CN110373403A

CN110373403A - 耐高温中性普鲁兰酶及其应用

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Publication number: CN110373403A
Application number: CN201910764525.5A
Authority: CN
Inventors: 俞峰; 刘校函; 丁少明
Original assignee: BAIYIN SAINUO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BAIYIN SAINUO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2039-08-19
Also published as: CN110373403B

Abstract

本发明提供了一种耐高温中性普鲁兰酶及其应用。通过构建各种表达载体并转化相关菌株，从而获得了多种工程菌株，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌表达菌株。采用这些工程菌可以有效的表达耐高温中性普鲁兰酶。本发明提供的重组宿主细胞包括具有上述编码基因的重组表达载体。根据本发明的中性普鲁兰酶最适温度高于65℃，pH范围5.5‑7.0，热稳定性好，适于工业上应用的要求，具有较高的经济效益和社会效益。

Description

耐高温中性普鲁兰酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术及食品领域，具体涉及一种耐高温中性普鲁兰酶及其应用。

背景技术

普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)是一种解支酶，能够专一性切开普鲁兰糖、可溶性淀粉、支链淀粉和一些寡聚糖中的α-1,6-糖苷键。普鲁兰酶是非常理想的解支酶，它属于糖苷水解酶13家族(GH13)，根据水解糖苷键的类型的不同和产物的差异，可以将普鲁兰酶分为五类(表1)。

表1普鲁兰酶的分类

普鲁兰酶既可以单独使用，亦可与其它酶如葡糖淀粉酶配合使用以收到良好的效果。目前已广泛地应用于高葡萄糖浆、高麦芽糖浆和啤酒生产中。普鲁兰酶能专一性地催化断裂支链淀粉中的α-1,6-糖苷键的性质，决定了它在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新的产品方面有着相当巨大的价值，在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。具体到啤酒行业，普鲁兰酶能够使原料中的淀粉等分解完全，从而降低麦芽汁中极限糊精的含量，增加可发酵糖含量，进而提高发酵度。近期兴起的干爽啤酒，其主要特色就是发酵度高，一般获得这样高的发酵度，在前期糖化阶段就必须要添加外源普鲁兰酶。

普鲁兰酶可以分解最小单位的支链淀粉，突破其他淀粉酶无法水解极限糊精的障碍，所以它与其他淀粉酶协同作用时，能够大大提高淀粉原料的利用率。最近十年，有许多的极端嗜高温菌被学者们分离出来，他们甚至可以生长在沸水中，最高生长温度在105℃左右，这类生物包括Pyrobaculum、Pyrococcus、Pyrodictium以及Methanopyrus等种属。这些从极端微生物中产生分离而得到的普鲁兰酶展示了非常与众不同的特性：比如热稳定性高，且一般能较好地抵抗变性剂(化学)，例如表面活性剂、有机溶剂、高酸高碱环境等，其催化功能也优于目前已在各种工业生产中使用的酶。

普鲁兰酶是由Bender和Wallenfals在Aerobacter aerogenes(Klebsiellapneumoniae)中发现的，但至今能够工业化的菌株极少，丹麦诺维信公司的产品Promozyme几乎占领了全世界95％的市场份额，且目前国内仍没有任何厂家能够自己生产普鲁兰酶，因此，其价格昂贵在所难免。一方面国内淀粉资源精良丰富，另一方面食品、发酵工业、医药工程及食品行业对水解糖的需求量依然很大，所以，研究、开发并生产属于我们自己的性质优良的普鲁兰酶、并寻找国产化生产道路、改变对进口产品依赖的现状势在必行。嗜热土芽孢杆菌属(Geobacillus)是从芽孢杆菌属中独立出来的一类菌株，由于其可以产生大量的代谢酶类，近年来受到人们的广泛关注。其中多糖水解酶是其产生的重要酶类之一，包括果胶裂解酶、葡聚糖酶、木葡聚糖酶等。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐高温中性普鲁兰酶及其编码基因。

