CN113265386A - 一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体及其应用 - Google Patents

一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明分别通过对普鲁兰酶的第73位、第135/314位、第135/314/126位和第135/314/126/72位的氨基酸进行突变，得到了4个热稳定性提高、催化效率不变或提高的普鲁兰酶突变体。在70℃下，其半衰期分别是野生型的2.6、1.9、3.3及3.1倍；Tm值分别提高了7.0、6.5、6.7、6.9℃。通过在耐高温中性普鲁兰酶突变体的N末端融合OptPelB使普鲁兰酶的胞外酶活达到9.7U·/mL，是野生型的的4.9倍。本发明中能够分泌表达的耐热中性普鲁兰酶突变体具有淀粉原料高值化利用的应用潜力。

Description

一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体及其应用，属于酶工程及基因工程技术领域。
背景技术
普鲁兰酶(EC3.2.1.41)因其特殊的淀粉脱支活性而广为人知。普鲁兰酶属于糖苷水解酶超家族，其能水解支链淀粉、糊精、普鲁兰多糖和其它寡糖中的α-1，6糖苷键。目前，普鲁兰酶主要应用于淀粉的糖化。在淀粉糖化过程中加入普鲁兰酶可减少糖化酶用量，缩短反应时间，从而提高产率和转化率。普鲁兰酶与异淀粉酶等脱支酶相比，其能水解的最小底物只需两条由α-1,6糖苷键连接的含有两个由α-1,4糖苷键连接的葡萄糖链段。因此，普鲁兰酶能最大程度地利用底物，从而减少工业成本。
然而，目前报道并已应用工业化生产的普鲁兰酶仍存在一些与应用相悖的问题：
首先，从自然界中筛选新的嗜热普鲁兰酶是有限的。嗜热普鲁兰酶的应用能够减少工业成本，减少微生物污染，到目前为止，我们已经从自然界中的芽孢杆菌、克雷伯氏菌、产气杆菌、放线菌、肠杆菌、链球菌、短梗霉以及少数的嗜热古细菌等均发现了野生型普鲁兰酶，但由于嗜热菌来源受限，直接从自然界筛选新的嗜热普鲁兰酶有限。
其次，具有特定工业应用所需特性的普鲁兰酶的可用性有限，目前工业上应用比较广泛的是酸性普鲁兰酶，中性和碱性普鲁兰酶应用比较少。
最后，野生型普鲁兰酶的热稳定性与工业应用不符。普鲁兰酶参与的反应一般是长期的高温环境，而从天然微生物或保存在数据库中的基因获得的酶的活性和稳定性仍然有限。对野生型普鲁兰酶，尤其是耐高温的嗜热普鲁兰酶，其稳定性需要进一步提高，以满足长时间反应和长期保存的要求。
发明内容
本发明的目的是为了提高中性普鲁兰酶的热稳定性，解决了野生型普鲁兰酶在高温条件下活性和稳定性差的问题。
本发明提供了一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体，所述突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第73位点、第135/314位点、第135/314/126位点或第135/314/126/72位点的氨基酸发生突变获得的。
在一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(d)中的任意一种：
(a)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第73位苏氨酸突变为溴乙基酪氨酸(O2beY)；
(b)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第135位脯氨酸突变为O2beY，以及第314位丙氨酸突变为半胱氨酸；
(c)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第135位脯氨酸突变为O2beY，第314位丙氨酸突变为半胱氨酸,以及第126位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；
(d)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的亲本的第135位脯氨酸突变为O2beY，第314位丙氨酸突变为半胱氨酸,第126位的苏氨酸突变为苯丙氨酸，以及第72位丙氨酸突变为精氨酸。
在一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列的N端融合信号肽PelB。
本发明还提供了一种携带上述耐热型普鲁兰酶突变体的编码基因。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体携带上述耐热型普鲁兰酶突变体的编码基因。
在一种实施方式中，所述重组载体的出发载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。
本发明还提供了一种耐热型中性普鲁兰酶的表达系统，所述表达系统是携带上述耐热型普鲁兰酶突变体的编码基因或者携带上述耐热型普鲁兰酶突变体的编码基因的重组载体的微生物细胞。
在一种实施方式中，所述微生物细胞为原核生物或者真核生物。
本发明还提供了上述普鲁兰酶的突变体、上述编码基因、上述重组载体在水解淀粉中的应用。
在一种实施方式中，所述淀粉不限于玉米淀粉和土豆淀粉。
本发明还提供一种提高分解淀粉效率的方法，所述方法是利用上述突变体加入到糊化后淀粉水溶液中，在60℃-65℃条件下水解。。
本发明的有益效果：
(1)本发明的普鲁兰酶突变体的热稳定性较野生型有了明显的改善。在70℃下，普鲁兰酶突变体T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C、T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的半衰期分别为330min、243min、425min、398min，分别是野生型的2.6倍、1.9倍、3.3倍及3.1倍；Tm值分别提高了7.0℃、6.5℃、6.7℃、6.9℃。
(2)本发明的普鲁兰酶突变体的比活。野生型比酶活为219.2±18U/mg，而突变体T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C、T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的酶活分别为203.9±12.1U/mg、151.1±12.0U/mg、282.9±25.1U/mg、316.6±22.3U/mg。其中，T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R在酶活提高的情况下较大程度改善了其热稳定性。
(3)本发明的普鲁兰酶突变体的分泌效率有了明显提高。普鲁兰酶突变体OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的胞外酶活达到9.7U/mL，是野生型的的4.9倍。
(4)本发明的普鲁兰酶突变体提高了分解淀粉的效率，无需调节PH，缩短淀粉分解的时间。
附图说明
图1为WT、T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C、T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的分子量鉴定结果。
图2为WT、T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C、T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的表面解链温度Tm，其中，横坐标是温度，纵坐标是d(相对荧光强度)/dT。
图3为WT、T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C、T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R在70℃下的半衰期，其中，横坐标是时间，纵坐标是ln(残余酶活)。
图4为WT、T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C、T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的比活，其中，横坐标是组别，纵坐标是相对酶活。
图5为WT、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R、OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的粗酶活，其中，横坐标是组别，纵坐标是粗酶活。
