CN112143722A

CN112143722A - 一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法

Info

Publication number: CN112143722A
Application number: CN202011047985.5A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 王蕾; 饶德明; 陈晟; 刘展志; 霍润甜; 杨卫康; 盛露菲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2020-12-29

Abstract

本发明公开了一种提高4,6‑α‑葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法，属于蛋白质工程和发酵工程技术领域，具体涉及分别以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主表达来源于发酵乳杆菌的4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)过程中，在发酵培养基中添加甜菜碱、麦芽糖、β‑环糊精、海藻糖、山梨醇小分子物质，提高4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)可溶性表达量的方法，使得发酵总酶活本发明为高效表达4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)提供了一个有效的策略，操作工艺简单，且成本较低，效果显著，为工业化生产奠定了基础。

Description

一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法

技术领域

一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法，属于蛋白质工程和发酵工程技术领域。

背景技术

4,6-α-葡萄糖基转移酶属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)70家族，该家族的酶可以利用蔗糖或淀粉为底物合成各种结构的α-葡聚糖，因此广泛应用于食品领域。

4,6-α-葡萄糖基转移酶大部分来源乳酸杆菌目(Lactobacillaceae)。由于野生菌发酵水平较低，通过异源表达提高表达量。大肠杆菌(Escherichia coli)由于其遗传背景清晰、基因工程技术操作成熟作为最广泛应用的宿主。一般情况下，大肠杆菌表达外源蛋白质有三种方式，胞内表达、周质空间表达、胞外分泌。随着食品安全意识提高，枯草芽孢杆菌(Lactobacillus fermentum)作为食品安全菌，表达异源蛋白质也越来越受到重视。无论是大肠杆菌还是枯草芽孢杆菌为宿主菌发酵产酶，经常遇到外源蛋白质，形成无活性的包涵体，以不可溶的形式出现在细胞液中。

4,6-α-葡萄糖基转移酶发酵过程中也遇到同样的问题。人们一般采用复杂的基因工程手段，从核酸水平、基因表达水平、发酵水平，试图提高蛋白质的可溶性表达量。这些技术手段对某些蛋白质的可溶性表达的确取得了一些效果，但是周期长、操作复杂、成本高这些缺地依然存在，难以克服。最关键的一点，对于很多外源蛋白质可溶性表达量始终难以提高。因而限制了4,6-α-葡萄糖基转移酶的大规模生产及在工业生产中的应用。

发明内容

面对这些难点针对目前存在的问题，本发明提出了在培养基添加小分子物质提高外源蛋白质的可溶性表达量的策略。由于小分子物质甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖、山梨醇可以提高菌株在恶劣的环境中的耐受性，保护细胞免受损伤，同时对细胞液中蛋白质的正确折叠起到重要的辅助作用以及对可溶性蛋白质的稳定性起到积极的影响，因此提高了细胞液中蛋白质的可溶性表达量。

本发明的第一个目的是提供一种提高重组菌外源蛋白表达量的方法，在重组菌发酵的体系中添加小分子物质。

在本发明的一种实施方式中，所述小分子物质包括甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖或山梨醇中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，所述外源蛋白包括4,6-α-葡萄糖基转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述外源蛋白还包括4,6-α-葡萄糖基转移酶的同家族酶。

在本发明的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述同家族酶结构相似，功能相同，均能将底物淀粉的α-1,4糖苷键转化成α-1,6糖苷键，所述同家族酶包括来源于Exiguobacteriumsp.RIT341、Burkholderia sp.NFACC38-1、Frateuriadefendens和Limosilactobacillusfermentum的酶。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于Exiguobacterium sp.RIT341的酶NCBI登录号为WP_035410561；

所述来源于Burkholderia sp.NFACC38-1的酶NCBI登录号为WP_091925906.1；

所述来源于Frateuriadefendens的酶NCBI登录号为WP_049623289.1；

所述来源于Limosilactobacillus fermentum的酶NCBI登录号为ASA47863。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coliBL21；所述枯草芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M2016536的菌株，已公开于公开号为CN106754466A的专利中。

在本发明的一种实施方式中，所述小分子物质的添加量为10～50mM。

在本发明的一种实施方式中，所述海藻糖或甜菜碱的添加量为10～50mM。

在本发明的一种实施方式中，在发酵体系中同时加入海藻糖和甜菜碱，添加量分别为10～50mM。

在本发明的一种实施方式中，所述体系中还含有蛋白胨10g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L，氨苄青霉素100mg/L。