本发明提供的耐高温中性普鲁兰酶的编码基因如下：

(a)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；或者，

(b)具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少80％同源性的序列，优选地，具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少90％同源性的序列。

上述(b)中的耐高温中性普鲁兰酶可通过将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的一个或者多个特异位点的一个或者多个特异氨基酸残基的替换、插入、缺失或者截短而获得，例如通过对其编码基因进行定点突变、或者定向进化而得到，或者通过在5’端或3’端加上或去掉具有特殊功能的多肽序列而得到。

本发明提供的耐高温中性普鲁兰酶的氨基酸序列如下：

(1)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；

(3)具有与所述SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列，优选地，具有与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列至少80％同源性的序列，进一步优选地，具有与SEQ IDNO.2所示核苷酸序列至少90％同源性的序列。

本发明提供一种包括上述编码基因的重组表达载体。

所述重组表达载体为在毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点间插入上述编码基因而得到的重组表达载体。

所述重组表达载体为在枯草芽孢杆菌表达载体pHT43的多克隆位点间插入上述编码基因而得到的重组表达载体。

本发明提供一种包括根据上述重组表达载体的重组菌株。

所述重组菌株是将上述重组表达载体转入到毕赤酵母KM71中得到的重组菌株。

所述重组菌株是将上述重组表达载体转入到枯草芽孢杆菌WB800N中得到的重组菌株。

本发明提供了一种来源于Geobacillus thermocatenulatus(Geobacillusthermocatenulatus GSMZ730)的普鲁兰酶基因和蛋白质氨基酸序列。根据本发明的普鲁兰酶最适温度70℃，最适pH值5.5-7.0，且热稳定性好，适于工业上应用的要求。本发明得到的重组宿主细胞，适于上述耐高温中性普鲁兰酶的表达，通过摇瓶诱导表达，其中KM71蛋白表达量即可达到0.7g/L，因此具有产业化应用前景。该重组普鲁兰酶pH范围偏酸性接近中性，填补了目前酸性普鲁兰酶pH值范围的缺陷，在葡萄糖、麦芽糖、氨基酸及啤酒生产等工业领域中具有较高的潜在应用前景。

附图说明

图1a～1b为Geobacillus thermocatenulatus(Geobacillus thermocatenulatusGSMZ730)原始菌普鲁兰酶筛选鉴定。

图2为耐高温中性普鲁兰酶基因全长DNA电泳图。

图3a～3b为工程菌产耐高温中性普鲁兰酶蛋白电泳。

图4为重组酶最适温度曲线。

图5为重组酶最适pH曲线。

图6a～6d为重组酶产物TLC及HPLC分析。

具体实施方式

为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1普鲁兰筛选培养基透明圈实验及原始菌普鲁兰酶验证

1.1普鲁兰筛选培养基透明圈实验

用原始菌株适用的YPD培养基培养富集菌株后，使用穿刺接种的方法，将原始菌种穿刺接种到已经配制好的普鲁兰酶筛选培养基的培养皿上(普鲁兰酶筛选培养基：普鲁兰多糖3.0g；蛋白胨5.0g；KH₂PO₄ 0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.1g；琼脂20.0g，去离子水定容至1000mL，pH6.0)，将接种后的培养名在37℃培养30h左右，若观察到菌落大小明显后，则把培养皿从培养箱里取出。因为筛选培养基中含有普鲁兰多糖，所以会使得固体培养基具有浑浊、不透明的培养基背景。如果待筛选菌落产生了能够分解普鲁兰多糖的酶，则在乙醇浸泡该培养基的情况下，可以使得水解了普鲁兰多糖的固体培养基部分呈现出透明的区域，称之为透明圈。将从培养箱里取出的培养皿用乙醇静置浸泡培养皿中的培养基30min后，倒掉乙醇，若在接种出可以看到透明圈，则说明该菌株具有能够产生普鲁兰酶的能力，产生的透明圈越大，说明该菌株具有的产生水解普鲁兰多糖的酶的能力越大，结果如图1a。

