CN103834629A

CN103834629A - 一种重组高温普鲁兰酶及其制备方法

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Publication number: CN103834629A
Application number: CN201410005810.6A
Authority: CN
Inventors: 吴华伟; 蔚鑫鑫; 吴光旭; 陈丽冰; 高立琼
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2014-01-07
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2014-06-04

Abstract

本发明涉及一种重组高温普鲁兰酶及其制备方法，属于生物工程技术领域，其特征在于将编码高温普鲁兰酶的基因装载在pHsh表达载体上，然后转入到大肠杆菌宿主中进行含高温普鲁兰酶的工程菌的扩大培养，通过超声破碎、加热除去大肠杆菌自主表达的大部分杂蛋白、亲和层析分离纯化得到高温普鲁兰酶，重组高温普鲁兰酶最适反应温度高达70℃，能在70～80℃的高温均能发挥良好的催化活性，其适应pH值的范围较宽，使得该酶非常适合在淀粉制糖工业中与淀粉酶、糖化酶配合使用，降低糖化时间，提高糖化效率；本发明的重组高温普鲁兰酶可广泛应用于食品、酿酒、饲料、医药、造纸、纺织等工业中。

Description

一种重组高温普鲁兰酶及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种重组高温普鲁兰酶及其制备方法，属生物工程技术领域。

背景技术：

普鲁兰多糖是麦芽三糖通过α-1，6-糖苷键连接而成的线性多糖。普鲁兰酶（EC3.2.1.41）是一种能够专一性水解普鲁兰多糖、糖原、淀粉、支链淀粉和其它低聚糖中α-1，6糖苷键的脱枝酶（脱枝淀粉酶）。根据底物特异性和水解产物的不同，普鲁兰酶通常被分为四种类型：I型普鲁兰酶，可以水解普鲁兰多糖和支链寡糖中的α-1，6糖苷键生成麦芽三糖和直链寡糖；II型普鲁兰酶，既能水解普鲁兰多糖中的α-1，6糖苷键也能同时水解其他多糖中的α-1，4糖苷键；新普鲁兰酶和异普鲁兰酶，作用于普鲁兰多糖中的α-1，4糖苷键分别产生潘糖和异潘糖。

在淀粉制糖工业中，普鲁兰酶与淀粉酶、淀粉酶和糖化酶混合使用能最大限度地利用淀粉，因此，普鲁兰酶在以淀粉为原料的食品加工、酿造工业中有广泛的应用前景。普鲁兰酶与糖化酶并用时，可以大大降低糖化酶的用量，使DE值上升至98%，从而显著提高原料的利用率和葡萄糖的收率。普鲁兰酶与β-淀粉酶混合使用时，几乎可以全部将淀粉转化为麦芽糖，从而生产出80%以上超高麦芽糖浆。在啤酒生产的糖化工艺中，添加普鲁兰酶可以有效地提高麦芽汁中可发酵性糖的含量、提高麦汁的利用率和缩短糖化时间。普鲁兰酶还可以用来生产具有稳定的凝胶性能、良好的韧性和增稠作用的直链淀粉，进而利用直链淀粉生产出可生物降解的薄膜，或作为添加剂和辅料用于食品工业和纺织工业中。此外，普鲁兰酶在酒精、食品、环保领域中也有重要作用，它有可能和淀粉酶、糖化酶一样成为一个重要的工业酶制剂品种。

迄今为止，全世界只有诺维信和杰能科两个国际公司具备普鲁兰酶的工业化生产能力，国内企业均依靠进口，价格昂贵。在传统的酶法淀粉制糖工艺中，液化时淀粉酶的反应条件为pH值6.0～6.5，温度是65～90℃，糖化时糖化酶反应的最佳pH值为4.0～4.5之间，温度是60～65℃,因此，为了配合淀粉酶或糖化酶使用，理想的普鲁兰酶应该具备上述工艺特点所要求的特性，其中最重要的特性是要求酶的最适反应温度要在60℃以上，于是研究者们把注意力转移到在高温下生存的极端高温微生物，并分离出许多能够产生高温性普鲁兰酶的极端微生物，如高温厌氧菌、嗜热古细菌、深海古菌等极端微生物。由于这些极端微生物的生长温度较高，生长条件苛刻，目标酶的自然表达量都很低，所以很难直接利用这些微生物来工业化生产普鲁兰酶。