图6为O2beY/Cys对发生交联反应的原理。
图7为为玉米淀粉水解产物的HPLC分析，A为Prozozyme水解淀粉的HPLC分析，B为T73(O2beY)-171C/T126F/A72R水解淀粉的HPLC分析；其中，横坐标为时间，纵坐标为示差折光值。
具体实施方式
野生型普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
野生型普鲁兰酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例1.重组质粒的构建
(1)依据大肠杆菌密码子偏好性规律对SEQ ID NO.2所示的来自Bacillusthermoleovoran的普鲁兰酶基因进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)使用NcoI内切酶和XhoI内切酶对表达载体pET28a线性化，并利用NcoI内切酶和XhoI内切酶对SEQ ID NO.3所示的普鲁兰酶基因(Btpul)进行双酶切处理；酶切处理后的产物通过T4 DNA连接酶连接，获得野生型普鲁兰酶重组质粒；将重组质粒转入E.coliJM109感受态细胞中，从阳性转化子中提取质粒(质粒提取试剂盒购自OMEGA公司)，得到野生型Btpul的重组质粒。
(3利用
Figure BDA0003066110020000042
PCR酶(购于TaKaRa公司)采用两步PCR或全质粒PCR对普鲁兰酶基因进行突变：
扩增BtPul全长引物：
Btpul_F:AGAAGGAGATATACCATGGACATGCTGCATATTAGTCGCAC(SEQ ID NO.14)，
Btpul_R:TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGCCGGCCGGGTGCACCAGAACC(SEQ ID NO.15；
反向PCR引物：
PR1_F:CTCGAGCACCACCACCACCACC(SEQ ID NO.26)，
PR1_R:GTCCATGGTATATCTCCTTCTT(SEQ ID NO.27)；
全长引物用来与突变引物共同突变普鲁兰酶基因，以突变单个位点为例，两步PCR中，第一步：全长引物的上游引物与突变引物的下游引物扩增出普鲁兰酶的左片段，全长引物的下游引物与突变引物的上游引物扩增出普鲁兰酶的右片段；第二步：左片段与右片段重叠延伸出普鲁兰酶全长的突变基因。
(4)利用
Figure BDA0003066110020000041
PCR酶(购于TaKaRa公司)采用两步PCR或全质粒PCR对普鲁兰酶基因进行突变：溴乙基酪氨酸(O-2-bromoethyl tyrosine，缩写为O2beY)
1.T73(O2beY)-171C突变引物(以含有野生型普鲁兰酶基因Btpul的重组质粒为模板)：
T73(O2beY)-171C_Fm:TCGGTGCCTAGTATTGGGTGCGTAGTTGC(SEQ ID NO.16)，
T73(O2beY)-171C_Rm:CCCAATACTAGGCACCGAATTCGAAGGCG(SEQ ID NO.17)；
T73(O2beY)-171C的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
PCR反应体系/过程：采用两步PCR，第一步：全长引物中的Btpul_F与突变引物中的T73(O2beY)-171C_Rm扩增出普鲁兰酶的左片段，全长引物中的Btpul_R与突变引物中的T73(O2beY)-171C_Fm扩增出普鲁兰酶的右片段；第二步：扩增出的普鲁兰酶左片段与右片段重叠延伸出普鲁兰酶全长的突变基因。
将扩增得到的序列与利用反向PCR引物PR1_F和PR1_R扩增得到的线性载体pET28a连接，得到含有T73(O2beY)-171C基因的重组质粒。
2.P135(O2beY)-A314C突变引物(以含有野生型普鲁兰酶基因Btpul的重组质粒为模板)：
P135(ObeY)_Fm:CTGGTGCATTAGCACTTAGACGAGATCCGCT(SEQ ID NO.18)，
P135(ObeY)_Rm:CTCGTCTAAGTGCTAATGCACCAGTTTCACG(SEQ ID NO.19)；
A314C_Fm:ATCCCTGTGACCCGTACGCACGTATTGTG(SEQ ID NO.20)，
A314C_Rm:CGTACGGGTCACAGGGATCGGTGGCGTAG(SEQ ID NO.21)；
P135(O2beY)-A314C的氨基酸序列人SEQ ID NO.5所示，.P135(O2beY)-A314C的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
PCR反应的体系/过程：
采用两步PCR，第一步：全长引物中的Btpul_F与突变引物中的P135(ObeY)_Rm扩增出普鲁兰酶的左片段，突变引物中的P135(ObeY)_Fm与A314C_Rm扩增出普鲁兰酶的中片段，全长引物中的Btpul_R与突变引物中的A314C_Fm扩增出普鲁兰酶的右片段；第二步：扩增出的普鲁兰酶左片段、中片段以及右片段重叠延伸出普鲁兰酶全长的突变基因。
将扩增得到的序列与利用反向PCR引物PR1_F和PR1_R扩增得到的线性载体pET28a连接，得到含有P135(O2beY)-A314C基因的重组质粒。
3.T73(O2beY)-171C/T126F突变引物(以含有T73(O2beY)-171C基因的重组质粒为模板)：
T126F_Fm:GCACCGACCGCCTTTGCAGTTAGCGTGAAAC(SEQ ID NO.22)，
T126F_Rm:TTCACGCTAACTGCAAAGGCGGTCGGTGCC(SEQ ID NO.23)；
T73(O2beY)-171C/T126F氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，T73(O2beY)-171C/T126F核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
采用两步PCR，第一步：全长引物中的Btpul_F与突变引物中的T126F_Rm扩增出普鲁兰酶的左片段，全长引物中的Btpul_R与突变引物中的T126F_Fm扩增出普鲁兰酶的右片段；第二步：扩增出的普鲁兰酶左片段和右片段重叠延伸出普鲁兰酶全长的突变基因。
将扩增得到的序列与利用反向PCR引物PR1_F和PR1_R扩增得到的线性载体pET28a连接，得到含有T73(O2beY)-171C/T126F基因的重组质粒。
4.T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变引物(以含有T73(O2beY)-171C/T126F基因的重组质粒为模板)：
T73(ObeY)/A72R_Fm:CAGTTTCACGCTAACACGAAAGGCGGTCGGT(SEQ ID NO.24)，
T73(ObeY)/A72R_Rm:CTTCGAATTCGGTCGTTAGTATTGGGTGCGTA(SEQ ID NO.25)；
T73(O2beY)-171C/T126F/A72R氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，T73(O2beY)-171C/T126F/A72R核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
PCR反应的体系/过程：
采用两步PCR，第一步：全长引物中的Btpul_F与突变引物中的T73(ObeY)/A72R_Rm扩增出普鲁兰酶的左片段，全长引物中的Btpul_R与突变引物中的T73(ObeY)/A72R_Fm扩增出普鲁兰酶的右片段；第二步：扩增出的普鲁兰酶左片段和右片段重叠延伸出普鲁兰酶全长的突变基因。
将扩增得到的序列与利用反向PCR引物PR1_F和PR1_R扩增得到的线性载体pET28a连接，得到含有T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的重组质粒。
5.OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体所用引物(以含有T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的重组质粒为模板)：
