CN112094781B

CN112094781B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112094781B
Application number: CN202011031718.9A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 张康; 宿玲恰; 夏伟; 秦芩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2040-09-27
Also published as: CN112094781A

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株产胞外蛋白能力强的解淀粉芽孢杆菌WS；将此菌株接种至发酵培养基中发酵48h，即可使发酵上清中蛋白的表达量高达0.6mg/mL，比现有模式菌株B.amyloliquefaciens DSM7高0.2～0.3mg/mL；将以此菌株为宿主表达编码麦芽三糖淀粉酶的基因构建得到的重组菌接种至发酵培养基中发酵48h，即可使发酵上清中麦芽三糖淀粉酶的酶活高达155.28U/mL；将以此菌株为宿主表达编码普鲁兰酶的基因构建得到的重组菌接种至发酵培养基中发酵72h，即可使发酵上清中普鲁兰酶的酶活高达5.66U/mL。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种革兰氏阳性细菌，具有非致病性、较强的蛋白分泌能力以及可高密度发酵培养等特点，在高效表达外源蛋白方面具有很大的潜力和应用价值。解淀粉芽孢杆菌在亲缘关系上与枯草芽孢杆菌具有很高的同源性，同时两者在遗传上和生化特征上存在种间差异。与枯草芽孢杆菌相比，解淀粉芽孢杆菌具有更强的蛋白分泌能力。目前，解淀粉芽孢杆菌是中温α-淀粉酶的主要生产菌种，同时也是蛋白酶和β-葡聚糖酶等酶制剂的重要生产菌种。

尽管解淀粉芽孢杆菌具有优良的蛋白表达和分泌特性，然而相比于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌在外源蛋白表达方面的研究相对较少，其研究大都集中在内源性蛋白表达方面。这主要是因为用于外源蛋白高效表达的解淀粉芽孢杆菌较少(具体可见参考文献“Hui Wang,et al,Plos One,2016”和“Neelam Gurung,et al,BioMedResearch International,2013”)。

目前，获得外源蛋白高效表达菌株的途径主要有两种：从自然界筛选和在现有菌株基础上进行改造优化。对于解淀粉芽孢杆菌表达来说，由于其作为外源蛋白高效表达的研究相对较少，从现有表征菌株中很难选取到一株产胞外蛋白能力强的解淀粉芽孢杆菌。鉴于菌株本身遗传和生化性状对于蛋白表达的重要性，从自然界筛选获取一株产胞外蛋白能力强的解淀粉芽孢杆菌至关重要。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一株产胞外蛋白能力强的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)WS，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020455，保藏日期为2020年08月28日。

所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS来源于江苏无锡地区的土壤样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GenBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌以上述解淀粉芽孢杆菌WS为宿主表达编码目的蛋白的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白为麦芽三糖淀粉酶、普鲁兰酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶或环糊精葡萄糖基转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽三糖淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了一种生产目的蛋白的方法，所述方法为将上述重组菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；从发酵液中分离得到目的蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30～40℃、转速为200～300rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为37℃、转速为200rpm。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌WS或上述重组菌或上述方法在生产目的蛋白中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一株产胞外蛋白能力强的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)WS；将此解淀粉芽孢杆菌接种至发酵培养基中发酵48h，即可使发酵上清中蛋白的表达量高达0.6mg/mL，比现有模式菌株B.amyloliquefaciens DSM7高0.2～0.3mg/mL；将以此解淀粉芽孢杆菌为宿主表达编码麦芽三糖淀粉酶的基因构建得到的重组菌接种至发酵培养基中发酵48h，即可使发酵上清中麦芽三糖淀粉酶的酶活高达155.28U/mL；将以此解淀粉芽孢杆菌为宿主表达编码普鲁兰酶的基因构建得到的重组菌接种至发酵培养基中发酵72h，即可使发酵上清中普鲁兰酶的酶活高达5.66U/mL。

生物材料保藏

一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS已于2020年08月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020455，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1：重组枯草芽孢杆菌B.subtilis SCK6/bamHIM的菌落PCR电泳验证结果；其中，M为DL10000 DNA Marker，泳道1、2、3、4、5、6、8为甲基转移酶基因bamHIM未插入成功的菌落PCR产物，泳道7为甲基转移酶基因bamHIM插入成功的菌落PCR产物。

图2：重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-amyM提取质粒经EcoR I酶切后的电泳验证结果；其中，M为DL10000 DNA Marker，泳道1为对照(待转化重组质粒)，泳道2为转化子所含重组质粒的酶切产物。

图3：重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-amyM的表达电泳验证结果；其中，M为蛋白相对分子质量Marker，泳道1、2、3分别为发酵48h的破壁沉淀、破壁上清和胞外上清，泳道4、5、6分别为发酵60h的破壁沉淀、破壁上清和胞外上清，泳道7、8、9分别为发酵72h的破壁沉淀、破壁上清和胞外上清。

图4：重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-tkp的表达电泳验证结果；其中，M为蛋白相对分子质量Marker，泳道1、2、3分别为发酵48h的破壁沉淀、破壁上清和胞外上清，泳道4、5、6分别为发酵60h的破壁沉淀、破壁上清和胞外上清，泳道7、8、9分别为发酵72h的破壁沉淀、破壁上清和胞外上清。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的模式菌株B.amyloliquefaciens DSM7和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCK6购自杭州宝赛生物科技有限公司；下述实施例中涉及的基因编辑质粒pHYcas9dinγ记载于公开号为CN111499688A的专利申请文本中；重组质粒YvcE-PamyE_(B.S)-amyM/pHY300PLK记载于文献“李雨桐，嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达及发酵优化，江南大学，2018”中；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、In-Fusion HD Cloning Plus kit试剂盒购自Takara公司；下述实施例中涉及的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；下列实施例中涉及的引物和来源于Thermococcus kodakarensis的编码超高温普鲁兰酶的基因tkp由天霖生物有限公司合成。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、15g/L琼脂粉。

LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L NaCl。

TB液体培养基：24g/L酵母粉、12g/L蛋白胨、5g/L甘油、12.54g/L K₂HPO₄、2.31g/LKH₂PO₄。

发酵培养基1：120g/L玉米淀粉、20g/L蛋白胨、5g/L玉米浆、5g/L(NH₄)₂SO₄、0.4g/LCaCl₂、1g/L K₂HPO₄、3.9g/L KH₂PO₄。

发酵培养基2：30g/L麸皮、40g/L玉米粉、30g/L豆粕、4g/L Na₂HPO₄、0.3g/LKH₂PO₄。

YN液体培养基：7g/L酵母抽提物、18g/L营养肉汤。

甘油溶液：700g/L。

木糖溶液：400g/L。

LBS液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、90g/L山梨醇。

RM液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、90g/L山梨醇、70g/L甘露醇。

洗涤缓冲液：100g/L甘油、90g/L山梨醇、92.5g/L甘露醇。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

麦芽三糖淀粉酶酶活检测方法：将1mL的10g/L的可溶性淀粉溶液和0.9mL的50mM、pH 5.5的磷酸缓冲液充分混匀，得到反应体系；将反应体系在60℃预热5min后，在反应体系中加入0.1mL粗酶液，振荡混匀进行反应；反应10min后，在反应获得的反应液中加入3mLDNS显色液，振荡，置于冰水中终止反应；反应终止后，将添加有显色液的反应液先煮沸7min，然后置于冰水中迅速冷却，接着添10mL去离子水，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂进行同样操作作为空白)。

麦芽三糖淀粉酶酶活的定义：在上述条件下，定义每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖所需酶量为一个酶活力单位(1U)。

超高温普鲁兰酶酶活检测方法：将1mL的10g/L的普鲁兰多糖溶液和0.9mL的50mM、pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混匀，得到反应体系；将反应体系在100℃预热5min后，在反应体系中加入0.1mL粗酶液，振荡混匀进行反应；反应10min后，在反应获得的反应液中加入3mLDNS显色液，振荡，置于冰水中终止反应；反应终止后，将添加有显色液的反应液先煮沸7min，然后置于冰水中迅速冷却，接着添10mL去离子水，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂进行同样操作作为空白)。

超高温普鲁兰酶酶活的定义：在上述条件下，定义每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖所需酶量为一个酶活力单位(1U)。

实施例1：菌株的筛选及鉴定

1、筛选

从不同地区的不同地点(垃圾场，淀粉厂，菜市场，食品厂，粮食加工厂，酒店等地)采集土壤样本；取2g土壤样本与9mL无菌水混合，在90℃水浴锅中放置30min，加玻璃珠振荡摇匀后静置片刻，取5mL上清液加入到LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养2～3d，得到培养液；取10mL培养液加入到新鲜的LB液体培养基中，37℃、200rpm继续振荡培养2～3d，重复此操作两次后，将得到的菌液涂布在LB固体培养基上，37℃倒置培养2～3d，可观察到单个菌落并筛选生长状况良好的菌株；通过高通量将LB固体培养基上的单菌落接种至装有LB液体培养基的浅孔板中，37℃、200rpm振荡培养10～14h，得到种子液1；按5％(v/v)的接种量将种子液1接入装有TB液体培养基的深孔板中，30℃、200rpm振荡培养培养2～3d，得到发酵液1；将发酵液1离心取上清1；将上清1接入酶标板后，在酶标板上利用考马斯亮蓝检测法(考马斯亮蓝检测法具体可见参考文献：Marion M.Bradford,Analytical Biochemistry,1976)检测上清1中的蛋白含量，初步筛选到胞外蛋白表达量高的菌株；挑取初筛所得的菌株的单菌落接种到装有10mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养10～14h，得到种子液2；按5％(v/v)的接种量将种子液2接入装有50mL TB液体培养基的三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养2～3d，得到发酵液2；将发酵液2离心取上清2；将上清2接入15mL磨口试管后，在磨口试管中利用考马斯亮蓝检测法检测上清2中的蛋白含量，复筛得到一株胞外蛋白表达量高达0.6mg/mL的菌株WS，此菌株筛选自江苏无锡地区的土壤样本。

将模式菌株B.amyloliquefaciens DSM7的菌液涂布在LB固体培养基上，37℃倒置培养2～3d，得到单菌落；挑取单菌落接种到装有10mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养10～14h，得到种子液；按5％(v/v)的接种量将种子液接入装有50mLTB液体培养基的三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养2～3d，得到发酵液；将发酵液离心取上清；将上清接入15mL磨口试管后，在磨口试管中利用考马斯亮蓝检测法检测上清中的蛋白含量，检测结果为0.3～0.4mg/mL。可见，复筛得到菌株WS产胞外蛋白的能力远优于模式菌株B.amyloliquefaciens DSM7。

2、鉴定

提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16S rDNA进行扩增和测序(扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列在在GenBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)WS。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS的应用