在本发明的一种实施方式中，将重组菌培养得到种子液，将种子液接种至发酵的体系中，在转速200rpm、温度37℃，培养2h后，加入终浓度为0.1mmol/L诱导剂IPTG，并将温度调至25℃，培养24h。

本发明的第二个目的是提供一种生产4,6-α-葡萄糖基转移酶的方法，所述方法是将4,6-α-葡萄糖基转移酶在宿主细胞中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞在含有甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇的发酵体系中进行培养。

在本发明的一种实施方式中，将编码4,6-α-葡萄糖基转移酶的基因连接至表达载体上，再将表达载体转入大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，以pET15b、pET20b、pET24a等pET系列载体为表达载体，表达4,6-α-葡萄糖基转移酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述编码4,6-α-葡萄糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，将重组菌培养得到种子液，将种子液接种至发酵体系中，在转速200rpm、温度37℃，培养2h后，加入终浓度为0.1mmol/L诱导剂IPTG，并将温度调至25℃，培养24h。

本发明还保护所述方法在提高外源蛋白可溶性表达或提高胞外酶活产量中的应用。

本发明的有益效果：

本发明相比现有提高异源蛋白质可溶性表达量的方法，特点如下：

1)相比传统的从分子水平优化基因的表达强度来提高蛋白质的可溶性表达量的方法，本发明操作工艺简单，且效果显著；

2)对同家族的酶有一定的普适性；

3)小分子物质的添加提高异源蛋白质的可溶性表达量，在发酵体系中可稳定起到效果，适合产业化应用。

附图说明

图1为以大肠杆菌为宿主菌时，发酵培养基中添加10mmol/L海藻糖菌株胞内4,6-α-葡萄糖基转移酶酶活；

图2为以枯草芽孢杆菌为宿主菌时，发酵培养基中添加10mmol/L海藻糖菌株胞内4,6-α-葡萄糖基转移酶酶活。

具体实施方式

实施例中所述的培养基配方如下：

所述LB种子培养基：蛋白胨10g/L、NaCL 10g/L、酵母粉5g/L，pH＝7.0。

所述TB发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L，氨苄青霉素100mg/L。

4,6-α-葡萄糖基转移酶酶活测定：

1)底物配置过程

利用碘显色法测定实施例3和4中得到的GtfB的酶活，称取0.0125mg的直连淀粉加入1mL磷酸-柠檬酸缓冲μ液润湿，然后加入1mL NaOH(2mol/L)，超声使其溶解，加1mL HCl(2mol/L)，调节pH至7.0，最后利用磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 7.0)定容至10mL,配成0.125％的淀粉底物。

2)检测过程

取100μL的底物于1.5mL离心管中，35℃水浴锅中温浴10min。加入100μL破碎上清的GtfB酶液35℃反应8min，反应结束后取100μL反应液加入到1900μL的碘显色液中显示5min，分光光度计测定660nm下的吸光度。对照用是缓冲液替换GtfB酶，空白取100μL的缓冲液加入到1900μL的碘显色液中显示5min。

3)相对酶活单位定义

单位时间吸光值下降一个百分点为一个酶活单位。

公式：酶活(U/mL)＝(100*D(稀释倍数)×(A对照-A实验))/(8min×0.1ml×(A对照-A空白)。

4)最适pH和最适温度测定

GtfB酶的最适温度和pH，在温度范围30-40℃，pH范围4.0-8.0，利用磷酸-柠檬酸缓冲液，获得最适温度35℃最适pH 7.0。

实施例1：来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的4,6-α-葡萄糖基转移酶基因(gtfB)的表达载体的构建

以含有gtfB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的合成质粒为模板，通过PCR获得目的基因，然后连接到pET15b质粒上，最终获得表达载体pET15b-gtfB，具体过程如下：

gtfB-F：5'-CATATGCAGGCCAACGATGGTCATTG-3'(下划线为NdeI酶切位点，SEQ IDNO.3)

gtfB-R：5'-GGATCCTTAATCATCTTCAATATTTG-3'(下划线为BamHI酶切位点，SEQ IDNO.4)人工序列

PCR反应体系：10xSuper PfxMasterMix 5μL，GtfB-F(10μM)1μL,gtfB-R(10μM)1μL模板0.5μL，加无菌水补齐至50μL。PCR扩增程序：98℃ 5min预变性；(98℃ 15S、55℃ 30S、72℃ 3.5min)×30个循环；72℃延伸10min。

