JP3025625B2 - アルカリα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアルカリα−アミラーゼ
活性を有するアルカリプルラナーゼをコードする遺伝
子、当該遺伝子の一部の発現によって得られるアルカリ
α−アミラーゼ及びこれをコードする遺伝子、並びにこ
れらの遺伝子を含む組換えＤＮＡ及び形質転換体に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】古くから醸造産業で穀類やイモ類の糖
化、繊維産業で澱粉糊抜き剤、医薬品産業で消化剤、食
品産業で水飴の製造等に広く利用されてきたα−アミラ
ーゼは、澱粉、アミロース、アミロペクチン等の澱粉系
多糖類の分子中のα−１，４グルコシド結合のみを切断
する酵素で細菌、黴類、植物の種子及び動物の消化腺な
ど多くの生物から結晶標品あるいは電気泳動的に均一な
標品として得られている。一方、プルラナーゼは、澱
粉、グリコーゲン、アミロペクチンあるいはプルラン分
子中に存在するα−１，６グルコシド結合のみを切断
し、最終的にマルトトリオースを生成する酵素であり、
アエロバクター アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の一菌株から発見され〔Ｂｅｎ
ｄｅｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｗａｌｌｅｎｆｅｌｓ，Ｋ．，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３４，７９（１９６１）〕、更
に、その後、バチルス ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ）等の多くの微生物から発見されている。
このプルラナーゼは、エンド型アミラーゼ及びエキソ型
アミラーゼと併用することにより、澱粉からグルコース
やマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース等のマル
トオリゴ糖を生産することができるので、澱粉製造工業
において注目されている酵素である。

【０００３】更に、この様な２種以上の酵素を用いた糖
の製造工程を簡略化するために、α−１，４グルコシド
結合に対しても反応する、すなわちα−アミラーゼ活性
を有するプルラナーゼの探索が行われてきた。枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＵ株〔Ｔａ
ｋａｓａｋｉ，Ｙ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５１，９（１９８７）、特公平１−１８７１７号
公報〕はプルラナーゼ−アミラーゼ複合酵素を生産する
ことが知られている。両酵素活性を有する単一酵素、所
謂アミロプルラナーゼとしては、バチルス サーキュラ
ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）〔特開
昭６４−６０３７６号公報〕の生産するアミラーゼ、バ
チルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）〔Ｓａ
ｈａ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒ
ｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，７６０（１９８
９）〕、サーモアンアエロビウム ブロキイ（Ｔｈｅｒ
ｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）〔Ｃｏｌ
ｅｍａｎ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，１６９，４３０２（１９８７）〕、サーモアン
アエロビウム エスピー（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂ
ｉｕｍ ｓｐ．）〔Ｐｌａｎｔ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．，２６，４２７（１９８７）〕、クロストリジ
ウム サーモハイドロスルフリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕ
ｍ）〔Ｓａｈａ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．，２５２，３４３（１９８８）〕、クロストリ
ジウム サーモスルフロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ）〔Ｓｐｒ
ｅｉｎａｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３，５１１（１
９９０）〕、サーマス アキュアティキス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）〔Ｐｌａｎｔ，Ａ．Ｒ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎ
ｏｌ．，８，６６８（１９８６）〕、サーマス エスピ
ー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）〔Ｎａｋａｍｕｒａ，
Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ，４
１，１１２（１９８９）〕、サーモアンアエロバクテリ
ウム サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕ
ｍ）〔Ｓａｈａ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６，８８１
（１９９０）〕、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及びサーモコッカス
リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓ）〔Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ Ｋｅｌｌ
ｙ，Ｒ．Ｍ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，５９，２６１４（１９９３）〕など数多く
の好（耐）熱性微生物で報告例がある。