1.2原始菌株在其最适温度下的生长曲线及原始菌酶活曲线

把复苏好的菌株接种在液体培养基里，在最适温度的生长温度下(60℃)，200rpm振荡培养，前密后稀隔时间取样，用OD600测定菌浓，并测定发酵液上清普鲁兰酶酶活。使用origin绘制出原始菌株的生长及酶活曲线，结果如图1b。

实施例2耐高温中性普鲁兰酶的扩增

2.1菌株及其培养

从德国菌种保藏中心GSMZ购得Geobacillus thermocatenulatus(GSM NO.730)。用M1培养基60℃培养过夜。

M1培养基：蛋白胨5.0g，酵母提取物3.0g(若需要配成固体培养基，加入15.0g琼脂糖)，最后加入去离子水定容到1000mL。调整pH至7.0，对于芽孢杆菌菌株，建议添加10.0mgMnSO4·7H2O用于孢子形成。

2.2基因组提取

参照Omega细菌基因组提取试剂盒说明书

2.3引物合成及PCR反应

以提取的基因组为模版进行PCR，以提取基因，体系50μL，各组分如下：

PCR反应条件如下：

PCR扩增结果如图2所示。

2.4序列测定

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-T Simple，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序得到Geobacillus thermocatenulatus GSMZ730普鲁兰酶序列，即开放阅读框。

其中，普鲁兰酶基因全场DNA电泳图如图2所示。

将测序结果在GenBank上进行比对并分析表明，所获得的普鲁兰酶基因DNA由2157个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO.1所示。

通过NCBI Blastn比对，通过上述方法获得的普鲁兰酶序列，与Geobacillus属其他菌种普鲁兰酶基因有80-90％的同源性。测序结果显示该普鲁兰酶基因一共可以编码718个氨基酸，经转录翻译后，得到的蛋白(PulN)序列如SEQ ID NO.2下。

实施例3含有耐高温中性普鲁兰酶基因的毕赤酵母重组表达载体的构建及其转化

3.1引物设计

根据普鲁兰酶序列及毕赤酵母表达载体序列设计引物如下：

Pul-730-Ppic9k-U CCGGAATTCATGCTTCACATCAGCCGAACGT

Pul-730-Ppic9k-D ATTTGCGGCCGCTTAAGCGTCCGTTTTGACGAGCA

3.2重组表达载体构建

以连有普鲁兰酶基因开放阅读框的pMD19-T Vector为模板，用3.1所示引物进行PCR扩增；将PCR产物EcoRI、NotI酶切，然后与同样经EcoR I、NotⅠ酶切的酵母表达载体pPIC9k连接，筛选，得到重组质粒(pPIC9KR.pGLA)。

3.3毕赤酵母感受态细胞的制备

(1)将酵母接种YPD液体培养基，30℃培养至OD 1～2A(600nm)；

(2)将培养液6000rpm，4℃离心3Min，收集菌体；

(3)用8ml缓冲液(100mM LiAc，10mM DTT，0.6M山梨醇，10mM pH 7.5Tris-HCl)重悬菌体，室温静置30Min；

(4)6000rpm，4℃离心5min，收集菌体；

(5)用2～3ml 1M山梨醇洗涤菌体，重复两次；

(6)用适量1M山梨醇重悬菌体，使细胞浓度为10^10个/ml，静置冰上，待用。

3.4重组表达载体的转化

(1)将100ul重组质粒(9KPul)用SacI线性化酶切，用Takara核酸共沉剂进行浓缩，用10ul的无菌超纯水溶解质粒；

(2)将10ul的上述质粒与100ul的酵母感受态细胞混合，转入预冷的电极杯中，进行电击，迅速加入1ml预冷的1M山梨醇，转移至30℃培养箱中静置1h，涂布MD板。

3.5高拷贝转化子的筛选

将MD平板长出的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布分别含有1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml G418的YPD平板，置于30℃培养箱中培养。在含有高浓度G418的YPD平板生长出的转化子即认为含有高拷贝普鲁兰酶基因。

