CN111235135B

CN111235135B - 一种中性普鲁兰酶突变体及其应用

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Publication number: CN111235135B
Application number: CN202010180787.XA
Authority: CN
Inventors: 聂尧; 徐岩; 毕家华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2020-03-16
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2040-03-16
Also published as: CN111235135A

Abstract

本发明公开了一种中性普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明分别通过对普鲁兰酶的第138位、第691位、第692位和第694位的氨基酸进行突变，得到了四个热稳定性提高且催化效率未改变的普鲁兰酶突变体D138F、C691R、G692M及T694F。在70℃下，其半衰期可分别是野生型的1.35、1.58、2.07及1.64倍。其中，G692M突变体的热稳定性得到最明显的改善，其在60、65℃下的半衰期甚至可分别达到58h、19h，分别是野生型的2.5、1.8倍。本发明中热稳定性提高的中性普鲁兰酶突变体将更适合于工业应用。

Description

一种中性普鲁兰酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种中性普鲁兰酶突变体及其应用，属于酶工程及基因工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是一类催化支链淀粉、普鲁兰多糖及相关聚合物的α-1,6-糖苷键水解的淀粉脱支酶，目前主要应用于淀粉的糖化。淀粉结构复杂，分为直链淀粉和支链淀粉，且75％-80％是支链淀粉，其解聚成低聚糖或小分子葡萄糖需要多种酶的协同作用。在淀粉糖化过程中，糖化酶或β淀粉酶主要作用于α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键作用非常有限，而β淀粉酶遇到α分支点则停止作用，这使得该法淀粉制糖的最高产率(DE值)被限制在60％左右。所幸的是，在糖化液中加入解支酶能够在一定程度上减轻这一限制所带来的损失，解支酶是指能够水解α-1,6-糖苷键的酶，包括普鲁兰酶、寡-1,6-葡萄糖苷酶、异淀粉酶、R-酶。不同的解支酶的性质也不尽相同，比如，寡-1,6-葡萄糖苷酶只能水解经过其他酶修饰过的底物中的α-1,6-糖苷键，而普鲁兰酶和异淀粉酶能够水解未经修饰的底物，而异淀粉酶更倾向于水解高分子量的底物，普鲁兰酶却能水解的最小底物只需两条由α-1,6-糖苷键连接的含有两个由α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖链段，因而普鲁兰酶能更大程度地利用底物，其与糖化酶或β-淀粉酶协同作用，从而使得淀粉能够得到充分糖化。

尽管普鲁兰酶具有巨大的应用前景，但目前报道并已应用工业化生产的普鲁兰酶仍然存在如下2个主要缺陷：

第一，目前已应用于工业化生产的普鲁兰酶菌株主要为丹麦诺维信公司Bacillusacidopullulyticus和美国Genencor公司的Bacillus deramificans，其所产普鲁兰酶为酸性普鲁兰酶。酸性普鲁兰酶应用于淀粉水解时，由于其最适pH在4.5-5.5左右的偏酸范围，而液化反应后的原始pH在6.0-6.5的偏中性的范围，故在液化与糖化的过渡中需要先对液化液的pH调节至酸性范围后再加入普鲁兰酶进行糖化，这不可避免地增加了资源的消耗和水解时间；

第二，目前大多数报道中的普鲁兰酶大多是中温酶(40-60℃)，而一般糖化温度60-70℃，仅只有少数的嗜热酶能够在一般糖化温度下有较好的活性，并且在这少数的嗜热普鲁兰酶中，其酶学性质尤其是其热稳定性与工业应用不相符。

因而寻找既能在偏中性条件下反应、又具有良好的热稳定性的普鲁兰酶成为一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种耐高温的中性普鲁兰酶突变体，所述普鲁兰酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶为亲本酶，将亲本酶的第138位、691位、第692位、第694位任一位点的氨基酸发生突变，得到普鲁兰酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本酶，将亲本酶第138位的天冬氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为D138F。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体D138F的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本酶，将亲本酶第691位的半胱氨酸突变为精氨酸，并命名为C691R。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体C691R的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本酶，将亲本酶第692位的甘氨酸突变为蛋氨酸，并命名为G692M。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体G692M的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本酶，将亲本酶第694位的苏氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为T694F。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体T694F的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明提供一种编码所述突变体D138F、C691R、G692M、T694F的基因，所述基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。

本发明提供一种携带编码所述突变体的基因的重组表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。

本发明提供一种携带编码所述突变体酶的基因的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为重组原核细胞或真核细胞；所述原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞的构建方法为将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。

本发明提供一种水解淀粉中α-1,6-糖苷键的方法，所述方法为以淀粉为底物，在淀粉糖化过程中加入所述突变体，反应一段时间后，即能水解淀粉中的α-1,6-糖苷键。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为以50～150g·L^-1的淀粉为底物，先将淀粉在95～105℃下进行糊化，得到糊化液；再将糊化液降温至85～92℃，向糊化液中加入α-淀粉酶液化20～40min，再将液化后的液体降至60～70℃，加入2.0～3.0U/L纯化后的突变体，在60～70℃反应25～35min，反应结束后立即煮沸5～15min，进行灭酶，灭酶后即得到水解了α-1,6-糖苷键的糖化液。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉为玉米淀粉、土豆淀粉、番薯粉、葛粉、木薯粉。

本发明提供一种水解淀粉中α-1,6-糖苷键的方法在制备糖化液中的应用，所述方法为以淀粉为底物，在糖化过程中加入突变体和糖化酶或β-淀粉酶，进行反应一段时间即得到糖化液。

本发明提供所述突变体、基因、表达载体或宿主细胞在食品、医药领域制备糖化液中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明的普鲁兰酶突变体的热稳定性较野生型有了明显的改善。在70℃下，普鲁兰酶突变体D138F、C691R、G692M、T694F的半衰期分别为173、202、265、210min，分别是野生型的1.35、1.58、2.07及1.64倍；T_m值分别提高了1.4、2.5、3.8、3.2℃；其中，G692M突变体的热稳定性得到最明显的改善，其在60、65℃下的半衰期分别达到58、19h，分别是野生型的2.5、1.8倍。

