CN102676557A

CN102676557A - 一种i型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用

Info

Publication number: CN102676557A
Application number: CN2012101455217A
Authority: CN
Inventors: 吕红; 冯碧薇; 王儒恺; 周峻岗
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-05-11
Also published as: CN102676557B

Abstract

本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体为一种I型普鲁兰酶的编码基因，及其重组表达和应用。本发明提供了来源于气单胞菌属的普鲁兰酶新基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，记为pluAs。该普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够降解普鲁兰多糖或淀粉中的α-1，6葡萄糖糖苷键。重组表达该基因的三种具有I型普鲁兰酶活性的DNA片段，该重组普鲁兰酶片段最适pH均为8.0，最适反应温度为60℃；在55℃处理1h，该普鲁兰酶的残余活性达90%左右；在pH7～10的条件下非常稳定。使用重组普鲁兰酶与淀粉糖化酶协同糖化淀粉，能够制备具有更高葡萄糖含量的产物。本发明提供的重组普鲁兰酶可应用于淀粉加工、环保、食品、医疗保健等行业。

Description

一种I型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种气单胞菌属产普鲁兰酶菌株普鲁兰酶编码基因的克隆。本发明还提供该普鲁兰酶编码基因重组质粒的构建和重组普鲁兰酶制备方法。

背景技术

I型普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）以内切方式专一水解普鲁兰糖的α-1，6葡萄糖糖苷键，其水解产物主要是麦芽三糖（Doman-Pytka M et al.，Critical Reviews in Microbiology，2004，Vol 30，Issue 2，107-121）。除了降解普鲁兰多糖以外，普鲁兰酶还能水解淀粉和支链淀粉，因此I型普鲁兰酶具有很重要应用价值。比如：I型普鲁兰酶能够与α-淀粉酶、β-淀粉酶等协同作用生产高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、提高啤酒中的发酵度；在食品、医药化妆品、分析化学等领域，普鲁兰酶能够逆向合成麦芽糖基-α-环糊精，相比目前广泛应用的环糊精，无任何毒性与溶血性；利用普鲁兰酶水解支链淀粉中的α-1，6糖苷键，可将支链淀粉转变成直链淀粉，后者具有很好的抗水性和成膜性，有望生产可食性包装膜，解决“白色污染”问题；除此之外，采用普鲁兰酶将各类淀粉脱支后再糊化老化处理可增加抗消化淀粉的含量，后者对人体血糖水平、肥胖、癌症、脂质代谢和能量等方面有重要生理功能。

目前，国内外分离产普鲁兰酶菌的产酶酶活较低，产酶水平一般为2～5 U/mL，且这些产酶菌主要来源于芽孢杆菌属和克雷伯菌属（巩培 et al.，天津科技大学学报，2009，Vol 24，Issue 3，10-12；Shobha M.S. et al.，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，Vol 56，Issue 22，10858-10864）。这些产酶菌株大多为病原菌，其发酵液不能直接用于工业添加，特别是食品工业，因此普鲁兰酶基因的重组表达至关重要。然而，普鲁兰酶编码基因序列通常较长（3～6 kb），这就使其重组表达变得困难重重，国内关于普鲁兰基因重组表达的报道较少。另外，淀粉加工时通常采取50～55 ℃的反应温度，这就对普鲁兰酶在该温度下的物理化学的稳定性提出了较高的要求。筛选新型高酶活、具有一定热稳定性的普鲁兰降解酶，具有重要的应用意义。

申请人的课题组先前从稻田土壤中筛选到一株产普鲁兰酶的气单胞菌属菌株Aeromonas sp. As，其菌种保藏号为：CGMCC NO.5490，保藏日期为2011年11月28号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为3G2。

发明内容

本发明的第一个目的是提供酶活高、热稳定性好的普鲁兰降解酶编码基因。

本发明的第二个目的是提供具有活性的上述普鲁兰酶基因片段的重组质粒。

本发明的第三个目的是提供上述重组普鲁兰酶的酶学特性和功能及应用。

本发明提供的普鲁兰降解酶编码基因，是利用Aeromonas sp. As菌株（CGMCC NO.5490）所产，记为 pluAs。

本发明利用PCR技术获得Aeromonas sp. As菌株（CGMCC NO.5490）普鲁兰酶基因pluAs的全长序列，该基因全长4053 bp，编码1351个氨基酸，预测蛋白大小140 KDa。其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列与Aeromonas hydrophia普鲁兰酶（通过对该菌株全基因组测序的方法获得，蛋白序列号：ABK37551.1）相似度为89%，表明该基因为新的普鲁兰酶基因。

本发明还提供上述普鲁兰酶全长基因（pluAs）的克隆方法，即以气单胞菌属菌株Aeromonas sp. As 基因组DNA为模板，通过保守序列设计引物，进行PCR扩增（图1）。

本发明还提供3种含有普鲁兰酶基因片段（见图2）的核苷酸编码序列的重组质粒。该质粒是pET21a-PluAs-1、pET21a-PluAs-2、pET21a-PluAs-3。将含有本发明的普鲁兰酶基因片段编码序列通过常规方法克隆至载体的多克隆位点，即可形成上述重组质粒。

蛋白质结构域分析（http://www.expasy.ch/）表明Aeromonas sp. As的PluAs蛋白具有4个保守结构域，分别为图2中所示PUD（CBM41）、CBM48、GH13和DUF（Domain of unknown function）。其中PUD结构域为预测的普鲁兰酶底物结合结构域；CBM48存在于多种分解支链的酶中，比如：普鲁兰酶、异淀粉酶等；GH13结构域是在普鲁兰酶中存在的α-淀粉酶催化结构域，能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉中的α-1，6糖苷键；DUF结构域的功能未知，在细菌和真菌中都发现了这一保守结构域，大小约170个氨基酸残基，SP为蛋白信号肽区域。Pullulan-Starch结构域为革兰氏阴性菌普鲁兰酶基因共有的保守结构域。