【０００４】一方、ごく近年になって本発明者らは、α
−アミラーゼとプルラナーゼを共に食器洗浄剤及び衣料
洗浄剤に配合することによって、主に澱粉汚れに対する
洗浄力が飛躍的に向上することを明らかにした（特開平
２−１３２１９３号公報）。しかしながら、自然界にお
いて従来見出されているα−アミラーゼ及びプルラナー
ゼのほとんどが、中性ないし酸性領域において最大且つ
安定な酵素活性を示し、pH９〜１０のアルカリ性溶液中
ではほとんど作用しないものであった。アルカリ領域に
おいて最大活性を示すいわゆるアルカリプルラナーゼの
存在は、極めて少なく、わずかに中村ら〔Ｎａｋａｍｕ
ｒａ，Ｎ．ａｎｄ Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｋ．，Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３９７，１８８
（１９７５），特公昭５３−２７７８６号公報〕と荒ら
（特公平６−３２６１３号公報）によって報告されてい
るのみである。更にアルカリα−アミラーゼ活性とアル
カリプルラナーゼ活性を有した単一酵素（アミロプルラ
ナーゼ）に至っては、全く見出されていないのが実情で
あった。しかしながら、本発明者らがアルカリプルラナ
ーゼを生産する微生物を自然界に求めて鋭意探索を続け
たところ、生育の至適pHをアルカリ性領域に有する、い
わゆる好アルカリ性バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−ＡＰ１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ
−３０４８）がアルカリα−アミラーゼ活性を有する新
規なアルカリプルラナーゼＹを生産することを発見し、
本酵素が自動食器洗浄機用洗浄剤組成物並びに衣料用洗
浄剤組成物の添加成分として有用であることを明らかに
した（特開平３−２９０４９８号公報）。本酵素は一酵
素分子でありながらアルカリα−アミラーゼ活性及びア
ルカリプルラナーゼ活性の両者を有しており、本酵素の
利用は工業生産過程において、別々の菌体から２種各々
の酵素を生産する場合と比較して、菌体の培養あるいは
酵素の精製等に極めて効率的である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、アルカ
リプルラナーゼＹの生産菌であるバチルス エスピーＫ
ＳＭ−ＡＰ１３７８株に対して培養方法の検討による生
産性の向上を試みたが、本酵素を工業的に有利に実生産
するためには、更にその生産性を向上させることが必要
である。また、近年、遺伝子工学の手法を用いて酵素の
生産量を向上せしめることや、蛋白質工学的手法によっ
て当該酵素の遺伝子を改変して当該酵素の改良を行うこ
とも可能となっている。その為には当該酵素の遺伝子が
必要であるが、アルカリα−アミラーゼ活性を有するア
ルカリプルラナーゼ（アルカリアミロプルラナーゼ）を
コードする遺伝子は未だ取得されていなかった。

【０００６】従って、本発明の目的はアルカリアミロプ
ルラナーゼをコードする遺伝子、これを含有する組換え
ＤＮＡ及び当該組換えＤＮＡを保持する形質転換体を提
供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、好
アルカリ性バチルス属細菌の染色体ＤＮＡからアルカリ
アミロプルラナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片を取得すべく、ショットガンクローニングとＰＣＲ法
を併用することによってアルカリアミロプルラナーゼを
コードするＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を適
当なベクターに連結して微生物に導入したところ、得ら
れた組換え微生物がアルカリアミロプルラナーゼを生産
することが確認できた。更に、コードされるアルカリア
ミロプルラナーゼのアミノ酸配列がこれまでに知られて
いる他のアミラーゼやプルラナーゼとは全く異なり、酵
素分子のアミノ末端側がアルカリα−アミラーゼであ
り、カルボキシ末端側がアルカリプルラナーゼであると
いう特徴を有していることが明らかとなり、本発明を完
成した。

【０００８】すなわち、本発明は、配列番号１に記載の
アミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列に
対して１若しくは２以上のアミノ酸が置換、付加、欠
失、逆位若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ
アルカリα−アミラーゼ活性及びアルカリプルラナーゼ
活性を有する蛋白質（アルカリアミロプルラナーゼ）を
コードするＤＮＡ断片を提供するものである。

【０００９】また、本発明は配列番号３に記載のアミノ
酸配列からなるアルカリα−アミラーゼ及びこれをコー
ドするＤＮＡ断片を提供するものである。

【００１０】

【００１１】更に本発明は上記アルカリアミロプルラナ
ーゼ又はアルカリα−アミラーゼをコードするＤＮＡ断
片を有する組換えＤＮＡを提供するものである。

【００１２】更にまた、本発明は上記アルカリアミロプ
ルラナーゼ又はアルカリα−アミラーゼをコードするＤ
ＮＡ断片を有する組換えＤＮＡを保持する形質転換微生
物を提供するものである。