(2)本发明的普鲁兰酶突变体的比活及动力学参数几乎没有变化。野生型比酶活为219.2±18U·mg^-1，而突变体D138F、C691R、G692M、T694F的酶活分别为197.4±15U·mg^-1、207.2±14U·mg^-1、214.9±20U·mg^-1、203.4±15U·mg^-1，表明获得的普鲁兰酶突变体在酶活几乎不受影响的情况下改善了其热稳定性。

(3)本发明的耐高温中性普鲁兰酶突变体的最适pH几乎没有变化，仍为6.0-6.5左右，表明其可直接应用于高温下玉米淀粉等的糖化而无需调节pH。

附图说明

图1为不同普鲁兰酶突变体纯化后的SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白分子量标准；

1为野生型普鲁兰酶(WT)纯化后的SDS-PAGE电泳结果；2为普鲁兰酶突变体D138F纯化后的SDS-PAGE电泳结果；3为普鲁兰酶突变体C691R纯化后的SDS-PAGE电泳结果；4为普鲁兰酶突变体G692M纯化后的SDS-PAGE电泳结果；5为普鲁兰酶突变体T694F纯化后的SDS-PAGE电泳结果。

图2为WT、D138F、C691R、G692M、T694F在70℃下温浴不同时间的残余酶活。

图3为WT、G692M在60、65、70℃下的半衰期比较。

图4为WT、D138F、C691R、G692M、T694F的表面解链温度T_m。

图5为WT、D138F、C691R、G692M、T694F在不同温度下的相对酶活。

图6为WT、D138F、C691R、G692M、T694F在不同pH下的相对酶活。

图7为玉米淀粉水解产物的HPLC分析，A为Prozozyme水解淀粉的HPLC分析，B为G692M水解淀粉的HPLC分析。

具体实施方式

实施例1：突变质粒构建

根据NCBI数据库中公开的来自Bacillus thermoleovoran的普鲁兰酶基因SEQ IDNO.2序列信息，依据大肠杆菌密码子偏好性规律进行密码子优化，化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的普鲁兰酶基因，使用NcoI内切酶和XhoI内切酶将表达载体pET28a线性化，并用相同的内切酶对SEQ ID NO.3所示的普鲁兰酶基因进行酶切处理，酶切处理后的普鲁兰酶基因与线性化载体通过T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒，将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)，转化后的菌液涂布于含25μg/mL的卡那霉素抗性的LB平板，在37℃下培养12-14h至长出单克隆，挑取单克隆，进行菌落PCR(所用引物为BtPul全长引物)和测序验证，验证得到阳性转化子即为含野生型普鲁兰酶基因Btpul的重组菌，从阳性转化子中提取质粒(质粒提取试剂盒购自OMEGA公司)，即为含有野生型普鲁兰酶基因Btpul的重组质粒。

以上述含有野生型普鲁兰酶基因Btpul的重组质粒为模板，利用

HSPCR酶(购于TaKaRa公司)采用两步PCR对普鲁兰酶基因的138、691、692、694位点进行定点突变，突变所用引物(金维智合成)分别如下所示，第一步分别以Btpul_F/D138F_Rm，或Btpul_F/C691R_Rm，或Btpul_F/G692M_Rm，或Btpul_F/T694F_Rm为引物进行PCR扩增出出普鲁兰酶基因Btpul的左半片段，以D138F_Fm/Btpul_R，或C691R_Fm/Btpul_R，或G692M_Fm/Btpul_R，或T694F_Fm/Btpul_R为引物进行PCR扩增出普鲁兰酶突变基因的右半片断，第二步分别使用Btpul_F/Btpul_R对第一步PCR获得的相对应的左右片断进行重叠延伸PCR，扩增出全长的普鲁兰酶突变基因；线性载体片段由以反向F/反向R为引物进行PCR获得：

BtPul全长引物:

Btpul_F:5’-AAGAAGGAGATATACCATGGACATGCTGCATATTAGTCGCAC-3’(SEQ IDNO.12)，

Btpul_R:5’-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGCCGGCCGGGTGCACCAGAACC-3’(SEQ IDNO.13)；

D138F突变引物:

D138F_Fm:5’-GTGCATCCGCACTTATTTGAGATCCGCTGTG-3’(SEQ ID NO.14)，

D138F_Rm:5’-ACACAGCGGATCTCAAATAAGTGCGGATGC-3’(SEQ ID NO.15)；

C691R突变引物：

C691R_Fm:5’-GACGGTCAGCGCCGTGGTACAACACCGTTTG-3’(SEQ ID NO.16)，

C691R_Rm:5’-ACGGTGTTGTACCACGGCGCTGACCGTCAC-3’(SEQ ID NO.17)；

G692M突变引物：

G692M_Fm:5’-CGGTCAGCGCTGCATGACAACACCGTTTGGC-3’(SEQ ID NO.18)，

G692M_Rm:5’-GCCAAACGGTGTTGTCATGCAGCGCTGACCG-3’(SEQ ID NO.19)；

T694F突变引物：

T694F_Fm:5’-GCGCTGCGGTACATTTCCGTTTGGCCAAG-3’(SEQ ID NO.20)，

T694F_Rm:5’-CTTGGCCAAACGGAAATGTACCGCAGCGC-3’(SEQ ID NO.21)；

反向PCR引物：

反向F:5’-CTCGAGCACCACCACCACCACC-3’(SEQ ID NO.22)，

反向R:5’-GTCCATGGTATATCTCCTTCTT-3’(SEQ ID NO.23)。

PCR体系：25μL

MAX DNA Polymerase，23μL ddH₂O，1μL重组质粒pET28a(+)-Btpul，0.5μL引物1，0.5μL引物2。

PCR反应条件：98℃3min，98℃30s，58℃40s，72℃40s-60s，共30个循环。

PCR产物的载体片段与普鲁兰酶基因片段通过同源同组酶(购于南京诺唯赞生物科技公司)连接。

实施例2：重组菌的构建

感受态细胞的制备：按照Competent Cell Preparation kit(购于TaKaRa公司)说明书上的操作，将长在LB无抗平板的大肠杆菌单菌落挑至LB试管，37℃，200rpmin的条件下过夜培养8-12个小时；后以2％的接种量转接至装有50mLLB培养基的250mL三角瓶，培养条件如前所述；培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8后，将三角瓶于冰上放置30min；于超净台，50mL菌液以25mL分装量分装至两个已灭菌的50ml离心管；4℃下，6000rpmin离心5min后弃上清，加入10％A液轻轻将菌体重悬；再次于4℃，6000rpmin离心5min后弃上清，加入10％B液轻轻将菌体重悬后以100μL分装量分装至1.5mL已灭菌的ep管中，于-80℃下保存至多1年。所有操作注意无菌操作。

化学转化：将E.coli JM109感受态细胞至于冰上融化后，于超净台加入10μL的同源重组产物；轻轻混匀后，冰上放置30min左右；于金属浴中，42℃热击45-90s后冰上放置5min；加入800mL LB培养基，37℃，200rpmin培养1h；6000rpmin离心5min后于超净台弃800μL上清；剩余培养液重悬菌体后涂布至卡那霉素抗性平板，37℃静置过夜培养12h；挑菌落进行菌落PCR验证(所用引物为BtPul全长引物)后送至测序公司测序。验证得到的阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒后按上述化学转化法转化至E.coli BL21感受态细胞，抗性平板中长出的菌落即为含有Btpul突变基因的重组菌。

实施例3：普鲁兰酶突变体的表达及纯化

(1)普鲁兰酶突变体的表达

将含野生型普鲁兰酶基因及其突变基因的重组菌分别接种于5mL含卡那霉素(50μg·mL^-1)的LB培养基中，在37℃和200rpm下培养8-12h；将1mL培养物转移到含50mL自动诱导培养基(10g·L^-1胰蛋白胨，5.0g·L^-1酵母提取物，10g·L^-1α-乳糖，5.0g·L^-1甘油，1.0g·L^-1葡萄糖，7.1g·L^-1Na₂HPO₄，6.8g·L^-1KH₂PO₄，2.67g·L^-1NH₄Cl，0.71g·L^-1Na₂SO₄和0.25g·L^-1MgSO₄；pH7.5)的250mL三角瓶中，并加入卡那霉素(50μg·mL^-1)，在37℃和200rpmin的培养条件下培养2-3h；将温度降至17℃，并继续培养48-60h以表达重组蛋白。

(2)普鲁兰酶突变体的纯化

用超声破碎仪对含有目的质粒的细胞进行超声处理，功率为36％，工作2s，间歇3s，直至破碎完全，得到全细胞破碎液；将细胞破碎液在冷冻离心机中设置离心温度4℃，转速12000rpm离心30min，离心后将上清液通过0.22μm水系滤膜过滤后收集滤液；将滤液利用AKTAxpress系统的纯化仪纯化，纯化柱使用5mL规格的HisTrap HP纯化柱；洗脱时用含1M咪唑的缓冲液(20mMTris-HCl，150mMNaCl)，以2-3mL·min^-1的流速进行洗脱；然后，用10％(w/v)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证纯化的组分，并将最纯的组分用PD-10脱盐柱进行脱盐，脱盐时使用低盐缓冲液(10mMTris-HCl，0.1MNaCl；pH 6.0)，收集得到纯化脱盐的蛋白。

实施例4：突变前后热稳定性的比较

普鲁兰酶酶活测定采用DNS法，具体通过测定普鲁兰底物与稀释酶液反应时所释放的醛的量来定义酶活。将2％(w/v)普鲁兰多糖溶液200μL与200μL用0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.0)稀释的酶液混合反应，并设置无酶样品的反应系统作为对照；反应在70℃下反应20min，立即置于冰水浴中放置5min终止反应；对照补加200μL稀释酶液，向管中各加入600μL的DNS(185g·L^-1酒石酸钾钠，6.3g·L^-1 3,5-二硝基水杨酸，21g·L^-1NaOH，5g·L^-1结晶酚，5g·L^-1亚硫酸钠)；然后，将加入DNS的混合物在水浴中煮5min后立即于冰上冷却；最后，通过在540nm处测量吸光度来确定释放醛的量。

1U定义为在指定的测定条件下每分钟释放1微摩尔还原糖(相当于葡萄糖)的酶的量。

(1)表观溶解温度T_m

对于每个被分析的酶蛋白样品，将5μL 100×

橙色染料(Sigma；S5692)和20μL浓度为50μg·mL^-1的纯化蛋白样品混合，并在4℃下离心5min。测定时在StepOnePlus^TM实时荧光定量PCR系统中以1℃·min^-1的速率从25℃加热到95℃，三次平行实验。

由图4所示，相比于野生型，普鲁兰酶突变体D138F、C691R、G692M、T694F的T_m值分别提高了1.4℃、2.5℃、3.8℃、3.2℃。

表1野生型与突变体的T_m值

(2)半衰期t_1/2

保持蛋白浓度为10μg·ml^-1，于70℃孵育不同时间，并在冰上冷却5min后按照实例4中的酶活测定方法测剩余酶活，时间间隔设置为0、30、60、90、120、180、240min。t_1/2的计算公式为

kd为失活常数，定义为ln[(残余酶活)/孵育时间(t)]。

由图2所示，野生型普鲁兰酶的半衰期仅为128min，而普鲁兰酶突变体D138F、C691R、G692M、T694F的半衰期分别为173、202、265、210min，分别是野生型的1.35、1.58、2.07及1.64倍，可见突变体的热稳定性较野生型得到明显改善。

