CN101993863B

CN101993863B - 一种葡萄糖淀粉酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN101993863B
Application number: CN2009100912694A
Authority: CN
Inventors: 马延和; 郑迎迎; 薛燕芬
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2029-08-14
Also published as: CN101993863A

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖淀粉酶及其编码基因。该蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有葡萄糖淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明通过基因工程技术，从腾冲嗜热厌氧菌(菌种保藏号AS 1.2430^T＝JCM 11007^T)中扩增得到葡萄糖淀粉酶编码基因，并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中，实验结果表明，本发明的葡萄糖淀粉酶具有较高的最适反应温度，比黑曲霉来源的葡萄糖淀粉酶的最适反应温度高10℃，且热稳定性好，具有较好的工业应用前景。

Description

一种葡萄糖淀粉酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种葡萄糖淀粉酶及其编码基因与应用。

背景技术

葡萄糖淀粉酶(1，4-α-D-glucan glucohydrolases，EC 3.2.1.3)，又称淀粉葡萄糖苷酶(glucoamylase)或γ-淀粉酶(γ-amylase)，简称糖化酶。葡萄糖淀粉酶可以从寡糖或多糖碳链的非还原端逐个水解α-1，4-糖苷键，生成β-D-葡萄糖。葡萄糖淀粉酶处于淀粉降解的最后一步，在食品加工、生物乙醇生产和制酒业中具有重要的应用价值。

工业上从淀粉制备葡萄糖分为液化和糖化两个连续的步骤，其中用到两种主要的酶：细菌来源的嗜热α淀粉酶和黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡萄糖淀粉酶(AMG)。在第一步液化的过程中，淀粉在pH6和100℃左右的条件下被嗜热α淀粉酶液化成麦芽糊精；随后的糖化步骤中，麦芽糊精被真菌来源的葡萄糖淀粉酶在pH4.5和60℃下的条件下进一步糖化生成葡萄糖。虽然黑曲霉来源的葡萄糖淀粉酶(AMG)的酶活力较高，但是其最适反应温度远远低于细菌来源的嗜热α淀粉酶，因而导致在实际生产中降温步骤的成本较高；另外黑曲霉来源的葡萄糖淀粉酶(AMG)的热稳定性不够好，高温下很快失活，使AMG的催化效率降低，这些都导致了生产成本的增加。因此，迫切需要寻找一种在酸性pH和80-90℃的高温条件下具有高活力的葡萄糖淀粉酶。

近年来，来源于嗜热微生物的酶引起了人们极大的兴趣。这些酶能在高温条件下发挥最大的活力，比中温酶更能适应工业生产的需要。因此，向嗜热微生物索取耐高温酶资源，已成为工业生产中解决高温催化的重要手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄糖淀粉酶及其编码基因。

本发明所提供的葡萄糖淀粉酶，来源于腾冲嗜热厌氧菌(菌种保藏号AS 1.2430^T＝JCM 11007^T)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有葡萄糖淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。

为了便于葡萄糖淀粉酶的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的葡萄糖淀粉酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的葡萄糖淀粉酶的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′末端第1-2046位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述葡萄糖淀粉酶的编码基因也属于本发明的保护范围。

葡萄糖淀粉酶的编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-2046位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述葡萄糖淀粉酶的DNA分子；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述葡萄糖淀粉酶的DNA分子。

序列表中的序列1由2049个碱基组成，其开放阅读框架(0RF)为自5′末端第1-2046位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的葡萄糖淀粉酶。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

扩增上述葡萄糖淀粉酶编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述葡萄糖淀粉酶编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为在pET系列载体(如pET42b或pET28a等)的多克隆位点间插入上述葡萄糖淀粉酶编码基因得到的重组载体，如pET42b-ttga或pET28a-ttga等。

所述重组菌具体可为在大肠杆菌BL21(DE3)、BL21-Gold(DE3)、BL21-Gold(DE3)pLysS或BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中导入含有上述葡萄糖淀粉酶编码基因的重组载体得到的重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种制备葡萄糖淀粉酶的方法。