OptPelB_Fm:CTGCTGCTGCTGGCCGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATGCTGCATATTAGTCGCAC(SEQID NO.28)；
OptPelB_Rm:GCTGGGCGGCCAGCAGCAGCAGACCGGCGGCGGCGGTCGGCAGCAGATATTTCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC(SEQ ID NO.29)；
OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，
OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
PCR反应的体系/过程：
采用全质粒PCR，利用OptPelB_Fm和OptPelB_Rm反向扩增出含有OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的线性重组质粒
将反向扩增出的线性重组质粒连接，得到含有OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的重组质粒。
(4)构建pEVOL-pBpF突变质粒：以质粒pEVOL-pBpF(购于Addgene公司)为模板，根据其AARS/tRNA基因设计出其对应的全长引物、反向PCR引物及突变引物，引入T158A、S159I和L162A突变位点，由此构建pEVOL-pBpF突变质粒，引物设计如下(引物方向为从5’→3’)：
全长引物：
AARS/tRNA_F:TAACAGGAGGAATTAGATCTATGGACGAATTTGAAATGATAAAG(SEQ IDNO.30)
AARS/tRNA_R:TTTAGCGTTTGAAACTGCAGTTATAATCTCTTTCTAATTGGC(SEQ ID NO.31)
突变引物：
AARS/tRNA_Fm:TGCAATTCATTATGCAGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGG(SEQ IDNO.32)
AARS/tRNA_Rm:CCTGCATAATGAATTGCATTAACCTGCATTATTGGATAGATAACTTCAGCAACC(SEQ ID NO.33)
反向PCR引物：
RP2_F:AGATCTAATTCCTCCTGTTAGCCCAAAAAAACGGGTATGGAG(SEQ ID NO.34)
RP2_R:CTGCAGTTTCAAACGCTAAATTGCCTGATGCGCTACGCTTATC(SEQ ID NO.35)
PCR过程：采用全质粒PCR，第一步：全长引物中的AARS/tRNA_F与突变引物中的AARS/tRNA_Rm扩增出AARS的左片段，全长引物中的AARS/tRNA_R与突变引物中的AARS/tRNA_Fm扩增出AARS的右片段；第二步：扩增出的AARS左片段和右片段重叠延伸出普鲁兰酶全长的突变基因。
将扩增得到的序列与利用反向PCR引物RP2_F和RP2_R扩增得到的线性载体pEVOL-pBpF连接，得到pEVOL-pBpF突变质粒。
以上反应的条件和体系：
PCR反应条件：两步PCR中的第一步反应以及全质粒PCR：98℃3min，98℃30s，58℃40s，72℃40s-60s，共30个循环；两步PCR中的第二步反应中：先进行上述条件下的8个循环的PCR反应，再进行上述条件下的30个循环的PCR反应
PCR体系：第一步反应中：25μL
Figure BDA0003066110020000071
MAX DNA Polymerase，23μL ddH2O，1μL质粒模板，0.5μL引物1，0.5μL引物2；第二步反应中：25μL
Figure BDA0003066110020000072
MAX DNAPolymerase，16-19μL ddH2O，3μL左片段，(3μL中片段)，3μL右片段。
PCR体系：25μL
Figure BDA0003066110020000073
MAX DNA Polymerase，23μL ddH2O，1μL重组质粒，0.5μL引物1，0.5μL引物2。反应的条件和体系：
PCR反应条件：98℃3min，98℃30s，58℃40s，72℃40s-60s，共30个循环。
PCR产物的载体片段与普鲁兰酶基因片段通过同源同组酶(购于南京诺唯赞生物科技公司)连接。
实施例2.重组菌的构建
1.野生型普鲁兰酶表达菌株：感受态细胞的制备：参照Competent CellPreparation kit(购于TaKaRa公司)说明书上的规范操作，将保藏的大肠杆菌划线分离培养至LB无抗平板，并挑取长出的单菌落至无抗的LB试管，37℃，200rpm的条件下过夜培养8-12h；之后，按2％的接种量转接至装有20％LB无抗培养基的250mL三角瓶，培养条件如前所述37℃，200rpm的条件下过夜培养8-12h；待OD600约为0.6-0.8后，将250mL三角瓶于冰上静置30min；将菌液以25mL的分装量分装至已灭菌的50mL离心管中；4℃下，8000rpm离心5min后弃上清，加入10％A液轻轻将菌体重悬；再次于4℃，6000rpm离心5min后弃上清，加入10％B液轻轻将菌体重悬后以100μL分装量分装至1.5mL已灭菌的ep管中，于-80℃下保存至多1年。所有操作注意无菌操作。
化学转化：将于冰上融化的E.coli JM109感受态细胞于超净台中加入10μL左右的含有野生型Btpul基因的重组质粒；缓慢混匀后，于冰上放置30min左右；于42℃金属浴中，热击45-90s后于冰上放置5min；加入800mL LB培养基，于37℃，200rpm培养1h；8000rpm离心5min，并于超净台轻轻将800mL上清弃去；利用剩余培养液重悬菌体，涂布至抗性平板，37℃静置过夜培养12h；挑菌落进行菌落PCR验证(所用引物为Btpul全长引物)后送至测序公司测序。从验证得到的阳性转化子中提取质粒，并按上述化学转化法转化至E.coli BL21感受态细胞，抗性平板中长出的菌落即为重组表达菌株。
2.含普鲁兰酶突变基因的重组表达菌株：按照上述步骤1的化学转化的方法，分别含有T73(O2beY)-171C基因的重组质粒、含有P135(O2beY)-A314C基因的重组质粒、含有T73(O2beY)-171C/T126F基因的重组质粒、含有T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的重组质粒或者含有OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的重组质粒将转化至E.coli JM109感受态细胞，按照上述步骤1的培养方法培养后挑单菌落进行菌落PCR验证(所用引物为Btpul全长引物)后送至测序公司测序。从验证得到的阳性转化子中提取相应的含有突变基因的重组质粒。
将含有普鲁兰酶突变基因的重组质粒(含有T73(O2beY)-171C基因的重组质粒、含有P135(O2beY)-A314C基因的重组质粒、含有T73(O2beY)-171C/T126F基因的重组质粒、含有T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的重组质粒或者含有OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的重组质粒)和pEVOL-pBpF突变质粒按步骤1中的操作共转化至E.coliBL21得到双重质粒的表达菌株，其中含有普鲁兰酶突变基因的重组质粒和pEVOL-pBpF突变质粒的加入比例为1：1。
获得T73(O2beY)-171C突变菌株、P135(O2beY)-A314C突变菌株、T73(O2beY)-171C/T126F突变菌株、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变菌株和OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变菌株。
实施例3.普鲁兰酶的表达及纯化
(1)野生型普鲁兰酶表达
将含野生型Btpul的重组菌接种于5mL含卡那霉素(50μg·mL-1)的LB试管中，于37℃，200rpm下培养8-12h；以2％的接种量将培养液转接至含20％的自诱导培养基(10g·L-1胰蛋白胨，5.0g·L-1酵母提取物，10g·L-1α-乳糖，5.0g·L-1甘油，1.0g·L-1葡萄糖，7.1g·L-1Na2HPO4，6.8g·L-1KH2PO4，2.67g·L-1NH4Cl，0.71g·L-1Na2SO4和0.25g·L-1MgSO4；pH7.5)的250mL三角瓶中，并加入卡那霉素至其终浓度为50μg·mL-1，在37℃和200rpm的培养条件下培养2-3h；将温度降至17℃，并继续培养48-60h以表达野生型重组蛋白。
