CN108531438B - 地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，本发明通过基因工程的方法通过在地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中敲除bcaP基因，得到地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP，相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了11％以上。

Description

地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用

技术领域

本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法及所得菌株的应用。

背景技术

地衣芽孢杆菌通过非核糖体合成酶能够合成次级代谢产物—杆菌肽。杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸(Orn)，D-苯丙氨酸(D-Phe)，异亮组氨酸(His),D-天冬氨酸(D-Asp), 天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys),D-谷氨酸(D-Glu)，半胱氨酸(Cys)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)11种氨基酸。杆菌肽为一种广谱抗菌素，其主要通过抑制细胞壁的合成来抑制细菌的生长。杆菌肽能够有效抑制革兰氏阳性菌，如梭状芽孢杆菌属、葡萄球菌属，链球菌属、棒状杆菌属和奈瑟球菌属等，对部分革兰氏阴性菌如脑膜炎双球菌、流感杆菌、放线菌也有较好的抑制作用。杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。

目前，鉴于组成杆菌肽的这12种氨基酸在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌内的含量并不清楚，哪种或哪几种氨基酸是限制杆菌肽高产的关键氨基酸也尚不清楚。并且，虽然，现有技术中已公布：氨基酸转运蛋白BcaP是芽胞杆菌体内一种重要的氨基酸转运蛋白。但是，关于BcaP具体会影响哪些氨基酸的转运并不清楚，关于BcaP是负责目标氨基酸的转入还是转出也不清楚。再加上，细胞内的氨基酸具有严格、且复杂的调控机制，因此，想要通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌来提高杆菌肽产量并非易事。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法，此构建方法是通过敲除地衣芽孢杆菌DW2基因组中的氨基酸转运蛋白(简称“BcaP”)的基因(简称“bcaP”)来构建地衣芽孢杆菌基因工程菌，所得到的基因工程菌的杆菌肽产量有了大幅提升。

一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 的方法，包括以下步骤：

(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

(2)采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；

(3)准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对质粒T2(2)-ori 进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；

(4)将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP；

(5)将bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到bcaP基因的上游臂或bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

(6)挑选bcaP基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA 产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除bcaP基因的地衣芽胞杆菌DW2 ΔbcaP；

其中，上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO： M2011344的地衣芽孢杆菌DW2(即Bacillus licheniformis DW2)；

所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的bcaP基因为SEQUENCE LISTING中所示。

本发明的目的之二在于根据上述通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP。

本发明的目的之三在于根据上述通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，其应在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。

所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉， 7-10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2。

所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO₃和0.5-2g/L(NH₄)₂SO₄。

附图说明

图1为bcaP基因的上游同源臂和下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为bcaP基因的上游同源臂，泳道3为bcaP基因的下游同源臂；

图2为融合基因序列A的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2 为融合基因序列A；

图3为bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP进行菌落PCR验证图；其中，泳道1 为DNAmarker，泳道2为bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP的验证条带；

图4为阳性单交换结合子菌株的菌落PCR验证图，泳道1为DNA marker，泳道 2为bcaP基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株的验证条带，泳道3为bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2 基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株的验证条带；

图5为地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP的PCR验证图，泳道1为DNA marker，泳道 2为地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP的验证条带；

其中，图1-图5中的DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

具体实施方式

一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 的方法，包括以下步骤：

(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

(2)采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；

(3)准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对质粒T2(2)-ori 进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；

(4)将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP；

(5)将bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到bcaP基因的上游臂或bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

(6)挑选bcaP基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA 产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除bcaP基因的地衣芽胞杆菌DW2 ΔbcaP；

其中，上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO： M2011344的地衣芽孢杆菌DW2(即Bacillus licheniformis DW2)；

所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的bcaP基因为SEQUENCE LISTING中所示。

一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 的方法的具体实施方式如下：

1、步骤(1)的具体操作步骤为：

以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出bcaP基因的上游同源臂(626bp，所用引物为bcaP-F1和bcaP-R1)和bcaP基因的下游同源臂(630bp，所用引物为bcaP-F2和bcaP-R2)；再利用重叠延伸PCR方法将bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A(1043bp)；其中，用于扩增bcaP基因的上、下游同源臂的引物为：

bcaP-F1：GCGAGCTCGCTCTGAAGAAATCGGTAAAG、

bcaP-R1：AGATAACACTTAAGAGAATACACACCCCAAGCCGCGACAAA、

bcaP-F2：TTTGTCGCGGCTTGGGGTGTGTATTCTCTTAAGTGTTAT、

bcaP-R2：GCTCTAGACCGGCTTGATGATAAAGGTA；

2、步骤(2)的具体操作步骤为：

采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A(1039bp)；

3、步骤(3)的具体操作步骤为：

准备质粒T2(2)-ori(其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献下述文献：郭兴华, 熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报 7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441)，并采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI 对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori(4250bp)；其中，所述的限制性内切酶XbaⅠ和BamHI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；

4、步骤(4)的具体操作步骤为：

将步骤(2)得到的酶切基因片段A与步骤(3)得到的线性质粒片段经DNA 连接酶(市售的DNA连接酶均可，通常为T4 DNA连接酶)进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1289bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子 (命名为：敲除载体T2(2)-ΔbcaP)；

将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori 中，得到bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP；并对bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori- bcaP进行PCR验证，其验证引物为：