随着基因工程技术的发展，将这些来源于嗜热微生物中的普鲁兰酶编码基因插入到表达质粒后，然后导入到培养简单、生长迅速的中温宿主菌如大肠杆菌、酵母菌中表达，这样就能高效地生产出优质的普鲁兰酶。

目前，用于外源基因表达最成熟的首选是大肠杆菌表达系统，在表达载体中选择最多的是具有T7启动子的质粒，如已经商业化的pET系列；但是，很多重组酶在T7启动子下诱导表达时，由于基因的转录速度太快，新合成的蛋白质来不及折叠成具有正确构象的成熟蛋白。虽然目标蛋白的总表达量不少，但是很多是以不溶解和无活性的沉淀形式存在。

本发明者构建的pHsh这一表达载体，完全不同于具有T7启动子的载体，它独特的热激启动子是根据E.coli中热休克蛋白基因启动子的保守序列设计而成，与具有T7启动子的载体在对重组蛋白的表达效果方面相比，具有重组细胞密度高、不易形成不溶解的、无活性的重组蛋白的优势，从而使得最终的总活性重组蛋白的产量提高。同时，通过热激方式来诱导外源基因的表达，避免了IPTG（T7载体常用的诱导剂）等有毒化学诱导剂的使用。

Thermus scotoductus SA-01是在某南非金矿的三千米地下的热环境中分离得到的一个极端高温、耐盐的需氧、严格异养的微生物，其最适生长温度为75℃，由它产生的普鲁兰酶具有良好的热稳定性，非常适合淀粉加工工业之用。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组高温普鲁兰酶及其制备方法，将编码高温普鲁兰酶的基因装载在pHsh表达载体上，然后转入到大肠杆菌宿主中进行含高温普鲁兰酶的工程菌的扩大培养，通过超声破碎、加热除去大肠杆菌自主表达的大部分杂蛋白、亲和层析分离纯化得到高温普鲁兰酶，重组高温普鲁兰酶最适反应温度高达70℃，能在70～80℃的高温均能发挥良好的催化活性，其适应pH值的范围较宽,使得该酶非常适合在淀粉制糖工业中与淀粉酶、糖化酶配合使用，降低糖化时间，提高糖化效率。

本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。

本发明所提供的一种重组高温普鲁兰酶及其制备方法，包括如下步骤：

（1）引物设计及用PCR法获取高温普鲁兰酶的目的基因

引物设计如下：

上游引物：5’ATGCCATGGCCTGGTACGAGGGCGCTTTCTT’，下划线部分为NcoⅠ的酶切位点；

下游引物：5’CCGCTCGAGGACCTCCACCCAGATGGCCACG3’,下划线部分为Xho Ⅰ的酶切位点；

以高温细菌Thermus scotoductus SA-01菌株的基因组DNA溶液为模版，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，然后再对PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，最后用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切，得到高温普鲁兰酶的目的基因；高温普鲁兰酶目的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；

（2）构建重组表达载体

以pHsh为表达载体，对载体用限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶与步骤1所得的高温普鲁兰酶的目的基因片段进行连接，得到重组表达载体；pHsh是本研究室构建的一种新型大肠杆菌表达载体，它独特的热激启动子是根据E.coli中热休克蛋白基因启动子的保守序列设计而成的，同时它还有一个来源于pUC19的高拷贝复制子序列；与现有的商业化的带有T7启动子的大肠杆菌表达载体比较，很多外源基因能在pHsh中获得比T7载体中更高的具有生物活性的表达，同时由于目的基因通过热激诱导，用它来表达那些需求量巨大的工业酶能降低成本，因此具有广阔的应用前景；