其中，G692M的热稳定性改善最明显，其在60℃、65℃下分别达到58h、19h，分别是野生型的2.5、1.8倍，如图3所示。

(3)最适温度

测定不同温度梯度(50℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，90℃)下的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，由此计算普鲁兰酶的最适温度。

由图5所示，普鲁兰酶突变体的最适温度与野生型相同，均为70℃，但相同温度下普鲁兰酶突变体具有较高的催化活力，表明其作用温度范围相比于野生型更宽。

实施例5：突变前后比活及动力学参数的比较

在最适温度70℃，最适pH6.0的条件下，以普鲁兰多糖为底物，测定普鲁兰酶突变体的比活及其动力学参数。动力学参数测定时的底物普鲁兰多糖的浓度分别设置为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0和16.0mg·ml^-1，分别测定不同底物浓度下反应初速度，并利用GraphPad Prism5.0软件进行非线性拟合得到各项动力学参数。

比活及动力学参数如下表2所示，普鲁兰酶突变体在热稳定性得到提高的同时，比活及动力学参数几乎没有变化，这对于其实际应用可观的。

表2野生型普鲁兰酶及其突变体的比活、动力学参数比较

实施例6：突变前后最适pH的比较

分别在70℃，pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0条件下测定野生型酶和突变酶的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，由此计算最适pH。

如图6所示，所有普鲁兰酶突变体的最适pH在6.0-6.5之间，几乎未改变。

实施例7：突变体在玉米淀粉等水解中的应用

为了进一步探索实施例1～3的中性普鲁兰酶突变体应用于玉米淀粉等水解的过程中，在不调节液化反应液的pH的条件下，其作用于α-1,6-糖苷键的具体情况，以热稳定性提高最明显的G692M为研究对象，并将已广泛应用于工业生产的来源于Bacillusacidopullulyticus的酸性普鲁兰酶Prozozyme(购于诺维信公司)作为对比进行玉米淀粉水解的实际应用。

以浓度为100g·L^-1的玉米淀粉为底物，在100℃下，用磁力搅拌器搅拌15min使其糊化。降温至90℃后，向糊化液中加入2U/L耐热的α-淀粉酶Novamyl(购于诺维信公司)液化30min。然后不调节液化液pH，将温度降至65℃后直接加入2.5U/L的Prozozyme或纯化后的G692M糖化30min。结束后，反应产物立即煮沸10min，并用高效液相色谱(HPLC)进行产物成分及其含量的分析，HPLC具体方法参见文献(Bai,Y,Wu,Y,Ji,H,Jin,Z.Synthesis,separation,and purification of glucosyl-β-cyclodextrin by one-pot method.JFood Biochem.2019；43:e12890.)。

如图7所示，从HPLC的峰面积可以看出，与Prozozyme相比(图7A)，G692M能水解更多的糊精(图7B)，从而产生更多的多糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。已知玉米淀粉等被发酵以生产糖浆等的过程中，经耐高温α-淀粉酶液化处理后的原始pH值约为6.0-6.5，酸性普鲁兰酶Prozozyme在此pH下表现出很大的酶活损失，而中性普鲁兰酶G692M却能表现出高酶活。因此，即使未调节玉米液化反应液的pH，本申请的G692M仍能很好地作用于液化反应液中糊精等的α-1,6-糖苷键。因此，在糖化过程中，加入中性普鲁兰酶突变体可降低成本，提高效率，缩短玉米淀粉水解所需的时间。

本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种中性普鲁兰酶突变体及其应用

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 718

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Leu His Ile Ser Arg Thr Phe Ala Ala Tyr Leu Asp Glu Met Asp

1 5 10 15

Gln Ile Val Val Leu Ala Pro Lys Ser Leu Gly Phe Asp Gly Met Ala

20 25 30

Pro Phe Thr Leu Val Ala Pro Ser Gly Glu Glu Ile Pro Leu Ser Val

35 40 45

Gln His Val Glu Asp Val Gly Glu Thr Val Lys Tyr Val Cys Arg Phe

50 55 60

Ala Ser Ala Phe Glu Phe Gly Ala Thr Tyr Trp Val Arg Ser Cys Arg

65 70 75 80

Gly Glu Glu Thr Asp Val Gln Ile Gly Ala Val Val Arg Thr Pro Ala

85 90 95

Phe Asp Asp Arg Phe Phe Tyr Asp Gly Pro Leu Gly Ala Glu Tyr Leu

100 105 110

Lys Glu Gln Thr Val Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val

115 120 125

Ser Val Lys Leu Val His Pro His Leu Asp Glu Ile Arg Cys Val Pro

130 135 140

Leu Val Arg Gly Glu Arg Gly Val Trp Ser Ala Val Val Pro Gly Asp

145 150 155 160

Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Thr Tyr Ile Ala Cys Ile Asn Arg Val Trp

165 170 175

Arg Glu Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Ser Val Asn Gly Glu

180 185 190

Phe Gly Val Val Ile Asp Trp Glu Lys Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ser

195 200 205

Leu Pro Leu Pro Pro Leu Cys Ser Pro Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Glu

210 215 220

Leu Ser Ile Arg Asp Phe Thr Ser His Pro Asp Ser Gly Ala Val His

225 230 235 240

Lys Gly Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Glu Thr Asn Thr Ser Gly Pro Asn

245 250 255

Gly Thr Ala Thr Gly Leu Ser Tyr Val Lys Glu Leu Gly Val Thr His

260 265 270

Val Gln Leu Met Pro Phe Met Asp Phe Ala Gly Val Asp Glu Arg Asp

275 280 285

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Val Glu Leu Lys Gln Ala Ile His Thr Leu His Glu Asn Gly Leu Arg