将PluAs与气单胞菌属来源及其他种属来源的普鲁兰降解酶蛋白构建系统发育树，分析了PluAs的进化地位，结果表明PluAs与Aeromonas hydrophia来源的普鲁兰降解酶进化关系最相近，而与芽孢杆菌属（Bacillus）来源的普鲁兰降解酶进化关系较远。见图3所示。

本发明还提供重组表达具有活性的I型普鲁兰酶的方法，所用的表达系统可以是大肠杆菌表达系统，也可以是酵母表达系统。

为了获得具有活性的普鲁兰酶片段，本发明通过PCR的方法扩增了如图2所示的pluAs基因片段，分别是：PluAs蛋白的四个核心结构域（22～1114位氨基酸，PluAs-1，蛋白预测大小117 KDa），去除PUD结构域的基因片段（149～1344位氨基酸，PluAs-2，蛋白预测大小129 KDa），革兰氏阴性菌普鲁兰酶的保守结构域（149～1114位氨基酸，PluAs-3，蛋白预测大小104 KDa）。该大肠杆菌重组表达质粒为pPET21a-PluAs-1、pPET21a-PluAs-2、pPET21a-PluAs-3，该重组表达蛋白C端融合6×His标签，利用Ni柱纯化获得与预测蛋白分子量相一致的重组普鲁兰酶片段。如图4所示：泳道1为纯化后的PluAs-3，泳道2为蛋白标准分子量，泳道3为纯化后的PluAs-1，泳道4为纯化后的PluAs-2。纯化后的PluAs-1、PluAs-2、PluAs-3的普鲁兰酶比酶活分别约为600 U/mg，650 U/mg，250 U/mg。

本发明对重组普鲁兰酶最适pH进行了测定。分别配制含1%普鲁兰多糖的pH 3.0～10.0的缓冲液，其中pH 3.0～6.0为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 7.0为20mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，pH 8.0～10.5为20mM的Tris-HCl缓冲液，pH 11.0为20mM的甘氨F酸-NaOH缓冲液。取含有底物的缓冲液98 μL与2 μL纯化后的酶液一起在水浴中60℃反应10 min。测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图5表明，该酶的最适pH均为8.0，在pH 7.0～10.0的范围内酶活均在80%以上，在pH 5.0时，保留40%～70%左右的酶活。见图5所示。

本发明对重组普鲁兰酶最适温度进行了测定。将2 μL纯化后的酶液与98 μL含1%普鲁兰多糖的Tris-HCl中（pH 8.0）混匀，分别在20，30，40，50，60，70和80 ℃温度下反应10 min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图6的结果表明3种重组普鲁兰酶的最适反应温度均为60 ℃。见图6所示。

本发明对重组普鲁兰酶的热稳定性进行了测定。将适量酶液放置在55 ℃、60 ℃和65 ℃下恒温水浴中，每隔15 min取样测定剩余酶活力，以保温0 min时的酶活力计为100%。图7的结果表明，在55 ℃条件下处理1h，PluAs-1的酶活基本保持不变，PluAs-2和PluAs-2酶活力残余约70%；由于淀粉加工时通常采取50～55 ℃的反应温度，该酶的在这一温度下的物理化学的稳定性符合工业发展的需求。见图7所示。

本发明对重组普鲁兰酶的pH稳定性进行了测定。将适量酶液分别置于pH 3～11的缓冲液中。4 ℃ 放置24 h后，于普鲁兰酶最适条件下测定残余的酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图8的结果表明，该重组普鲁兰酶在碱性和中性环境下非常稳定；在pH 5.0的条件下反应24 h残余酶活为60%～80%。在pH为3.0～4.0酸性的条件下，酶活有比较明显的降低。见图8所示。

根据IUBMB（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）建立的两类分类标准（把普鲁兰降解酶分成多类，其中I型普鲁兰酶（Type I pullulanase, EC 3.2.1.41）专一水解普鲁兰糖α-1，6糖苷键产生麦芽三糖；新普鲁兰酶（Neopullulanase，EC3.2.1.135）专一水解普鲁兰多糖的α-1，4糖苷键产生潘糖。不同类型的普鲁兰降解酶能够水解不同的糖苷键，并生成不同的产物，因此在各个行业中的应用也不尽相同；而I型普鲁兰酶在工业上的应用价值最为广泛。本发明通过薄层层析（TLC）和离子色谱法（HPAEC，如图10）对PluAs-1水解普鲁兰多糖的产物进行了分析，层析分析图见图9所示。图9中泳道1为葡萄糖（C1）、麦芽糖（C2）、麦芽三糖（C3）层析后位置；泳道2为未水解过的普鲁兰多糖（0 min）；泳道3～9是使用PluAs-1水解普鲁兰多糖不同时间得到的产物（泳道3：5 min；泳道4：10 min；泳道5：15 min；泳道6：20 min；泳道7：25 min；泳道8：30 min；泳道9：40 min）。该图表明PluAs-1的通过内切方式为水解普鲁兰多糖，得到的终产物为三糖。通过TLC分析表明PluAs-2和PluAs-3具有相同的水解方式。

为了进一步鉴定该普鲁兰降解酶的催化分类，本发明采取离子色谱的方法对其水解普鲁兰多糖的产物进行了鉴定。见图10所示。该普鲁兰降解酶水解普鲁兰多糖产生的三糖产物，其离子色谱保留时间约为17.5 min（如A）。通过标准加入法分析，结果表明该酶水解普鲁兰糖三糖产物的色谱峰与麦芽三糖标准品的峰发生重叠（如 B），形成单一峰，这一结果说明该普鲁兰酶完全水解普鲁兰多糖的产物是麦芽三糖，因此PluAs-1的催化分类属于I型普鲁兰酶。通过相同的实验证明PluAs-2和PluAs-3的催化分类均为I型普鲁兰酶。