以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS的基因组为模板，以P1/P2为引物(引物具体可见表1)，通过PCR扩增获得甲基转移酶基因bamHIM及其自身启动子和终止子片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；以基因编辑质粒pHYcas9dinγ为模板，以P3/P4为引物(引物具体可见表1)，通过PCR扩增获得载体骨架片段，载体骨架片段两端分别带有amyE上游同源修复臂(887bp、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)和amyE下游同源修复臂(851bp、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；通过In-Fusion HD Cloning Plus kit无缝连接将甲基转移酶基因bamHIM及其自身启动子和终止子片段连接到载体骨架片段的amyE上游同源修复臂和amyE下游同源修复臂之间，得到基因编辑质粒pHYcas9bam。

将基因编辑质粒pHYcas9bam转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCK6，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有20μg/mL四环素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；以转化子1的基因组为模板，以P5/P6为引物(引物具体可见表1)进行菌落PCR(菌落PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环)，扩增同源修复片段，由于正确插入基因的同源修复片段长度与未插入基因的同源修复片段长度大小不同，对PCR产物进行核酸电泳(电泳结果见图1)；将PCR验证正确的转化子在LB固体培养基上划线，于51℃培养10h进行基因编辑质粒的消除，再对质粒消除菌进行菌落PCR验证(验证结果见图1)，并对PCR产物进行测序验证，验证正确即获得在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCK6的基因组中正确插入甲基转移酶基因bamHIM及其自身启动子和终止子片段的枯草芽孢杆菌B.subtilis SCK6/bamHIM。

以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS的基因组为模板，以P7/P8为引物(引物具体可见表1)，通过PCR扩增获得编码B.amyloliquefaciens来源淀粉酶启动子、信号肽、成熟蛋白和终止子的基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)；以pUB110质粒为模板，以P9/P10为引物(引物具体可见表1)，通过PCR扩增获得载体骨架片段；将编码B.amyloliquefaciens来源淀粉酶启动子、信号肽、成熟蛋白和终止子的基因片段和载体骨架片段以等摩尔的量加入到POE-PCR反应体系进行连接(POE-PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸0.77kb/min，30个循环)，得到连接产物；将连接产物转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCK6，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有30μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证，验证正确即获得带有编码B.amyloliquefaciens来源淀粉酶启动子、信号肽、成熟蛋白和终止子的基因片段的pUB110质粒。

以重组质粒YvcE-PamyE_(B.S)-amyM/pHY300PLK为模板，以P11/P12为引物(引物具体可见表1)，通过PCR扩增获得编码麦芽三糖淀粉酶基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)；以带有编码B.amyloliquefaciens来源淀粉酶启动子、信号肽、成熟蛋白和终止子的基因片段的pUB110质粒为模板，以P13/P14为引物(引物具体可见表1)，通过PCR扩增获得载体骨架片段；将编码麦芽三糖淀粉酶基因片段和载体骨架片段以等摩尔的量加入到POE-PCR反应体系进行连接(POE-PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸0.77kb/min，30个循环)，得到连接产物；将连接产物转化枯草芽孢杆菌B.subtilis SCK6/bamHIM，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有30μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证，验证正确即获得经甲基化修饰的待转化重组表达质粒pUB110-amyM。

将重组表达质粒pUB110-amyM转化解淀粉芽孢杆菌，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有30μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图2)，验证正确即获得重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-amyM。

蘸取重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-amyM的菌液于LB固体培养基上(含有30μg/mL卡那霉素)划线，于37℃的条件下培养8～12h，得到单菌落；挑取单菌落接种至10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养10h，得到种子液；将种子液以5％(v/v)的接种量接种至50mLTB液体培养基中(含有30μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm培养，分别于48、60和72h取样，检测发酵液中麦芽三糖淀粉酶的酶活。

检测结果为：重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-amyM发酵48、60和72h的胞外酶活分别为155.28、88.66和126.06U/mL(发酵液的电泳结果见图3)。可见，重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-amyM发酵生产48h时麦芽三糖淀粉酶的产量最高，高达155.28U/mL。

表1引物及其核苷酸序列

实施例3：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS的应用

合成来源于Thermococcus kodakarensis的编码超高温普鲁兰酶的基因tkp(核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，由天霖生物有限公司完成合成)；以实施例2获得的带有编码B.amyloliquefaciens来源淀粉酶启动子、信号肽、成熟蛋白和终止子的基因片段的pUB110质粒为模板，以P13/P14为引物(引物具体可见表1)，通过PCR扩增获得载体骨架片段；将编码超高温普鲁兰酶的基因tkp和载体骨架片段以等摩尔的量加入到POE-PCR反应体系进行连接(POE-PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸0.77kb/min，30个循环)，得到连接产物；将连接产物转化实施例2获得的枯草芽孢杆菌B.subtilis SCK6/bamHIM，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有30μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证，验证正确即获得经甲基化修饰的待转化重组表达质粒pUB110-tkp。

将重组表达质粒pUB110-tkp转化解淀粉芽孢杆菌，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有30μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证，验证正确即获得重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-tkp。

蘸取重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-tkp的菌液于LB固体培养基上(含有30μg/mL卡那霉素)划线，于37℃的条件下培养8～12h，得到单菌落；挑取单菌落接种至10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养10h，得到种子液；将种子液以5％(v/v)的接种量分别接种至50mLTB液体培养基、发酵培养基1和发酵培养基2中(含有30μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm培养，分别于48、60和72h取样，检测发酵液中超高温普鲁兰酶的酶活。