(2)普鲁兰酶突变体的表达
将含有普鲁兰酶突变基因的重组质粒以及pEVOL-pBpF突变质粒的双质粒重组菌接种于5mL含卡那霉素(50μg·mL-1)和氯霉素(34μg·/mL)的LB试管中，于37℃，200rpm下培养8-12h；将培养液以2％的接种量转接至不含α-乳糖的自诱导培养基中，并加入卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(34μg·/ml)，在37℃，200rpm的培养条件下培养2.5～3h；之后，加入终浓度为4mM L-阿拉伯糖和1mM O2beY，28℃，200rpm培养12h；最后，加入终浓度为10g/L的α-乳糖，于17℃，200rpm的培养条件下培养48～60h。
结果：T73(O2beY)-171C突变体、P135(O2beY)-A314C突变体、T73(O2beY)-171C/T126F突变体、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体均成功得到可溶性表达。
(3)普鲁兰酶突变体的纯化
利用超声破碎仪对重组菌进行超声破碎处理，工作功率为36％，工作2s，间歇3s，直至破碎完全，得到全细胞破碎液；以4℃，转速12000rpm进行冷冻离心，离心时间为30min，并将上清液通过0.22μm水系滤膜过滤后收集滤液；利用AKTAxpress系统的纯化仪系统以及5mL规格的HisTrap HP纯化柱对滤液进行分离纯化；洗脱时用含1M咪唑的缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl)，以2-3mL·min-1的流速进行洗脱；然后，用10％(w/v)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证纯化的组分，并将最纯的组分用PD-10脱盐柱进行脱盐，脱盐时使用低盐缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl；pH 6.0)。得到纯化后的T73(O2beY)-171C突变体、P135(O2beY)-A314C突变体、T73(O2beY)-171C/T126F突变体、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体和OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体。
利用以下实验验证实验效果：
1.普鲁兰酶分子量鉴定：
利用Q-TOF MS进行酶蛋白的分子量鉴定，测定参数如下：m/z范围：50-3000；扫描时间：0.1s；碰撞电压：MSe模式(低能)6V(高能)20～30V；正离子模式，锥孔电压：40V。结果如图1所示，81KDa附近均有单一信号,表明突变体成功表达。此外，由于突变体中非天然氨基酸O2beY翻译入普鲁兰酶后与临近的Cys(O2beY/Cys)发生交联反应(图6为交联反应的原理)，从而使其分子量发生不同的变化。对于T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C，其O2beY/Cys对的交联反应使HBr失去，从而导致分子量降低82Da。对于T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R，在质谱中可见两个信号，表明其O2beY/Cys对的交联反应只部分发生，与SDS-PAGE的结果一致。该结果表明，O2beY成功翻译至酶蛋白中的指定位点中。表1为各个突变体的理论分子量。
表1突变体的理论分子量
Figure BDA0003066110020000101
2.酶活测定：
普鲁兰酶酶活测定采用DNS法。将2％(w/v)普鲁兰多糖溶液200μL与200μL稀释酶液混合反应，溶剂为0.2M磷酸钠缓冲液(pH 6.0)，并设置不加酶样品的反应系统作为对照；反应温度为70℃，反应20min后立即置于冰水浴中放置5min以终止反应；对照补加200μL稀释酶液，并向各管中加入600μL的DNS试剂(185g·L-1酒石酸钾钠，6.3g·L-1 3,5-二硝基水杨酸，21g·L-1NaOH，5g·L-1结晶酚，5g·L-1亚硫酸钠)；反应混合物于沸水浴中煮5min后立即于冰上冷却，稀释一定倍数后通过酶标仪测定在540nm处的吸光值。
1U定义为在指定的测定条件下每分钟释放1微摩尔还原糖(相当于葡萄糖)的酶的量。
结果：野生型比酶活为219.2±18U/mg，而T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C突变体、T73(O2beY)-171C/T126F突变体、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体的酶活分别为203.9±12.1U/mg、151.1±12.0U/mg、282.9±25.1U/mg、316.6±22.3U/mg。
3.突变前后热稳定性的比较：
(1)表观溶解温度Tm
对于每个被分析的酶蛋白样品，将20μL浓度为50μg/mL的纯化蛋白样品与5μL
Figure BDA0003066110020000102
橙色染料(Sigma；S5692)轻轻混合，并在4℃下闪离2min；利用StepOnePlusTM实时荧光定量PCR系统，将混合样品以1℃min-1的速率从25℃加热到95℃，从而测得Tm值；3次平行实验以获得Tm的平均值。
由图2和表2所示，相比于野生型，普鲁兰酶突变体T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C、T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的Tm值分别提高了7.0℃、6.5℃、6.7℃、6.9℃。
表2野生型与突变体的Tm值
Figure BDA0003066110020000103
Figure BDA0003066110020000111
(2)半衰期t1/2
将蛋白浓度为10μg/mL的稀释酶液于70℃孵育一定时间，时间间隔设置为0min、30min、60min、90min、120min、180min、240min；孵育后立即于冰上冷却5min，并按照效果验证中的第2步骤的酶活测定方法测定残余酶活。t1/2的计算公式为
Figure BDA0003066110020000112
kd为失活常数，定义为ln[(残余酶活)/孵育时间(t)]。
由图3所示，野生型普鲁兰酶的半衰期仅为128min，而普鲁兰酶突变体T73(O2beY)-171C、P135(O2beY)-A314C、T73(O2beY)-171C/T126F、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的半衰期分别为330min、243min、425min和398min，分别是野生型的2.6倍、1.9倍、3.3倍和3.1倍，各个突变体的热稳定性较野生型均得到明显改善。
4.突变前后比活及动力学参数的比较：
在最适反应条件下，以普鲁兰多糖为底物，测定野生型普鲁兰酶及其突变体的比活和动力学参数。比活按照步骤2酶活测定方法测定酶活，并利用蛋白浓度测定仪测定酶蛋白浓度；动力学参数测定时，普鲁兰多糖的底物浓度分别设置为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0mg/mL、8.0mg/mL、10.0mg/mL、12.0mg/mL、14.0mg/mL和16.0mg/mL，分别测定不同底物浓度下反应初速度，并利用GraphPad Prism 5.0软件进行非线性拟合得到各项动力学参数。
结果：比活及动力学参数如下表3和图4所示，普鲁兰酶突变体在热稳定性得到提高的同时，比活几乎没有变化甚至明显提高，而其动力学参数也显示向有益的方向变化，这对于其实际应用可观的。
表3野生型普鲁兰酶及其突变体的比活、动力学参数比较
Figure BDA0003066110020000113
5.突变前后PH比较