关于重组普鲁兰酶PluAs-1与淀粉糖化酶对淀粉的协同糖化作用研究。由于3个重组普鲁兰酶中PluAs-1具有较好的热稳定性和pH稳定性，本发明挑选PluAs-1与淀粉糖化酶协同作用，检测其对淀粉的糖化作用。见图11所示。其中，A为α-淀粉酶糖化淀粉不同时间的葡萄糖产物含量变化；B为α-淀粉酶糖和普鲁兰酶协同水解淀粉不同时间的葡萄糖产物含量变化。该图的结果表明，使用两种酶协同水解淀粉能够制备更高葡萄糖含量的产物。

本发明用HPAEC分析PluAs-1与淀粉糖化酶对淀粉协同糖化后的水解产物。见图12所示。其中，（A）为糖化前的淀粉液化液（糖化0 h样品），可以发现糖化之前葡萄糖含量较低，样品中含有较多二糖、三糖等不同聚合度的糖组分。（B）为单一添加糖化酶水解淀粉液化液6 h所得的产物；从图中可知，糖化6 h后液化液中得到较高浓度的葡萄糖组分，但还有较少两的三糖组分，出峰时间为18.5 min；由于糖化酶对α-1，6糖苷键水解效率较低，推测该三糖组分可能为潘糖或异潘糖（由α-1，6糖苷键和α-1，4糖苷键组成）。（C）为同时添加糖化酶和普鲁兰酶对淀粉液化液协同水解6 h后产物分析图谱；结果表明使用同时使用两种酶具有更好的效果，所得糖产物都为葡萄糖，并未检测到多余的三糖组分。因此，在工业应用中同时使用两种酶将对葡萄糖浆等产物的制备具有更好、更高效的作用。

综上，本发明获得了3种含有pluAs基因核心结构域的大肠杆菌重组质粒，重组表达蛋白比酶活约250～650 U/mg。重组表达的普鲁兰酶最适pH均为8.0，最适反应温度为60℃；在55℃处理1 h，该普鲁兰酶的残余活性达到了90%以上。通过薄层层析和离子色谱分析鉴定该重组表达普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够水解普鲁兰多糖或淀粉中的α-1，6葡萄糖糖苷键，不能水解直链淀粉和环糊精。Triton X-100、SDS、尿素、甲醇、乙醇、Mn²⁺能够不同程度的提高酶活；α-，β-，γ-环糊精、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺对酶活力具有较大程度的抑制。本发明的重组普鲁兰酶可应用于淀粉加工、环保、食品、医疗保健等行业。

附图说明

图1：气单胞菌属来源普鲁兰酶基因序列比对图。根据已完成基因组测序的气单胞菌Aeromonas hydrophia、Aeromonas salmonicida和Aeromonas veronii注释为普鲁兰酶基因，通过Align-X进行序列软件比发现1～100 bp和4001～4122 bp区域为保守序列，如图1（A）和1（B）所示。根据此区域的核苷酸序列特征，设计引物扩增了Aeromonas sp. As完整的普鲁兰酶编码基因（pluAs）。该基因全长4053 bp，编码1351个氨基酸，蛋白预测分子量为140 KDa。与该蛋白的氨基酸序列相似度最高的序列为Aeromonas hydrophia假定的普鲁兰酶，其相似度仅为89%，表明获得普鲁兰酶基因为新基因。

图2：PluAs蛋白结构域。

图3：气单胞菌属普鲁兰酶PluAs（Aeromonas sp. PluAs）系统发育树分析。

图4：重组表达PluAs-1、PluAs-2、PluAs-3蛋白纯化图。

图5：重组普鲁兰酶最适pH测定图示。

图6：重组普鲁兰酶最适温度测定图示。

图7：重组普鲁兰酶的热稳定性测定图示。

图8：重组普鲁兰酶的pH稳定性测定图示。

图9: PluAs-1水解普鲁兰多糖产物薄层层析分析图。

图10：PluAs-1水解普鲁兰多糖产物离子色谱分析图。

图11：重组普鲁兰酶PluAs-1与淀粉糖化酶对淀粉的协同糖化作用图示。

图12：HPAEC分析PluAs-1与淀粉糖化酶对淀粉协同糖化后的水解产物。

具体实施方式

所用实验材料和相关操作方法如下，未详述处可以参考冷泉实验室的《分子克隆》（J.Sambrook, et al., 第二版，1996）：

1. 菌株，载体：大肠杆菌菌株E.coli Rosetta和Top10，质粒pPMD18-T，pPET21a，均为本实验室保存，与现有文献中相应物质的性质相同。

2.培养基

LB 培养基：1.0% Polypeptone（BBI），0.5% Yeast Extract（Oxoid），0.5% NaCl，pH 7.0。

3. 实验试剂：普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉等多糖购于Sigma公司；分子生物学需要的试剂购自TaKaRa公司；引物合成和DNA测序由上海英潍捷基生物技术有限公司完成。DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂（甲液：溶解6.9 g结晶酚于15.2 mL 10%NaOH中，用蒸馏水稀释至69 mL，再加入6.9 g NaHSO₃；乙液：255克酒石酸钾钠加至300 mL 10%NaOH中，再加入880 mL 1%3，5-二硝基水杨酸溶液；将甲液与乙液相混合即得到黄色DNS试剂，储于棕色瓶中，在室温下放置7～10天后使用）。

4.大肠杆菌系统表达及纯化酶蛋白：将含有酶基因的PET21a质粒转化至大肠杆菌表达菌Rosetta中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养至转化子出现。用牙签挑取一个单克隆转化子接种至3ml LA（LB培养液+100ug/ml氨苄青霉素）培养液中，37℃，220 rpm培养过夜。次日取0.5 mL过夜菌至50 mL LA中，37℃，220rpm培养，当菌密度（OD.600）达到0.4～0.6，加入终浓度为0.1 mM 的IPTG，22℃，220rpm继续培养12小时。离心收集菌体，用pH8.0，20 mM Tris-HCl重悬菌体，超声破碎大肠杆菌细胞，高速离心收集上清，Ni-NTA柱结合目的酶蛋白，用梯度浓度的咪唑洗脱蛋白。