325 330 335

Val Val Met Asp Ala Val Tyr Asn His Val Tyr Asp Arg Glu Gln Ser

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Pro Leu Glu Lys Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Phe Arg Tyr Asp Ala Tyr

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Lys Glu Tyr Gly Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Val His

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Asp Ile Glu Thr Met Lys Ala Val Arg Asp Ala Leu Asp Ala Ile Asp

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Pro Ser Ile Leu Val Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Leu Pro Thr Pro Leu

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Pro Pro Glu Gln Lys Ala Thr Met Ala Asn Ala Lys Gln Leu Pro Arg

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Phe Ala Tyr Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr

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Phe His Leu Pro Asp Arg Gly Phe Ala Leu Gly Asn Pro Gly Gly Arg

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Ala Ile Ala Leu Pro Asp Glu Arg Glu Trp Ala Val Val Cys Asp Gly

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<212> DNA

<213> Bacillus thermoleovoran

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<212> PRT

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Pro Phe Thr Leu Val Ala Pro Ser Gly Glu Glu Ile Pro Leu Ser Val

35 40 45

Gln His Val Glu Asp Val Gly Glu Thr Val Lys Tyr Val Cys Arg Phe

50 55 60

Ala Ser Ala Phe Glu Phe Gly Ala Thr Tyr Trp Val Arg Ser Cys Arg

65 70 75 80

Gly Glu Glu Thr Asp Val Gln Ile Gly Ala Val Val Arg Thr Pro Ala

85 90 95

Phe Asp Asp Arg Phe Phe Tyr Asp Gly Pro Leu Gly Ala Glu Tyr Leu

100 105 110

Lys Glu Gln Thr Val Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val

115 120 125

Ser Val Lys Leu Val His Pro His Leu Asp Glu Ile Arg Cys Val Pro

130 135 140

Leu Val Arg Gly Glu Arg Gly Val Trp Ser Ala Val Val Pro Gly Asp

145 150 155 160

Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Thr Tyr Ile Ala Cys Ile Asn Arg Val Trp

165 170 175

Arg Glu Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Ser Val Asn Gly Glu

180 185 190

Phe Gly Val Val Ile Asp Trp Glu Lys Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ser

195 200 205

Leu Pro Leu Pro Pro Leu Cys Ser Pro Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Glu

210 215 220

Leu Ser Ile Arg Asp Phe Thr Ser His Pro Asp Ser Gly Ala Val His

225 230 235 240

Lys Gly Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Glu Thr Asn Thr Ser Gly Pro Asn

245 250 255

Gly Thr Ala Thr Gly Leu Ser Tyr Val Lys Glu Leu Gly Val Thr His

260 265 270

Val Gln Leu Met Pro Phe Met Asp Phe Ala Gly Val Asp Glu Arg Asp

275 280 285

Pro Gln Ala Ala Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Leu His Leu Tyr Ala

290 295 300

Pro Glu Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Ala Asp Pro Tyr Ala Arg Ile

305 310 315 320

Val Glu Leu Lys Gln Ala Ile His Thr Leu His Glu Asn Gly Leu Arg

325 330 335

Val Val Met Asp Ala Val Tyr Asn His Val Tyr Asp Arg Glu Gln Ser

340 345 350

Pro Leu Glu Lys Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Phe Arg Tyr Asp Ala Tyr

355 360 365

Gly Gln Pro Ala Asn Gly Thr Gly Val Gly Asn Asp Ile Ala Ser Glu

370 375 380

Arg Arg Met Ala Arg Arg Trp Ile Val Asp Ser Val Val Phe Trp Ala

385 390 395 400

Lys Glu Tyr Gly Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Val His

405 410 415

Asp Ile Glu Thr Met Lys Ala Val Arg Asp Ala Leu Asp Ala Ile Asp

420 425 430

Pro Ser Ile Leu Val Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Leu Pro Thr Pro Leu

435 440 445

Pro Pro Glu Gln Lys Ala Thr Met Ala Asn Ala Lys Gln Leu Pro Arg

450 455 460

Phe Ala Tyr Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr

465 470 475 480

Phe His Leu Pro Asp Arg Gly Phe Ala Leu Gly Asn Pro Gly Gly Arg

485 490 495

Glu Gln Val Lys Leu Ala Ile Ala Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gly Gly

500 505 510

Leu Phe Cys His Pro Arg Gln Ser Ile Asn Tyr Val Glu Cys His Asp

515 520 525

Asn His Thr Phe Trp Asp Lys Met Glu Ala Ala Asn His Asp Glu Pro

530 535 540

Glu Trp Leu Arg Arg Lys Arg Gln Lys Leu Ala Thr Ala Ile Val Leu

545 550 555 560

Leu Ala Gln Gly Ile Pro Phe Leu His Ser Gly Gln Glu Phe Tyr Arg

565 570 575

Thr Lys Gly Gly Asp Gly Asn Ser Tyr Arg Ser Pro Asp Ala Val Asn

580 585 590

Gln Leu Asp Trp Glu Arg Lys Ser Arg Tyr Glu Asp Asp Val Arg Tyr

595 600 605

Val Gln Gly Leu Ile Ala Leu Arg Arg Ala His Gly Ala Phe Arg Leu

610 615 620

Ala Thr Glu Ala Glu Val Leu Arg His Phe Thr Phe Leu Glu Pro Leu

625 630 635 640

Pro Pro Ser Val Ile Ala Tyr Arg Leu His Asp Ala Ala Val Tyr Gly

645 650 655

Pro Trp Glu Asp Ile Ile Val Val His His Asn Glu Glu Lys Glu Thr

660 665 670

Ala Ile Ala Leu Pro Asp Glu Arg Glu Trp Ala Val Val Cys Asp Gly

675 680 685

Gln Arg Cys Gly Thr Phe Pro Phe Gly Gln Ala Arg Gly Met Leu Arg

690 695 700

Leu Asp Gly Ile Gly Thr Trp Val Leu Val His Pro Ala Gly

705 710 715

<210> 8

<211> 2157

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgctgcata ttagtcgcac ctttgccgcc tatttagacg aaatggatca aatcgtggtt 60

