CN111304235B - 强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的提供一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用，其中强化cysP表达的地衣芽胞杆菌是通过在地衣芽胞杆菌DW2内转入携带有硫元素转运蛋白基因cysP的质粒载体制得的，实现了地衣芽胞杆菌DW2游离表达硫元素转运蛋白基因cysP，达到强化硫元素转运蛋白基因cysP表达的目的。与直接将不含有cysP基因的空白质粒载体转入地衣芽孢杆菌DW2中得到的菌株相比，通过本发明构建得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的杆菌肽产量有了大幅提升。

Description

强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程菌改造技术领域，尤其是一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用。
背景技术
地衣芽胞杆菌是公认的具有生物安全性（GRAS）的重要工业微生物菌株，其广泛存在于自然界中。鉴于地衣芽胞杆菌具有遗传背景清晰、工业应用价值高等特点，其在近年来被广泛研究。地衣芽胞杆菌属革兰氏阳性菌，其主要用于发酵生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素等多种生物化工产品。
杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，其组成氨基酸包括鸟氨酸（Orn）、D-苯丙氨酸（D-Phe）、异亮组氨酸（His）、D-天冬氨酸（D-Asp）、天冬酰胺（Asn）、 赖氨酸（Lys）、D-谷氨酸（D-Glu）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）共11种氨基酸。杆菌肽可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素（如青霉素、庆大霉素等）产生协同增强效应；并且，其几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此已被广泛应用于饲料添加。
目前的研究尚未解析出硫元素转运蛋白CysP在地衣芽孢杆菌中发挥作用的机制以及其是否对杆菌肽前体氨基酸供应造成影响，因此硫元素转运蛋白CysP及其转录基因—cysP基因对地衣芽胞杆菌杆菌肽合成的影响也是不可预知的。
地衣芽胞杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的制备方法，此构建方法通过在地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）内游离表达硫元素转运蛋白基因cysP，达到了强化硫元素转运蛋白基因cysP表达的目的。
强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA为模板扩增硫元素转运蛋白基因cysP，再在cysP基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成目的基因片段；
（2）准备游离型质粒载体，并根据游离型质粒载体上的酶切位点选择能够对该游离型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对该游离型质粒载体和步骤（1）得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；
（3）将步骤（2）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到游离表达载体；
（4）将步骤（3）得到的游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2中，并筛选得到阳性转化子，即为强化cysP表达的地衣芽胞杆菌；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2（Bacillus licheniformis DW2）已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的cysP基因如SEQ ID NO.1中所示。
本发明人首次尝试构建强化cysP基因表达的地衣芽胞杆菌，通过将携带有cysP基因的质粒载体转入地衣芽胞杆菌DW2中，成功得到了强化cysP基因表达的地衣芽胞杆菌。与直接将不含有cysP基因的空白质粒载体转入地衣芽孢杆菌DW2中得到的菌株相比，通过本发明构建得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的杆菌肽产量提高了13%以上。本发明的研究结果表明：强化表达硫元素转运蛋白基因cysP是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。
优选的，步骤（2）中的游离型质粒载体选用pHY300PLK，步骤（4）中将游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2后，在30-37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基进行筛选转化子，得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-cysP。相对于pHT01、pHT43等来说，pHY300PLK拷贝数更高，是组成型表达，表达效果更好；当选用pHY300PLK时，通过对该质粒载体的基因组进行分析可知：其上存在EocRI和XbaI限制性内切酶的酶切位点，进而确定双酶切步骤采用EocRI和XbaI限制性内切酶。在具体实施过程中，根据质粒载体的基因序列中含有EocRI和XbaI限制性内切酶的酶切位点，步骤（2）中采用EocRI和XbaI限制性内切酶对游离型质粒载体和目的基因片段进行双酶切。
优选的，步骤（1）中启动子选用P43启动子，P43启动子是芽胞杆菌通用的强启动子，普适性较强。在具体实施过程中，所述P43启动子通常通过以枯草芽胞杆菌基因组为模板经PCR扩增得到。
优选的，步骤（1）中终止子选用淀粉酶终止子，淀粉酶终止子为菌种基因改造领域比较通用的终止子。进一步的，所述淀粉酶终止子采用以地衣芽胞杆菌DW2基因组为模板经PCR扩增得到的淀粉酶终止子，此时无需另行购买淀粉酶终止子的来源菌株。