将实施例1-3得到的普鲁兰酶突变体与野生型普鲁兰酶在70℃的温度下，pH为4、5、5.5、6.0、6.5、7、8，通过第2步骤中的酶活测定方法测定相对酶活，确定并比较突变体和野生型普鲁兰酶的最适pH，结果为T73(O2beY)-171C突变体、P135(O2beY)-A314C突变体、T73(O2beY)-171C/T126F突变体、T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体和OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体的普鲁兰酶突变体的最适反应pH均仍为中性。
实施例4.突变体在E.coli系统中的分泌效率
为将突变体更方便地应用到工业中，我们构建了PelB密码子优化的突变体OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R，并测定了其粗酶活，包括胞外酶活和胞内酶活。测定时，将菌液以4℃，8000rpm冷冻离心5min收集上清及菌体；菌体用生理盐水重悬洗涤两次后再用0.2M,pH 6.0的磷酸钠缓冲重悬菌体并稀释一定倍数；采用超声破碎仪破碎细胞，破碎功率为36％，工作2S，间歇3S，总时间为5min；破碎液于4℃，10000rpm条件下冷冻离心10min，上清即为胞内表达产物；按照上述效果验证中的第2步骤中的酶活测定方法对胞外上清和胞内上清进行粗酶活测定，即得胞外酶活和胞内酶活。
结果如图5所示，突变体T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的胞外酶活仅为1.0U/mL，而融合了信号肽OptPelB的突变体OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的胞外酶活达到9.7U/mL。因此，OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R的成功改造将有望简化其下游纯化工艺，进而减少工业成本。
融合了信号肽OptPelB的OptPelB-T73(O2beY)-171C突变体、融合了信号肽OptPelB的OptPelB-P135(O2beY)-A314C突变体、融合了信号肽OptPelB的OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F突变体的胞外酶活也均有提升的。
实施例5.突变体在水解淀粉中的应用
为了展示实施例1～3的普鲁兰酶突变体应用于玉米淀粉等水解的过程中，在不调节液化反应液的pH的条件下，其作用于α-1,6-糖苷键的具体情况，以热稳定性提高最明显的含有T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的突变体为研究对象，并将已广泛应用于工业生产的来源于Bacillus acidopullulyticus的酸性普鲁兰酶Prozozyme(购于诺维信公司)作为对比进行玉米淀粉水解的实际应用。
以浓度为100g/L的玉米淀粉为底物，在100℃下，用磁力搅拌器搅拌15min使其糊化。降温至90℃后，向糊化液中加入2U/L耐热的α-淀粉酶Novamyl(购于诺维信公司)液化30min。然后不调节液化液pH，将温度降至65℃后直接加入2.5U/L的Prozozyme或纯化后的T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体，糖化30min。结束后，反应产物立即煮沸10min，并用高效液相色谱(HPLC)进行产物成分及其含量的分析，HPLC具体方法参见文献(Bai,Y,Wu,Y,Ji,H,Jin,Z.Synthesis,separation,and purification of glucosyl-β-cyclodextrinby one-pot method.J Food Biochem.2019；43:e12890.)。
如图7所示，从HPLC的峰面积可以看出，与Prozozyme相比(图7A)，含有T73(O2beY)-171C/T126F/A72R基因的突变体能水解更多的糊精(图7B)，从而产生更多的多糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。已知玉米淀粉等被发酵以生产糖浆等的过程中，经耐高温α-淀粉酶液化处理后的原始pH值约为6.0-6.5，酸性普鲁兰酶Prozozyme在此pH下表现出很大的酶活损失，而中性普鲁兰酶T73(O2beY)-171C/T126F/A72R却能表现出高酶活。因此，即使未调节玉米液化反应液的pH，本申请的T73(O2beY)-171C/T126F/A72R仍能很好地作用于液化反应液中糊精等的α-1,6-糖苷键。因此，在糖化过程中，加入T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体可降低成本，产生更多的多糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖提高淀粉分解的效率，无需调节PH值，缩短玉米淀粉分解所需的时间。
在糖化过程中，加入T73(O2beY)-171C突变体、P135(O2beY)-A314C突变体、T73(O2beY)-171C/T126F突变体以及T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体，可降低成本，提高淀粉分解效率，无需调节pH值，缩短玉米淀粉分解所需的时间。
在糖化过程中，加入融合了信号肽OptPelB的OptPelB-T73(O2beY)-171C突变体、融合了信号肽OptPelB的OptPelB-P135(O2beY)-A314C突变体、融合了信号肽OptPelB的OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F突变体、融合了信号肽OptPelB的OptPelB-T73(O2beY)-171C/T126F/A72R突变体。可降低成本，提高淀粉分解效率，无需调节pH值，缩短玉米淀粉分解所需的时间。
本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 宿迁市江南大学产业技术研究院
<120> 一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体及其应用
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 720
<212> PRT
<213> Bacillus thermoleovoran
<400> 1
Met Asp Met Leu His Ile Ser Arg Thr Phe Ala Ala Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Met Asp Gln Ile Val Val Leu Ala Pro Lys Ser Leu Gly Phe Asp Gly
20 25 30
Met Ala Pro Phe Thr Leu Val Ala Pro Ser Gly Glu Glu Ile Pro Leu
35 40 45
Ser Val Gln His Val Glu Asp Val Gly Glu Thr Val Lys Tyr Val Cys
50 55 60
Arg Phe Ala Ser Ala Phe Glu Phe Gly Ala Thr Tyr Trp Val Arg Ser
65 70 75 80
Cys Arg Gly Glu Glu Thr Asp Val Gln Ile Gly Ala Val Val Arg Thr
85 90 95
Pro Ala Phe Asp Asp Arg Phe Phe Tyr Asp Gly Pro Leu Gly Ala Glu
100 105 110
Tyr Leu Lys Glu Gln Thr Val Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Thr
115 120 125
Ala Val Ser Val Lys Leu Val His Pro His Leu Asp Glu Ile Arg Cys
130 135 140
Val Pro Leu Val Arg Gly Glu Arg Gly Val Trp Ser Ala Val Val Pro
145 150 155 160
Gly Asp Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Thr Tyr Ile Ala Cys Ile Asn Arg
165 170 175
Val Trp Arg Glu Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Ser Val Asn