5.普鲁兰酶酶活力测定方法：本发明使用DNS还原糖法测定普鲁兰酶的酶活力。具体方法如下：取10 μL适当稀释酶液加入90 μL含1%（质量体积比）的普鲁兰多糖的Tris-HCl缓冲液中（pH 8.0，20 mM），60℃反应10 min，加入100 μL DNS终止反应，煮沸10 min显色；以10 μL煮沸灭活的酶液为空白对照，570 nm测定吸光值，根据标准曲线计算产生还原糖的量，每组反应做3个平行样品。酶活单位定义：每分钟释放1 μmol还原糖（以葡萄糖计）定义为一个酶活力单位(U)。

实施例1：通过PCR方法获得Aeromonas sp. As普鲁兰酶全长基因pluAs

通过比对已报道的气单胞菌属普鲁兰酶基因（来源于对产酶菌株全基因组测序后获得的信息），寻找基因5’和3’端保守区域（见图3），设计PCR引物Aero-F和Aero-R如下：

Aero-F：ATGGATATGAAAAAGACCAAAGTGGCG (正向引物，不含酶切位点)，即SEQ ID NO 3。

Aero-R：CTTGRCRCKGCACTCCTGRATSACRGCRGTACC (反向引物，不含酶切位点) ，即SEQ ID NO 4。

以Aeromonas sp. As基因组为模板，以上述引物进行PCR扩增。PCR 扩增产物回收后连于pMD18-T载体，转化大肠杆菌Top10菌株，获得质粒pT-pluAs，测序后果利用NCBI的数据库的Blastp软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行蛋白质同源性比对和蛋白结构域分析（图2）。

实施例2：通过PCR方法获得pluAs-1及大肠杆菌Rosetta基因工程菌的制备

本发明通过PCR的方法扩增了如图2所示的pluAs基因片段，分别是：PluAs蛋白的四个核心结构域（22～1114位氨基酸，PluAs-1），去除PUD结构域的基因片段（149～1344位氨基酸，PluAs-2），革兰氏阴性菌普鲁兰酶的保守结构域（149～1114位氨基酸，PluAs-3）。该大肠杆菌重组表达质粒为pPET21a-PluAs-1、 pPET21a-PluAs-2、pPET21a-PluAs-3，该重组表达蛋白C端具有融合表达的6×His标签。

设计PCR引物Pul-F64和Pul-R3342扩增PluAs-1，如下：

Pul-F64：CCC GAATTC TGTAACGACAACAGTTCTTCACCCTCC（正向引物，含EcoRI酶切位点），即SEQ ID NO 5。

Pul-R3342：CCC GCGGCCGC CCCCAAGAAGCCACGGACAAACA（反向引物，含NotI酶切位点，不含终止密码子，利用载体上的终止密码子终止表达）,即SEQ ID NO 6。

设计PCR引物Pul-F445和Pul-R4032扩增PluAs-2，如下：

Pul-F445：CCC GAATTC AAGGTGGTCTTCAGCGATCACCC

（正向引物，含EcoRI酶切位点），即SEQ ID NO 7。

Pul-R4032：CCC GCGGCCGC CTTGGCACGGCACTCCTGGAT

（反向引物，含NotI酶切位点，不含终止密码子，利用载体上的终止密码子终止表达）,即SEQ ID NO 8。

使用引物Pul-F445和Pul-R3342扩增PluAs-3，序列即SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 6。

以质粒pT-pluAs为模板，使用以上引物PCR扩增，PCR 扩增产物回收后连于pPET21a载体，转化大肠杆菌Top10菌株，获得质粒pPET21a-PluAs-1/-2/-3。

将原核表达质粒pET21a-PluAs-1/-2/-3按参考例4的方法转化大肠杆菌Rosetta。从转化子中各挑选5个阳性转化子，与受体菌阴性对照同步进行发酵，发酵上清也分别进行SDS-PAGE和普鲁兰酶的酶活力检测，结果显示工程菌株Rosetta/pET21a-PluAs-1/-2/-3各阳性转化子均有相同的表达量且酶活一致，可用于后续的实验研究。蛋白纯化的方法见参考例4，纯化后蛋白条带如图4。

实施例3：重组表达普鲁兰酶的酶学特性分析

（1）最适pH值测定：分别配制含1%普鲁兰糖的pH 3.0～10.0的缓冲液，其中pH 3.0～6.0为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 7.0为20mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，pH 8.0～10.5为20mM的Tris-HCl缓冲液，pH 11.0为20mM的甘氨酸-NaOH缓冲液。取含有底物的缓冲液98 μL与2 μL纯化后的酶液一起在水浴中60℃反应10 min。测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%（如图5）。

（2）最适反应温度测定：将2 μL纯化后的酶液与98 μL含1%普鲁兰多糖的Tris-HCl中（pH 8.0）混匀，分别在20，30，40，50，60，70和80 ℃温度下反应10 min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%（如图6）。

（3）热稳定性分析：将适量的酶液放置在55℃、60℃和65℃下恒温水浴中，每隔15 min取样测定剩余酶活力，以保温0 min时的酶活力计为100%（如图7）。

（4）pH稳定性分析：将适量酶液分别置于pH 3～11的缓冲液中, 其中pH 3.0～6.0为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 7.0为20mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，pH 8.0～10.5为20mM的Tris-HCl缓冲液，pH 11.0为20mM的甘氨酸-NaOH缓冲液。酶液于4 ℃ 放置24 h后，在普鲁兰酶最适条件下测定残余的酶活力，其中酶活力最高的设为100%。

实施例4：重组表达普鲁兰酶的酶学催化类型分析

由于不同类型的普鲁兰酶的应用不相同；其中，I型普鲁兰酶在工业上的应用最广。为了鉴定重组表达普鲁兰酶的酶学催化类型，本发明使用TLC和HPAEC方法对重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖产物进行分析，具体操作如下：

取5 μL化后的酶液加入到95 μL的底物（含1%普鲁兰多糖的20 mM Tris-HCl，pH 8.0），60 ℃反应3 h，取2～3 μL水解后样品点样于Silica gel 60 F₂₅₄板上，吹干后将硅胶板放置在丁醇/乙醇/水（5:3:2）展层液中展2～3次。展层结束后，在硅胶板上喷上甲醇/浓硫酸（7:3）显色液，于110℃烘干显色5 min。