T₂-F：ATGTGATAACTCGGCGTA、

T₂-R：GCAAGCAGCAGATTACGC；

5、步骤(5)的具体操作步骤为：

将bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP转入地衣芽孢杆菌DW2中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)，得到阳性转化子；将阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的转接培养数次后，并以T2-F和Δ bcaP-KYR为引物(或以T2-R与ΔbcaP-KYF为引物)进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1370bp或2506bp长度的条带，即证明为单交换菌株；

其中，ΔbcaP-KYF和ΔbcaP-KYR的序列为:

ΔbcaP-KYF：CGGGCGGAAATGCTTGAT、

ΔbcaP–KYR：CGGAATACCCGCTTCGTG；

6、步骤(6)的具体操作步骤为：

将步骤(5)得到的PCR检测出现1370bp条带的单交换菌株和步骤(5)得到的PCR检测出现2506bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为ΔbcaP-KYF和ΔbcaP-KYR)。若转化子的PCR验证结果为：在2368bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽孢杆菌DW2；在1232bp 处出现电泳条带时，说明DW2的基因组上的bcaP基因成功敲除，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的bcaP敲除菌株(即地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP)。

其中，其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344 的地衣芽孢杆菌DW2；

所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的bcaP基因为SEQUENCE LISTING中所示。

本发明人根据上述通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法构建得到了地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP。

本发明人还根据上述通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。

所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉， 7-10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2。

所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO₃和0.5-2g/L(NH₄)₂SO₄。

本发明人根据上述地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用步骤提供了15种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例15的种子培养基和发酵培养基的配方。

表1

其中，上述实施例中均采用本发明中构建得到地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP。其中，种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵的培养基后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2％(体积百分比)，转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。

本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为A:B＝35:65(A 相：100mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300mL水中混合均匀；B相：520mL甲醇与 40mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30℃；紫外检测器波长：254nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量(见表2)。

表2

从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌DW2来说，采用本发明的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升(提高11～14％)，说明：本发明的技术方案在提高地衣芽孢杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。

序列表

<110> 绿康生化股份有限公司

<120> 一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法及所得菌株的应用

<130> 2018

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1392

<212> DNA

<213> 地衣芽胞杆菌DW2(Bacillus licheniformis)

<400> 2

atgggaaaac agcaaatgaa aaaaacgatg tcgcagacgg atgtgctatt tttagcgatc 60

ggggcgatgc tcggctgggg ctgggtcgtc ctttccggcg actggatttc gacagccggc 120

tttatgggca gcaccgtcgc gtttatcatc ggcggcattc tcgtcatctt aatcgggtta 180

acgtacgcgg agctgtcttc cgccatccct gaaacgggag gcggcttgat attcgtctac 240

agggcgttcg gccgaaaaac ggcttttgtc gcggcttggg gtgtgctttt cggctatgtt 300

tcggtaatta catttgaggc ggtcgcattg ccgaccgtca ttgattacgt cctgcctgtc 360

gaacatcagg gctttctctg gtcgctaagc ggctgggacg tgtatgtcac ttgggtgttg 420

atcggttcag ggggtgcggt cgtcctgacc gcgctcaatt acttcggcgt caagccggcc 480

gcgatttttc agtcagtttt tacgatcgcg attatcgcca caggctttct ccttttgggc 540

ggcgccttgg tcaacggtaa tgttgaacat atgcagcccc tttttaaaga cggattttcc 600

gggatgatgt ccgtcctcgt catgattccg tttctgtttg tcggatttga cgtcatccct 660

caggttgcgg ctgaaattaa tgctccgaaa aaaattatcg gcaaaatttt gattatttcg 720

atcgtcagtg cggtcttgtt ttatttgctg attgtattcg gggtgacgat ggggctgtca 780

gaaagcgagc ttgcaacgac ttctttggcg accgcggatg ccatggtcaa tctgctcggg 840

aaccagctgt tcggcacggt gcttgtcctt ggcggagtcg ccggcatcat tacgagctgg 900

aacgcattta tcatcggcgc gagccgcatt ctgtttgcga tgtcggaaaa aggcatggtg 960

ccgaaatggt tcggtttcat ccatccgaag tataaaacac cgacgaacgc gattttgttt 1020

ctgggagcgc tggcgttttt tgcgccgctg ctcgggcgcc ctgcccttgt ttggatcgtc 1080

aatgcagggg gaacaggtat tatagtcgga tatttgatcg tctcgattgc attcatgaag 1140

ctgagaaaga cagagccgga tttaaacaga ccgtataaaa tcaataagtg gaaaacgacg 1200

ggtatatctg ctattctctt aagtgttatc tttctcgcct tttatttgcc aggtatgccg 1260

gccgcgctca catggccgta tgaatggctg atcttggcgg gatggacatt gatcggtttt 1320

cttttattca acagcagttc aaaacgtaaa ggggaggaga ttcaacatga ccagcatgct 1380

agaagtatat aa 1392

Claims (4)

1.通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，所述的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP的具体构建方法包括以下步骤：

（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

（2）采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；

（3）准备质粒 T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；

（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP；

（5）将bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP转入地衣芽孢 杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到bcaP基因的上游臂或bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（6）挑选bcaP基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除bcaP基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP；

其中上述步骤中的地衣芽孢杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；

所述地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA序列中的bcaP基因如SEQ ID NO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，该应用步骤包括： A种子发酵，B生产发酵。

3.根据权利要求2所述的通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。

4.根据权利要求2所述的通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO₃和0.5-2 g/L (NH4)₂SO₄。

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