180 185 190
Gly Glu Phe Gly Val Val Ile Asp Trp Glu Lys Thr Lys Leu Ala Pro
195 200 205
Pro Ser Leu Pro Leu Pro Pro Leu Cys Ser Pro Thr Asp Ala Ile Ile
210 215 220
Tyr Glu Leu Ser Ile Arg Asp Phe Thr Ser His Pro Asp Ser Gly Ala
225 230 235 240
Val His Lys Gly Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Glu Thr Asn Thr Ser Gly
245 250 255
Pro Asn Gly Thr Ala Thr Gly Leu Ser Tyr Val Lys Glu Leu Gly Val
260 265 270
Thr His Val Gln Leu Met Pro Phe Met Asp Phe Ala Gly Val Asp Glu
275 280 285
Arg Asp Pro Gln Ala Ala Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Leu His Leu
290 295 300
Tyr Ala Pro Glu Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Ala Asp Pro Tyr Ala
305 310 315 320
Arg Ile Val Glu Leu Lys Gln Ala Ile His Thr Leu His Glu Asn Gly
325 330 335
Leu Arg Val Val Met Asp Ala Val Tyr Asn His Val Tyr Asp Arg Glu
340 345 350
Gln Ser Pro Leu Glu Lys Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Phe Arg Tyr Asp
355 360 365
Ala Tyr Gly Gln Pro Ala Asn Gly Thr Gly Val Gly Asn Asp Ile Ala
370 375 380
Ser Glu Arg Arg Met Ala Arg Arg Trp Ile Val Asp Ser Val Val Phe
385 390 395 400
Trp Ala Lys Glu Tyr Gly Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly
405 410 415
Val His Asp Ile Glu Thr Met Lys Ala Val Arg Asp Ala Leu Asp Ala
420 425 430
Ile Asp Pro Ser Ile Leu Val Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Leu Pro Thr
435 440 445
Pro Leu Pro Pro Glu Gln Lys Ala Thr Met Ala Asn Ala Lys Gln Leu
450 455 460
Pro Arg Phe Ala Tyr Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly
465 470 475 480
Ser Thr Phe His Leu Pro Asp Arg Gly Phe Ala Leu Gly Asn Pro Gly
485 490 495
Gly Arg Glu Gln Val Lys Leu Ala Ile Ala Gly Ser Leu Arg Ala Leu
500 505 510
Gly Gly Leu Phe Cys His Pro Arg Gln Ser Ile Asn Tyr Val Glu Cys
515 520 525
His Asp Asn His Thr Phe Trp Asp Lys Met Glu Ala Ala Asn His Asp
530 535 540
Glu Pro Glu Trp Leu Arg Arg Lys Arg Gln Lys Leu Ala Thr Ala Ile
545 550 555 560
Val Leu Leu Ala Gln Gly Ile Pro Phe Leu His Ser Gly Gln Glu Phe
565 570 575
Tyr Arg Thr Lys Gly Gly Asp Gly Asn Ser Tyr Arg Ser Pro Asp Ala
580 585 590
Val Asn Gln Leu Asp Trp Glu Arg Lys Ser Arg Tyr Glu Asp Asp Val
595 600 605
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Ile Ala Leu Arg Arg Ala His Gly Ala Phe
610 615 620
Arg Leu Ala Thr Glu Ala Glu Val Leu Arg His Phe Thr Phe Leu Glu
625 630 635 640
Pro Leu Pro Pro Ser Val Ile Ala Tyr Arg Leu His Asp Ala Ala Val
645 650 655
Tyr Gly Pro Trp Glu Asp Ile Ile Val Val His His Asn Glu Glu Lys
660 665 670
Glu Thr Ala Ile Ala Leu Pro Asp Glu Arg Glu Trp Ala Val Val Cys
675 680 685
Asp Gly Gln Arg Cys Gly Thr Thr Pro Phe Gly Gln Ala Arg Gly Met
690 695 700
Leu Arg Leu Asp Gly Ile Gly Thr Trp Val Leu Val His Pro Ala Gly
705 710 715 720
<210> 2
<211> 2163
<212> DNA
<213> Bacillus thermoleovoran
<400> 2
atggacatgc ttcacatcag ccgaacgttt gccgcctatt tggacgagat ggatcaaatc 60
gttgtgcttg cgccgaaatc gctcggcttt gatggaatgg cgccgtttac gctcgtggcg 120
ccgagcggcg aggagattcc gctgtccgtg cagcacgtcg aggatgttgg ggagacggtg 180
aaatatgtgt gccggtttgc atccgcgttc gagtttggag cgacatactg ggtgcgttct 240
tgccgcgggg aggagaccga tgttcaaatc ggcgccgttg tgcgcactcc tgcatttgat 300
gatcggtttt tctatgatgg accgttagga gcggagtatc tcaaagaaca gacggtattt 360
cgcgtatggg cgccgaccgc caccgcggtt agcgtcaagc tggttcatcc gcatctcgac 420
gagatccgct gcgtgccgct tgtgcgcggc gaacgcggcg tatggtcagc cgtcgtcccc 480
ggcgattggg agcgagcgcg ttacacatat atcgcctgca tcaaccgcgt atggcgcgag 540
gcagtggacc cgtatgcgac cgcggtttcg gtcaatggcg agttcggcgt cgtgatcgac 600
tgggagaaaa cgaagctggc gccgccctct ttgccgcttc cgccgctctg ttcgccgacg 660
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565 570 575
Tyr Arg Thr Lys Gly Gly Asp Gly Asn Ser Tyr Arg Ser Pro Asp Ala