本发明的目的之二在于提供一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌，其是根据上述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的。
进一步的，所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌为DW2/pHY-cysP。
本发明的目的之三在于提供上述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，所述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌是根据上述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的。
进一步的，应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵，其中种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2；生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-2 g/L (NH4)2SO4。
附图说明
图1为实施例1~14的步骤（1）中得到的P43启动子，硫元素转运蛋白基因cysP和淀粉酶终止子；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为P43启动子，泳道2为硫元素转运蛋白基因cysP，泳道3为淀粉酶终止子；
图2为实施例1~14的步骤（1）中得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为目的基因片段；
图3为实施例1~14的步骤（3）中得到的游离表达载体pHY-cysP进行菌落PCR验证图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为游离表达载体pHY-cysP；
图4为实施例1~14的步骤（4）中得到的阳性转化子的菌落PCR验证图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为阳性转化子；
其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp。
具体实施方式
现根据附图具体阐述本发明的实施方式：
强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法的具体实施方式如下：
1、步骤（1）的具体操作步骤为：
根据枯草芽胞杆菌168基因组序列，设计P43启动子基因的上游引物（cysp-P43-F）和下游引物（cysp-P43-R），并以枯草芽胞杆菌168基因组序列为模板，采用P43启动子基因的上、下游引物进行PCR扩增得到P43启动子（305bp，如图1所示）。同时，根据地衣芽胞杆菌DW2的基因组序列，设计硫元素转运蛋白基因cysP的上游引物（cysp-F）和下游引物（cysp-R）；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组序列为模板，采用硫元素转运蛋白基因cysP的上、下游引物进行PCR扩增得到硫元素转运蛋白基因cysP（1065bp，如图1所示）；同时，根据地衣芽胞杆菌DW2的基因组序列，设计淀粉酶终止子基因的上游引物（cysp-TamyL-F）和下游引物（cysp-TamyL-R），并根据地衣芽胞杆菌DW2的基因组序列，采用淀粉酶终止子的上、下游引物进行PCR扩增得到淀粉酶终止子（501bp，如图1所示）；
其中，cysp-P43-F、cysp-P43-R、cysp-F、 cysp-R、cysp-TamyL-F和cysp-TamyL-R的序列为：
cysp-P43-F ：CCGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGC、
cysp-P43-R：ATAAAATGGCGGCAAGTTCCATTTCATGTGTACATTCCTCTC、
cysp-F：GAGAGGAATGTACACATGAAATGGAACTTGCCGCCATTTTAT、
cysp-R：GAAATCCGTCCTCTCTGCTCTTTTAAATTCCTCCGCCTTGTTCA、
cysp-TamyL-F：TGAACAAGGCGGAGGAATTTAAAAGAGCAGAGAGGACGGATTTC、
cysp-TamyL-R：GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTGG。并以P43启动子、硫元素转运蛋白基因cysP和淀粉酶终止子为模板，P43启动子上游引物cysp-P43-F和淀粉酶终止子下游引物cysP-TamyL-R分别作为上、下游引物，通过重叠延伸PCR将P43启动子片段、硫元素转运蛋白基因cysP和淀粉酶终止子依序连接到一起得到目的基因片段（1871 bp）（如图2所示），该目的基因片段的排列顺序为：P43启动子-硫元素转运蛋白基因cysP-淀粉酶终止子；
2、步骤（2）的具体操作步骤为：
准备质粒载体pHY300PLK，并采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒载体pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段（4800bp）；同时，采用EocRI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段（1871 bp）；其中，质粒载体pHY300PLK购自Takara公司，所述的限制性内切酶EcoRI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
3、步骤（3）的具体操作步骤为：
将步骤（2）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经 DNA 连接酶（市售的DNA连接酶均可，通常为T4 DNA连接酶）进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基（常用的细菌培养基均可，通常为LB培养基）进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：pHY-F和pHY-R）。若转化子的PCR验证结果为：在2165bp处出现电泳条带，说明游离表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：游离表达载体pHY-cysP,如图3所示)；