将上述酶解液2000倍，取1 mL上样于色谱柱，使用Dionex 600离子色谱分析系统检测酶解液的组成，稀释2000倍的1%的麦芽三糖作为标准品。HPAEC洗脱条件：在100 mmol/L NaOH中以0～250 mmol/L醋酸钠梯度洗脱30 min，流速为1 mL/min。

实施例5：重组表达普鲁兰酶的底物特异性分析

用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）配制1%的普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉、糖原、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精溶液，取2 μL纯化后的酶液与98 μL底物混合，于60 ℃反应10 min，用DNS还原糖法测定重组普鲁兰酶对不同底物的水解酶活。将重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的能力设为100%，计算其水解淀粉、糖原等多糖的能力。结果如表1所示，重组普鲁兰酶能够特异水解普鲁兰多糖和淀粉，其水解淀粉能力约为水解普鲁兰多糖的14%～16%。不能够水解直链淀粉，糖原和α-/β-/γ-环糊精。

表1. PluAs-1底物特异性分析

底物/ 比酶活 (U/mg)	PluAs-1	PluAs-2	PluAs-3
				普鲁兰多糖	596.5±8.6 （100%）	643.2±27.7 （100%）	278.1±25.8（100%）
淀粉	96.9±9.6（16.3%）	93.9±5.5（14.6%）	38.9±3.6（14.1%）

实施例6：二价金属阳离子、醇等试剂对重组普鲁兰酶酶活的影响

在酶的反应体系中加入终浓度为5 mM的MgCl₂、CoCl₂、CaCl₂、MnCl₂、NiCl₂和 CuCl₂，或5%的甲醇、乙醇，或不同浓度的SDS、Triton X-100等试剂，接着加入适量的酶，在pH 8.0和60 ℃条件下测定重组普鲁兰酶的活性。以不加任何二价金属阳离子、醇等试剂时的酶活性作为对照，并定为100%。结果如表2所示，表明：Triton X-100、SDS、尿素、甲醇、乙醇、Mn²⁺能够不同程度的提高PluAs-1的酶活；其中5 mM SDS能够提高重组普鲁兰酶的酶活将近100%；α-，β-，γ-环糊精、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺对酶活具有较大程度的抑制。

表2. 金属离子、醇等试剂对重组普鲁兰酶活的影响

。

实施例7：重组普鲁兰酶PluAs-1与淀粉糖化酶对淀粉的协同糖化作用

配置5%的马铃薯淀粉浆液，使用NaOH调节其pH为6.5。使用20U/g的α-淀粉酶于90 ℃对淀粉浆液进行液化，人工搅拌至碘色为棕色。液化后的淀粉利用淀粉糖化酶和普鲁兰酶PluAs-1进行糖化，反应温度为50 ℃，每隔12 h取样，使用葡萄糖检测试剂盒（氧化酶法）测定糖化过程中的葡萄糖产量。

将上述糖化6 h样品，稀释10000倍，取1 mL上样于色谱柱，使用Dionex 600离子色谱分析系统鉴定淀粉糖化后产物。HPAEC洗脱条件：在100 mmol/L NaOH中以0～250 mmol/L醋酸钠梯度洗脱30 min，流速为1 mL/min。

<110> 复旦大学

<120> 一种I型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用

<130> 001

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4035

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggatatga aaaagaccaa agtggcgctg gtaacagcct cactgctcgc gcttttgtca 60