580 585 590
Val Asn Gln Leu Asp Trp Glu Arg Lys Ser Arg Tyr Glu Asp Asp Val
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Arg Tyr Val Gln Gly Leu Ile Ala Leu Arg Arg Ala His Gly Ala Phe
610 615 620
Arg Leu Ala Thr Glu Ala Glu Val Leu Arg His Phe Thr Phe Leu Glu
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Pro Leu Pro Pro Ser Val Ile Ala Tyr Arg Leu His Asp Ala Ala Val
645 650 655
Tyr Gly Pro Trp Glu Asp Ile Ile Val Val His His Asn Glu Glu Lys
660 665 670
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675 680 685
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ggc 2223
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<221> misc_feature
<222> (96)..(96)
<223> Xaa can be O-2-bromoethyl tyrosine
<400> 13
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Met Leu His Ile Ser Arg Thr Phe Ala
20 25 30
Ala Tyr Leu Asp Glu Met Asp Gln Ile Val Val Leu Ala Pro Lys Ser
35 40 45
Leu Gly Phe Asp Gly Met Ala Pro Phe Thr Leu Val Ala Pro Ser Gly
50 55 60
Glu Glu Ile Pro Leu Ser Val Gln His Val Glu Asp Val Gly Glu Thr
65 70 75 80
Val Lys Tyr Val Cys Arg Phe Ala Ser Ala Phe Glu Phe Gly Arg Xaa
85 90 95
Tyr Trp Val Arg Ser Cys Arg Gly Glu Glu Thr Asp Val Gln Ile Gly
100 105 110
Ala Val Val Arg Thr Pro Ala Phe Asp Asp Arg Phe Phe Tyr Asp Gly
115 120 125
Pro Leu Gly Ala Glu Tyr Leu Lys Glu Gln Thr Val Phe Arg Val Trp
130 135 140
Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val Ser Val Lys Leu Val His Pro His Leu
145 150 155 160
Asp Glu Ile Arg Cys Val Pro Leu Val Arg Gly Glu Arg Gly Val Trp
165 170 175
Ser Ala Val Val Pro Gly Asp Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Thr Tyr Ile
180 185 190
Ala Cys Ile Asn Arg Val Trp Arg Glu Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr
195 200 205
Ala Val Ser Val Asn Gly Glu Phe Gly Val Val Ile Asp Trp Glu Lys
210 215 220
Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ser Leu Pro Leu Pro Pro Leu Cys Ser Pro
225 230 235 240
Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Glu Leu Ser Ile Arg Asp Phe Thr Ser His
245 250 255
Pro Asp Ser Gly Ala Val His Lys Gly Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Glu
260 265 270
Thr Asn Thr Ser Gly Pro Asn Gly Thr Ala Thr Gly Leu Ser Tyr Val
275 280 285
Lys Glu Leu Gly Val Thr His Val Gln Leu Met Pro Phe Met Asp Phe
290 295 300
Ala Gly Val Asp Glu Arg Asp Pro Gln Ala Ala Tyr Asn Trp Gly Tyr
305 310 315 320
Asn Pro Leu His Leu Tyr Ala Pro Glu Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro
325 330 335
Ala Asp Pro Tyr Ala Arg Ile Val Glu Leu Lys Gln Ala Ile His Thr
340 345 350
Leu His Glu Asn Gly Leu Arg Val Val Met Asp Ala Val Tyr Asn His
355 360 365
Val Tyr Asp Arg Glu Gln Ser Pro Leu Glu Lys Leu Val Pro Gly Tyr
370 375 380
Tyr Phe Arg Tyr Asp Ala Tyr Gly Gln Pro Ala Asn Gly Thr Gly Val
385 390 395 400
Gly Asn Asp Ile Ala Ser Glu Arg Arg Met Ala Arg Arg Trp Ile Val
405 410 415
Asp Ser Val Val Phe Trp Ala Lys Glu Tyr Gly Ile Asp Gly Phe Arg
420 425 430
Phe Asp Leu Met Gly Val His Asp Ile Glu Thr Met Lys Ala Val Arg
435 440 445
Asp Ala Leu Asp Ala Ile Asp Pro Ser Ile Leu Val Tyr Gly Glu Gly
450 455 460
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465 470 475 480
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Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr Phe His Leu Pro Asp Arg Gly Phe Ala
500 505 510
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515 520 525
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Arg Ser Pro Asp Ala Val Asn Gln Leu Asp Trp Glu Arg Lys Ser Arg
610 615 620
Tyr Glu Asp Asp Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu Ile Ala Leu Arg Arg
625 630 635 640
Ala His Gly Ala Phe Arg Leu Ala Thr Glu Ala Glu Val Leu Arg His
645 650 655
Phe Thr Phe Leu Glu Pro Leu Pro Pro Ser Val Ile Ala Tyr Arg Leu