ctggccccga agagtctggg ctttgacggc atggccccgt ttacactggt ggcaccgagc 120

ggtgaagaga ttccgctgag cgttcagcac gtggaggatg tgggcgagac agtgaaatat 180

gtgtgccgtt ttgccagcgc cttcgaattc ggtgccacct attgggtgcg tagttgccgc 240

ggcgaagaaa ccgatgttca aatcggcgcc gtggttcgca ccccggcctt tgatgaccgc 300

ttcttttatg acggcccgct gggcgccgaa tatctgaagg agcagacagt ttttcgtgtt 360

tgggcaccga ccgccaccgc agttagcgtg aaactggtgc atccgcactt atttgagatc 420

cgctgtgtgc ctttagtgcg tggtgaacgt ggcgtttgga gtgccgttgt gccgggcgac 480

tgggaacgtg cacgttacac atacatcgct tgtatcaacc gtgtgtggcg tgaagcagtt 540

gatccgtatg ccacagccgt tagcgtgaat ggcgagtttg gcgttgtgat cgattgggag 600

aagaccaagc tggcacctcc gagtctgccg ctgccgccgt tatgtagccc taccgatgca 660

atcatctacg agctgagcat ccgcgatttc accagccatc cggatagcgg tgccgtgcac 720

aagggtaaat atttaggtct ggccgaaacc aacaccagtg gcccgaatgg tacagccacc 780

ggtttaagtt atgtgaagga actgggtgtg acccacgttc agttaatgcc gttcatggac 840

tttgctggtg tggatgagcg cgaccctcaa gctgcataca actggggcta caatccgctg 900

catttatatg ccccggaagg cagctacgcc accgatcccg ctgacccgta cgcacgtatt 960

gtggagctga aacaagctat ccatacttta cacgagaacg gtttacgcgt ggtgatggac 1020

gccgtgtaca accatgtgta cgatcgtgaa caaagcccgc tggagaagct ggttccgggt 1080

tactatttcc gttacgacgc ctacggtcag cccgctaacg gtaccggcgt gggcaatgac 1140

attgccagcg aacgtcgcat ggcccgccgc tggattgtgg atagcgtggt gttctgggcc 1200

aaggagtatg gtattgacgg ctttcgcttc gatttaatgg gtgtgcatga tatcgagacc 1260

atgaaggccg ttcgcgatgc tttagatgcc attgacccga gcattttagt gtatggtgaa 1320

ggctgggatt taccgacccc tctgccgccg gaacagaaag ccactatggc taatgccaag 1380

cagctgccgc gcttcgccta ctttaatgac cgttttcgcg atgccgtgaa aggcagtacc 1440

ttccatttac ccgatcgtgg ctttgcctta ggtaacccgg gcggccgcga acaagttaaa 1500

ctggccattg ctggttcttt acgtgcctta ggcggtctgt tttgccaccc gcgtcagagc 1560

attaactatg tggaatgcca cgataaccac acattctggg acaagatgga agccgccaac 1620

cacgatgaac cggaatggct gcgtcgtaaa cgccagaaac tggccaccgc aatcgtgctg 1680

ctggcccaag gtattccgtt tctgcacagc ggccaagaat tttatcgcac caaaggtggc 1740

gacggtaaca gctatcgcag ccccgatgcc gtgaatcaac tggattggga gcgcaagagt 1800

cgttacgagg acgatgttcg ctacgtgcaa ggtctgattg cattacgtcg cgcacatggt 1860

gcctttcgtc tggcaaccga agccgaagtg ctgcgtcatt tcacattttt agaaccgctg 1920

ccccctagcg ttattgcata tcgtttacat gacgcagccg tgtatggccc gtgggaagac 1980

atcatcgtgg tgcaccataa cgaggagaag gaaaccgcca tcgcattacc ggatgagcgt 2040

gaatgggccg tggtttgtga cggtcagcgc tgcggtacaa caccgtttgg ccaagctcgc 2100

ggtatgctgc gtctggatgg tattggcact tgggttctgg tgcacccggc cggctaa 2157

<210> 9

<211> 2157

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgctgcata ttagtcgcac ctttgccgcc tatttagacg aaatggatca aatcgtggtt 60