本发明所提供的制备葡萄糖淀粉酶的方法，是发酵培养上述含有葡萄糖淀粉酶编码基因的重组菌，得到葡萄糖淀粉酶。

本发明通过基因工程技术，从腾冲嗜热厌氧菌(菌种保藏号AS 1.2430^T＝JCM11007^T)中扩增得到葡萄糖淀粉酶编码基因，并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中，实验结果表明，本发明的葡萄糖淀粉酶具有较高的最适反应温度，比黑曲霉来源的葡萄糖淀粉酶的最适反应温度高10℃，且热稳定性好，具有较好的工业应用前景。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、葡萄糖淀粉酶及其编码基因的获得

腾冲嗜热厌氧菌(菌种保藏号AS 1.2430^T＝JCM 11007^T)是中科院微生物所2001年从我国腾冲地区温泉内分离得到的革兰氏阴性厌氧真细菌，它的最适生长温度为75℃，最适pH为7-7.5。2002年，由中科院微生物所和北京华大基因研究中心共同完成了该菌全基因组序列的测定和基因注释。注释结果表明，该菌的基因组中存在一系列的淀粉水解酶。

提取腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)(购自中国科学院微生物研究所菌保藏中心，菌种保藏号为AS 1.2430^T＝JCM 11007^T)的基因组DNA并以其为模板，以F：5′-GAGCCATATGTGTTCTGATGTTTCATAC-3′和R：5′-CCTCGTCGACAGAGTATTATAACCTA-3′为引物进行PCR扩增。PCR扩增条件如下：先95℃预变性3min，然后95℃25s，58℃25s，72℃2min，共25个循环；最后70℃延伸10min。

回收上述PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得2049bp的条带，回收该条带连入pMD18-T克隆载体中进行序列测定。测序结果表明，获得的全长的葡萄糖淀粉酶基因ttga的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

实施例2、利用含有葡萄糖淀粉酶编码基因的重组菌发酵生产葡萄糖淀粉酶

1、含有葡萄糖淀粉酶编码基因的重组菌的获得

将上述实施例1获得的葡萄糖淀粉酶编码基因纯化后用NdeI和SalI双酶切，酶切产物与经相同酶切的pET42b载体(购自Novagen公司)用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌。提取重组菌的质粒测序验证，结果表明，获得的重组菌中含有葡萄糖淀粉酶编码基因ttga，说明表达载体构建正确。

2、利用重组菌发酵生产葡萄糖淀粉酶

将上述步骤1获得的重组菌的单菌落接种至卡那霉素终浓度为30μg/ml的LB液体培养基中，37℃培养。12h后将发酵液按照1％的接种量转接至300ml新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀达到0.8，再在培养基中加入无菌的IPTG，使IPTG在培养基中的终浓度为0.5mM进行诱导。4h后结束发酵，将发酵液5000rpm离心5min收集菌体。

将菌体重悬于15ml浓度为50mM pH5.0的HAc-NaAc缓冲液中，超声破碎(300W，20min)，将超声破碎产物置于85℃水浴中热处理15min，然后13000rpm离心10min，收集上清。将上清用superdex75分子筛纯化，收集14min时的蛋白峰，superdex75分子筛纯化的条件为：

缓冲液：50mM pH7.0 K₂HPO₄-KH₂PO₄，0.15M NaCl，5％体积百分含量异丙醇；

流速：0.3ml/min。

将经superdex75分子筛纯化的蛋白用HiTrap脱盐柱(购自GE公司)脱盐，收集蛋白峰，即为葡萄糖淀粉酶，HiTrap脱盐柱脱盐的条件为：

缓冲液：20mM K₂HPO₄-KH₂PO₄；

流速：1ml/min。

将上述纯化得到的葡萄糖淀粉酶经N端测序验证，结果表明，上述纯化得到的葡萄糖淀粉酶在蛋白质水平上与上述实施例1中序列2一致。

3、功能验证

1)酶活测定

对上述步骤2获得的葡萄糖淀粉酶进行酶活检测。将1个酶活单位(U)定义为：一定条件下，每分钟产生1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个单位。

酶活测定的反应体系如下：将2g麦芽糖溶于100ml浓度为50mM，pH5.0的HAc-NaAc缓冲液中，得到麦芽糖底物溶液；取48μl上述麦芽糖底物溶液，与2μl浓度为0.2mg/ml的上述步骤2获得的葡萄糖淀粉酶TTGA混合均匀，75℃反应10min，然后再95℃反应5min使酶失活。