实施例4毕赤酵母重组菌的诱导表达

4.1在3.5所述含G418的YPD平板上挑取重组菌的单克隆，接种YPD液体培养基，30℃，200rpm培养24h。

4.2将上述种子培养液接入BMGY培养基，30℃，200rpm培养24h。

4.3培养至OD 6.0，6500rpm，离心5min收集菌体，转移至BMMY培养基，225rpm,，30℃诱导表达，每24h加100％甲醇至终浓度0.5％。

4.4诱导120h，离心收集上清，测酶活，测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳。

如图3a～3b所示，蛋白电泳显示Geobacillus thermocatenulatus(Geobacillusthermocatenulatus GSMZ730)普鲁兰酶毕赤酵母KM71重组菌诱导表达的蛋白电泳图。

本发明构建的毕赤酵母重组菌蛋白表达达到0.7g/L(考马斯亮蓝染色法测定)，且几乎没有其它杂蛋白，有利于后续纯化。

实施例5含有耐高温中性普鲁兰酶基因的枯草芽孢杆菌重组表达载体的构建及表达

本实验还将该普鲁兰酶基因放在枯草芽孢杆菌中进行了表达。普鲁兰酶已经广泛地应用于食品、淀粉糖等工业中，作此应用时，要求普鲁兰酶的生产菌为食品级安全微生物。枯草芽孢杆菌属于食品安全级微生物，适于作为普鲁兰酶的生产菌。

本实验所用的表达质粒是pHT43为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。pHT43是诱导型载体，有一个强启动子P_grac，它是将groESL这个启动子融合在乳糖操纵子的下游得到的，所以可以用乳糖替代物IPTG进行诱导表达。将普鲁兰酶基因连接在启动子P_grac的下游，并转化到枯草芽孢杆菌WB800N中进行诱导表达。诱导后的培养液上清进行SDS-PAGE分析。

5.1引物设计

根据该普鲁兰酶基因序列及表达质粒序列设计引物如下：

pHT43-pul-U：GTCGGATCCATGCTTCACATCAGCCGAACGTTTG

pHT43-pul-D：CGTCCCGGGTCAAGCGTCCGTTTTGACGAGCACC

5.2Bacillus subtilis感受态的制备及电转化

生长培养基：包含0.5M Sorbitol的LB液体培养基；

电转培养基：0.5M trehalose,0.5M sorbitol,0.5M mannitol和10％v/vglycerol；

复苏培养基：包含0.5M sorbitol和0.38M mannitol的LB液体培养基。

(1)挑取Bacillus subtilis单菌落过夜培养后转接到50ml生长培养基中，控制菌体终浓度OD₆₀₀＝0.01；

(2)在37℃摇床中继续培养至对数生长期OD₆₀₀＝0.85-1，收集菌体将细胞在冰上冷却5分钟，然后在5000rpm的转速下离心10分钟，弃上清液保留沉淀；

(3)用预冷的电转培养基清洗细胞4次，然后将沉淀细胞悬浮在1/80体积比的电转培养基中，分成每管100μl在-40℃冰箱中保存备用；

(4)向100μl体积的感受态细胞中加入10μl体积的目的DNA，混合均匀后转移到0.2cm的电转杯中，在冰上冷却5分钟，设置电转仪参数为25μF和200Ω，电击后(电击时间应显示为5-5.8ms)立即向电转杯中加入1ml的复苏培养基，在37℃下培养3-6小时，然后吸取适当体积的转化液涂布到包含20μg/ml卡那霉素的抗性平板上，次日检查转化子。

实施例6葡萄糖标准曲线及普鲁兰酶酶活测定

取干净试管将试管标号，配制葡萄糖浓度梯度溶液，分别向试管中加入0.2-1.4mL(以0.2mL为间隔)的0.1％的葡萄糖溶液，以不加葡萄糖的试管做空白对照。每管做三个平行样品。分别向试管中补ddH₂O至总体积为2.0mL，再向试管中加入3mL DNS试剂，煮沸15min，立即加入10mL ddH₂O并预冷，在波长550nm处用分光光度计比色测量，并记下各试管对应的样品的光密度值再求其平均值，再绘制葡萄糖标准曲线。