检测结果为：重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-tkp在TB培养基发酵48、60和72h胞外酶活分别为1.65、1.59和1.47U/mL；在发酵培养基1发酵48、60和72h胞外酶活分别为2.88、2.93和3.04U/mL；在发酵培养基2发酵48、60和72h胞外酶活分别为4.16、5.20和5.66U/mL(发酵液的电泳结果见图4)。可见，重组解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens WS/pUB110-tkp在发酵培养基2中培养72h时麦芽三糖淀粉酶的产量最高，高达5.66U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 829

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 1

atccttagaa aggaggtgat ccagccgcac cttccgatac ggctaccttg ttacgacttc 60

accccaatca tctgtcccac cttcggcggc tggctccaaa aaggttacct caccgacttc 120

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ggattgtcag aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac 600

atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta 660

ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac 720

acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca 780

cgctttcgct cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgcca 829

<210> 2

<211> 1272

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 2

ttgcgttttt tttctgtttt tgacattgtt aaaaataaag cgaatcagtt agggtatacg 60

gaaactgaaa tgtatgctgt attgaaaaat tacaatgtga ataagaagga tttactcgcc 120

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atttttgctg atccaccatt taaccttgat aaagagtatg atgagggtgt aacagataaa 480

aattccttta gcggatattt ggattggtat tataaatgga tagacgagtg tatcagagtt 540

ttaaaaccag gcggttcttt attcatttat aatattccaa aatggaacac ttacctttct 600

gagtacttaa ataggaaatt gaattttaga aactggataa ctgtagatat gaaatttgga 660

cttccaattc agaatagatt atatccagca aattacagcc ttttatacta tgtaaaaggt 720

gataaaccta agacatttaa tgttcaaagg atacctctac aaacttgccc tcattgtggt 780

agagaaataa aagactatgg cggttacaag aataaaatga acccaaaggg tgtaactctt 840

tctgatgttt ggtcagatat ttaccctgtt agacatagta gttcaaaaaa tagaaagttc 900

aatgaattat cagttaaatt acttgatcgt ataataacta tgagtacaaa tgaaggtgac 960

gttgttttag acccgtttgg aggaagcggt acaacatttg ctgtaagtga aatgttaggt 1020

cgtaaatgga ttggttttga gttggggaat tgtgaaatta tcaaagagag acttaaaaat 1080

aaagacaaag ataaaaagct gttaggtaaa gtttatgaag aaaaaaacaa gctgttccct 1140

aatagggtta aagaattacg taaaaaaaat ggtttatgga ttgatgatga ttttagacaa 1200

gaccatgagg gaaattctaa aggtgataaa aaaaacgaaa acaatgacca aatttcatta 1260

agtctagaat ga 1272

<210> 3

<211> 686

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ser Ser Ser Ala Ser Val Lys Gly Asp Val Ile Tyr Gln Ile Ile Ile

1 5 10 15

Asp Arg Phe Tyr Asp Gly Asp Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys Ser

20 25 30

Tyr Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp Gly

35 40 45

Gly Asp Leu Glu Gly Val Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln Leu

50 55 60

Gly Val Thr Thr Ile Trp Leu Ser Pro Val Leu Asp Asn Leu Asp Thr

65 70 75 80

Leu Ala Gly Thr Asp Asn Thr Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg Asp

85 90 95

Phe Lys Gln Ile Glu Glu His Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp Thr

100 105 110

Leu Val Asn Asp Ala His Gln Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Phe

115 120 125

Val Pro Asn His Ser Thr Pro Phe Lys Ala Asn Asp Ser Thr Phe Ala

130 135 140

Glu Gly Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr Phe

145 150 155 160

Asp Asp Ala Thr Lys Gly Tyr Phe His His Asn Gly Asp Ile Ser Asn

165 170 175

Trp Asp Asp Arg Tyr Glu Ala Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro Ala

180 185 190

Gly Phe Ser Leu Ala Asp Leu Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala Gln

195 200 205

Tyr Leu Thr Asp Ala Ala Val Gln Leu Val Ala His Gly Ala Asp Gly

210 215 220

Leu Arg Ile Asp Ala Val Lys His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys Ser

225 230 235 240

Leu Ala Asp Lys Leu Tyr Gln Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly Glu

245 250 255

Trp Tyr Gly Asp Asp Pro Gly Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val Arg

260 265 270

Tyr Ala Asn Asn Ser Gly Val Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn Thr

275 280 285

Val Ile Arg Asn Val Phe Gly Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp Leu

290 295 300

Asn Asn Met Val Asn Gln Thr Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu Asn

305 310 315 320

Leu Ile Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser Val

325 330 335

Asn Ser Asn Lys Ala Asn Leu His Gln Ala Leu Ala Phe Ile Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Thr Pro Ser Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Ala

355 360 365

Gly Gly Asn Asp Pro Tyr Asn Arg Gly Met Met Pro Ala Phe Asp Thr

370 375 380

Thr Thr Thr Ala Phe Lys Glu Val Ser Thr Leu Ala Gly Leu Arg Arg

385 390 395 400

Asn Asn Ala Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Thr Thr Gln Arg Trp Ile Asn

405 410 415

Asn Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Phe Asn Asp Val Val Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Thr Gln Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Gln Thr Ala Leu Pro Asn Gly Ser Tyr Ala Asp Tyr Leu Ser Gly Leu

450 455 460

Leu Gly Gly Asn Gly Ile Ser Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser Phe

465 470 475 480

Thr Leu Ala Pro Gly Ala Val Ser Val Trp Gln Tyr Ser Thr Ser Ala

485 490 495

Ser Ala Pro Gln Ile Gly Ser Val Ala Pro Asn Met Gly Ile Pro Gly

500 505 510

Asn Val Val Thr Ile Asp Gly Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gln Gly Thr