（3）将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤2中得到的重组表达载体转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中进行培养，得到含有高温普鲁兰酶基因的基因工程菌，并在基因工程菌的生长过程中进行热激诱导，使普鲁兰酶得到表达；将工程菌在LB培养基中于30℃下进行振荡培养，当工程菌的细胞密度OD₆₀₀达到0.6－0.8时，将培养温度迅速上升到42℃，诱导重组普鲁兰酶表达，诱导时间6～8小时；大肠杆菌为大肠杆菌菌株K12或其衍生菌株；

（4）收集细胞，破壁并离心获得粗酶液

当诱导结束后，用高速离心机对含有高温普鲁兰酶基因工程菌的培养液进行离心，离心速度为8000g，时间为20min；收集细胞，然后用2倍于细胞体积的缓冲液（5mM咪唑,0.5M NaCl,and20mM Tris-HCl,pH7.9）重悬细胞，细胞通过超声波进行破壁，超声破碎的工作条件为：150W，工作10s，间隔10s，共30min，破碎液为全细胞蛋白，全细胞蛋白经12000g离心10min后，其上清为粗酶液，沉淀为细胞不可溶性蛋白及细胞碎片；

（5）对步骤4得的粗酶液在70℃下热处理1h，20000g离心30min，除去不耐热的杂蛋白，然后利用重组高温普鲁兰酶的N-末端含有His-tag,通过镍离子亲和层析Ni-NTA-affinity Column对重组蛋白进行纯化，用20mM、40mM、60mM、80mM和1M咪唑梯度洗脱与层析柱结合的目的蛋白，得到纯化的重组高温普鲁兰酶；重组高温普鲁兰酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

步骤1中所述的PCR反应，其体系按以下方法配制：DNA聚合酶(Pyrobest)1μL，DNA聚合酶缓冲液（10×Pyrobest BufferⅡ）5μL，基因组DNA模版溶液1μL，2.5mM脱氧核苷酸混合物（dNTP）4μL，上下游引物各加20pmol，加灭菌去离子水至总体积50μL；所述的PCR反应程序为：95℃预变性5min；然后94℃变性30s；68℃退火30s，72℃延伸2min，72℃再延伸10min,共32个循环；

步骤1中所述的用限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，其体系包括：42μL纯化的PCR产物，Nco Ⅰ和Xho Ⅰ各1μL，限制性内切酶缓冲液（10×KBuffer）5.5μL,10×BSA溶液5.5μL，混匀后放入37℃水浴锅中保温4h；

步骤2中所述的用限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶，其体系包括：pHsh空载体38μL，Nco Ⅰ和Xho Ⅰ各1μL，限制性内切酶缓冲液（10×KBuffer）5μL,10×BSA溶液5μL。

用高温普鲁兰酶基因工程菌制备的重组高温普鲁兰酶，具有以下特性：

(1)最适反应温度

在45-95℃表现较高的催化活力，最适反应温度为70℃。

(2)最适反应pH

在pH4.5-9.5范围内表现较高的催化活力，最适pH为6.5。

(3)温度稳定性

在70℃保温2h仍然保持93%的活力，在80℃保温2h能够保持50%的活力。

(4)pH稳定性

在pH6-8之间pH稳定性良好，在此范围内保温1小时，仍然能够保持70%的酶活。

(5)底物特异性

能够有效地催化普鲁兰糖、可溶性淀粉、直链淀粉和支链淀粉水解。既能水解普鲁兰多糖中的α-1，6糖苷键也能同时缓慢水解其他多糖中的α-1，4糖苷键，属于II型普鲁兰酶。