【００１３】本発明においてアルカリアミロプルラナー
ゼ遺伝子の供与体となる微生物としては、例えば、好ア
ルカリ性バチルスの１種、バチルス エスピー ＫＳＭ
−ＡＰ１３７８株を用いることができる。本菌株は、本
発明者らが、菌体外に著量のアルカリアミロプルラナー
ゼの１種であるアルカリプルラナーゼＹを生産する菌株
として栃木県栃木市の土壌より分離したものであり、微
工研条寄第ＢＰ−３０４８号として寄託されている。

【００１４】供与菌株から染色体ＤＮＡを得る方法とし
ては、例えばマーマーの方法〔Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２０８（１９６１）〕や
斉藤と三浦の方法〔Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｍｉｕｒ
ａ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，７２，６１９（１９６３）〕等が挙げられるが、他
の類似な方法を用いることもできる。

【００１５】かくして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素
で切断することによって、アルカリアミロプルラナーゼ
遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製することができるが、用
いる制限酵素の種類としては、当該遺伝子を分断しない
ものであれば、いかなるものでも使用できる。アルカリ
アミロプルラナーゼ遺伝子の取得法については、ＰＣＲ
法を用いることもできる。例えば、配列番号２に記載の
塩基配列を基にして必須領域の５′末端の上流及び３′
末端の下流位置にあたる配列のプライマーを合成し、ア
ルカリアミロプルラナーゼ生産菌の染色体ＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲ反応を行うことによってアルカリアミロプ
ルラナーゼ遺伝子を取得できる。あるいは、アルカリア
ミロプルラナーゼ生産菌より何らかの方法によってアル
カリプルラナーゼ遺伝子断片を取得した後、ＰＣＲ法に
よってその上流部分のアルカリα−アミラーゼ遺伝子断
片を増幅し、完全な遺伝子を取得する方法、反対にアル
カリα−アミラーゼ遺伝子を取得した後、ＰＣＲ法によ
ってその下流部分のアルカリプルラナーゼ遺伝子断片を
増幅し、完全な遺伝子を取得することもできる。

【００１６】こうして調製した当該遺伝子の断片をクロ
ーニングするが、この際用いる宿主・ベクター系として
は、宿主菌株が本発明のアルカリアミロプルラナーゼ遺
伝子を発現させることができ、また、組換えＤＮＡが宿
主菌中で複製可能であり、組み込んだ当該遺伝子を安定
に保持できるものであれば、いかなるものも使用するこ
とができる。例えば、大腸菌Ｋ−１２系統株を宿主とす
るＥＫ系や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）Ｍａｒｂｕｒｇ系統株を宿主とするＢＳ系等が挙げ
られるが、好適には、遺伝学的に最も良く研究されてお
り、ベクターの種類が豊富であるＥＫ系を用いると良い
結果が得られる。宿主菌株の具体例としては、ＥＫ系で
は、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＢＳ系
ではＢＤ１７０株、ＭＩ１１２株、ＩＳＷ１２１４株な
どが挙げられる。また、ベクターとしては、ＥＫ系では
ｐＢＲ３２２やｐＵＣ１８等のベクター、またＢＳ系で
はｐＵＢ１１０、ｐＨＹ３００ＰＬＫなどのベクターが
挙げられる。ベクターを制限酵素で切断し、上記の染色
体ＤＮＡ断片と結合させ、組換えプラスミドＤＮＡを作
成するが、結合の方法としては、例えばＤＮＡリガーゼ
によって結合させる方法等が挙げられる。

【００１７】組換えＤＮＡによる宿主菌株の形質転換の
方法は特に限定されないが、例えば、ＥＫ系宿主菌株の
場合、塩化カルシウム法〔Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ
Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５
９（１９７０）〕等、またＢＳ系宿主菌株の場合には、
プロトプラスト法〔Ｃｈａｎｇ，Ｃ．ａｎｄ Ｃｏｈｅ
ｎ．Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６
８，１１１（１９７８）〕等を用いることができる。

