源臂融合片段进行双酶切得到酶切融合片段；
（4）准备质粒 T2(2)-ori（其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献下述文献：郭兴华,熊占等(1991).枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建[J].生物工程学报.7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002).短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建[J] .生物工程学报.18(4):438-441），并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段（4250bp）；其中，所述的限制性内切酶XbaI和BamHI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
（5）将步骤（3）的酶切基因片段和步骤（4）的线性质粒片段经T4 DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，用引物T2-F和T2-R对转化子进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R）。转化子的PCR验证结果为：在1535 bp处出现电泳条带（如图3所示），则说明敲除载体构建成功，命名为：敲除载体T2(2)-ori-amtR；
其中，T2-F和T2-R的序列为:
T2-F： ATGTGATAACTCGGCGTA、
T2-R： GCAAGCAGCAGATTACGC；
（6）将敲除载体T2(2)-ori-amtR通过电击转换的方法转入地衣芽胞杆菌DW2中，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，用引物T2-F和T2-R对筛选得到的转化子进行菌落PCR验证。若转化子的PCR验证结果为：在1535 bp处出现电泳条带，证明：敲除载体T2(2)-ori-kipR成功转入地衣芽胞杆菌DW2中，该转化子为阳性转化子；
（7）将步骤（6）得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12 h，并以T2-F和amtR-KYR为引物（或以T2-R与amtR-KYF为引物）进行菌落PCR验证单交换菌株，若电泳条带大小为1479 bp或2094 bp，即证明为单交换成功的菌株（如图4所示）；
其中引物amtR-KYF和amtR-KYR的序列为：
amtR-KYF：GACGCCGTTGTCGGAAGC
amtR-KYR：TGATTTGCGGAGCGGACT
（8）将步骤（7）得到的单交换菌株接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过3～6次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证（引物为amtR-KYF和amtR-KYR）。若转化子的PCR验证结果为：在1993 bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽胞杆菌DW2；在1378 bp处出现电泳条带时，说明amtR基因在地衣芽胞杆菌DW2中被成功敲除，该转化子为阳性转化子（如图5所示）。随后对阳性转化子进一步测序验证，得到敲除了amtR基因的地衣芽胞杆菌DW2△amtR。
接着，本申请人还采用上述构建得到的地衣芽胞杆菌DW2△amtR来发酵生产杆菌肽。其中，地衣芽胞杆菌DW2△amtR在杆菌肽生产中的应用，包括种子培养和发酵培养。
所述种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌DW2△amtR活化，即从甘油管以1%的体积百分比接种于装有5mL LB培养基中，在230 r/min、温度37℃条件下培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以1%体积百分比的接种量接种于种子培养基后于230r/min、37℃中培养12小时，得到种子培养液（所述的种子培养基的配方为：10 g/L 蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L氯化钠，pH 7.2）。
所述发酵培养的具体步骤为：向250mL三角瓶中装入20mL的不同配方的发酵培养基（具体配方见表1，表1中各实施例中所使用的发酵培养基的pH均自然，然后将种子培养的菌液以接种量为3%（体积百分比）接入，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，即得到发酵液。
本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18 (5μm ,4.6 mm× 250 mm) ；流动相为A:B＝35:65 (A相：100 mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300 mL水中混合均匀；B相：520 mL甲醇与40 mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30°C；紫外检测器波长：254 nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。
表1
表2
从表2可看出：在相同发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽胞杆菌DW2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌DW2△amtR的发酵液中杆菌肽产量明显提高（提高18%以上），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量方面具有重要应用价值。
本发明对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌的方法，其特征在于，采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的amtR基因，并获得敲除了amtR基因后的重组菌株，即所述产杆菌肽工程菌，所述amtR基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1中所示。
2.根据权利要求1所述的敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌的方法，其特征在于，所述地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2，其已于2011年10月12日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2011344。
3.根据权利要求2所述的敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌的方法，其特征在于，所述采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的amtR基因，具体包括如下步骤：
（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组为模板，通过PCR扩增出amtR基因的上游同源臂和下游同源臂；
（2）利用重叠延伸PCR将步骤（1）的上游同源臂和下游同源臂连接在一起，得到同源臂融合片段；
（3）用限制性内切酶BamH I和Xba I对步骤（2）中得到的同源臂融合片段进行双酶切，得到酶切融合片段A；同时采用BamH I和Xba I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切后线性质粒片段；
（4）将步骤（3）得到的酶切融合片段A和线性质粒片段经 T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以卡那霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到amtR基因的敲除质粒T2(2)-ori-amtR；
（5）将步骤（4）中构建的T2(2)-ori-amtR转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那青霉素抗性筛选得到阳性转化子；
（6）将步骤（5）中菌落PCR验证正确的阳性转化子经过数次转接培养，并进行菌落PCR检测，筛选得到amtR基因的上游臂或amtR基因的下游臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（7）将步骤（6）中得到的阳性单交换结合子菌株经过数次转接培养，结合PCR法筛选得到敲除了amtR基因的地衣芽胞杆菌，即地衣芽胞杆菌DW2△amtR。
4.一种敲除amtR基因的产杆菌肽工程菌，其为采用权利要求1～3中任一项所述的敲除amtR基因制备产杆菌肽工程菌的方法构建得到的重组菌株。
5.权利要求4所述的敲除amtR基因的产杆菌肽工程菌在杆菌肽生产中的应用，包括种子培养和发酵培养。
6.根据权利要求5所述的敲除amtR基因的产杆菌肽工程菌在杆菌肽生产中的应用，其特征在于：所述发酵培养所使用的发酵培养基配方为60-100 g/L豆粕；30-50 g/L玉米淀粉；4-8 g/L 碳酸钙和0.5-2 g/L 硫酸铵。
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