ggctgtaacg acaacagttc ttcaccctcc accccgactc cccaggatga gcccgtcgct 120

cgccttccca atgtgcaacc cccggccgaa cagctggtgg ccggtcccaa tgaggcggtc 180

atcgccctgg tcgacaccca gagcagcgcg gcccgtggcg tcgatggccc cttcgcgggt 240

cacagcctgc acctgtggaa caacgacgcc tgcaactcca ccgccgacgg cggcctgaac 300

gcgagctggg acgacaagag caagacgccg tccgcggcgg acagcttcgg cccgagctgg 360

gtggtgcccc tcagcaagat ggaaggctgc atcaacttca tcgcccgcaa cggcgatctc 420

gcgaacctga ccggcgccga catgaaggtg gtcttcagcg atcacccgga tcgcaccgtg 480

gccatagtcg ccggcaagaa cgagatcttc ggcagccggg ccgacgcttt caccgccgcc 540

ttcggcgtgg cgggggccag cgcccacctg atcgacggca acaccctgat ctggcaaggg 600

ggcaaggaca agccccacgt ccgcctctac tacaccgagt ccggcaccat caccgccaac 660

gccgaggggg tgttcgactt cccctacctc aagctgaccc cgaccagcct gacggccgag 720

cagcaggcca agtacccgca tctcaaggat gccgccgcct tcgccctgcc ggcggggcag 780

gatctcaagc ccctgctcaa gggtgagctg gtggccatcg gcaccgatgc cgacggcatc 840

ctgcagggcg ccaccctggt gcagagcgcc ggtgccctcg atgccctcta tagcgatgcc 900

gccaccaaac tggcctacgg tgccgtggtc gaggggggca atgtcacctt ccggctctgg 960

gcgccgaccg ccaagtcggt caagctggcg ctgttcgacg agcagcacaa cgccatcggt 1020

gagcgtgcca tgaccctgga cgaggccagc ggcagctgga gcgtacaggg gggcagcgat 1080

ctggtgggca aatactatcg ctacgacatc caggtctatc acccggtcag ccgcaagctg 1140

gaatcctatc aggtgaccga cccctactcc ctgagcctgg ccatgaactc cgagttcagc 1200

caggtggtgg atctcgacga tccggccctc aagccggacg gctgggacag cctgaaggcg 1260

ccccacagcc agcagaaccc cgccgacatc accatctatg aggcccatgt ccgggatctg 1320

accggcaacg acgcctcgac cgatgcagag aagcgcggca agttcctcgg cctgacccag 1380

cccgacagcg tgccggtcaa gcacctgcaa tctctggcca agagcggcgt cagccacctg 1440

cacctgctgc cggtgttcga catcgccacc gtcaacgagg atccggccaa ggtggccaac 1500

atcggcgacg acttcagcaa gctgtgcgag gtcaatgccg aggtcaagaa ctccaagttt 1560

gccagccact gtggcggtgg ccagaccatc gaggccgtgc tggcagatct gcaagccagc 1620

gacagcaagg agaacccggt cgtgcaggag ctgtacggct atctgcgcgg cgtggactcc 1680

ttcaactggg gttatgaccc ctaccactac accacgccgg aaggctccta cgccaccgat 1740

gcggagggga cgacccggat caaggagttc cgcgagatgg tcatggccat caagcagaac 1800

atcggcatga acgtggtgat ggacgtggtc tacaaccaca ccaacgaggc cggcctgggg 1860

ccgaagtccg tgctcgacaa gatagtgccc tggtactacc agcgcctgaa cccggagacc 1920

ggctcggtgg aaaactccac ctgctgctcc aacacggcac ctgaacacgc catgttcgcc 1980

aagctgatgg atgactccct ggtcacctgg gcgcgggact acaagatcga cgccttccgc 2040

ttcgacctga tgggtcacca cccgaaggat cagatggtgc aggccctggc cgaggtgaag 2100

aaggtcaacc cggacatgta cttctacggc gaggggtgga acttcggcga agtgcaggat 2160

gacaagcgct tcgtgcaggc gacccagaaa cacctggccg gtaccggcat cggctccttc 2220

tccgaccggt tgcgggatgc ggtgcgcggc ggcagtccgt ccgacggcgg cgacgccatc 2280

cgcaagaccc agggctttgg caacggcgcc ctggtggatg ccaacgaggt ggacggcgtc 2340

gatctcgcca ccgccctgca ccagtcagac ctggtgcgtc tcggcatggc gggcaacctc 2400

aaggagtttg tgctgaccga caaggacggc gtgccgaaga aggggtccga catcgactac 2460

aacggtcagc ccgcgggcta tgcccaggat ccgaccgaaa tccagaacta tgtcgacaag 2520

cacgacaacc agaccctgtt cgacaacctg gtctacaagg cgccggcggg ggccgatctg 2580

gtgcggatgc agggggtgtc gctcgctacc gccatgctgg gtcagggcat tcccttcacc 2640

cacgccgggg tggaactgct gcgttccaag tccatggagc gggacagcta tgactccggc 2700

gactggtaca accgggtcga ctataccctg ggcgacaaca acttcgacaa gggcctgccg 2760

cgcaaggaca aggacgaggc caactacgag ttgatcgagc aggtgctcgg ccagcacgcc 2820

aagccgggct cggccgagat ggcgcagatg gtgagcttct accaggagct gtccgagctg 2880

cgtcaatcct cccgcctgct gcgtctgggc agcggtgccg aggtgatcaa gcgggttgac 2940

ttccgcaaca cagggccgga tcagactccg ggtctcatcg tgatgacggt ggacgatggc 3000

agcaaggccg gcgcggatct ggatccggcc atcgacggcc tggtggtgat gatcaacgcc 3060

accagccaga gccagagcat cggcgacttc cgtgacggcg acgatcagcc catcgacctc 3120

tccggtctgg tgctgagcgg tgcccatcgc gacgtcgaca gcatcgccag cggcgccgcc 3180

gtggggaacg gtgagctgac cctgggtgcc tggtccgccg ccgtcttcgt caagccgcag 3240

aacggcgccc agggcgcggg tctgccggtg agcaagaaga cggatctgag caccttgcca 3300

cccttcggtg ataccgaggt gtttgtccgt ggcttcttgg gggcctggga tccggtcaac 3360

aagatgagct tcagtggcaa ctacacctat gagttcacca ccgaagtgac gacggatcag 3420

ctggggacga cccaggtgaa gatcgccggc agcgactggg gcggcccagt caactacggc 3480

aagtgcagcg ataccgacca gctggcaacc ggccaggtca gcgcgctctg cgccaacggc 3540

ggggatctgc cgttcaatgt ggacaaggcg ggcacctaca ggttcgtctt taccgccatg 3600

aacaaggaca agccgaccct gagcgtcagc ttcaccgagc cggtgcagag ctgcaaggtg 3660

ctggatacgg tggcgggcaa ccctctcggc tacaacctgt tcatcaaggg tgagctgtct 3720

ggctggaatc cccagcctca gtaccagttg agctacaagg ggatggaggg cgatctcgcc 3780

atctatcagg tcgcgttcaa ctacaacggc accacagagt tcaaggtggc caacgaggac 3840

tggagcaagg agtacctgat caatggcggt ggtgaagttc aggccgagac aggctatccg 3900

tttgccttct cccagccagc cagcgccaac aacaagatca ccctgccgca gggtctgtgg 3960

agcgtgctgg tgaaggtgga tccggctgcg gctaagccgg gtaccgccgt gatccaggag 4020

tgccgtgcca agtaa 4035

<210> 2

<211> 1344

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Asp Met Lys Lys Thr Lys Val Ala Leu Val Thr Ala Ser Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Ser Gly Cys Asn Asp Asn Ser Ser Ser Pro Ser Thr Pro