其中pHY-F和pHY-R的序列为：
pHY-F：CAGATTTCGTGATGCTTGTC、
pHY-R：GTTTATTATCCATACCCTTAC；
4、步骤（4）的具体操作步骤为：
将步骤（3）得到的游离表达载体pHY-cysP电转化至地衣芽胞杆菌DW2中，在30-37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基（常用的细菌培养基均可，通常为LB培养基）进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：pHY-F和pHY-R）。若转化子的PCR验证结果为：在2165bp处出现电泳条带（如图4所示），证明：游离表达载体pHY-cysP成功转入地衣芽胞杆菌DW2中，此时，该转化子为阳性转化子（即转入了游离表达载体pHY-cysP的地衣芽胞杆菌DW2/pHY-cysP）；
上述硫元素转运蛋白基因cysP公布于美国国立生物技术信息中心—NCBI的基因库中，cysP的基因ID号为16052655；
所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述的地衣芽胞杆菌DW2基因组中的cysP基因序列如SEQ ID NO.1中所示。
本发明还保护根据上述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌（DW2/pHY-cysP）。
本发明人还保护一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，所述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌是根据上述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的。进一步的，所述应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵，其中种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2；生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-2 g/L (NH4)2SO4。
本发明人根据上述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方。
表1
Figure 784222DEST_PATH_IMAGE001
其中，上述实施例中均采用本发明专利方法构建得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌（即DW2/pHY-cysP）；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子发酵的培养基后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2%（体积百分比），转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。
本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6 mm×250 mm) ；流动相为A:B＝35:65(A相：100 mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300 mL水中混合均匀；B相：520 mL甲醇与40 mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30°C；紫外检测器波长：254 nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。
表2
Figure 763679DEST_PATH_IMAGE002
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于通过直接将质粒载不含有cysP基因的空白质粒载体pHY300PLK转入地衣芽孢杆菌DW2中得到的DW2/pHY来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌DW2/pHY-cysP的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了较大幅提升（提高幅度13%以上），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。
本申请人还进行了实施例15和实施例16，实施例15和实施例16的具体实施方案如下：
实施例15
实施例15与实施例14的不同之处在于：步骤（1）中的启动子选用PcysP启动子，在步骤（1）中以地衣芽孢杆菌DW2基因组序列，设计PcysP启动子基因的上游引物和下游引物，并以地衣芽孢杆菌DW2基因组序列为模板，采用PcysP启动子基因的上、下游引物进行PCR扩增得到PcysP启动子，并通过重叠延伸PCR将PcysP启动子片段、硫元素转运蛋白基因cysP和淀粉酶终止子依序连接到一起得到目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：PcysP启动子-硫元素转运蛋白基因cysP-淀粉酶终止子，其余步骤均与实施例14相同，最终得到阳性转化子，命名为：DW2/pHY-cysP-1；
实施例16
实施例16与实施例14的不同之处在于：步骤（1）中的终止子选用步骤（1）中的启动子选用PcysP启动子，在步骤（1）中根据地衣芽孢杆菌DW2基因组序列，设计TcysP终止子基因的上游引物和下游引物，并根据地衣芽孢杆菌DW2基因组序列，采用TcysP终止子的上、下游引物进行PCR扩增得到TcysP终止子,并通过重叠延伸PCR将P43启动子片段、硫元素转运蛋白基因cysP和TcysP终止子依序连接到一起得到目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：P43启动子-硫元素转运蛋白基因cysP-TcysP终止子，其余步骤均与实施例14相同，最终得到阳性转化子，命名为：DW2/pHY-cysP-2。