ctggccccga agagtctggg ctttgacggc atggccccgt ttacactggt ggcaccgagc 120

ggtgaagaga ttccgctgag cgttcagcac gtggaggatg tgggcgagac agtgaaatat 180

gtgtgccgtt ttgccagcgc cttcgaattc ggtgccacct attgggtgcg tagttgccgc 240

ggcgaagaaa ccgatgttca aatcggcgcc gtggttcgca ccccggcctt tgatgaccgc 300

ttcttttatg acggcccgct gggcgccgaa tatctgaagg agcagacagt ttttcgtgtt 360

tgggcaccga ccgccaccgc agttagcgtg aaactggtgc atccgcactt agacgagatc 420

cgctgtgtgc ctttagtgcg tggtgaacgt ggcgtttgga gtgccgttgt gccgggcgac 480

tgggaacgtg cacgttacac atacatcgct tgtatcaacc gtgtgtggcg tgaagcagtt 540

gatccgtatg ccacagccgt tagcgtgaat ggcgagtttg gcgttgtgat cgattgggag 600

aagaccaagc tggcacctcc gagtctgccg ctgccgccgt tatgtagccc taccgatgca 660

atcatctacg agctgagcat ccgcgatttc accagccatc cggatagcgg tgccgtgcac 720

aagggtaaat atttaggtct ggccgaaacc aacaccagtg gcccgaatgg tacagccacc 780

ggtttaagtt atgtgaagga actgggtgtg acccacgttc agttaatgcc gttcatggac 840

tttgctggtg tggatgagcg cgaccctcaa gctgcataca actggggcta caatccgctg 900

catttatatg ccccggaagg cagctacgcc accgatcccg ctgacccgta cgcacgtatt 960

gtggagctga aacaagctat ccatacttta cacgagaacg gtttacgcgt ggtgatggac 1020

gccgtgtaca accatgtgta cgatcgtgaa caaagcccgc tggagaagct ggttccgggt 1080

tactatttcc gttacgacgc ctacggtcag cccgctaacg gtaccggcgt gggcaatgac 1140

attgccagcg aacgtcgcat ggcccgccgc tggattgtgg atagcgtggt gttctgggcc 1200

aaggagtatg gtattgacgg ctttcgcttc gatttaatgg gtgtgcatga tatcgagacc 1260

atgaaggccg ttcgcgatgc tttagatgcc attgacccga gcattttagt gtatggtgaa 1320

ggctgggatt taccgacccc tctgccgccg gaacagaaag ccactatggc taatgccaag 1380

cagctgccgc gcttcgccta ctttaatgac cgttttcgcg atgccgtgaa aggcagtacc 1440

ttccatttac ccgatcgtgg ctttgcctta ggtaacccgg gcggccgcga acaagttaaa 1500

ctggccattg ctggttcttt acgtgcctta ggcggtctgt tttgccaccc gcgtcagagc 1560

attaactatg tggaatgcca cgataaccac acattctggg acaagatgga agccgccaac 1620

cacgatgaac cggaatggct gcgtcgtaaa cgccagaaac tggccaccgc aatcgtgctg 1680

ctggcccaag gtattccgtt tctgcacagc ggccaagaat tttatcgcac caaaggtggc 1740

gacggtaaca gctatcgcag ccccgatgcc gtgaatcaac tggattggga gcgcaagagt 1800

cgttacgagg acgatgttcg ctacgtgcaa ggtctgattg cattacgtcg cgcacatggt 1860

gcctttcgtc tggcaaccga agccgaagtg ctgcgtcatt tcacattttt agaaccgctg 1920

ccccctagcg ttattgcata tcgtttacat gacgcagccg tgtatggccc gtgggaagac 1980

atcatcgtgg tgcaccataa cgaggagaag gaaaccgcca tcgcattacc ggatgagcgt 2040

gaatgggccg tggtttgtga cggtcagcgc cgtggtacaa caccgtttgg ccaagctcgc 2100

ggtatgctgc gtctggatgg tattggcact tgggttctgg tgcacccggc cggctaa 2157

<210> 10

<211> 2157

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgctgcata ttagtcgcac ctttgccgcc tatttagacg aaatggatca aatcgtggtt 60