515 520 525

Val Thr Phe Gly Gly Val Thr Ala Thr Val Lys Ser Trp Thr Ser Asn

530 535 540

Arg Ile Glu Val Tyr Val Pro Asn Met Ala Ala Gly Leu Thr Asp Val

545 550 555 560

Lys Val Thr Ala Gly Gly Val Ser Ser Asn Leu Tyr Ser Tyr Asn Ile

565 570 575

Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ser Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala Pro

580 585 590

Pro Thr Asn Leu Gly Asp Lys Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro Glu

595 600 605

Leu Gly Asn Trp Ser Thr Asp Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala Gln

610 615 620

Gly Pro Leu Leu Ala Pro Asn Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe Ser

625 630 635 640

Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Gln Phe Lys Phe Phe Ile Lys Arg Ala

645 650 655

Asp Gly Thr Ile Gln Trp Glu Asn Gly Ser Asn His Val Ala Thr Thr

660 665 670

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Asn Ile Thr Val Thr Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 4

<211> 748

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Gly Cys Ile Ser Glu Ser Asn Glu Asn Gln Thr Ala Thr Ala Ser

1 5 10 15

Thr Val Pro Pro Thr Ser Val Thr Pro Ser Gln Ser Ser Thr Pro Thr

20 25 30

Thr Ser Thr Ser Thr Tyr Gly Pro Ser Glu Arg Thr Glu Leu Lys Leu

35 40 45

Pro Ser Val Asn Tyr Thr Pro Ile Tyr Val Gly Ile Glu Lys Gly Cys

50 55 60

Pro Ser Gly Arg Val Pro Val Lys Phe Thr Tyr Asn Pro Gly Asn Lys

65 70 75 80

Thr Val Lys Ser Val Ser Leu Arg Gly Ser Phe Asn Asn Trp Gly Glu

85 90 95

Trp Pro Met Glu Leu Lys Asn Gly Thr Trp Glu Thr Thr Val Cys Leu

100 105 110

Arg Pro Gly Arg Tyr Glu Tyr Lys Tyr Phe Ile Asn Gly Gln Trp Val

115 120 125

Lys Asp Met Ser Asp Asp Gly Thr Gly Arg Pro Tyr Asp Pro Asp Ala

130 135 140

Asp Ala Tyr Ala Pro Asp Gly Tyr Gly Gly Lys Asn Ala Val Arg Val

145 150 155 160

Val Glu Gly Arg Glu Ala Phe Tyr Val Glu Phe Asp Pro Arg Asp Pro

165 170 175

Ala Tyr Leu Ser Ile Ala Asp Lys Arg Thr Val Val Arg Phe Glu Ala

180 185 190

Lys Arg Asp Thr Val Glu Ser Ala Val Leu Val Thr Asp His Gly Asn

195 200 205

Tyr Thr Met Lys Leu Gln Val Trp Trp Asp Phe Gly Glu Thr Trp Arg

210 215 220

Ala Glu Met Pro Val Glu Pro Ala Asp Tyr Tyr Ile Leu Val Thr Ser

225 230 235 240

Ser Asp Gly Gly Lys Phe Ala Val Leu Asn Thr Ser Glu Ser Pro Phe

245 250 255

Phe His Phe Asp Gly Val Glu Gly Phe Pro Gln Leu Glu Trp Val Ser

260 265 270

Asn Gly Ile Thr Tyr Gln Ile Phe Pro Asp Arg Phe Asn Asn Gly Asn

275 280 285

Lys Ser Asn Asp Ala Leu Ala Leu Asp His Asp Glu Leu Ile Leu Asn

290 295 300

Gln Val Asn Pro Gly Gln Pro Ile Leu Ser Asn Trp Ser Asp Pro Ile

305 310 315 320

Thr Pro Leu His Cys Cys His Gln Tyr Phe Gly Gly Asp Ile Lys Gly

325 330 335

Ile Thr Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Val Thr Ile Ile

340 345 350

Tyr Ile Asn Pro Ile Phe Leu Ser Gly Ser Ala His Gly Tyr Asp Thr

355 360 365

Tyr Asp Tyr Tyr Arg Leu Asp Pro Lys Phe Gly Thr Glu Asp Glu Leu

370 375 380

Arg Glu Phe Leu Asp Glu Ala His Arg Arg Gly Met Arg Val Ile Phe

385 390 395 400

Asp Phe Val Pro Asn His Cys Gly Ile Gly Asn Pro Ala Phe Leu Asp

405 410 415

Val Trp Glu Lys Gly Asn Glu Ser Pro Tyr Trp Asp Trp Phe Phe Val

420 425 430

Lys Lys Trp Pro Phe Lys Leu Gly Asp Gly Ser Ala Tyr Val Gly Trp

435 440 445

Trp Gly Phe Gly Ser Leu Pro Lys Leu Asn Thr Ala Asn Gln Glu Val

450 455 460

Arg Glu Tyr Leu Ile Gly Ala Ala Leu His Trp Ile Glu Phe Gly Phe

465 470 475 480

Asp Gly Ile Arg Val Asp Val Pro Asn Glu Val Leu Asp Pro Gly Thr

485 490 495

Phe Phe Pro Glu Leu Arg Lys Ala Val Lys Glu Lys Lys Pro Asp Ala

500 505 510

Tyr Leu Val Gly Glu Ile Trp Thr Leu Ser Pro Glu Trp Val Lys Gly

515 520 525

Asp Arg Phe Asp Ser Leu Met Asn Tyr Ala Leu Gly Arg Asp Ile Leu

530 535 540

Leu Asn Tyr Ala Lys Gly Leu Leu Ser Gly Glu Ser Ala Met Lys Met

545 550 555 560

Met Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Tyr Gly Glu Asn Val Val Ala Met Gly