PCR产物经过核酸胶回收，然后经过NdeI、BamHI(takara公司)双酶切，纯化后试剂盒(天根公司试剂盒)纯化，获得基因gtfB片段；利用利用同样NdeI、BamHI(takara公司)双酶切质粒pET15b，经过核酸胶回收，获得线性质粒片段。

T4连接体系：4μLgtfB基因片段、4μL pET15b质粒片段、1μL T4 ligase、1μL T4ligase buffer，16℃过夜连接。

将连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，然后涂含有氨苄青霉素(100μg/mL)LB固体培养基，37℃培养10h，挑选转化子，进行测序，最终获得正确的转化子即E.coliJM109/pET15-gtfB。

实施例2：重组质粒pET15-gtfB转化BL21(DE3)获得重组菌株

取2-5μL重组质粒pET15-gtfB，加入BL21(DE3)感受态细胞，在冰上孵育30min，然后42℃热激90s，加入800μL LB复苏40min，涂含有氨苄青霉素(100μg/mL)LB固体培养基，37℃培养12h，挑选正确的转化子到LB液体培养基中，37℃，200rpm条件下，培养10h后，加甘油，保藏菌株至-80℃条件下，为发酵菌株BL21/pET15-gtfB。

实施例3：TB培养基中添加小分子物质提高重组大肠杆BL21(DE3)/pET15-gtfB摇瓶发酵产酶量

(1)种子活化阶段

从-80℃的甘油管，取10μL实施例2构建得到的重组菌菌接入装有10mL液体LB培养基的100mL三角瓶中，使用回旋恒温调速摇床进行培养，控制温37℃，转速200rpm，初始pH7.0，培养10h。

(2)摇瓶发酵阶段

设置不同的发酵培养基：在TB培养基中分别加入甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖、山梨醇。

将种子培养液(OD₆₀₀大约为3)按2mL/100mL接种量分别接入上述发酵培养基中，在转速200rpm、温度37℃，培养2h后在对照组合实验组发酵培养基中均添加终浓度为0.1mmol/L诱导剂IPTG，并将温度调至25℃，在此条件下培养24h，菌液离心弃上清获得菌体，加入悬浮缓冲液(磷酸-柠檬酸缓冲液)，利用超声破碎细胞，12000rpm离心2min后，获得上清即4,6-α-葡萄糖基转移酶液，检测对照组和实验组酶活，结果如表1所示。对照组酶活85.2U/mL，而分别添加了海藻糖和甜菜碱的实验组酶活均可达400U/mL及以上，较对照组提升了至少369.5％，在同时添加了海藻糖和甜菜碱的培养基中，发酵酶活可达430.3U/mL，较对照组提高了405％。

表1重组菌在含有不同小分子的培养基中的发酵酶活

实施例4：TB培养基中添加小分子物质提高重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵产酶量

本实施例中的重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M2016536为宿主，转入表达质粒pHY300PLK-gtfB(pHY300PLK-gtfB的构建方法记载于公开号为CN111424047A的专利中)。

(1)种子活化阶段

从-80℃的甘油管，取10μL甘油菌接入装有10mL LB种子培养基的100mL三角瓶中，使用回旋恒温调速摇床进行培养，控制温度37℃，转速200rpm，初始pH 7.0，培养10h。

(2)发酵阶段

将种子培养液按3mL/100mL接种量接入TB发酵培养基中，为了说明小分子物质海藻糖对以枯草芽孢杆菌为宿主的重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gtfB产酶的影响，现将发酵培养基设置对照组：TB，实验组：TB中加入终浓度为20mmol/L的海藻糖，在37℃ 200rpm条件下培养3h，然后在对照组和实验组的发酵培养基中添加终浓度是0.1mmol/L的IPTG，同时在温度33℃、转速200rpm条件下，培养48h后结束发酵，收集菌株发酵液离心，获得菌体细胞，加入悬浮缓冲液(磷酸-柠檬酸缓冲液)，利用超声破碎细胞，12000rpm离心2min后，获得上清即4,6-α-葡萄糖基转移酶液，检测对照组和实验组酶活。对照组酶活50.3U/mL,而实验组酶活183.2U/mL，结果表明实验组的酶活相比对照组提高了264.2％，据此，说明海藻糖有利于GtFB酶表达。