【００１８】組換え微生物の選択は、先ずベクターＤＮ
Ａ上にコードされている抗生物質耐性等の形質のうち、
外来染色体ＤＮＡ断片の挿入によって失活しない形質を
指標として、ベクター由来のＤＮＡ断片を含むＤＮＡに
よって形質転換されたものを一次選択する。具体的に
は、例えばベクターとしてＥＫ系のｐＢＲ３２２を用
い、このＢａｍＨＩ切断部位に染色体ＤＮＡのＢａｍＨ
Ｉ断片を挿入した場合には、テトラサイクリン耐性遺伝
子が失活するので、遺伝子中にＢａｍＨＩ切断部位を持
たないアンピシリン耐性を指標として一次選択を行えば
良い。次にこれを澱粉あるいはプルランを含む寒天プレ
ートにそれぞれレプリカ法等によって移植して培養した
後、集落を出現させる。澱粉を含む寒天プレート上で澱
粉を分解したことによってコロニーの周囲にハローを形
成し、なおかつプルラン寒天プレート上でもハローを形
成することのできるコロニーを検出する。

【００１９】斯くして得られた組換え微生物が保持する
組換えＤＮＡは、通常のプラスミド調製法あるいはファ
ージＤＮＡ調製法〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８２）〕を用いて抽出でき、
更に各種制限酵素による切断パターンを電気泳動法等に
よって解析することによって、組換えＤＮＡがベクター
ＤＮＡとアルカリアミロプルラナーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が結合したものであることを確認できる。

【００２０】本発明に於けるアルカリアミロプルラナー
ゼのうち、アルカリプルラナーゼＹ遺伝子は図１に示し
た制限酵素地図を有する約９．４ｋｂのＤＮＡ断片に含
まれており、斜線で示した約６．２ｋｂの部分に存在し
ている。

【００２１】アルカリプルラナーゼＹ遺伝子を含む約
６．２ｋｂ断片は配列番号２に示したヌクレオチド配列
を有している。本配列は配列番号２に示した約６．２ｋ
ｂ断片の左側から右側に向けての配列を５′から３′の
方向に示したものである。本配列中にヌクレオチド番号
１４５番のＡＴＧから翻訳を開始し、配列番号１記載の
アミノ酸１９３８残基から成る配列をコードするオープ
ン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が認められる。
ＯＲＦの１５ベース（ｂ）上流に枯草菌の１６Ｓリボゾ
ームＲＮＡの３′末端の配列〔ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，
Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
５６，１１２８３（１９８１）〕と相補性が高いGAAAGG
GG配列が存在し、更に上流には、ヌクレオチド番号３５
以降にσ^A型プロモーターの共通配列〔Ｇｉｔｔ，Ｍ．
Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
０，７１７８（１９８５）〕と相同性の高いTTTACA----
20 ｂ----TAAATT配列が存在する。また、ヌクレオチド
番号の５９５９番の翻訳終止コドンTAAの下流には転写
ターミネーターと思われるインバーティッド・リピート
配列が存在する（ヌクレオチド番号５９６１−６０１
５）。また、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＡＰ１３７
８株の培養液から精製したアルカリプルラナーゼＹのア
ミノ末端側１４残基のアミノ酸配列は、当該ＤＮＡ断片
中のヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列の１
番号以降の配列と一致した（配列番号２のアミノ酸配列
１−１４）。

【００２２】本発明の遺伝子のヌクレオチド配列及び推
定されるアミノ酸配列をこれまでに知られているα−ア
ミラーゼ及びプルラナーゼと比較したところ、本遺伝子
は独自のヌクレオチド配列を有しており、且つコードさ
れるアミノ酸の配列も他のα−アミラーゼ及びプルラナ
ーゼのものとは異なっており新規なものであった。

【００２３】一方、本遺伝子は一つの酵素がアルカリα
−アミラーゼ活性中心及びアルカリプルラナーゼ活性中
心の二つの活性中心を有しているという特徴を持ってい
る。即ち、アミラーゼやプルラナーゼの活性中心に共通
に見られる４種（Ｉ〜IV領域）の配列〔Ｎａｋａｊｉｍ
ａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，３５５（１９８
６）〕がそれぞれアミノ酸配列４３０〜６１３と１３６
４〜１５４９の間に存在する（配列番号２のアミノ酸配
列において、アルカリα−アミラーゼのＩ領域＝４３０
〜４３５、アルカリα−アミラーゼのII領域＝５１４〜
５２２、アルカリα−アミラーゼのIII領域＝５４７〜
５５０、アルカリα−アミラーゼのIV領域＝６０８〜６
１３、アルカリプルラナーゼのＩ領域＝１３６４〜１３
６９、アルカリプルラナーゼのII領域＝１４２８〜１４
３６、アルカリプルラナーゼのIII領域＝１４６１〜１
４６４、アルカリプルラナーゼのIV領域＝１５４４〜１
５４９）。また、アルカリα−アミラーゼとアルカリプ
ルラナーゼをコードしていると思われる構造遺伝子の間
には３３アミノ酸よりなる介在配列が２回繰り返して存
在する（配列番号２のアミノ酸配列において、８０２〜
８３４及び９１２〜９４４）。従って、この特徴を利用
することによってアルカリα−アミラーゼ部分とアルカ
リプルラナーゼ部分とを別々に発現させることも可能で
ある。例えば、開始コドンから介在配列直前までのアミ
ノ酸を含む遺伝子をプラスミドベクターＤＮＡに挿入し
適当な宿主菌に導入することによってアルカリα−アミ
ラーゼだけを生産させることが可能である（配列番号
３）。また、介在配列直後のアミノ酸から１９０６番目
までのアミノ酸を含む遺伝子を発現可能なプラスミドベ
クターＤＮＡに挿入し適当な宿主菌に導入することによ
ってアルカリプルラナーゼだけを生産させることも可能
である（配列番号４）。

