CN109913488B - 一种提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过敲除碳代谢转录因子基因ccpC提高芽胞杆菌中伊枯草菌素(IturinA)产量的方法。本发明以质粒T2(2)‑Ori为基础，通过构建碳代谢转录因子基因ccpC的敲除载体T2‑ΔccpC，成功在解淀粉芽胞杆菌LX‑12中敲除了基因ccpC，得到了解淀粉芽胞杆菌工程菌LX‑12△ccpC。与对照菌LX‑12相比，工程菌株LX‑12△ccpC的IturinA产量至少提高了29％以上。

Description

一种提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物学技术领域，具体涉及一种通过敲除碳代谢转录因子基因ccpC提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法。

背景技术

伊枯草菌素(IturinA)是主要由枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌合成产生的一种脂肽，其分子结构包含由七个氨基酸残基组成的肽链和一条β-氨基脂肪酸侧链,氨基酸组成包括天冬酰胺(Asn)，谷氨酰胺(D-Gln)，丝氨酸(L-Ser)，脯氨酸(L-Pro)，酪氨酸(D-Tyr)，因其表现出很强的抗菌活性与溶血活性，对环境友好，所以在植物病害的生物防治等诸多领域有着非常重要的价值。脂肽类抗生素主要应用于农业生物防治、医药、石油开采、食品保藏、环境治理及化妆品等领域。

CcpC是一种碳代谢调节因子，其在解淀粉芽胞杆菌中的调控网络及调控的基因目前不清楚，因此敲除ccpC会对IturinA产量造成的影响也是不可预测的。本专利通过敲除解淀粉芽胞杆菌LX-12中碳代谢转录因子ccpC，使得IturinA的产量有大幅度提升。本发明首次通过敲除碳代谢转录因子基因ccpC来提高 IturinA产量，为IturinA高产提供一种新的策略。

发明内容

本发明的目在于提供一种提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法，此方法通过敲除碳代谢转录因子基因ccpC来提高IturinA产量，为IturinA高产提供一种新的策略。

本发明第一方面提供了一种高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，步骤包括：在解淀粉芽胞杆菌的基因组内敲除碳代谢转录因子基因ccpC，所述基因ccpC核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述在解淀粉芽胞杆菌的基因组内敲除碳代谢转录因子基因ccpC 的步骤包括：

S1、以解淀粉芽胞杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增出ccpC基因的上游同源臂和下游同源臂；

S2、通过重叠延伸PCR将ccpC基因的上游同源臂和下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：ccpC基因的上游同源臂-ccpC 基因的下游同源臂；

S3、采用限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，采用相同的限制性内切酶对质粒进行双酶切得到线性质粒片段；

S4、将酶切基因片段和线性质粒片段经连接酶连接，将酶连产物转入大肠杆菌DH5α中，以卡那青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR验证、测序验证得到敲除质粒T2(2)-△ccpC；

S5、将敲除质粒T2(2)-△ccpC转入解淀粉芽胞杆菌中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

S6、将阳性转化子转接培养后，进行菌落PCR检测，得到ccpC基因的上游同源臂或ccpC基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

S7、挑选ccpC基因的上游同源臂与解淀粉芽胞杆菌基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ccpC基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌基因组 DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于培养基中转接培养，PCR 法筛选得到缺失了ccpC基因的地衣芽胞杆菌工程菌株。

优选的，所述解淀粉芽胞杆菌为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12，该菌于2015年4月15日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2015234。

更加优选的，步骤S3中，所述限制性内切酶为SacI和XbaI，所述质粒为 T2(2)-ori。

更加优选的，步骤S6中，所述阳性转化子在45℃下进行转接培养。

更加优选的，步骤S7中，所述培养基为不含有卡那青霉素的培养基，所述转接培养温度为37℃。

本发明第二方面提供了上述高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法构建得到的工程菌。

本发明第三方面提供了一种提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法，步骤包括：采用上述高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法构建得到工程菌，再将工程菌进行发酵培养，所述发酵的培养基配方为：50-90g/L豆粕，30-70g/L玉米淀粉，0.5-2.5g/L KH₂PO₄，0.5-1.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.10-0.50g/L FeSO₄·7H₂O、 0.01-0.05g/L MnSO₄·H₂O，pH6.2～7.2。