(6)对金属离子有很好的抗性。

Thermus scotoductus SA-01是一株极端高温的细菌，其最适生长温度为75℃。该菌种购买于美国标准生物品收藏中心（ATCC），通过NCBI对Thermusscotoductus SA-01的全基因组进行预测发现，其全基因组的位于2068955～2070382区域的长为1428bp的核苷酸可能编码一种高温普鲁兰酶。由于Thermus scotoductus SA-01是一株极端高温菌，培养条件复杂，人工培养比较困难，因此直接用培养Thermus scotoductus SA-01类生产高温普鲁兰酶的成本较高。而将高温普鲁兰酶基因转入易培养、可以快速繁殖的常温宿主如大肠杆菌内，可以有效地解决上述问题。

将编码高温普鲁兰酶的基因装载在pHsh表达载体上，然后转入到大肠杆菌宿主中，得到一株含目的基因的大肠杆菌工程菌。表达的产物是可溶性细胞蛋白，通过超声破碎、加热除去大部分大肠杆菌杂蛋白和亲和层析，即得到纯化的目的蛋白。

工程菌表达的目的重组蛋白为高温普鲁兰酶，其氨基酸序列如序列表SEQID No.2所示。该高温普鲁兰酶的最适反应温度为70℃，最适pH为6.5，可以催化普鲁兰糖、可溶性淀粉、直链淀粉和支链淀粉水解，有广泛的应用前景。如在酿酒工业中，在淀粉糖化和液化的过程中添加普鲁兰酶可以提高淀粉的糖化率，最大限度的利用原材料，节省成本，同时可以提高产物中的葡萄糖浓度；在食品包装领域，可以利用其水解支链淀粉来生产直链淀粉，直链淀粉具有易成膜性、水溶性差和不溶于脂肪，非常适合作为食品的保护层；在医药行业，可以用来生产高浓度的麦芽糖浆来作为肝病、糖尿病和手术后患者的营养补给品；还可以用其生产歧化环糊精来作为乳化剂、稳定剂和抗氧化剂用在医药、食品、轻工和农业化工等行业中。

上述重组高温普鲁兰酶的制备方法，将构建在大肠杆菌宿主中的含高温普鲁兰酶的工程菌进行扩大培养，然后通过超声破碎、加热除去大肠杆菌自主表达的大部分杂蛋白、亲和层析分离纯化得到高温普鲁兰酶。

所述的重组高温普鲁兰酶可广泛应用于食品、酿酒、饲料、医药、造纸、纺织等工业中。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1、本发明中的重组高温普鲁兰酶是目前已知的在同类酶中分子量最小的，这样更容易获得高的表达量。

2、该基因是在pHsh载体携带的独特的热激启动子控制下进行表达，能够获得比在传统的T7启动子控制下更高的表达量，并且具有更高的生物活性。

3、本重组普鲁兰酶最适反应温度高达70℃，能在70～80℃的高温均能发挥良好的催化活性，其适应pH值的范围较宽（pH6～8）,这样的特性使得该酶非常适合在淀粉制糖工业中与淀粉酶、糖化酶配合使用，降低糖化时间，提高糖化效率。

本发明的高温普鲁兰酶基因与表达载体重组，形成重组表达载体，但是不限于特定的表达载体，优选的表达载体为原核表达载体，进一步优先选择的为pHsh。重组蛋白在大肠杆菌中表达选择最多的是具有T7启动子的载体，但是该蛋白在具有T7启动子的载体如pET28中表达时，会形成大量的不溶性的没有生物活性的目的蛋白，而在pHsh中表达时，目的蛋白大部分为可溶性的且具有生物活性。

本发明不限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体，本发明使用大肠杆菌（E.coli JM109）菌株。

附图说明:

图1为高温普鲁兰酶基因的克隆显示图。

M:DNA marker;1.分支淀粉酶基因的PCR产物；2.阳性重组质粒Xho I单酶切验证；3.阳性重组质粒双酶切验证(Xho I/Nco I)。

图2为高温普鲁兰酶基因在pHsh和pET28a载体中的表达比较图。

M:蛋白marker;1.携带pET28a质粒的大肠杆菌全细胞蛋白；2.携带pET28-pullu质粒的大肠杆菌全细胞蛋白；3.携带pET28-pullu质粒的大肠杆菌可溶性蛋白；4.携带pET28-pullu质粒的大肠杆菌不溶性蛋白；5.携带pHsh质粒的大肠杆菌全细胞蛋白；6.携带pHsh-pullu质粒的大肠杆菌全细胞蛋白;7.携带pHsh-pullu质粒的大肠杆菌可溶性细胞蛋白；8.携带pHsh-pullu质粒的大肠杆菌不溶性细胞蛋白。

图3为纯化得到的高温普鲁兰酶的电泳图。

M:蛋白marker;1.携带pHsh-pullu质粒的大肠杆菌可溶性细胞蛋白；2.70℃加热处理1h后的细胞蛋白；3.经镍离子亲和层析后获得的纯重组高温支链淀酶。

图4为高温普鲁兰酶的pH-活力曲线图。

图5为高温普鲁兰酶的pH稳定性-活力曲线图。

图6为高温普鲁兰酶的温度-活力曲线图。

图7为高温普鲁兰酶的热稳定性-活力曲线图。

图8为高温普鲁兰酶的金属离子-活力曲线图。

图9为高温普鲁兰酶的水解产物分析图。

1.支链淀粉经重组酶水解后的产物；2.支链淀粉；3.直链淀粉经重组酶水解后的产物；4.直链淀粉；5.寡糖标准品：葡萄糖（G1）,麦芽糖（G2），麦芽三糖（G3），麦芽四糖（G4）；6.普鲁兰糖；7.普鲁兰糖经重组酶水解后的产物；8.可溶性淀粉；9.可溶性淀粉经重组酶水解后的产物。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：高温普鲁兰酶工程菌的构建及其酶的表达

1、引物设计及用PCR法获取高温普鲁兰酶目的基因和重组载体的制备

Thermus scotoductus SA-01菌株的基因组中有一段预测的可能编码普鲁兰酶基因的序列。选择的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，将该基因命名为pullu。该酶的基因通过PCR法从Thermus scotoductus SA-01菌的基因组DNA中扩增得到。根据基因序列和载体内的限制性酶切位点来设计引物，委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。上游引物：5’ATGCCATGGCCTGGTACGAGGGCGCTTTCTT’，下划线部分为NcoⅠ的酶切位点；下游引物：5’CCGCTCGAGGACCTCCACCCAGATGGCCACG3’,下划线部分为Xho Ⅰ的酶切位点；两个引物的酶切位点与pHsh表达载体中的Nco Ⅰ和Xho Ⅰ相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。

PCR反应：在50μL反应体系中含有1μL DNA聚合酶，DNA聚合酶缓冲液5μL，基因组DNA模版溶液1μL，2.5mM dNTP混合物4μL，上下游引物各加20pmol，加灭菌去离子水至总体积50μL；所述的PCR反应程序为：95℃预变性5min；然后94℃变性30s；68℃退火30s，72℃延伸2min，72℃再延伸10min,共32个循环；用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如附图1泳道1所示，PCR所得产物约为1400bp的DNA片段，并经序列测定与预期中的完全一样。使用北京全式金生物技术有限公司的PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物。

将纯化的PCR产物用限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，酶切体系包括42μL的目的基因PCR回收产物，Nco Ⅰ和Xho Ⅰ各加1μL，10×KBuffer5.5μL，10×BSA溶液5.5μL。37℃下保温4小时，然后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，最后用胶回收试剂盒回收。