【００２４】アルカリプルラナーゼＹ遺伝子の全領域を
含む組換えＤＮＡの好適な例として、プラスミドｐＡＰ
１０１（図２）等が挙げられる。本プラスミドはアルカ
リプルラナーゼＹ遺伝子６．２ｋｂを含む断片とｐＵＣ
１８、ｐＨＹ３００ＰＬＫの一部からなる１３．４ｋｂ
の組換えプラスミドである。組換えＤＮＡを含有する組
換え微生物の好適な例としては、大腸菌ＨＢ１０１（ｐ
ＡＰ１０１）株が挙げられる。この菌株は組換えプラス
ミドｐＡＰ１０１を大腸菌ＨＢ１０１株に通常の形質転
換法を用いて導入したものであり、大腸菌の培養に通常
用いられる培地で培養することにより菌体内にアルカリ
プルラナーゼＹを生産する。生産された当該酵素の最適
反応pHはα−アミラーゼ活性がpH８〜９、プルラナーゼ
活性がpH９〜１０であり、遺伝子供与菌株であるバチル
ス エスピー ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株が生産するアル
カリプルラナーゼＹの値（図３）と良く一致する。

【００２５】目的とする酵素活性を有する蛋白をコード
する限り、本発明のＤＮＡ断片には、後記配列表記載の
アミノ酸配列をコードするもの以外に、このアミノ酸配
列に１又は２以上のアミノ酸が置換、付加、欠失、逆位
又は挿入されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含ま
れる。その例としては、配列番号１のアミノ酸配列か
ら、Ｎ末端側３２アミノ酸が欠失したアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡが挙げられる。

【００２６】

【発明の効果】本発明によればアルカリ性側pH領域にお
いて最大の活性を示すアルカリアミロプルラナーゼの遺
伝子及びこれを含有する微生物が得られ、これらを利用
すれば当該アルカリアミロプルラナーゼの大量生産が可
能である。アルカリアミロプルラナーゼは単一蛋白質
で、α−アミラーゼ及びプルラナーゼ活性それぞれの活
性部位が異なるという特徴を持つ。

【００２７】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではな
い。尚、本実施例中の濃度は何れも重量％で示してあ
る。

【００２８】実施例１ α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹを
生産するバチルス エスピー ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株
を５mlのＡ培地（表１）に接種し、３０℃で２４時間振
盪培養を行った後、この１mlを１００mlの同培地に接種
して３０℃で更に１２時間振盪培養した。この後、遠心
分離によて菌体を集め、斉藤と三浦の方法〔Ｓａｉｔ
ｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｍｉｕｒａ Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６
３）〕に従って約１mgの染色体ＤＮＡを得た。