取5μl上述反应液，与100μl葡萄糖显色试剂(德国r-biopharm，D-glucose试剂盒)混合，室温反应15min，测定340nm处的吸光值。

实验设三次重复，结果表明，上述步骤2获得的葡萄糖淀粉酶的平均比酶活为80U/mg。

2)酶学性质表征

A、最适酶促反应温度的测定

取48μl上述步骤1)的麦芽糖底物溶液，加入2μl浓度为0.2mg/ml的上述步骤2获得的葡萄糖淀粉酶TTGA，混合均匀后分别在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和85℃下，按照上述步骤1)的酶活测定方法测定葡萄糖淀粉酶TTGA在不同温度下的酶活，以确定最适酶促反应温度。

B、最适酶促反应pH值的测定

将麦芽糖分别溶于pH值为3.0、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0和7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，配制不同pH值的麦芽糖底物溶液。取48μl上述不同pH值的麦芽糖底物溶液，加入2μl浓度为0.2mg/ml的上述步骤2获得的葡萄糖淀粉酶TTGA，混合均匀后在75℃下，按照上述步骤1)的酶活测定方法测定葡萄糖淀粉酶TTGA在不同pH条件下的酶活，以确定最适酶促反应的pH值。

C、热稳定性的测定

将上述步骤2获得的葡萄糖淀粉酶TTGA用50mM、pH4.0-7.0的HAc-NaAc缓冲液稀释至终浓度为0.2mg/ml，将上述酶液分别在65℃、70℃、75℃和80℃的温度下保温1-6h，然后按照上述步骤1)的酶活力测定方法测定葡萄糖淀粉酶TTGA的残余酶活力，以考察上述葡萄糖淀粉酶的热稳定性。

实验设三次重复，结果表明，上述步骤2获得的葡萄糖淀粉酶的最适反应温度为75℃；最适反应pH值为4.8；且热稳定性较高，在pH 5-6的条件下，75℃处理6h，残余酶活大于80％。上述步骤2获得的葡萄糖淀粉酶的最适反应温度比黑曲霉来源的葡萄糖淀粉酶(AMG)提高了10℃，具有较高的工业应用潜力。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种葡萄糖淀粉酶及其编码基因与应用

<130>CGGNARZ92482

<160>2

<210>1

<211>2049

<212>DNA

<213>腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)