在16℃用T₄DNA连接酶来连接普鲁兰酶基因和载体,将连接产物转入大肠杆菌JM109中，用含氨苄青霉素的琼脂平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。挑取一个阳性的单克隆加入到含氨苄青霉素的试管中，37℃180rpm/min培养过夜，提取质粒，然后采用单酶切、双酶切和测序的方法鉴定目的基因是否成功插入。

结果如图1所示泳道2、3所示，单酶切后的片段介于Marker的3000-5000bp之间，大约为4000bp左右，大小正好与载体和片段相加的大小一样，经Nco I和Xho I双酶切验证，能得到两条带，大的一条代表线性质粒pHsh，小的一条代表目的片段，约1400bp。

2、重组普鲁兰酶的表达和纯化

将重组DNA质粒pHsh-pullu-his转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中。大肠杆菌感受态细胞的制备及其载体转化方法参照《分子克隆实验指南》。挑取阳性转化菌，置30mL含氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB培养液中30℃振荡培养过夜，然后按2%的接种量接种到含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，当OD₆₀₀达到0.6－0.8左右时将培养温度升高到42℃来诱导目的蛋白表达6h。诱导完成后，8000g离心10min收集菌体，加2倍体积的5mM咪唑，0.5M NaCl,20mM Tris-HCl,pH7.9的缓冲液悬浮菌体，超声破碎(工作条件：150W，工作10s，间隔10s，共30min)后得到的为全细胞蛋白，全细胞蛋白经12000g离心10min后，上清为细胞可溶性蛋白，沉淀为细胞不可溶性蛋白及细胞碎片。为检验该基因在pHsh表达载体与大肠杆菌目前主流表达载体pET系列（具有T7启动子）中的表达效果，将pullu基因同时插入到pET28a中，构建成重组质粒pET28a-pullu，重组质粒转化到大肠杆菌JM109(DE3)中，诱导前的培养方法和携带pHsh-pullu的大肠杆菌一样，当OD₆₀₀达到0.6－0.8左右时，加入化学诱导剂IPTG至终浓度为1mM,诱导目的蛋白表达6h，各细胞成分分级方法与携带pHsh-pullu的重组菌一样。各取不同分级的10μL样品（代表全细胞蛋白，可溶性蛋白，不溶性蛋白）进行SDS-PAGE，结果见附图2，与未诱导的菌株相比，经过诱导的菌株的全细胞蛋白在50kDa附近处都出现一条非常明显的蛋白条带（图2，泳道2和6），与目的蛋白预期的理论分子量一致。但是，在携带pET28a-pullu的菌株中，较多的目的蛋白以不溶性成分出现在沉淀中（泳道4），少部分为活性蛋白（泳道3），而在携带pHsh-pullu的菌株中，大部分目的蛋白以可溶性的活性蛋白形式（泳道7）出现在全细胞蛋白的上清液中，少部分为不溶性成分（泳道8），这一结果说明了高温pullu基因在pHsh中获得了更高的活性表达。

从携带pHsh-pullu的重组菌中得到的粗酶液在70℃下热处理1h，20000g离心30min，除去不耐热的杂蛋白，然后利用重组高温普鲁兰酶的N-末端含有His-tag,通过镍离子亲和层析（Ni-NTA-affinity Column）对重组蛋白进行纯化，用20mM、40mM、60mM、80mM和1M咪唑梯度洗脱与层析柱结合的目的蛋白，然后在pH6.5、温度70℃的条件下，以0.5%普鲁兰糖为底物测定不同处理后的酶活力以及相应的蛋白浓度，得到不同处理后的蛋白纯化表，如表1所示。