表2重组菌在含有不同小分子的培养基中的发酵酶活

实施例5：小分子物质在提高GTFB酶同家族酶中的应用

在上述实施例中筛选得到的小分子物质甜菜碱和海藻糖在GTFB酶同家族酶中也能取得相同或相似的效果，从GTFB酶同家族酶中选取了4中酶的结果作为展示：

将分别来源于Exiguobacterium sp.RIT341(基因1，NCBI登录号为WP_035410561)、Burkholderia sp.NFACC38-1(基因2，NCBI登录号为WP_091925906.1)、Frateuriadefendens(基因3，NCBI登录号为WP_049623289.1)和Limosilactobacillusfermentum(基因4，NCBI登录号为ASA47863)的酶，利用与实施例1～4相似的方法，将酶分别经过密码子优化，连接至质粒pET15b，构建得到重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，同时将基因1、2、3、4连接至质粒pHY300PLK，构建的得到的重组质粒转入枯草芽孢杆菌，最终得到重组大肠杆菌和重组枯草芽孢杆菌，并在含有小分子物质(海藻糖和甜菜碱)的培养基中进行发酵产酶，结果如表3所示，可以看出，将重组菌在添加了海藻糖和甜菜碱的培养基中进行产酶，均能够显著提高酶的表达。

表3表达GTFB酶同家族酶的重组菌在含小分子物质培养基中的发酵酶活

虽然本发明己以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法

<130> BAA200835A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3144

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcaggcca acgatggtca ttggtatctg tttacggccg atggtacggc ggcgagccgt 60