【００２９】

【表１】

【００３０】実施例２ 実施例１で得られた染色体ＤＮＡ１０μg を制限酵素Ｐ
ｓｔＩによって切断したのち、同じくＰｓｔＩで切断し
たベクタープラスミドｐＢＲ３２２（ベーリンガー マ
ンハイム社製）１μg を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによ
る結合反応を行って組換えプラスミドを作製した。この
組換えプラスミド混合物による形質転換処理を行った大
腸菌懸濁液を１５μg ／mlテトラサイクリンを含むＬＢ
寒天プレート培地〔１．０％トリプトン（ディフコ社
製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％
ＮａＣｌ、１．５％寒天（和光純薬社製）〕に塗抹し３
７℃で１２時間培養した。更に、出現した形質転換コロ
ニー上に、０．２％プルラン、０．８％レッドプルラン
〔Ｋａｎｎｏ，Ｍ．ａｎｄ Ｔｏｍｉｕｒａ，Ｅ．，Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，１５２９（１
９８５）〕、１mg／mlリゾチーム、グリシン−ＮａＣｌ
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０）を含む０．８％
寒天を重層し、３７℃にて５時間反応させた。この結
果、レッドプルランの分解によってコロニー周辺に透明
なハローを形成した株１株が得られ、これをアルカリプ
ルラナーゼを生産する組換え微生物として分離した。

【００３１】実施例３ 実施例２で得られた組換え微生物を、１５μg ／mlテト
ラサイクリンを含む５mlのＬＢ培地〔１．０％トリプト
ン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社
製）、１．０％ＮａＣｌ〕に接種し、３７℃で一夜培養
した後、これを５００mlのＬＢ培地に移植し、更に２４
時間振盪培養した。この培養液より遠心分離によって菌
体を集め、常法〔Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（１９８２）〕に従って、組換えプラスミド約５００μ
g を調製した。得られた組換えプラスミドの制限酵素切
断地図を作製したところ、図１に示した約６．３ｋｂの
ＰｓｔＩ断片（断片Ａ）が含まれていることが明らかに
なり、これをプラスミドｐＰＵ１００と命名した。ま
た、ｐＰＵ１００によって形質転換された大腸菌ＨＢ１
０１株をＨＢ１０１（ｐＰＵ１００）株と命名した。

【００３２】実施例４ ５mlのＬＢ培地（テトラサイクリンを含む）で一晩培養
したＨＢ１０１（ｐＰＵ１００）株の培養液１mlを１０
０mlのＬＢ培地（テトラサイクリンを含む）に接種し、
３７℃で２４時間振盪培養した。培養後、遠心分離によ
って集めた菌体をトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に懸
濁し、超音波による破砕を行った。破砕後、遠心分離に
よって不溶物を取り除き、得られた上清液を無細胞抽出
液とした。対照として、ＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２）株
についても同様に無細胞抽出液を調製し、これらの抽出
液中のプルラナーゼ活性を測定した。尚、プルラナーゼ
活性は、４０mMグリシン−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液
（pH１０）とプルラン（終濃度０．２５％）を含む反応
液中で、４０℃、３０分間の反応を行った後、生成した
還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸〔３，５−ｄｉｎ
ｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ）〕法
にて定量することによって測定し、１分間に１μmolの
グルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位
とした。この結果、ＨＢ１０１（ｐＰＵ１００）株の無
細胞抽出液にはプルラナーゼ活性が認められた。更に、
生産されたプルラナーゼの作用至適pHを測定した結果、
本酵素におけるプルラナーゼ活性はpH９．５に最適作用
pHを有するアルカリプルラナーゼであることが明らかと
なった。尚、酵素活性の測定には、次に示した緩衝液
（各々４０mM）を用いた。

【００３３】 pH ３．５〜５．５ ；酢酸緩衝液。 pH ５．５〜８．５ ；トリス−マレイン酸緩衝液。 pH ８．５〜１０．５ ；グリシン−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液。 pH １０．５〜１１．０；Ｎａ₂ＣＯ₃−ＮａＨＣＯ₃緩衝液。

【００３４】実施例５ 約５μg のｐＰＵ１００を制限酵素ＰｓｔＩによって切
断後、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルからジーン
クリーンキット（フナコシ社製）によって、約６．３ｋ
ｂのＰｓｔＩ断片約０．５μg を単離した。このＰｓｔ
Ｉ断片をＤＮＡラベリング＆ディテクション キット
（ベーリンガー マンハイム社製）を用いて標識化する
ことによって、プローブＤＮＡを調製した。一方、Ｐｓ
ｔＩによって切断したバチルス エスピー ＫＳＭ−Ａ
Ｐ１３７８株由来の染色体ＤＮＡ（各３μg ）をアガロ
ースゲル電気泳動後、ＤＮＡバンドをサザンの方法〔Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
９８，５０３（１９７５）〕によって、ナイロンメンブ
ラン（アマーシャム社製）に移した後、ＤＮＡラベリン
グ＆ディテクションキットを用いてプローブＤＮＡとの
ハイブリダイゼーション解析を行った。この結果、図４
に示したように、ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来の染色体
ＤＮＡのＰｓｔＩ切断物中には、用いたプローブＤＮＡ
とバイブリダイズする約６．３ｋｂのＤＮＡ断片が存在
することが認められ、プラスミドｐＰＵ１００に含まれ
る約６．３ｋｂのＰｓｔＩ断片が、バチルス エスピー
ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株の染色体ＤＮＡ由来であるこ
とが確認された。