20 25 30

Thr Pro Gln Asp Glu Pro Val Ala Arg Leu Pro Asn Val Gln Pro Pro

35 40 45

Ala Glu Gln Leu Val Ala Gly Pro Asn Glu Ala Val Ile Ala Leu Val

50 55 60

Asp Thr Gln Ser Ser Ala Ala Arg Gly Val Asp Gly Pro Phe Ala Gly

65 70 75 80

His Ser Leu His Leu Trp Asn Asn Asp Ala Cys Asn Ser Thr Ala Asp

85 90 95

Gly Gly Leu Asn Ala Ser Trp Asp Asp Lys Ser Lys Thr Pro Ser Ala

100 105 110

Ala Asp Ser Phe Gly Pro Ser Trp Val Val Pro Leu Ser Lys Met Glu

115 120 125

Gly Cys Ile Asn Phe Ile Ala Arg Asn Gly Asp Leu Ala Asn Leu Thr

130 135 140

Gly Ala Asp Met Lys Val Val Phe Ser Asp His Pro Asp Arg Thr Val

145 150 155 160

Ala Ile Val Ala Gly Lys Asn Glu Ile Phe Gly Ser Arg Ala Asp Ala

165 170 175

Phe Thr Ala Ala Phe Gly Val Ala Gly Ala Ser Ala His Leu Ile Asp

180 185 190

Gly Asn Thr Leu Ile Trp Gln Gly Gly Lys Asp Lys Pro His Val Arg

195 200 205

Leu Tyr Tyr Thr Glu Ser Gly Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Gly Val

210 215 220

Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Lys Leu Thr Pro Thr Ser Leu Thr Ala Glu

225 230 235 240

Gln Gln Ala Lys Tyr Pro His Leu Lys Asp Ala Ala Ala Phe Ala Leu

245 250 255

Pro Ala Gly Gln Asp Leu Lys Pro Leu Leu Lys Gly Glu Leu Val Ala

260 265 270

Ile Gly Thr Asp Ala Asp Gly Ile Leu Gln Gly Ala Thr Leu Val Gln

275 280 285

Ser Ala Gly Ala Leu Asp Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Lys Leu

290 295 300

Ala Tyr Gly Ala Val Val Glu Gly Gly Asn Val Thr Phe Arg Leu Trp

305 310 315 320

Ala Pro Thr Ala Lys Ser Val Lys Leu Ala Leu Phe Asp Glu Gln His

325 330 335

Asn Ala Ile Gly Glu Arg Ala Met Thr Leu Asp Glu Ala Ser Gly Ser

340 345 350

Trp Ser Val Gln Gly Gly Ser Asp Leu Val Gly Lys Tyr Tyr Arg Tyr

355 360 365

Asp Ile Gln Val Tyr His Pro Val Ser Arg Lys Leu Glu Ser Tyr Gln

370 375 380

Val Thr Asp Pro Tyr Ser Leu Ser Leu Ala Met Asn Ser Glu Phe Ser

385 390 395 400

Gln Val Val Asp Leu Asp Asp Pro Ala Leu Lys Pro Asp Gly Trp Asp

405 410 415

Ser Leu Lys Ala Pro His Ser Gln Gln Asn Pro Ala Asp Ile Thr Ile

420 425 430

Tyr Glu Ala His Val Arg Asp Leu Thr Gly Asn Asp Ala Ser Thr Asp

435 440 445

Ala Glu Lys Arg Gly Lys Phe Leu Gly Leu Thr Gln Pro Asp Ser Val

450 455 460

Pro Val Lys His Leu Gln Ser Leu Ala Lys Ser Gly Val Ser His Leu

465 470 475 480

His Leu Leu Pro Val Phe Asp Ile Ala Thr Val Asn Glu Asp Pro Ala

485 490 495

Lys Val Ala Asn Ile Gly Asp Asp Phe Ser Lys Leu Cys Glu Val Asn

500 505 510

Ala Glu Val Lys Asn Ser Lys Phe Ala Ser His Cys Gly Gly Gly Gln

515 520 525

Thr Ile Glu Ala Val Leu Ala Asp Leu Gln Ala Ser Asp Ser Lys Glu

530 535 540

Asn Pro Val Val Gln Glu Leu Tyr Gly Tyr Leu Arg Gly Val Asp Ser

545 550 555 560

Phe Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Tyr His Tyr Thr Thr Pro Glu Gly Ser

565 570 575

Tyr Ala Thr Asp Ala Glu Gly Thr Thr Arg Ile Lys Glu Phe Arg Glu

580 585 590

Met Val Met Ala Ile Lys Gln Asn Ile Gly Met Asn Val Val Met Asp

595 600 605

Val Val Tyr Asn His Thr Asn Glu Ala Gly Leu Gly Pro Lys Ser Val

610 615 620

Leu Asp Lys Ile Val Pro Trp Tyr Tyr Gln Arg Leu Asn Pro Glu Thr

625 630 635 640

Gly Ser Val Glu Asn Ser Thr Cys Cys Ser Asn Thr Ala Pro Glu His

645 650 655

Ala Met Phe Ala Lys Leu Met Asp Asp Ser Leu Val Thr Trp Ala Arg

660 665 670

Asp Tyr Lys Ile Asp Ala Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly His His Pro