ctggccccga agagtctggg ctttgacggc atggccccgt ttacactggt ggcaccgagc 120

ggtgaagaga ttccgctgag cgttcagcac gtggaggatg tgggcgagac agtgaaatat 180

gtgtgccgtt ttgccagcgc cttcgaattc ggtgccacct attgggtgcg tagttgccgc 240

ggcgaagaaa ccgatgttca aatcggcgcc gtggttcgca ccccggcctt tgatgaccgc 300

ttcttttatg acggcccgct gggcgccgaa tatctgaagg agcagacagt ttttcgtgtt 360

tgggcaccga ccgccaccgc agttagcgtg aaactggtgc atccgcactt agacgagatc 420

cgctgtgtgc ctttagtgcg tggtgaacgt ggcgtttgga gtgccgttgt gccgggcgac 480

tgggaacgtg cacgttacac atacatcgct tgtatcaacc gtgtgtggcg tgaagcagtt 540

gatccgtatg ccacagccgt tagcgtgaat ggcgagtttg gcgttgtgat cgattgggag 600

aagaccaagc tggcacctcc gagtctgccg ctgccgccgt tatgtagccc taccgatgca 660

atcatctacg agctgagcat ccgcgatttc accagccatc cggatagcgg tgccgtgcac 720

aagggtaaat atttaggtct ggccgaaacc aacaccagtg gcccgaatgg tacagccacc 780

ggtttaagtt atgtgaagga actgggtgtg acccacgttc agttaatgcc gttcatggac 840

tttgctggtg tggatgagcg cgaccctcaa gctgcataca actggggcta caatccgctg 900

catttatatg ccccggaagg cagctacgcc accgatcccg ctgacccgta cgcacgtatt 960

gtggagctga aacaagctat ccatacttta cacgagaacg gtttacgcgt ggtgatggac 1020

gccgtgtaca accatgtgta cgatcgtgaa caaagcccgc tggagaagct ggttccgggt 1080

tactatttcc gttacgacgc ctacggtcag cccgctaacg gtaccggcgt gggcaatgac 1140

attgccagcg aacgtcgcat ggcccgccgc tggattgtgg atagcgtggt gttctgggcc 1200

aaggagtatg gtattgacgg ctttcgcttc gatttaatgg gtgtgcatga tatcgagacc 1260

atgaaggccg ttcgcgatgc tttagatgcc attgacccga gcattttagt gtatggtgaa 1320

ggctgggatt taccgacccc tctgccgccg gaacagaaag ccactatggc taatgccaag 1380

cagctgccgc gcttcgccta ctttaatgac cgttttcgcg atgccgtgaa aggcagtacc 1440

ttccatttac ccgatcgtgg ctttgcctta ggtaacccgg gcggccgcga acaagttaaa 1500

ctggccattg ctggttcttt acgtgcctta ggcggtctgt tttgccaccc gcgtcagagc 1560

attaactatg tggaatgcca cgataaccac acattctggg acaagatgga agccgccaac 1620

cacgatgaac cggaatggct gcgtcgtaaa cgccagaaac tggccaccgc aatcgtgctg 1680

ctggcccaag gtattccgtt tctgcacagc ggccaagaat tttatcgcac caaaggtggc 1740

gacggtaaca gctatcgcag ccccgatgcc gtgaatcaac tggattggga gcgcaagagt 1800

cgttacgagg acgatgttcg ctacgtgcaa ggtctgattg cattacgtcg cgcacatggt 1860

gcctttcgtc tggcaaccga agccgaagtg ctgcgtcatt tcacattttt agaaccgctg 1920

ccccctagcg ttattgcata tcgtttacat gacgcagccg tgtatggccc gtgggaagac 1980

atcatcgtgg tgcaccataa cgaggagaag gaaaccgcca tcgcattacc ggatgagcgt 2040

gaatgggccg tggtttgtga cggtcagcgc tgcatgacaa caccgtttgg ccaagctcgc 2100

ggtatgctgc gtctggatgg tattggcact tgggttctgg tgcacccggc cggctaa 2157

<210> 11

<211> 2157

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgctgcata ttagtcgcac ctttgccgcc tatttagacg aaatggatca aatcgtggtt 60

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ggtgaagaga ttccgctgag cgttcagcac gtggaggatg tgggcgagac agtgaaatat 180

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ggcgaagaaa ccgatgttca aatcggcgcc gtggttcgca ccccggcctt tgatgaccgc 300

ttcttttatg acggcccgct gggcgccgaa tatctgaagg agcagacagt ttttcgtgtt 360

tgggcaccga ccgccaccgc agttagcgtg aaactggtgc atccgcactt agacgagatc 420

cgctgtgtgc ctttagtgcg tggtgaacgt ggcgtttgga gtgccgttgt gccgggcgac 480

tgggaacgtg cacgttacac atacatcgct tgtatcaacc gtgtgtggcg tgaagcagtt 540

gatccgtatg ccacagccgt tagcgtgaat ggcgagtttg gcgttgtgat cgattgggag 600

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atcatctacg agctgagcat ccgcgatttc accagccatc cggatagcgg tgccgtgcac 720

aagggtaaat atttaggtct ggccgaaacc aacaccagtg gcccgaatgg tacagccacc 780

ggtttaagtt atgtgaagga actgggtgtg acccacgttc agttaatgcc gttcatggac 840

tttgctggtg tggatgagcg cgaccctcaa gctgcataca actggggcta caatccgctg 900

catttatatg ccccggaagg cagctacgcc accgatcccg ctgacccgta cgcacgtatt 960

gtggagctga aacaagctat ccatacttta cacgagaacg gtttacgcgt ggtgatggac 1020

gccgtgtaca accatgtgta cgatcgtgaa caaagcccgc tggagaagct ggttccgggt 1080

tactatttcc gttacgacgc ctacggtcag cccgctaacg gtaccggcgt gggcaatgac 1140

attgccagcg aacgtcgcat ggcccgccgc tggattgtgg atagcgtggt gttctgggcc 1200

aaggagtatg gtattgacgg ctttcgcttc gatttaatgg gtgtgcatga tatcgagacc 1260

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attaactatg tggaatgcca cgataaccac acattctggg acaagatgga agccgccaac 1620

cacgatgaac cggaatggct gcgtcgtaaa cgccagaaac tggccaccgc aatcgtgctg 1680

ctggcccaag gtattccgtt tctgcacagc ggccaagaat tttatcgcac caaaggtggc 1740

gacggtaaca gctatcgcag ccccgatgcc gtgaatcaac tggattggga gcgcaagagt 1800

cgttacgagg acgatgttcg ctacgtgcaa ggtctgattg cattacgtcg cgcacatggt 1860

gcctttcgtc tggcaaccga agccgaagtg ctgcgtcatt tcacattttt agaaccgctg 1920

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atcatcgtgg tgcaccataa cgaggagaag gaaaccgcca tcgcattacc ggatgagcgt 2040

gaatgggccg tggtttgtga cggtcagcgc tgcggtacat ttccgtttgg ccaagctcgc 2100

ggtatgctgc gtctggatgg tattggcact tgggttctgg tgcacccggc cggctaa 2157

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aagaaggaga tataccatgg acatgctgca tattagtcgc ac 42

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tggtggtggt ggtgctcgag gccggccggg tgcaccagaa cc 42

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtgcatccgc acttatttga gatccgctgt g 31

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acacagcgga tctcaaataa gtgcggatgc 30

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gacggtcagc gccgtggtac aacaccgttt g 31

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acggtgttgt accacggcgc tgaccgtcac 30

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cggtcagcgc tgcatgacaa caccgtttgg c 31

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gccaaacggt gttgtcatgc agcgctgacc g 31

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcgctgcggt acatttccgt ttggccaag 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cttggccaaa cggaaatgta ccgcagcgc 29

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctcgagcacc accaccacca cc 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gtccatggta tatctccttc tt 22

Claims

1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶为亲本，所述突变体为以下(a)～(d)任一：

(a)将亲本的第138位由天冬氨酸突变为苯丙氨酸；

(b)将亲本的第691位由半胱氨酸突变为精氨酸；

(c)将亲本的第692位由甘氨酸突变为蛋氨酸；

(d)将亲本的第694位由苏氨酸突变为苯丙氨酸。

2.编码权利要求1所述突变的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。

5.表达权利要求1所述突变体，或携带权利要求2所述基因的微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞。

7.一种水解淀粉中α-1,6-糖苷键的方法，其特征在于，所述方法以淀粉为底物，在淀粉糖化过程中加入权利要求1所述任一突变体进行反应，反应结束后得到水解了α-1,6-糖苷键的糖化液。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述淀粉为玉米淀粉、土豆淀粉、番薯粉、葛粉、木薯粉。

9.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述重组表达载体，或权利要求5或6所述微生物细胞，或权利要求7或8所述方法在食品、医药、化工或纺织领域制备糖化液中的应用。