gttgcgaaat gggccggtac gtattattat tttgatccgc agacgcatct gcgtgttgat 120

gataattatg ttcagagcca gtggggtgat tggtatatgt ttggtaaaga tggtcgtatt 180

gcaaccggcc tgtataaatg ggataaaaat aatcagtggt attattttga tcctgtgaca 240

tatctgaaag tgacaaataa atgggttgat ggtaattatt atgatgaaga tggtgcgcag 300

gcaattagca aactggttac cattaataac cgtctgtatt attttgatga tcagggcaaa 360

gaaatcagta atcagtttcg tacgattcat ggtgataaat attattttgg caacgatagt 420

gcagcagtga ccggccagca gaccatcgat ggtaaagttt ataaatttag caactatggc 480

tatctgctgg gtaatcgtta tggtaaaatt gaaaacggta aactgaacat ttatagcctg 540

gcagataaca gtctgattaa aaccgttgaa gcaggtccgt gggaaaatat ggcatatagc 600

atggatagta acagcattaa taacattgat ggttatatca gctatacggg ctggtatcgt 660

ccgtatggta caagccagga tggtaaaaca tggtatccga caaccgttgc agattggcgt 720

ccgattctga tgtatgtttg gccgagcaaa gatgttcagg ttaaatttat tcagtatttt 780

gtgaaccacg gttatgaaaa ttcaaattat ggcctgaccg caggtagtgt taaagattta 840

agcgaaaaca ccgcaagcat taaactgaat gaagttgcac agaatctgcg ttatgtcatt 900

gaacagcatg tcgtggcagc caaaagcacc agccagctgg caaatgatat taataatttt 960

atcaccacca tcccggaact gagcaaagca agcgaactga gcgtagttaa tagttatggc 1020

tataaacctg ataactcagg ttccgtcgat gatgatcagg tgatttttgt taacaatgat 1080

agcaaaaacc agaaaatcgg taataccagc tatgcagatt caaattatcg cctgatgaac 1140

cgcaccatta ataatcagaa tggtgataat aacagcgatg atagcccgga actgctggta 1200

ggcaatgata ttgataatag caatccagtt gtgcaggccg aaaatctgaa ttgggaatat 1260

tttctgctga attatggtaa atttatgaac tataacccta acggtaactt tgatggtttt 1320

cgcattgatg cagccgataa cattgatgcg gatgttctgg atcaggccgc ccagctgatt 1380

aatagcatct ataataccaa aggtaaccag gcaaatgcaa atgatcatct gatttataac 1440

gaaggttatc atctgggcgc agcaaatatg ctggatcgta aaagcaatcc tgaactgtat 1500

atggatagcg gctattttta taccctggaa aatgtactgg gtcgtgcaag cgatcgtgat 1560

gatattaata acctgattac caactctatc gtgaatcgtc agaacgatgt gtcagaaaac 1620

gtggcaaccc cgaattggag ctttgttacg aatcatgatc agcgtaaaaa tctgattaac 1680

cagatcgtga tcgatgatca tccgggcgtt gcggatatta tgagcgatgg ttataaagca 1740

gaatatgtta accaggcatg gaaagaattt tatgcagatc aggcacgcac cgataaaaag 1800

tatacccagt ataatctgcc ggcacagtat gcactgctgc tgacgaataa agatacagtg 1860

ccgcaggtgt attatggtga tctgtatgat gaaaccgatc agtatatgca gaataaaagc 1920

gtttattatg atgccattac caccctgatg aaagcccgta aaagctatgt gagcggtggt 1980

cagagcatga ttaaaattaa tgatcatctg ctgaccagcg tgcgttatgg taaaggtatt 2040

attgatggta atgtgagcat gaccgatatt ctgggtcgta atagcggtat tgcagttgtt 2100

gttggtaacg atgcccagat ggcaaatcag acaattagta ttaacatggg taaagcccat 2160

gcaaatcagg catataaaca gctgctgggt acaatcgatt caggtctgac cagttctgat 2220

acaacaattt atcataccga tagcaacggc gtgctgaacg tcaccgtgaa aggttatagc 2280

aacccatacg ttagcggtta tctgggtgtt tgggttccgc tgaatggcgg tgccaatatt 2340

accaccaaag ccagcgaagt taccaatcag agcgataaaa cctatagcag taatgcagca 2400

ctggatagcc atgttattta tgaagatttt agcctgtttc agccggaacc gaccagcaaa 2460

gcagaacatg cctataatat tatcgcagat aatgcaagcc tgtttaatga actgggtatt 2520

accgattttt ggatggcccc ggcatatacc ccgtttaata caagccgtta taatgaaggt 2580

tattccatga ccgatcgtta taatctgggt acagaagcca atctgaccaa atatggcagc 2640

ggtgaagaac tgagtaatgc aatcgctgca ctgcatgatg caggtctgaa agtgcaggaa 2700

gatttagtta tgaatcagat gatcggtttt agtggtcagg aagcagtgac cgttacccgt 2760

accgatggtc atgccaaaca gctgaccgtt gatggtaaaa cgtttgcaaa tcagatttat 2820

tttgcgtata cccgtggtgg tggtgaaggt cagaaaaatt atggtggcaa atatctggat 2880

gaactgcaaa aaaaatatcc ggaactgttt accaccaaag cagttagcac cggcgttgca 2940

ccggacccta gcgttcatat taccgaatgg agcgcaaaat atcagaatgg tacaagcctg 3000

caaaatattg gtattggtct ggcagttaaa ctggcaaatg gtgattatgc ctatctgaat 3060

gatagcaata ataaagcatt taataccacc ctgccggaaa ccatgagcag cgcagattat 3120

tatgcaaata ttgaagatga ttaa 3144

<210> 2

<211> 1047

<212> PRT

<213> Lactobacillus fermentum

<400> 2

Met Gln Ala Asn Asp Gly His Trp Tyr Leu Phe Thr Ala Asp Gly Thr

1 5 10 15

Ala Ala Ser Arg Val Ala Lys Trp Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Asp

20 25 30

Pro Gln Thr His Leu Arg Val Asp Asp Asn Tyr Val Gln Ser Gln Trp

35 40 45

Gly Asp Trp Tyr Met Phe Gly Lys Asp Gly Arg Ile Ala Thr Gly Leu

50 55 60

Tyr Lys Trp Asp Lys Asn Asn Gln Trp Tyr Tyr Phe Asp Pro Val Thr

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Val Thr Asn Lys Trp Val Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Glu