675 680 685

Lys Asp Gln Met Val Gln Ala Leu Ala Glu Val Lys Lys Val Asn Pro

690 695 700

Asp Met Tyr Phe Tyr Gly Glu Gly Trp Asn Phe Gly Glu Val Gln Asp

705 710 715 720

Asp Lys Arg Phe Val Gln Ala Thr Gln Lys His Leu Ala Gly Thr Gly

725 730 735

Ile Gly Ser Phe Ser Asp Arg Leu Arg Asp Ala Val Arg Gly Gly Ser

740 745 750

Pro Ser Asp Gly Gly Asp Ala Ile Arg Lys Thr Gln Gly Phe Gly Asn

755 760 765

Gly Ala Leu Val Asp Ala Asn Glu Val Asp Gly Val Asp Leu Ala Thr

770 775 780

Ala Leu His Gln Ser Asp Leu Val Arg Leu Gly Met Ala Gly Asn Leu

785 790 795 800

Lys Glu Phe Val Leu Thr Asp Lys Asp Gly Val Pro Lys Lys Gly Ser

805 810 815

Asp Ile Asp Tyr Asn Gly Gln Pro Ala Gly Tyr Ala Gln Asp Pro Thr

820 825 830

Glu Ile Gln Asn Tyr Val Asp Lys His Asp Asn Gln Thr Leu Phe Asp

835 840 845

Asn Leu Val Tyr Lys Ala Pro Ala Gly Ala Asp Leu Val Arg Met Gln

850 855 860

Gly Val Ser Leu Ala Thr Ala Met Leu Gly Gln Gly Ile Pro Phe Thr

865 870 875 880

His Ala Gly Val Glu Leu Leu Arg Ser Lys Ser Met Glu Arg Asp Ser

885 890 895

Tyr Asp Ser Gly Asp Trp Tyr Asn Arg Val Asp Tyr Thr Leu Gly Asp

900 905 910

Asn Asn Phe Asp Lys Gly Leu Pro Arg Lys Asp Lys Asp Glu Ala Asn

915 920 925

Tyr Glu Leu Ile Glu Gln Val Leu Gly Gln His Ala Lys Pro Gly Ser

930 935 940

Ala Glu Met Ala Gln Met Val Ser Phe Tyr Gln Glu Leu Ser Glu Leu

945 950 955 960

Arg Gln Ser Ser Arg Leu Leu Arg Leu Gly Ser Gly Ala Glu Val Ile

965 970 975

Lys Arg Val Asp Phe Arg Asn Thr Gly Pro Asp Gln Thr Pro Gly Leu

980 985 990

Ile Val Met Thr Val Asp Asp Gly Ser Lys Ala Gly Ala Asp Leu Asp

995 1000 1005

Pro Ala Ile Asp Gly Leu Val Val Met Ile Asn Ala Thr Ser Gln

1010 1015 1020

Ser Gln Ser Ile Gly Asp Phe Arg Asp Gly Asp Asp Gln Pro Ile

1025 1030 1035

Asp Leu Ser Gly Leu Val Leu Ser Gly Ala His Arg Asp Val Asp

1040 1045 1050

Ser Ile Ala Ser Gly Ala Ala Val Gly Asn Gly Glu Leu Thr Leu

1055 1060 1065

Gly Ala Trp Ser Ala Ala Val Phe Val Lys Pro Gln Asn Gly Ala

1070 1075 1080

Gln Gly Ala Gly Leu Pro Val Ser Lys Lys Thr Asp Leu Ser Thr

1085 1090 1095

Leu Pro Pro Phe Gly Asp Thr Glu Val Phe Val Arg Gly Phe Leu

1100 1105 1110

Gly Ala Trp Asp Pro Val Asn Lys Met Ser Phe Ser Gly Asn Tyr

1115 1120 1125

Thr Tyr Glu Phe Thr Thr Glu Val Thr Thr Asp Gln Leu Gly Thr

1130 1135 1140

Thr Gln Val Lys Ile Ala Gly Ser Asp Trp Gly Gly Pro Val Asn

1145 1150 1155

Tyr Gly Lys Cys Ser Asp Thr Asp Gln Leu Ala Thr Gly Gln Val

1160 1165 1170

Ser Ala Leu Cys Ala Asn Gly Gly Asp Leu Pro Phe Asn Val Asp

1175 1180 1185

Lys Ala Gly Thr Tyr Arg Phe Val Phe Thr Ala Met Asn Lys Asp

1190 1195 1200

Lys Pro Thr Leu Ser Val Ser Phe Thr Glu Pro Val Gln Ser Cys

1205 1210 1215

Lys Val Leu Asp Thr Val Ala Gly Asn Pro Leu Gly Tyr Asn Leu

1220 1225 1230

Phe Ile Lys Gly Glu Leu Ser Gly Trp Asn Pro Gln Pro Gln Tyr

1235 1240 1245

Gln Leu Ser Tyr Lys Gly Met Glu Gly Asp Leu Ala Ile Tyr Gln

1250 1255 1260

Val Ala Phe Asn Tyr Asn Gly Thr Thr Glu Phe Lys Val Ala Asn

1265 1270 1275

Glu Asp Trp Ser Lys Glu Tyr Leu Ile Asn Gly Gly Gly Glu Val

1280 1285 1290

Gln Ala Glu Thr Gly Tyr Pro Phe Ala Phe Ser Gln Pro Ala Ser

1295 1300 1305

Ala Asn Asn Lys Ile Thr Leu Pro Gln Gly Leu Trp Ser Val Leu

1310 1315 1320

Val Lys Val Asp Pro Ala Ala Ala Lys Pro Gly Thr Ala Val Ile

1325 1330 1335

Gln Glu Cys Arg Ala Lys

1340

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggatatga aaaagaccaa agtggcg 27

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cttgrcrckg cactcctgra tsacrgcrgt acc 33

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cccgaattct gtaacgacaa cagttcttca ccctcc 36

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cccgcggccg cccccaagaa gccacggaca aaca 34

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cccgaattca aggtggtctt cagcgatcac cc 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cccgcggccg ccttggcacg gcactcctgg at 32

Claims

1.一种来源于气单胞菌属的普鲁兰酶编码基因，其特征在于编码I型普鲁兰酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，记为 pluAs。

2.如权利要求1所述的普鲁兰酶编码基因，其特征在于所述编码的I型普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

3. 具有I型普鲁兰酶活性的DNA片段，其特征在于分别是：SEQ ID NO 2的第22～1114位氨基酸，记为PluAs-1，蛋白预测大小117 KDa；SEQ ID NO 2的第149～1344位氨基酸，记为PluAs-2，蛋白预测大小129 KDa；SEQ ID NO 2的第149～1114位氨基酸，记为PluAs-3，蛋白预测大小104 KDa。

4. 含有如权利要求3所述具有I型普鲁兰酶活性的DNA片段的核苷酸编码序列的重组质粒，其特征在于由含有所述DNA片段的核苷酸编码序列克隆至载体pET21a的多克隆位点而获得，分别记为pET21a-PluAs-1、pET21a-PluAs-2、pET21a-PluAs-3。

5. 一种重组表达具有活性的I型普鲁兰酶的方法，其特征在于，所用的表达系统是大肠杆菌表达系统，或者是酵母表达系统。

6. 如权利要求4所述的重组表达的I型普鲁兰酶片段在淀粉加工、环保、食品、或医疗保健中的应用。