660 665 670
His Asp Ala Ala Val Tyr Gly Pro Trp Glu Asp Ile Ile Val Val His
675 680 685
His Asn Glu Glu Lys Glu Thr Ala Ile Ala Leu Pro Asp Glu Arg Glu
690 695 700
Trp Ala Val Val Cys Asp Gly Gln Arg Cys Gly Thr Thr Pro Phe Gly
705 710 715 720
Gln Ala Arg Gly Met Leu Arg Leu Asp Gly Ile Gly Thr Trp Val Leu
725 730 735
Val His Pro Ala Gly
740
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
agaaggagat ataccatgga catgctgcat attagtcgca c 41
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
tggtggtggt ggtgctcgag gccggccggg tgcaccagaa cc 42
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
tcggtgccta gtattgggtg cgtagttgc 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
cccaatacta ggcaccgaat tcgaaggcg 29
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
ctggtgcatt agcacttaga cgagatccgc t 31
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
ctcgtctaag tgctaatgca ccagtttcac g 31
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
atccctgtga cccgtacgca cgtattgtg 29
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
cgtacgggtc acagggatcg gtggcgtag 29
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
gcaccgaccg cctttgcagt tagcgtgaaa c 31
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
ttcacgctaa ctgcaaaggc ggtcggtgcc 30
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
cagtttcacg ctaacacgaa aggcggtcgg t 31
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
cttcgaattc ggtcgttagt attgggtgcg ta 32
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
ctcgagcacc accaccacca cc 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
ctcgagcacc accaccacca cc 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
ctcgagcacc accaccacca cc 22
<210> 29
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
gctgggcggc cagcagcagc agaccggcgg cggcggtcgg cagcagatat ttcatggtat 60
atctccttct taaagttaaa c 81
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
taacaggagg aattagatct atggacgaat ttgaaatgat aaag 44
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
tttagcgttt gaaactgcag ttataatctc tttctaattg gc 42
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
tgcaattcat tatgcaggcg ttgatgttgc agttggaggg atgg 44
<210> 33
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
cctgcataat gaattgcatt aacctgcatt attggataga taacttcagc aacc 54
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
agatctaatt cctcctgtta gcccaaaaaa acgggtatgg ag 42
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
ctgcagtttc aaacgctaaa ttgcctgatg cgctacgctt atc 43

Claims (10)

1.一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如SEQID NO.1所示的普鲁兰酶为出发序列，对第72、73、126、135、314位中的至少一个氨基酸突变获得的。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(d)中的任意一种：
(a)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第73位苏氨酸突变为溴乙基酪氨酸；
(b)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第135位脯氨酸突变为溴乙基酪氨酸，以及第314位丙氨酸突变为半胱氨酸；
(c)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第135位脯氨酸突变为溴乙基酪氨酸，第314位丙氨酸突变为半胱氨酸，以及第126位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；
(d)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的亲本的第135位脯氨酸突变为溴乙基酪氨酸，第314位丙氨酸突变为半胱氨酸,第126位的苏氨酸突变为苯丙氨酸，以及第72位丙氨酸突变为精氨酸。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列的N端融合信号肽PelB。
4.编码权利要求1-3任意一项所述突变体的基因。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求4所述的编码基因。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。
7.一种重组微生物细胞，其特征在于，携带权利要求4所述的基因或者表达权利要求1-3任一所述的突变体。
8.根据权利要求7所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核生物或者真核生物。
9.权利要求1-3任意一项所述的突变体、权利要求4所述的编码基因、权利要求5或6所述的重组载体在水解淀粉中的应用。
10.一种提高分解淀粉效率的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-3任意一项所述的突变体加入到糊化后淀粉水溶液中，在60℃-65℃条件下水解。
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