本发明的有益效果为：

本发明首次尝试通过缺失ccpC基因来提高IturinA的产量，为提高IturinA 产量提供了一种新策略。与解淀粉芽胞杆菌LX-12相比，通过本发明构建得到的解淀粉芽胞杆菌LX-12△ccpC的IturinA产量提高了至少29％。本发明的研究结果表明：通过缺失碳代谢转录因子基因ccpC来提高IturinA产量是一个十分有效的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中步骤(1)得到的ccpC基因的上游同源臂和下游同源臂及其重叠延伸后的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为ccpC基因的上游同源臂，泳道3为ccpC基因的下游同源臂；泳道4 为步骤(2)得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；

图2为实施例1中步骤(4)得到的敲除质粒T2(2)-△ccpC菌落PCR验证的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为敲除质粒T2(2)-△ccpC PCR 验证的条带；

图3为实施例1中步骤(5)得到的阳性转化子LX-12/T2(2)-△ccpC菌落PCR 验证的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为LX-12/T2(2)-△ ccpC菌落PCR验证的条带；

图4为实施例1中步骤(7)得到的缺失菌株LX-12△ccpC进行菌落PCR 验证图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为回复突变结果即野生菌PCR验证条带，泳道3为缺失菌株即ccpC敲除菌株菌落PCR验证的条带；

其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为： 5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

具体实施方式

本发明的几个实施例按如下技术路线实施：

一种能够提高IturinA产量的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)工程菌的构建，出发菌株以解淀粉芽胞杆菌LX-12为例，但本方法并不局限于解淀粉芽胞杆菌LX-12这一种，工程菌构建方法包括以下步骤：

(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出ccpC基因的上游同源臂和ccpC基因的下游同源臂；

(2)通过重叠延伸PCR将ccpC基因的上游同源臂和下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：ccpC基因的上游同源臂-ccpC基因的下游同源臂；

(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

(4)将步骤(2)得到的酶切目的片段和步骤(3)得到的线性质粒片段经 T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以卡那青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，以T2-F和T2-R为验证引物得到阳性转化子，经过测序得到敲除质粒T2(2)-△ccpC；

(5)将敲除质粒T2(2)-△ccpC转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

(6)将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ccpC基因的上游同源臂或ccpC基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12 基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

(7)挑选ccpC基因的上游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ccpC基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌 LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到缺失了ccpC基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12△ccpC(简称：Bacillusamyloliquefaciens LX-12△ ccpC)；

其中，所述的解淀粉芽胞杆菌LX-12已于2015年4月15日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015234；

所述解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组中的碳代谢转录因子基因ccpC序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。这些实施案例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

实施例1

本实施例提供了一种能够提高IturinA产量的解淀粉芽胞杆菌工程菌构建方法，步骤包括：

1、根据解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA序列中的ccpC基因的上、下游序列，设计ccpC基因的上游同源臂引物(C-F1和C-R1)、下游同源臂引物(C-F2 和C-R2)；并以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，分别扩增得到ccpC 基因的上游同源臂(529bp)和ccpC基因的下游同源臂(506bp)。

其中，C-F1、C-R1、C-F2、C-R2的序列为：

C-F1：GCTCTAGA TACCGCCATTCCCGTCCTT

C-R1：AAATGGGCGTTCCTGCTTGGCTGTGACACGAATAAC

C-F2：GTTATTCGTGTCACAGCCAAGCAGGAACGCCCATTT

C-R2：CGAGCTC CCTGTTCAAACGCATCGC

2、通过重叠延伸PCR将ccpC基因的上游同源臂和下游同源臂连接到一起 (所用引物为C-F1和C-R2)，构成目的基因片段(1035bp)，该目的基因片段的排列顺序为：ccpC基因的上游同源臂-ccpC基因的下游同源臂。