按照文献方法，用DNS终止法来测量重组普鲁兰酶的酶活。

(1)适当稀释粗酶液(可做稀释梯度)，取75μL于试管中，并用煮沸10min灭活的粗酶液样品做空白对照。

(2)向每个试管中加入175μL柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)。混匀。

(3)加入250μL浓度为10％的普鲁兰多糖(Sigma)溶液。混匀。

(4)40℃下反应20min。

(5)从40℃水浴中取出，立即加入750μL DNS试剂终止反应，沸水浴中煮沸15min后迅速置于冰上。

(6)将上述各反应样品在550nm吸光度出测量其观密度值(用空白对照试管的样品调零分光光度计)。

普鲁兰酶酶活定义为：在所选取的条件下，每分钟分解普鲁兰多糖产生的还原糖，其还原力相当于1μmol葡萄糖所需要的酶量，以1U表示。

实施例7重组普鲁兰酶酶学性质测定

本实验探究了温度与pH对重组蛋白酶的影响，分别研究了酶的最适反应温度，最适pH，温度耐受性和pH耐受性。利用单一变量法进行测定(OVAT)。测量酶的最适反应温度时，选择pH7.0，温度梯度设置为40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，以测得的最大酶活为100％，计算其他温度酶活相对值，结果如图4所示。

测量最适pH时，选择的反应温度是70℃。利用不同的缓冲液体系进行反应，测量每个样品的酶活。缓冲液配方分别是pH3.5-pH6.0：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH6.0-pH7.5：100mM磷酸盐缓冲液；pH7.5-8.5：50mM Tris-HCl缓冲液。以最大酶活值为100％，计算其他pH下的相对酶活。测量pH耐受性时，也选择温度为70℃，预先将酶在不同的pH体系保温24小时后，再进行反应测量其残余酶活，以未保温的初始酶活力为100％，计算在不同pH缓冲体系中保温24h后的相对酶活，结果如图5所示。

实施例8重组普鲁兰酶产物底物分析

8.1重组普鲁兰酶降解底物底物谱分析

根据普鲁兰酶底物特异性和不同底物的产物情况，可以将普鲁兰酶分为如下几大类：I型普鲁兰酶，II型普鲁兰酶，普鲁兰水解酶I，普鲁兰水解酶II以及普鲁兰水解酶III。分析其底物特异性，是普鲁兰酶分类的必要条件之一。且不同来源的同种普鲁兰酶，对其能催化的底物的催化能力也存在很大差异。本实验分别用重组蛋白酶的纯酶催化不同底物，以催化普鲁兰多糖的酶活为100％，测量催化其他底物时的相对酶活。每种底物都设失活酶液催化的样品为空白对照(排除底物本身不稳定性)。实验中所应用的底物有：普鲁兰多糖，可溶性淀粉，直链淀粉，支链淀粉，动物糖原，α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精。

8.2降解不同底物的产物分析

为了分析酶解不同底物得到的产物情况，可做高效液相色谱或利用薄层层析法鉴定，结果如图6a～6d所示。

(1)TLC法

取75μL纯酶液与250μL 1％的普鲁兰多糖/可溶性淀粉/直链淀粉/动物糖原/α-环糊精混合，在pH6.0、温度35℃的条件下进行反应，以不含酶液(PBS缓冲液补足体积)的样品为对照。反应三小时后，取出样品在沸水中煮沸5min，12,000rpm离心5-10min，取上清进行薄层色谱分析。色谱粘层时间约为两小时，展层结束后，将薄层层析板从展层杯中拿出，浸润在显色剂中，再立即用吹风机吹干。放入85℃的烘箱显色15min，即可看到产物的斑点。