85 90 95

Asp Gly Ala Gln Ala Ile Ser Lys Leu Val Thr Ile Asn Asn Arg Leu

100 105 110

Tyr Tyr Phe Asp Asp Gln Gly Lys Glu Ile Ser Asn Gln Phe Arg Thr

115 120 125

Ile His Gly Asp Lys Tyr Tyr Phe Gly Asn Asp Ser Ala Ala Val Thr

130 135 140

Gly Gln Gln Thr Ile Asp Gly Lys Val Tyr Lys Phe Ser Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Leu Gly Asn Arg Tyr Gly Lys Ile Glu Asn Gly Lys Leu Asn

165 170 175

Ile Tyr Ser Leu Ala Asp Asn Ser Leu Ile Lys Thr Val Glu Ala Gly

180 185 190

Pro Trp Glu Asn Met Ala Tyr Ser Met Asp Ser Asn Ser Ile Asn Asn

195 200 205

Ile Asp Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Trp Tyr Arg Pro Tyr Gly Thr

210 215 220

Ser Gln Asp Gly Lys Thr Trp Tyr Pro Thr Thr Val Ala Asp Trp Arg

225 230 235 240

Pro Ile Leu Met Tyr Val Trp Pro Ser Lys Asp Val Gln Val Lys Phe

245 250 255

Ile Gln Tyr Phe Val Asn His Gly Tyr Glu Asn Ser Asn Tyr Gly Leu

260 265 270

Thr Ala Gly Ser Val Lys Asp Leu Ser Glu Asn Thr Ala Ser Ile Lys

275 280 285

Leu Asn Glu Val Ala Gln Asn Leu Arg Tyr Val Ile Glu Gln His Val

290 295 300

Val Ala Ala Lys Ser Thr Ser Gln Leu Ala Asn Asp Ile Asn Asn Phe

305 310 315 320

Ile Thr Thr Ile Pro Glu Leu Ser Lys Ala Ser Glu Leu Ser Val Val

325 330 335

Asn Ser Tyr Gly Tyr Lys Pro Asp Asn Ser Gly Ser Val Asp Asp Asp

340 345 350

Gln Val Ile Phe Val Asn Asn Asp Ser Lys Asn Gln Lys Ile Gly Asn

355 360 365

Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Asn Tyr Arg Leu Met Asn Arg Thr Ile Asn

370 375 380

Asn Gln Asn Gly Asp Asn Asn Ser Asp Asp Ser Pro Glu Leu Leu Val

385 390 395 400

Gly Asn Asp Ile Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Asn Leu

405 410 415

Asn Trp Glu Tyr Phe Leu Leu Asn Tyr Gly Lys Phe Met Asn Tyr Asn

420 425 430

Pro Asn Gly Asn Phe Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Asp Asn Ile

435 440 445

Asp Ala Asp Val Leu Asp Gln Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ser Ile Tyr

450 455 460

Asn Thr Lys Gly Asn Gln Ala Asn Ala Asn Asp His Leu Ile Tyr Asn

465 470 475 480

Glu Gly Tyr His Leu Gly Ala Ala Asn Met Leu Asp Arg Lys Ser Asn

485 490 495

Pro Glu Leu Tyr Met Asp Ser Gly Tyr Phe Tyr Thr Leu Glu Asn Val

500 505 510

Leu Gly Arg Ala Ser Asp Arg Asp Asp Ile Asn Asn Leu Ile Thr Asn

515 520 525

Ser Ile Val Asn Arg Gln Asn Asp Val Ser Glu Asn Val Ala Thr Pro

530 535 540

Asn Trp Ser Phe Val Thr Asn His Asp Gln Arg Lys Asn Leu Ile Asn

545 550 555 560

Gln Ile Val Ile Asp Asp His Pro Gly Val Ala Asp Ile Met Ser Asp

565 570 575

Gly Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Asn Gln Ala Trp Lys Glu Phe Tyr Ala

580 585 590

Asp Gln Ala Arg Thr Asp Lys Lys Tyr Thr Gln Tyr Asn Leu Pro Ala

595 600 605

Gln Tyr Ala Leu Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro Gln Val Tyr

610 615 620

Tyr Gly Asp Leu Tyr Asp Glu Thr Asp Gln Tyr Met Gln Asn Lys Ser

625 630 635 640

Val Tyr Tyr Asp Ala Ile Thr Thr Leu Met Lys Ala Arg Lys Ser Tyr

645 650 655

Val Ser Gly Gly Gln Ser Met Ile Lys Ile Asn Asp His Leu Leu Thr

660 665 670

Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly Ile Ile Asp Gly Asn Val Ser Met Thr