【００３５】実施例６ プラスミドｐＰＵ１００に含まれる約６．３ｋｂのＰｓ
ｔＩ断片をＢａｍＨＩで切断した時に得られる約３．５
ｋｂの断片（断片Ｂ，図１）をプラスミドｐＨＹ３００
ＰＬＫのＰｓｔＩ部位からＢａｍＨＩ部位の間に挿入し
た組換えプラスミドｐＨＹＰＵＬを調製した。これを大
腸菌ＨＢ１０１に導入し、実施例４と同様にプルラナー
ゼ活性を測定した結果、pH９〜１０の範囲に最適作用pH
を有するプルラナーゼ活性が認められた。この結果アル
カリプルラナーゼ遺伝子の必須領域はＰｓｔＩ部位から
ＢａｍＨＩ部位までの約３．５ｋｂであることが明らか
になった。

【００３６】実施例７ 実施例６で得られた断片Ｂから更に、市販のキロシーク
エンス用デレーションキット（宝酒造社製）と適当な２
種類の制限酵素を用いて、各小断片を含む組換えプラス
ミドＤＮＡを作成し、これらの挿入断片のヌクレオチド
配列を決定した。尚、ヌクレオチド配列の決定は蛍光プ
ライマーを用いる方法〔Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，６７４（１９８６）〕に
従って、アプライド バイオシステム社製のモデル３７
０Ａ ＤＮＡシークエンサーを用いて行った。各ＤＮＡ
試料から得られた約３００〜４５０ｂｐのヌクレオチド
配列を重ね合わせることによって、断片ＢのうちＰｓｔ
Ｉ部位側の３０３８ｂｐの配列を決定した。この結果、
アルカリプルラナーゼ遺伝子のオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）は取得した約６．３ｋｂ断片の末端で
あるＰｓｔＩ部位よりも上流に続いていることが明らか
になった。

【００３７】実施例８ 図１に示した約６．３ｋｂ断片から、ＰｓｔＩ−Ｘｂａ
Ｉ １．５ｋｂ断片（断片Ｃ）を調製し、これを実施例
５と同様にして標識し、プローブＤＮＡを作成した（プ
ローブ１）。一方、ＸｂａＩによって切断したバチルス
エスピー ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来の染色体ＤＮ
Ａ（各３μg ）をアガロースゲル電気泳動後、実施例５
と同様にしてナイロンメンブラン（アマーシャム社製）
に移した後、プローブとのハイブリダイゼーションを行
った。この結果、図５に示したように、プローブ１は約
２．３ｋｂのＸｂａＩ断片とハイブリッドすることが明
らかになり、ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来の染色体ＤＮ
Ａ上においてＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ６．３ｋｂ断片の約
０．８ｋｂ上流にＸｂａＩ部位が存在することが推定さ
れた（図１）。そこで実施例７において決定された塩基
配列を基にして合成した２４塩基配列から成るプライマ
ー１及びプライマー２（図１、図６）と、鋳型としてＸ
ｂａＩで切断したＫＳＭ−ＡＰ１３７８株の染色体ＤＮ
Ａを分子内結合した環状ＤＮＡ群を用い、ＰＣＲキット
（アプライド バイオシステム社製）によって逆ＰＣＲ
法〔Ｔｒｉｇｌｉａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，８１（１９８８）〕
で（９４℃ １分，５５℃ １分，７２℃ ３分を１サ
イクルとし、これを３０サイクル繰り返す）ＰｓｔＩ部
位から上流のＸｂａＩ部位までの約０．８ｋｂ間を増幅
させた。更に、増幅させた０．８ｋｂ断片を実施例７と
同様にその配列を決定した。この結果、断片Ｃから続く
アルカリプルラナーゼのＯＲＦが断片Ｄよりも更に上流
に続いていることが明らかになった（図１）。