(2)高效液相色谱

取150μL纯酶液、350μL pH6.0的PBS缓冲液与500μL 1％的普鲁兰多糖/可溶性淀粉/直链淀粉/动物糖原混合，在35℃的条件下进行反应，反应3小时后，将样品取出，在沸水中煮沸5min，12,000rpm离心10min，再用体积为500μL的10kDa的超滤浓缩管处理样品，除去残余的大分子物质。将超滤后的样品装入液相小瓶。流动相为乙腈：水＝80：20(v：v)，流速0.8mL/min，进样量20μL，调节柱温为45℃，示差检测器为40℃。

综上所述，采用本发明的重组工程菌株可以实现新型耐高温中性普鲁兰酶的规模化工业生产，该中性普鲁兰酶在麦芽糖生产、氨基酸生产、啤酒生产等糖工业中具有较高的潜在应用价值。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110> 白银赛诺生物科技有限公司

<120> 耐高温中性普鲁兰酶及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2157

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcttcaca tcagccgaac gtttgccgcc tatttggacg agatggatca aatcgttgtg 60

cttgcgccga aatcgctcgg ctttgatggg atggcgccgt tgacgctcgt agcgccgagc 120

ggcgaggaga ttccgctgtc cgtgcagcac gtcgaggatt gcggggagac ggtgaaatat 180

gtgtgccggt ttgcatccgc gttcgagttt ggagcgacat actgggtgcg ttcttgccgc 240

ggggaggaga ccgatgttca aatcggcgcc gttgtgcgca ctcctgcatt tgatgatcgg 300

tttttctatg atgggccgtt aggcgtggag tattccaaag aacaggcggt atttcgcgta 360

tgggcgccga ctgccaccgc ggtcaacgtc aagcttgttc atccgcatct cggcgagatc 420

cgctgcgtgc cgcttgagcg cggcgagtgc ggcgtatggt cagccgccgt ccccggcgat 480

tgggaacgag cgtgttacac gtatatcgcc tgcatcaacc gcgtatggcg cgaggcggtg 540

gacccgtatg caactgctgt gtcgatcaat ggcgagttcg gcgtcgtgat cgactgggag 600

aaaacgaagc tgacgccgcc ctcttcgccg tgtccgccgc tctgttcgcc gacggatgcc 660

atcctttatg aactgcatat ccgcgacttt acaagccatc cggacagcgg cgccgtccat 720

aaagggaagt atctcgggtt ggctgaaacg aacacaagcg ggccaaacgg gacggccact 780

gggctttcgt atgtcaaaga gctgggcgtc acccatgtgc agctcatgcc gtttatggac 840

tttgcaggcg ttgatgagcg cgacccacaa gcagcataca actggggata caatcccaga 900

catctatatg cgccgattgg gagttatgcg accgatccag cggatccata cgcacgcatt 960

gtagaattga agcaggcgat ccacacgctg cacgaaaatg gattgcgcgt cgtgatggat 1020

gcggtctaca accatgtcta cgatcgggag caatcgccgc ttgagaagct cgttcccggc 1080

tattacttcc gctacgacgc ctatggccaa ccggccaacg gcacaggcgt cggcaacgac 1140

atcgcttcgg agcggcggat ggcgcgccgt tggatcgtcg attcggttgt gttttgggcg 1200

aaagaatacg gccttgatgg gttccgcttt gatttgatgg gcgtgcacga tatcgagacg 1260

atgaaggcgg tgcgcgatgc cctcgacacc atcgatccat cgatccttgt gtatggggaa 1320

gggtgggact tgccgacacc ccttccgccg cgtcaaaagg cgacgatggc caacgccaat 1380

cagttgccgc gcttcgcgta ttttaatgac gaatttcgcg atgcggtgaa agggagcacc 1440

tttcatttgc cggatcgggg attcgccctc ggcaacccag gccctcgaga acaggtgaag 1500

ctcgccattg ccgggagctt gcgagcgctc ggcgggctgt tttgccaccc gcgtcagtcg 1560

atcaattacg tcgaatgcca tgacaaccat acgttttggg ataagatgga ggcggccaac 1620

catgatgagc cggaatggct ccggcggaag cggcaaaagc tggcgacggc gatcgttctg 1680