实施例15和实施例16所构建得到的地衣芽胞杆菌DW2/pHY-cysP-1、DW2/pHY-cysP-2分别进行种子、生产培养后发酵液中杆菌肽效价测试数据如下表3所示。
表3
菌株 杆菌肽效价 与地衣芽胞杆菌DW2相比，DW2-ppc杆菌肽产量的提高百分比（%）
实施例15 DW2/pHY-cysP-1 905.37 14.42
实施例16 DW2/pHY-<i>cysP</i>-2 914.36 15.56
另外，本发明的启动子并不限于实施例1中的P43启动子和实施例15中的PcysP启动子，其也可以为其他常见的、在本发明中能够成功启动转录的启动子，例如：PylB、PykzA、PgsiB等。
同时，本发明的淀粉酶终止子也不限于上述实施例1中的淀粉酶终止子和实施例16中的TcysP终止子，其也可以其他常见的、在本发明中能够成功终止转录的终止子均可。
本发明的淀粉酶终止子的来源菌株除了源自地衣芽孢杆菌DW2外，也可以为地衣芽胞杆菌14580、9945a、WX-0等。
本发明的双酶切所用的内切酶也不限于上述具体实施例中的EocRI和XbaI两种限制性内切酶的组合，其也选用其他内切酶位点如SacI、HindIII两种限制性内切酶的组合，这主要是由游离型质粒载体本身所具有的酶切位点决定的，需要根据游离型质粒载体进行基因序列分析后确定。双酶切所用内切酶的确定属于现有基因敲除/插入技术中的常规技术。
本发明的游离型质粒载体也并不限于上述具体实施例中的pHY300PLK，其也可以是常用的pHT01、pHT43等游离型质粒载体。
序列表
<110> 绿康生化股份有限公司
<120> 强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用
<130> DS-P20066
<141> 2020-02-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1065
<212> DNA
<213> 地衣芽胞杆菌DW2(Bacillus licheniformis)
<400> 1
atggaacttg ccgccatttt atttagcatg ttttttgcga tgaatatcgg agcgagcggt 60
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Claims (10)

1.强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA为模板扩增硫元素转运蛋白基因cysP，再在cysP基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成目的基因片段；
（2）准备游离型质粒载体，并根据游离型质粒载体上的酶切位点选择能够对该游离型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对该游离型质粒载体和步骤（1）得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；
（3）将步骤（2）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到游离表达载体；
（4）将步骤（3）得到的游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2中，并筛选得到阳性转化子，即为强化cysP表达的地衣芽胞杆菌；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的cysP基因如SEQ ID NO.1中所示。
2.根据权利要求1所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤（2）中的游离型质粒载体选用pHY300PLK，步骤（4）中将游离表达载体转入至地衣芽胞杆菌DW2后，在30-37℃的条件下经含有四环素抗性的培养基进行筛选转化子，得到的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌菌株DW2/pHY-cysP。
3.根据权利要求2所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤（2）中采用EocRI和XbaI限制性内切酶对游离型质粒载体和目的基因片段进行双酶切。
4.根据权利要求1所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）中启动子选用P43启动子。
5.根据权利要求4所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：所述P43启动子以枯草芽胞杆菌基因组为模板经PCR扩增得到。
6.根据权利要求1所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）中终止子选用淀粉酶终止子。
7.根据权利要求6所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，其特征在于：所述淀粉酶终止子以地衣芽胞杆菌DW2基因组为模板经PCR扩增得到。
8.一种强化cysP表达的地衣芽胞杆菌，其根据权利要求1~7中任一项所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到。
9.强化cysP表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，所述强化cysP表达的地衣芽胞杆菌根据权利要求1~7中任一项所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到。
10.根据权利要求9所述的强化cysP表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵，其中种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2；生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-2 g/L (NH4)2SO4。
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