<400>1

tgttctgatg tttcatacgt gaaggttgaa catttagata aaaccgaagc ttctcaagga 60

ccaggggaga gagatacatg ggcgacagct caaaaacagg gcattggcac tgccaataat 120

gatgtatcga aagtatggtt tactttagct cagggggccc tttctgagat ttactatcct 180

accattgaca gagccaacag caagttttta aaatttattg ttactgatgg caaaactttt 240

gtggctgatg agacaactga cactgtaagc aaggtagaga agattaacaa caggtcttta 300

gcttacaggc tagtgaatat tgataaaaga ggaaggtata aaattacaaa agagatattt 360

actgacccaa gaaggaattc tgttgtcatg aaggtgagat ttgaagcgtt aaaagggaaa 420

atggaagatt ataaacttta tcttgtgtac gaccctcata tttctaatca aggagcggat 480

aatgaggggt atgttgtaaa agcgaatggt gaatacggat ttatggcttg tagaaacaat 540

gtgtattcag ccttaatgac tgatgcgaaa tgggggagct attctgtagg atataacggt 600

gttaatgacc ctgtgagcga tttaaagaaa aataagaaaa tgacttacaa gttcgatagg 660

gctaaaggga atataattga gggtattgag attgatttaa gagacaagac ggaatttaaa 720

accgttcttt cctttggaga aagtgaggaa gaggcgttaa agacggctct tagtacttta 780

aaagacagtt acgacaggat gcttgggata tatatagcag aatggaataa atactgcgac 840

gggcttaaaa actttggtgg agaggcagac gagctttact ataccagttt aatgttttta 900

aaggcgagtg aagataaaac caacaaagga gcttttattg cctccctttc aattccatgg 960

ggagaaggac agggggatga gaataaagga gggtatcact tagtttgggc aagagattta 1020

taccacatcg ccaatgcttt tattgcagct aaagatatag attcggctaa tagggctttg 1080

gattttctag ctatggtggt agaaaaaaat ggatttatgc ctcaaaacac ttggataaac 1140

ggagaccctt actggaacgg gattcagatg gacgaacagg ctgacccgat aatcctggca 1200

tatcacctta aaagatacga tttgtatgaa aaattggtaa aaccccttgc tgattttata 1260

gtaagagtag gacctaagac aggacaagag aggtgggagg aagcgggagg gtattctcct 1320

gccactatgg cagctgaagt tgctggactt gtctgtgctg ctgatattgc gaagcaaaac 1380

aaagatatgg aaagggcaaa gaaatatctg gagacagctg acaaatggca agagttgata 1440

gacaaactca cttatactac gaaaggacct tatggcaatg ggcagtatta tataagaatt 1500

gcaggtttac cggacccgga tgccgacttt ttaataagca ttgccaacgg aggaggagtg 1560

tatgaccaga aggagattgt agatccaagt tttttagagc ttgtaaggtt aggagtaaaa 1620

gcttatgatg acccaaagat attgaatact atttcggtag ttgatagcct ccttaaagta 1680

aatactccta aagggccttc gtggtacagg tacaatcatg atggctatgg tgaacccgcc 1740

aaaggagaac tttatcatgg caaaggtaaa ggcagattat ggcctcttct tacaggagag 1800

agagggatgt acgaaattgc agcagggaaa aaagcagatg actatctaga gtatatgaga 1860

aattttgcta atgaaggttt tgtcttgtca gagcaaattt gggaagatac aggacttcct 1920

acagattctg cttctcctct caattgggct catgcggaat atgtggtgct ttttgcatct 1980

aacatagaag ggaaggtagt tgatatgcca caaattgtat acaaaaggta tgtattaggg 2040

gagagataa 2049

<210>2

<211>682

<212>PRT

<213>腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)