ttggcgcaag gcattccgtt tttgcacagc ggccaagagt tttatcggac gaaaggcggc 1740

gatgggaaca gctaccgatc gccggatgcg gtcaatcagc tggattgggg gcggaaaagc 1800

cgctatgaag acgacgtccg ctacgttcaa ggattgatcg ctcttcgccg cgcgcatggc 1860

gcgttccgcc tcgccacgga agcggaagtg ctgcgccatt tgacgtttct tgagccgctg 1920

ccgccctcgg tcatcgccta ccgattgcat gatgtcgccg tctatgggcc atgggatgag 1980

atcatcgttc ttcatcataa cgaagaaaaa aaagaggcca tccaccttcc agacgaacgg 2040

gaatgggaca tcgtatgcga cggacagcgg agcggagcgg cgccgtttcg ccgagtgcgt 2100

ggcaggcttg agcttgacgg cattggcaca tgggtgctcg tcaaaacgga cgcttga 2157

<210> 2

<211> 718

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu His Ile Ser Arg Thr Phe Ala Ala Tyr Leu Asp Glu Met Asp

1 5 10 15

Gln Ile Val Val Leu Ala Pro Lys Ser Leu Gly Phe Asp Gly Met Ala

20 25 30

Pro Leu Thr Leu Val Ala Pro Ser Gly Glu Glu Ile Pro Leu Ser Val

35 40 45

Gln His Val Glu Asp Cys Gly Glu Thr Val Lys Tyr Val Cys Arg Phe

50 55 60

Ala Ser Ala Phe Glu Phe Gly Ala Thr Tyr Trp Val Arg Ser Cys Arg

65 70 75 80

Gly Glu Glu Thr Asp Val Gln Ile Gly Ala Val Val Arg Thr Pro Ala

85 90 95

Phe Asp Asp Arg Phe Phe Tyr Asp Gly Pro Leu Gly Val Glu Tyr Ser

100 105 110

Lys Glu Gln Ala Val Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val

115 120 125

Asn Val Lys Leu Val His Pro His Leu Gly Glu Ile Arg Cys Val Pro

130 135 140

Leu Glu Arg Gly Glu Cys Gly Val Trp Ser Ala Ala Val Pro Gly Asp

145 150 155 160

Trp Glu Arg Ala Cys Tyr Thr Tyr Ile Ala Cys Ile Asn Arg Val Trp

165 170 175

Arg Glu Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Ser Ile Asn Gly Glu

180 185 190

Phe Gly Val Val Ile Asp Trp Glu Lys Thr Lys Leu Thr Pro Pro Ser

195 200 205

Ser Pro Cys Pro Pro Leu Cys Ser Pro Thr Asp Ala Ile Leu Tyr Glu

210 215 220

Leu His Ile Arg Asp Phe Thr Ser His Pro Asp Ser Gly Ala Val His

225 230 235 240

Lys Gly Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Glu Thr Asn Thr Ser Gly Pro Asn

245 250 255

Gly Thr Ala Thr Gly Leu Ser Tyr Val Lys Glu Leu Gly Val Thr His

260 265 270

Val Gln Leu Met Pro Phe Met Asp Phe Ala Gly Val Asp Glu Arg Asp

275 280 285

Pro Gln Ala Ala Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Arg His Leu Tyr Ala

290 295 300

Pro Ile Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Ala Asp Pro Tyr Ala Arg Ile

305 310 315 320

Val Glu Leu Lys Gln Ala Ile His Thr Leu His Glu Asn Gly Leu Arg

325 330 335

Val Val Met Asp Ala Val Tyr Asn His Val Tyr Asp Arg Glu Gln Ser

340 345 350

Pro Leu Glu Lys Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Phe Arg Tyr Asp Ala Tyr