675 680 685

Asp Ile Leu Gly Arg Asn Ser Gly Ile Ala Val Val Val Gly Asn Asp

690 695 700

Ala Gln Met Ala Asn Gln Thr Ile Ser Ile Asn Met Gly Lys Ala His

705 710 715 720

Ala Asn Gln Ala Tyr Lys Gln Leu Leu Gly Thr Ile Asp Ser Gly Leu

725 730 735

Thr Ser Ser Asp Thr Thr Ile Tyr His Thr Asp Ser Asn Gly Val Leu

740 745 750

Asn Val Thr Val Lys Gly Tyr Ser Asn Pro Tyr Val Ser Gly Tyr Leu

755 760 765

Gly Val Trp Val Pro Leu Asn Gly Gly Ala Asn Ile Thr Thr Lys Ala

770 775 780

Ser Glu Val Thr Asn Gln Ser Asp Lys Thr Tyr Ser Ser Asn Ala Ala

785 790 795 800

Leu Asp Ser His Val Ile Tyr Glu Asp Phe Ser Leu Phe Gln Pro Glu

805 810 815

Pro Thr Ser Lys Ala Glu His Ala Tyr Asn Ile Ile Ala Asp Asn Ala

820 825 830

Ser Leu Phe Asn Glu Leu Gly Ile Thr Asp Phe Trp Met Ala Pro Ala

835 840 845

Tyr Thr Pro Phe Asn Thr Ser Arg Tyr Asn Glu Gly Tyr Ser Met Thr

850 855 860

Asp Arg Tyr Asn Leu Gly Thr Glu Ala Asn Leu Thr Lys Tyr Gly Ser

865 870 875 880

Gly Glu Glu Leu Ser Asn Ala Ile Ala Ala Leu His Asp Ala Gly Leu

885 890 895

Lys Val Gln Glu Asp Leu Val Met Asn Gln Met Ile Gly Phe Ser Gly

900 905 910

Gln Glu Ala Val Thr Val Thr Arg Thr Asp Gly His Ala Lys Gln Leu

915 920 925

Thr Val Asp Gly Lys Thr Phe Ala Asn Gln Ile Tyr Phe Ala Tyr Thr

930 935 940

Arg Gly Gly Gly Glu Gly Gln Lys Asn Tyr Gly Gly Lys Tyr Leu Asp

945 950 955 960

Glu Leu Gln Lys Lys Tyr Pro Glu Leu Phe Thr Thr Lys Ala Val Ser

965 970 975

Thr Gly Val Ala Pro Asp Pro Ser Val His Ile Thr Glu Trp Ser Ala

980 985 990

Lys Tyr Gln Asn Gly Thr Ser Leu Gln Asn Ile Gly Ile Gly Leu Ala

995 1000 1005

Val Lys Leu Ala Asn Gly Asp Tyr Ala Tyr Leu Asn Asp Ser Asn

1010 1015 1020

Asn Lys Ala Phe Asn Thr Thr Leu Pro Glu Thr Met Ser Ser Ala

1025 1030 1035

Asp Tyr Tyr Ala Asn Ile Glu Asp Asp

1040 1045

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatgcagg ccaacgatgg tcattg 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatccttaa tcatcttcaa tatttg 26

Claims

1.一种提高重组菌外源蛋白表达量的方法，其特征在于，在重组菌生产目的蛋白的体系中添加甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括4,6-α-葡萄糖基转移酶及其同家族的酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇的添加量为10～50mM。

5.一种生产4,6-α-葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，将4,6-α-葡萄糖基转移酶在宿主细胞中表达，所述宿主细胞在含有甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇的体系中进行培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将编码4,6-α-葡萄糖基转移酶的基因连接至表达载体上，再将表达载体转入大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中；所述编码4,6-α-葡萄糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliBL21。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为保藏编号为CCTCCNO：M2016536的菌株。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇的添加量为10～50mM。

10.权利要求1～9任一所述方法在提高外源蛋白可溶性表达或提高胞外酶活产量中的应用，其特征在于，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶替换为具有酶活性的外源蛋白。