<400>2

Cys Ser Asp Val Ser Tyr Val Lys Val Glu His Leu Asp Lys Thr Glu

1 5 10 15

Ala Ser Gln Gly Pro Gly Glu Arg Asp Thr Trp Ala Thr Ala Gln Lys

20 25 30

Gln Gly Ile Gly Thr Ala Asn Asn Asp Val Ser Lys Val Trp Phe Thr

35 40 45

Leu Ala Gln Gly Ala Leu Ser Glu Ile Tyr Tyr Pro Thr Ile Asp Arg

50 55 60

Ala Asn Ser Lys Phe Leu Lys Phe Ile Val Thr Asp Gly Lys Thr Phe

65 70 75 80

Val Ala Asp Glu Thr Thr Asp Thr Val Ser Lys Val Glu Lys Ile Asn

85 90 95

Asn Arg Ser Leu Ala Tyr Arg Leu Val Asn Ile Asp Lys Arg Gly Arg

100 105 110

Tyr Lys Ile Thr Lys Glu Ile Phe Thr Asp Pro Arg Arg Asn Ser Val

115 120 125

Val Met Lys Val Arg Phe Glu Ala Leu Lys Gly Lys Met Glu Asp Tyr

130 135 140

Lys Leu Tyr Leu Val Tyr Asp Pro His Ile Ser Asn Gln Gly Ala Asp

145 150 155 160

Asn Glu Gly Tyr Val Val Lys Ala Asn Gly Glu Tyr Gly Phe Met Ala

165 170 175

Cys Arg Asn Asn Val Tyr Ser Ala Leu Met Thr Asp Ala Lys Trp Gly

180 185 190

Ser Tyr Ser Val Gly Tyr Asn Gly Val Asn Asp Pro Val Ser Asp Leu

195 200 205

Lys Lys Asn Lys Lys Met Thr Tyr Lys Phe Asp Arg Ala Lys Gly Asn

210 215 220

Ile Ile Glu Gly Ile Glu Ile Asp Leu Arg Asp Lys Thr Glu Phe Lys

225 230 235 240

Thr Val Leu Ser Phe Gly Glu Ser Glu Glu Glu Ala Leu Lys Thr Ala

245 250 255

Leu Ser Thr Leu Lys Asp Ser Tyr Asp Arg Met Leu Gly Ile Tyr Ile

260 265 270

Ala Glu Trp Asn Lys Tyr Cys Asp Gly Leu Lys Asn Phe Gly Gly Glu

275 280 285

Ala Asp Glu Leu Tyr Tyr Thr Ser Leu Met Phe Leu Lys Ala Ser Glu

290 295 300

Asp Lys Thr Asn Lys Gly Ala Phe Ile Ala Ser Leu Ser Ile Pro Trp

305 310 315 320

Gly Glu Gly Gln Gly Asp Glu Asn Lys Gly Gly Tyr His Leu Val Trp

325 330 335

Ala Arg Asp Leu Tyr His Ile Ala Asn Ala Phe Ile Ala Ala Lys Asp

340 345 350

Ile Asp Ser Ala Asn Arg Ala Leu Asp Phe Leu Ala Met Val Val Glu

355 360 365

Lys Asn Gly Phe Met Pro Gln Asn Thr Trp Ile Asn Gly Asp Pro Tyr

370 375 380

Trp Asn Gly Ile Gln Met Asp Glu Gln Ala Asp Pro Ile Ile Leu Ala

385 390 395 400

Tyr His Leu Lys Arg Tyr Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Val Lys Pro Leu

405 410 415

Ala Asp Phe Ile Val Arg Val Gly Pro Lys Thr Gly Gln Glu Arg Trp

420 425 430

Glu Glu Ala Gly Gly Tyr Ser Pro Ala Thr Met Ala Ala Glu Val Ala

435 440 445

Gly Leu Val Cys Ala Ala Asp Ile Ala Lys Gln Asn Lys Asp Met Glu

450 455 460

Arg Ala Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Ala Asp Lys Trp Gln Glu Leu Ile

465 470 475 480

Asp Lys Leu Thr Tyr Thr Thr Lys Gly Pro Tyr Gly Asn Gly Gln Tyr

485 490 495

Tyr Ile Arg Ile Ala Gly Leu Pro Asp Pro Asp Ala Asp Phe Leu Ile

500 505 510

Ser Ile Ala Asn Gly Gly Gly Val Tyr Asp Gln Lys Glu Ile Val Asp

515 520 525

Pro Ser Phe Leu Glu Leu Val Arg Leu Gly Val Lys Ala Tyr Asp Asp

530 535 540

Pro Lys Ile Leu Asn Thr Ile Ser Val Val Asp Ser Leu Leu Lys Val

545 550 555 560

Asn Thr Pro Lys Gly Pro Ser Trp Tyr Arg Tyr Asn His Asp Gly Tyr

565 570 575

Gly Glu Pro Ala Lys Gly Glu Leu Tyr His Gly Lys Gly Lys Gly Arg

580 585 590

Leu Trp Pro Leu Leu Thr Gly Glu Arg Gly Met Tyr Glu Ile Ala Ala

595 600 605

Gly Lys Lys Ala Asp Asp Tyr Leu Glu Tyr Met Arg Asn Phe Ala Asn

610 615 620

Glu Gly Phe Val Leu Ser Glu Gln Ile Trp Glu Asp Thr Gly Leu Pro

625 630 635 640

Thr Asp Ser Ala Ser Pro Leu Asn Trp Ala His Ala Glu Tyr Val Val

645 650 655

Leu Phe Ala Ser Asn Ile Glu Gly Lys Val Val Asp Met Pro Gln Ile

660 665 670

Val Tyr Lys Arg Tyr Val Leu Gly Glu Arg

675 680

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)中任一所述的基因：

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pET载体的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述pET载体为载体pET42b或载体pET28a。

7.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

8.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞。

9.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

10.根据权利要求9所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求5或6所述的重组载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)、BL21-Gold(DE3)、BL21-Gold(DE3)pLysS或BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中得到的重组菌。

11.一种制备葡萄糖淀粉酶的方法，是发酵培养权利要求10所述的重组菌，得到葡萄糖淀粉酶。