表1：高温普鲁兰酶的蛋白纯化表

用SDS-PAGE(10%)电泳检测重组蛋白浓度，可见50kDa附近可见一条电泳条带，如图1所示。

实施例2：重组高温普鲁兰酶的活性分析

重组高温普鲁兰酶活性使用DNS法进行分析：在pH6.5,70℃条件下，500μL反应体系包括：250μL1%普鲁兰糖底物（g/100mL）和240μL缓冲液（50mM）预热10min,然后加入10μL适当稀释的酶液反应5min,加入750μL DNS终止反应，沸水煮5min,冷却后540nm测定OD值，以葡萄糖为标准曲线，计算酶活力。1个酶活单位（U）定义为在给定条件下每分钟降解1%的普鲁兰糖溶液释放1μmol还原糖所需要的酶量。

实施例3：重组高温普鲁兰酶的性质测定

1、重组高温普鲁兰酶的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：将实施例1纯化的重组高温普鲁兰酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。以0.5%普鲁兰糖作为底物，利用实施例2中的反应体系，用50mM不同pH的邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液在65℃下进行普鲁兰酶活的测定。结果如图2所示，表明普鲁兰酶的最适pH为6.5。高温普鲁兰酶于上述不同pH缓冲液中70℃处理60min，再在70℃下测定残余酶活，以研究酶的pH稳定性。结果如图3所示，表明高温普鲁兰酶在pH6－8范围内稳定，酶活性可以维持最大酶活性的70%以上，这说明此酶拥有良好的pH稳定性。所使用的缓冲液为宽范围pH buffer：在室温下精确配制50mM不同pH4.5－9.5的邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液。

2、重组高温普鲁兰酶的最适反应温度和热稳定性的测定方法

高温普鲁兰酶的最适温度的测定以0.5%普鲁兰糖作为底物，在宽范围缓冲液pH6.5体系及温度45－95℃范围内测定普鲁兰酶的活力。热稳定性的测定是让高温普鲁兰酶在不同的温度下保温不同时间，再在70℃下进行酶活测定。酶反应最适温度测定结果如图4所示，表明最适温度为70℃。酶的热稳定性试验结果如图5所示，表明高温普鲁兰酶在65－70℃下稳定性非常好，在此温度范围内保温2h,仍然保留超过90%的残余酶活；在80℃保温2h能保留50%的残余酶活。

3、底物特异性

用TLC硅胶薄层色谱法来分析普鲁兰酶水解普鲁兰糖、可溶性淀粉、直链淀粉和支链淀粉的产物。纯化的酶和0.5%底物溶液在65℃，pH6.5的条件下水解过夜。然后将水解后的溶液14000rpm离心10min,后分别加2μL样品于活化好的硅胶板上（110℃，烘干1h）,以乙腈-水（4：1v:v）为展开剂，苯胺-二苯胺（1%（m:v）的二苯胺和1%(v:v)苯胺溶解于丙酮溶液中，然后在使用前与0.1倍体积的85%磷酸混合）为显色剂。最后在85℃烘烤15min显色。结果如图7所示，该酶水解普鲁兰多糖时，水解产物主要为麦芽三糖，少量为麦芽糖，微量的葡萄糖，当底物为支链淀粉、直链淀粉、可溶性淀粉时，水解产物主要为麦芽糖，其次是麦芽三糖，微量的葡萄糖，因此确定该酶为II型普鲁兰酶。

4、高温普鲁兰酶动力学测定

用不同浓度的普鲁兰糖作为底物（购自于Sigma公司）,在缓冲液(pH6.5)缓冲体系中，70℃下测定酶活性，计算出其在70℃下的Km和Vmax。经测定，普鲁兰糖的Km为0.003mg/mL，最大反应速度Vmax为23.75μmol/min。

5、金属离子、有机溶剂及表面活性剂对高温普鲁兰酶活力的影响

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，在70℃、pH6.5条件下测定其酶活性。结果（图6）表明：K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺对酶的活性影响不大，Ni²⁺、Cr³⁺、Zn²⁺、Pb²⁺对酶有明显的抑制作用，SDS强烈抑制酶活，而Hg²⁺和Cu²⁺完全抑制酶活。Mn²⁺、Fe²⁺、EDTA对酶活有促进作用，Mn²⁺强烈激活该酶的活性，因此在应用上建议添加一定浓度的Mn²⁺。所有金属离子和化学试剂的工作浓度都是5mM。