3、采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段(1007bp)，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori(质粒T2(2)-ori的结构与授权公告号为CN 104293723B、名称为“一种操纵子bacABC 拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽胞杆菌及其构建方法”的专利中所述的质粒 T2(2)-ori结构相等，在此不做赘述)进行双酶切得到线性质粒片段(4244bp)；其中，所述的限制性内切酶SacI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司。

4、将酶切基因片段和线性质粒片段经T₄DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在 1342bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子，命名为：敲除载体T2(2)-△ccpC。

5、将敲除载体T2(2)-△ccpC通过电转化转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，在 37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR 验证结果为：在1342bp处出现电泳条带，证明：敲除载体T2(2)-△ccpC成功转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，此时，该转化子为阳性转化子(即转入了敲除载体T2(2)-△ccpC的解淀粉芽胞杆菌LX-12)。

6、将步骤(5)得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和△ccpC-KYR为引物(或以 T2-R与△ccpC-KYF为引物)进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1333bp或 2205bp长度的条带，即证明为单交换菌株；

其中，△ccpC-KYR和△ccpC-KYF的序列为:

△ccpCKYF：GATGAAAAATGTAAAGGG

△ccpC-KYR：TGAGGTCACTGATGCCAT。

7、将步骤6)得到的PCR检测出现1333bp条带的单交换菌株和步骤6)得到的PCR检测出现2205bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中在37℃条件下经过6次转接培养，挑转化子进行菌落PCR 验证(引物为△ccpC-KYF和△ccpC-KYR)。若转化子的PCR验证结果为：在 2314bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为解淀粉芽胞杆菌 LX-12；在1342bp处出现电泳条带时，说明解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组上缺失了ccpC的基因，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA 测序进一步验证，得到双交换成功的ccpC缺失菌株(即解淀粉芽胞杆菌 LX-12△ccpC)。

实施例2

本实施例将实施例1构建得到的解淀粉芽胞杆菌LX-12△ccpC应用于发酵生产IturinA，具体步骤包括：

(1)种子培养：先将解淀粉芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵的培养基后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液。所述种子发酵培养基为LB培养基，配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠， pH 7.2。

(2)发酵培养：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)，转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养32小时，得到生产发酵的菌液。采用的发酵培养基配方如表 1所示。

表1发酵培养基配方表

采用液相检测的方法对上述实施例中生产发酵的菌液中IturinA的产量进行测定。测定条件具体为：取1.5mL发酵液于2mL离心管中，10000r/min离心 15min，取300μL上清液于1.2mL甲醇中，摇匀浸提1h，然后10000r/min离心15min，0.22μm滤膜过滤后，样品用于HPLC检测。

HPLC系统为Agilent 1260series，色谱柱为Lichrospher C18(规格：5μm， 25cm×4.6mm)，流动相为10mmol/L乙酸铵/乙腈＝65:35(V/V)，进样量为10 ul，检测波长为210nm，流速为0.9mL/min。根据液相法计算出不同配方培养基对应的生产发酵的菌液中IturinA的产量(见表2)。

表2不同配方培养基对应的生产发酵的菌液中IturinA的产量

从表2可看出，在相同的种子培养和生产发酵条件下，相对于现有技术的解淀粉芽胞杆菌LX-12来说，采用本发明的解淀粉芽胞杆菌LX-12△ccpC的发酵液中IturinA产量有了大幅提升(至少提高29％)，说明：本发明的技术方案在提高芽胞杆菌IturinA产量方面具有重大应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法