565 570 575

Phe Asn Leu Val Asp Ser His Asp Thr Ser Arg Val Leu Thr Asp Leu

580 585 590

Gly Gly Gly Lys Leu Gly Asp Thr Pro Ser Asn Glu Ser Ile Gln Arg

595 600 605

Leu Lys Leu Leu Ser Thr Leu Leu Tyr Ala Leu Pro Gly Thr Pro Val

610 615 620

Thr Phe Gln Gly Asp Glu Arg Gly Leu Leu Gly Asp Lys Gly His Tyr

625 630 635 640

Asp Glu Gln Arg Tyr Pro Ile Gln Trp Asp Thr Val Asn Glu Asp Val

645 650 655

Leu Asn His Tyr Arg Ala Leu Ala Glu Leu Arg Lys Arg Val Pro Ala

660 665 670

Leu Arg Ser Ser Ala Met Arg Phe Tyr Thr Ala Lys Gly Gly Val Met

675 680 685

Ala Phe Phe Arg Gly His His Asp Glu Val Leu Val Val Ala Asn Ser

690 695 700

Trp Lys Lys Pro Ala Leu Leu Glu Leu Pro Glu Gly Glu Trp Lys Val

705 710 715 720

Ile Trp Pro Glu Asp Phe Ser Pro Glu Leu Leu Arg Gly Thr Val Glu

725 730 735

Val Pro Ala Ile Gly Ile Ile Ile Leu Glu Arg Gly

740 745

<210> 5

<211> 887

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgcgtaata gactttcagg cgtgaatggg aaaaataaga gagtaaaaga aaaagaacaa 60

aaaatctggt cggagattgg gatgatagcg ggagcatttg cgctgcttga tgtgatcatc 120

cgcggcatta tgtttgaatt tccgtttaaa gaatgggctg caagccttgt gtttttgttc 180

atcattatct tatattactg catcagggct gcggcatccg gaatgctcat gccgagaata 240

gacaccaaag aagaactgca aaaacgggtg aagcagcagc gaatagaatc aattgcggtc 300

gcctttgcgg tagtggtgct tacgatgtac gacaggggga ttccccatac attcttcgct 360

tggctgaaaa tgattcttct ttttatcgtc tgcggcggcg ttctgtttct gcttcggtat 420

gtgattgtga agctggctta cagaagagcg gtaaaagaag aaataaaaaa gaaatcatct 480

tttttgtttg gaaagcgagg gaagcgttca cagtttcggg cagctttttt tataggaaca 540

ttgatttgta ttcactctgc caagttgttt tgatagagtg attgtgataa ttttaaatgt 600

aagcgttaac aaaattctcc agtcttcaca tcggtttgaa aggaggaagc ggaagaatga 660

agtaagaggg atttttgact ccgaagtaag tcttcaaaaa atcaaataag gagtgtcaag 720

aatgtttgca aaacgattca aaacctcttt actgccgtta ttcgctggat ttttattgct 780

gtttcatttg gttctggcag gaccggcggc tgcgagtgct gaaacggcga acaaatcgaa 840

tgagcttaca gcaccgtcga tcaaaagcgg aaccattctt catgcat 887

<210> 6

<211> 851

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtcgttcaa tacgttaaaa cacaatatga aggatattca tgatgcagga tatacagcca 60

ttcagacatc tccgattaac caagtaaagg aagggaatca aggagataaa agcatgtcga 120

actggtactg gctgtatcag ccgacatcgt atcaaattgg caaccgttac ttaggtactg 180

aacaagaatt taaagaaatg tgtgcagccg ctgaagaata tggcataaag gtcattgttg 240

acgcggtcat caatcatacc accagtgatt atgccgcgat ttccaatgag gttaagagta 300

ttccaaactg gacacatgga aacacacaaa ttaaaaactg gtctgatcga tgggatgtca 360

cgcagaattc attgctcggg ctgtatgact ggaatacaca aaatacacaa gtacagtcct 420

atctgaaacg gttcttagac agggcattga atgacggggc agacggtttt cgatttgatg 480

ccgccaaaca tatagagctt ccagatgatg gcagttacgg cagtcaattt tggccgaata 540

tcacaaatac atctgcagag ttccaatacg gagaaatcct gcaggatagt gcctccagag 600

atgctgcata tgcgaattat atggatgtga cagcgtctaa ctatgggcat tccataaggt 660

ccgctttaaa gaatcgtaat ctgggcgtgt cgaatatctc ccactatgca tctgatgtgt 720

ctgcggacaa gctagtgaca tgggtagagt cgcatgatac gtatgccaat gatgatgaag 780

agtcgacatg gatgagcgat gatgatatcc gtttaggctg ggcggtgata gcttctcgtt 840

caggcagtac g 851

<210> 7

<211> 2061

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 7

ctggctgaaa acattgagcc tttgatgact gatgatttgg ctgaagaagt ggatcgattg 60

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tgctgtccag actgtccgct gtgtaaaaaa taggaataaa ggggggttgt tattatttta 180