Claims

1.一种重组高温普鲁兰酶，其特征在于所述的高温普鲁兰酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的高温普鲁兰酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的一种重组高温普鲁兰酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）引物设计及用PCR法获取高温普鲁兰酶的目的基因

引物设计如下：

上游引物：5’ATGCCATGGCCTGGTACGAGGGCGCTTTCTT3’，下划线部分为Nco Ⅰ的酶切位点；

以高温细菌Thermus scotoductus SA-01菌株的基因组DNA溶液为模版，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，然后再对PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，最后用限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，得到高温普鲁兰酶的目的基因；

（2）构建重组表达载体

以pHsh为表达载体，对载体用限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶与步骤1所得的高温普鲁兰酶的目的基因片段进行连接，得到重组表达载体；

所述的pHsh是一种新型大肠杆菌表达载体，它独特的热激启动子是根据E.coli中热休克蛋白基因启动子的保守序列设计而成的，同时它还有一个来源于pUC19的高拷贝复制子序列；

（3）将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤2中得到的重组表达载体转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中进行培养，得到含有高温普鲁兰酶基因的基因工程菌，并在基因工程菌的生长过程中进行热激诱导，使普鲁兰酶得到表达；

（4）收集细胞，破壁并离心获得粗酶液

当诱导结束后，用高速离心机对含有高温普鲁兰酶基因工程菌的培养液进行离心、收集细胞、重悬细胞和细胞通过超声波进行破壁处理，得上清为粗酶液，沉淀为细胞不可溶性蛋白及细胞碎片；

（5）对步骤4中得到的粗酶液中的重组酶进行纯化得到纯化的重组高温普鲁兰酶。

3.根据权利要求2所述的一种重组高温普鲁兰酶的制备方法，其特征在于所述高温普鲁兰酶目的基因来源于高温细菌Thermus scotoductus SA-01。

4.根据权利要求3所述的一种重组高温普鲁兰酶的制备方法，其特征在于所述步骤3中的大肠杆菌是大肠杆菌菌株K12或其衍生菌株。

5.根据权利要求4所述的一种重组高温普鲁兰酶的制备方法，其特征在于所述的在基因工程菌的生长过程中进行热激诱导，使普鲁兰酶得到表达是将工程菌在LB培养基中于30℃下进行振荡培养，当工程菌的细胞密度OD₆₀₀达到0.6－0.8时，将培养温度迅速上升到42℃，诱导重组普鲁兰酶表达，诱导时间6～8小时。

6.根据权利要求5所述的一种重组高温普鲁兰酶的制备方法，其特征在于所述当诱导结束后，用高速离心机对含有高温普鲁兰酶基因工程菌的培养液进行离心，离心速度为8000g，时间为20min；收集细胞，然后用2倍于细胞体积的缓冲液重悬细胞，细胞通过超声波进行破壁，超声破碎的工作条件为：150W，工作10s，间隔10s，共30min，破碎液为全细胞蛋白，全细胞蛋白经12000g离心10min后，其上清为粗酶液，沉淀为细胞不可溶性蛋白及细胞碎片。

7.根据权利要求6所述的一种重组高温普鲁兰酶的制备方法，其特征在于所述的对重组酶进行纯化是对步骤4得的粗酶液在70℃下热处理1h，20000g离心30min，除去不耐热的杂蛋白，然后利用重组高温普鲁兰酶的N-末端含有His-tag,通过镍离子亲和层析Ni-NTA-affinity Column对重组蛋白进行纯化，用20mM、40mM、60mM、80mM和1M咪唑梯度洗脱与层析柱结合的目的蛋白，得到纯化的重组高温普鲁兰酶。