<141> 2018-04-27

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens LX-12

<400> 1

atgatgaacg aacgagtgaa caaagtagca ttaatcggag caggttttgt tggaagcagt 60

tatgcatttg cgttaattaa ccaagggatc acagatgagc ttgtgatcat tgatgtaaat 120

agagaaaaag ccatgggaga tgtcatggat ttaaatcacg gaaaggcatt tgcgcctcat 180

ccggtcaaaa cgtcttacgg cacatatgag gattgcaagg atgccgatat cgtgtgcatc 240

tgtgcagggg ccaatcaaaa accgggcgaa acgagacttg agctggtcga aaaaaatctc 300

gccattttta aaagcattgt cggtgaagta atggcaagcg gatttgacgg catcttcctc 360

gttgccacaa acccggtcga cattctcacc tatgcgactt ggacattcag cggcctgccg 420

aaagaacgcg tcatcggcag cggcacgaca ctggattctg cgcgattccg ttatatgctg 480

agtgaatact tcggagccgc tccgcaaaac gtacacgccc acattatcgg cgagcacggc 540

gataccgagc tccctgtatg gagtcacgcc aatatcggcg gagtgccggt gcagcaattg 600

ctggagaaac atgcagctta caaacaggac gagctggatc agatcgttga cgatgtgaaa 660

aacgcagcct atcatattat cgagaaaaaa ggcgcgacat attacggagt ggcgatgagc 720

ctcgcccgca tcacaaaagc gattttgcgt aatgaaaaca gcattttaac cgtcagcaca 780

tatctggacg gccaatacgg tgtaaacgac gtctttatcg gcgttccggc cgtcgtcaat 840

cggaacggca ttgcaggtgt gacggaactt gagctgaatg aaacagaaca ggctcaattc 900

agccgcagcg caaacgtgct gaaagatatt ctcgctccgc atttcgcaga gtaa 954

Claims (7)

1.一种高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤包括：在解淀粉芽胞杆菌的基因组内敲除碳代谢转录因子基因ccpC，所述基因ccpC核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1 所示；

所述解淀粉芽胞杆菌为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） LX-12，该菌于 2015年 4月 15日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015234。

2.根据权利要求 1所述的高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：所述在解淀粉芽胞杆菌的基因组内敲除碳代谢转录因子基因ccpC的步骤包括：

S1、以解淀粉芽胞杆菌基因组 DNA 为模板，PCR扩增出ccpC基因的上游同源臂和下游同源臂；

S2、通过重叠延伸PCR 将ccpC基因的上游同源臂和下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：ccpC基因的上游同源臂-ccpC基因的下游同源臂；

S3、采用限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，采用相同的限制性内切酶对质粒进行双酶切得到线性质粒片段；

S4、将酶切基因片段和线性质粒片段经连接酶连接，将酶连产物转入大肠杆菌 DH5α中，以卡那青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落 PCR 验证、测序验证得到敲除质粒；

S5、将敲除质粒转入解淀粉芽胞杆菌中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

S6、将阳性转化子转接培养后，进行菌落 PCR 检测，得到ccpC基因的上游同源臂或ccpC基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌基因组 DNA 产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

S7、挑选ccpC基因的上游同源臂与解淀粉芽胞杆菌基因组 DNA 产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ccpC基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌基因组DNA 产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于培养基中转接培养，PCR 法筛选得到缺失了ccpC基因的解淀粉芽胞杆菌工程菌株。

3.根据权利要求2所述的高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤S3中，所述限制性内切酶为SacI和XbaI，所述质粒为T2(2)-ori。

4.根据权利要求 2所述的高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤 S6中，所述阳性转化子在 45℃下进行转接培养。

5.根据权利要求 2所述的高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤 S7中，所述培养基为不含有卡那青霉素的培养基，所述转接培养温度为 37℃。

6.采用权利要求 1 所述高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法构建得到的工程菌。

7.一种提高芽胞杆菌伊枯草菌素产量的方法，其特征在于：步骤包括：采用权利要求 1所述高产伊枯草菌素的解淀粉芽胞杆菌的构建方法构建得到工程菌，再将工程菌进行发酵培养，所述发酵的培养基配方为：50-90g/L 豆粕，30-70g/L玉米淀粉，0.5-2.5g/L KH₂PO₄，0.5-1.5g/L MgSO₄•7H₂O、0.10-0.50 g/L FeSO₄•7H₂O、0.01-0.05 g/L MnSO₄•H₂O，pH6.2~7.2。

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