ctgatatgta aaatataatt tgtataagaa aatgagaggg agaggaaaca tgattcaaaa 240

acgaaagcgg acagtttcgt tcagacttgt gcttatgtgc acgctgttat ttgtcagttt 300

gccgattaca aaaacatcag ccgtaaatgg cacgctgatg cagtattttg aatggtatac 360

gccgaacgac ggccagcatt ggaaacgatt gcagaatgat gcggaacatt tatcggatat 420

cggaatcact gccgtctgga ttcctcccgc atacaaagga ttgagccaat ccgataacgg 480

atacggacct tatgatttgt atgatttagg agaattccag caaaaaggga cggtcagaac 540

gaaatacggc acaaaatcag agcttcaaga tgcgatcggc tcactgcatt cccggaacgt 600

ccaagtatac ggagatgtgg ttttgaatca taaggctggt gctgatgcaa cagaagatgt 660

aactgccgtc gaagtcaatc cggccaatag aaatcaggaa acttcggagg aatatcaaat 720

caaagcgtgg acggattttc gttttccggg ccgtggaaac acgtacagtg attttaaatg 780

gcattggtat catttcgacg gagcggactg ggatgaatcc cggaaaatca gccgcatctt 840

taagtttcgt ggggaaggaa aagcgtggga ttgggaagta tcaagtgaaa acggcaacta 900

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aaaatggggt atctggtatg cgaatgaact gtcattagac ggcttccgta ttgatgccgc 1020

caaacatatt aaattttcat ttctgcgtga ttgggttcag gcggtcagac aggcgacggg 1080

aaaagaaatg tttacggttg cggagtattg gcagaataat gccgggaaac tcgaaaacta 1140

cttgaataaa acaagcttta atcaatccgt gtttgatgtt ccgcttcatt tcaatttaca 1200

ggcggcttcc tcacaaggag gcggatatga tatgaggcgt ttgctggacg gtaccgttgt 1260

gtccaggcat ccggaaaagg cggttacatt tgttgaaaat catgacacac agccgggaca 1320

gtcattggaa tcgacagtcc aaacttggtt taaacctctt gcatacgcct ttattttgac 1380

aagagaatcc ggttatcctc aggtgttcta tggggatatg tacgggacaa aagggacatc 1440

gccaaaggaa attccctcac tgaaagataa tatagagccg attttaaaag cgcgtaagga 1500

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gggcaaccgt tcagatactg taaaaatcgg atctgacggc tggggagagt ttcatgtaaa 1740

cgatgggtcc gtctccattt atgttcagaa ataaggtaat aaaaaaacac ctccaagctg 1800

agtgcgggta tcagcttgga ggtgcgttta ttttttcagc cgtatgacaa ggtcggcatc 1860

aggtgtgaca aatacggtat gctggctgtc ataggtgaca aatccgggtt ttgcgccgtt 1920

tggctttttc acatgtctga tttttgtata atcaacaggc acggagccgg aatctttcgc 1980

cttggaaaaa taagcggcga tcgtagctgc ttccaatatg gattgttcat cgggatcgct 2040

gcttttaatc acaacgtggg a 2061

<210> 8

<211> 2061

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcttcttctg caagcgttaa aggcgacgtt atctaccaga tcatcattga tcgcttttac 60