355 360 365

Gly Gln Pro Ala Asn Gly Thr Gly Val Gly Asn Asp Ile Ala Ser Glu

370 375 380

Arg Arg Met Ala Arg Arg Trp Ile Val Asp Ser Val Val Phe Trp Ala

385 390 395 400

Lys Glu Tyr Gly Leu Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Val His

405 410 415

Asp Ile Glu Thr Met Lys Ala Val Arg Asp Ala Leu Asp Thr Ile Asp

420 425 430

Pro Ser Ile Leu Val Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Leu Pro Thr Pro Leu

435 440 445

Pro Pro Arg Gln Lys Ala Thr Met Ala Asn Ala Asn Gln Leu Pro Arg

450 455 460

Phe Ala Tyr Phe Asn Asp Glu Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr

465 470 475 480

Phe His Leu Pro Asp Arg Gly Phe Ala Leu Gly Asn Pro Gly Pro Arg

485 490 495

Glu Gln Val Lys Leu Ala Ile Ala Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gly Gly

500 505 510

Leu Phe Cys His Pro Arg Gln Ser Ile Asn Tyr Val Glu Cys His Asp

515 520 525

Asn His Thr Phe Trp Asp Lys Met Glu Ala Ala Asn His Asp Glu Pro

530 535 540

Glu Trp Leu Arg Arg Lys Arg Gln Lys Leu Ala Thr Ala Ile Val Leu

545 550 555 560

Leu Ala Gln Gly Ile Pro Phe Leu His Ser Gly Gln Glu Phe Tyr Arg

565 570 575

Thr Lys Gly Gly Asp Gly Asn Ser Tyr Arg Ser Pro Asp Ala Val Asn

580 585 590

Gln Leu Asp Trp Gly Arg Lys Ser Arg Tyr Glu Asp Asp Val Arg Tyr

595 600 605

Val Gln Gly Leu Ile Ala Leu Arg Arg Ala His Gly Ala Phe Arg Leu

610 615 620

Ala Thr Glu Ala Glu Val Leu Arg His Leu Thr Phe Leu Glu Pro Leu

625 630 635 640

Pro Pro Ser Val Ile Ala Tyr Arg Leu His Asp Val Ala Val Tyr Gly

645 650 655

Pro Trp Asp Glu Ile Ile Val Leu His His Asn Glu Glu Lys Lys Glu

660 665 670

Ala Ile His Leu Pro Asp Glu Arg Glu Trp Asp Ile Val Cys Asp Gly

675 680 685

Gln Arg Ser Gly Ala Ala Pro Phe Arg Arg Val Arg Gly Arg Leu Glu

690 695 700

Leu Asp Gly Ile Gly Thr Trp Val Leu Val Lys Thr Asp Ala

705 710 715

Claims

1.一种耐高温中性普鲁兰酶，其特征在于，所述的耐高温中性普鲁兰酶的编码基因如下：

(a)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；或者，

(b)具有与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少80％同源性的序列。

2.根据权利要求1所述的耐高温中性普鲁兰酶，其特征在于，所述的耐高温中性普鲁兰酶来源于嗜热菌属Geobacillus thermocatenulatus GSMZ 730。

3.根据权利要求1所述的耐高温中性普鲁兰酶，其特征在于，所述的耐高温中性普鲁兰酶的酶学特性为：最适温度65℃～70℃，最适pH5.5～7.0。

4.一种耐高温中性普鲁兰酶，其特征在于，所述的耐高温中性普鲁兰酶的氨基酸序列如下：

(1)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；或者，

(2)具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包括根据权利要求1所述的耐高温中性普鲁兰酶的编码基因。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为在毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点间插入所述的编码基因的重组表达载体。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为在枯草芽孢杆菌表达载体pHT43的多克隆位点间插入所述的编码基因的重组表达载体。

8.一种毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述的毕赤酵母重组菌以毕赤酵母为宿主，并包括权利要求6所述的重组表达载体。

9.一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌重组菌以枯草芽孢杆菌为宿主，并包括权利要求7所述的重组表达载体。

10.一种权利要求8所述的毕赤酵母重组菌或权利要求9所述的枯草芽孢杆菌重组菌在普鲁兰酶生产上的应用。