gacggtgaca ctaccaacaa caacccggct aagtcctacg gtctgtatga cccgaccaag 120

tccaaatgga aaatgtattg gggtggcgat ctggaaggtg ttcgtcagaa actgccgtat 180

ctgaaacagc tgggtgtgac caccatctgg ctgtccccgg ttctggacaa cctggacacc 240

ctggctggta ctgataacac tggttatcac ggttattgga cccgtgattt caaacagatc 300

gaagagcact tcggtaactg gactactttt gataccctgg ttaacgacgc tcatcagaac 360

ggtattaaag ttatcgtgga ctttgttccg aaccattcta ccccgttcaa agcaaacgac 420

tctactttcg cggagggtgg tgcgctgtat aacaacggta cctacatggg taactatttc 480

gatgacgcta ccaaaggcta cttccaccac aacggcgata tttctaactg ggacgaccgc 540

tacgaagcac agtggaaaaa ctttaccgac ccggcaggtt tctctctggc ggatctgtct 600

caggagaacg gcaccatcgc gcagtacctg actgatgcgg cggttcagct ggtggctcac 660

ggcgctgatg gcctgcgtat cgacgcagtt aaacatttca acagcggctt ctctaaaagc 720

ctggcagata agctgtatca gaaaaaagac atcttcctgg ttggcgaatg gtatggcgat 780

gatccgggca ccgcgaacca cctggagaaa gttcgttatg cgaacaactc cggtgtgaac 840

gtgctggatt tcgacctgaa cactgtgatc cgtaacgtgt ttggcacttt tactcagact 900

atgtacgatc tgaacaacat ggtgaaccag actggtaacg aatacaaata caaggaaaac 960

ctgattactt ttattgacaa ccacgacatg agccgcttcc tgtccgttaa ctctaacaaa 1020

gcgaacctgc accaggcgct ggcattcatt ctgacctctc gtggcactcc gtctatttac 1080

tatggcactg agcagtacat ggcgggtggc aacgacccgt acaaccgtgg tatgatgccg 1140

gcgttcgaca ccaccactac tgcattcaag gaagtgtcta ctctggcagg tctgcgccgt 1200

aacaacgcag caattcagta cggcactact actcagcgtt ggatcaacaa cgacgtttac 1260

atctacgaac gcaaattctt caacgatgtg gtgctggttg caatcaaccg caacactcag 1320

tcttcttact ccatctccgg cctgcagact gcactgccga acggctccta tgcggattac 1380

ctgtctggtc tgctgggcgg caacggcatt tctgtgtcta acggcagcgt ggcgtctttc 1440

actctggcac cgggtgcggt gtccgtgtgg cagtactcta cctctgcgtc cgcaccgcag 1500

attggttccg ttgcaccgaa catgggcatt ccgggtaacg ttgtgactat tgatggcaaa 1560

ggtttcggta ccacccaggg cactgttacc ttcggtggcg tgactgctac tgttaaatcc 1620

tggacctcta accgtattga agtttacgtg ccgaacatgg ctgcgggcct gaccgatgtt 1680

aaggtgaccg caggcggtgt ttctagcaac ctgtactctt ataacattct gtccggcacc 1740

cagacttctg tggttttcac cgtgaaatct gcaccgccga ctaacctggg cgacaagatc 1800

tatctgaccg gtaacatccc ggagctgggc aactggtcca ccgatacttc tggcgcggtt 1860

aacaacgctc agggtccgct gctggctccg aactatccgg actggttcta cgttttcagc 1920

gtgccggctg gcaaaaccat ccagtttaag ttctttatca aacgtgcgga tggtactatt 1980

cagtgggaaa acggttccaa ccatgtggcg accactccga ccggtgcgac cggcaacatt 2040

actgtgactt ggcagaacta a 2061

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccattcttca tgcatgtcta aggaaacatt tcttgttcc 39

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgtattgaa cgaccatcgg caaggaaatg caagg 35

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catttccttg ccgatggtcg ttcaatacgt taaaacaca 39

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aatgtttcct tagacatgca tgaagaatgg ttccg 35

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtaacatgta agccataagc cattcg 26

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaccgcagtg atagcctgat cttc 24

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aaatcgtttt tgttctcctg gatctctggc tgaaaacatt gagcctttg 49

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgagattttt ttgagcaact ggatctccca cgttgtgatt aaaagcagc 49

<210> 17

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgctgctttt aatcacaacg tgggagatcc agttgctcaa aaaaatctcg g 51

<210> 18

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caaaggctca atgttttcag ccagagatcc aggagaacaa aaacgatttt ttg 53

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtttgccgat tacaaaaaca tcagcctctt cttctgcaag cgttaaag 48

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcttggaggt gtttttttat taccttagtt ctgccaagtc acagtaatgt 50

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ggtaataaaa aaacacctcc aagctg 26

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggctgatgtt tttgtaatcg gcaaac 26

<210> 23

<211> 2247

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tcaggctgca tctcagaatc taatgaaaat caaacagcga cagcgtctac ggttcctccg 60

acgagcgtga cacctagcca aagctctaca ccgacgacaa gcacgtctac ctatggacct 120

agcgaacgca cagaacttaa attaccttca gtcaattata cacctatcta tgtcggcatc 180

gaaaaaggct gcccttcagg acgggtccct gttaaattta catataatcc gggcaataaa 240

acagttaaat ctgtgagcct tcgcggcagc tttaataatt ggggcgaatg gccgatggaa 300

cttaaaaatg gaacgtggga aacaacagtg tgccttagac cgggccgcta tgaatataaa 360

tattttatca atggacaatg ggtcaaagat atgtcagatg atggaacagg ccgcccgtat 420

gatccggatg cagatgcgta tgcaccggat ggctatggcg gcaaaaatgc agtgagagtt 480

gtcgaaggac gtgaagcgtt ttatgtcgaa tttgatccac gtgaccctgc gtatctgtct 540

atcgcagata aacgtacggt tgttcggttt gaagcgaaac gcgatacagt cgaaagcgca 600

gttctggtga cggatcatgg caattatacg atgaaacttc aagtgtggtg ggattttgga 660

gaaacgtggc gcgcagaaat gcctgtcgaa ccggcggatt attatattct ggtgacatcg 720

tcagatggag gcaaatttgc ggtgcttaat acgtcagaat ctccgttttt tcattttgat 780

ggagtcgaag gctttcctca acttgaatgg gtctctaatg gcatcacata tcaaatcttt 840

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gatagccatg atacgtctcg tgtgctgaca gatttaggag gcggcaaatt aggcgataca 1800

ccgtctaatg aaagcatcca acgccttaaa ctgctgagca cactgttgta tgcacttccg 1860

ggcacgccgg tgacgtttca aggagatgaa cggggactgt taggcgataa aggccattat 1920

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tatacagcga aaggaggagt catggcgttt tttcgcggcc atcatgatga agtgttagtt 2100

gttgcaaata gctggaaaaa acctgcgctg ttagaattgc ctgaaggaga atggaaagtc 2160

atctggccgg aagattttag cccggaactg ttaagaggaa cggtcgaagt cccggcgatc 2220

ggcatcatca ttctggaacg cggctaa 2247

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WS，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020455，保藏日期为2020年08月28日。

2.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌以权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌为宿主表达编码目的蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的一种重组菌，其特征在于，所述目的蛋白为麦芽三糖淀粉酶、普鲁兰酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶或环糊精葡萄糖基转移酶。

4.如权利要求3所述的一种重组菌，其特征在于，所述麦芽三糖淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.如权利要求3所述的一种重组菌，其特征在于，所述普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

6.一种生产目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求2-5任一项所述的重组菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；从发酵液中分离得到目的蛋白。

7.如权利要求6所述的一种生产目的蛋白的方法，其特征在于，所述目的蛋白为麦芽三糖淀粉酶、普鲁兰酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶或环糊精葡萄糖基转移酶。

8.如权利要求7所述的一种生产目的蛋白的方法，其特征在于，所述麦芽三糖淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

9.如权利要求7所述的一种生产目的蛋白的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

10.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌或权利要求2-5任一项所述的重组菌或权利要求6-8任一项所述的方法在生产目的蛋白中的应用。