【００３８】実施例９ 実施例８で取得したＸｂａＩからＰｓｔＩまでの約０．
８ｋｂ断片を実施例５と同様に標識し、プローブＤＮＡ
（プローブ２）を作成した。一方、ＥｃｏＲＩによって
切断したバチルス エスピー ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株
由来の染色体ＤＮＡ（各３μg ）をアガロースゲル電気
泳動後、実施例５と同様にしてナイロンメンブラン（ア
マーシャム社製）に移し、プローブ２とのハイブリダイ
ゼーションを行った。その結果、ハイブリッドしたＥｃ
ｏＲＩ断片のサイズ（３．６ｋｂ，図７）からＫＳＭ−
ＡＰ１３７８株由来の染色体ＤＮＡ上に、実施例８で得
られた断片Ｄの1.２ｋｂ上流にＥｃｏＲＩ部位が存在す
ることが推定された。そこで、実施例８において決定さ
れた塩基配列を元にして合成された２４塩基からなるプ
ライマー３及びプライマー４（図１，図６）と、鋳型と
してＥｃｏＲＩで切断したＫＳＭ−ＡＰ１３７８株の染
色体ＤＮＡを分子内結合した環状ＤＮＡ群を用いて、実
施例８と同様にして逆ＰＣＲ法によってＸｂａＩ部位か
ら更に上流の１．２ｋｂ間を増幅させた（断片Ｅ）。実
施例７と同様に、増幅させた１．２ｋｂの配列を決定し
たところ、断片Ｄから続くアルカリプルラナーゼのＯＲ
Ｆが断片Ｅよりも更に上流に続いていることが明らかに
なった。

【００３９】実施例１０ 実施例９で得られた断片Ｅを実施例５と同様に標識し
て、プローブＤＮＡ（プローブ３）を作成した。バチル
ス エスピー ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来の染色体Ｄ
ＮＡのＸｂａＩ切断物のハイブリダイゼーション解析を
実施例８、９と同様にして行った（図８）。この結果、
図１に示したように、ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来の染
色体ＤＮＡにおいて断片ＥのＥｃｏＲＩ部位より１．１
ｋｂ上流にＸｂａＩ部位が存在することが推定された。
そこで実施例９において決定された塩基配列を元にして
合成された２４塩基のプライマー５及びプライマー６
（図１，図６）と、鋳型としてＸｂａＩで切断したＫＳ
Ｍ−ＡＰ１３７８株の染色体ＤＮＡを分子内結合した環
状ＤＮＡ群を用い、実施例８と同様にして逆ＰＣＲ法に
よってＥｃｏＲＩから更に上流の１．１ｋｂ間を増幅さ
せた。この１．１ｋｂの増幅断片Ｆの配列を実施例７と
同様に決定したところ、本断片中に断片Ｅから続くアル
カリプルラナーゼ遺伝子のＯＲＦの５′末端が確認され
た。本遺伝子の全ヌクレオチド配列及び推定されるアミ
ノ酸配列を配列番号１に示したが、アミノ酸番号１から
１４までの推定配列が、バチルス エスピー ＫＳＭ−
ＡＰ１３７８株のアルカリプルラナーゼＹを用いて実際
に決定したアミノ末端配列と一致したことから、本遺伝
子がアルカリプルラナーゼＹをコードしていることが推
定された。

【００４０】実施例１１ 実施例７及び実施例１０において決定された塩基配列を
基にして合成された２５塩基からなるプライマーＡ及び
プライマーＢ（図１，図６）と、鋳型としてＫＳＭ−Ａ
Ｐ１３７８株の染色体ＤＮＡ及び、ＰＣＲキット（アプ
ライド バイオシステム社製）を用いてＰＣＲ法（９４
℃ １分，５５℃ １分，７２℃ ３分を１サイクルと
し、これを３０サイクル繰り返す。）によって、アルカ
リプルラナーゼＹ遺伝子のアルカリα−アミラーゼ領域
を含む３．５ｋｂ断片（断片Ｇ）を増幅させた。得られ
たＤＮＡ断片をｐＵＣ１８プラスミドベクターのＳｍａ
Ｉ部位に挿入し、市販のＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピ
テントセルを用いて形質転換を行った。得られた形質転
換体を０．４％ブルースターチ及び５０μg ／mlのアン
ピシリンを含んだＬＢ培地にレプリカ法で移植して３７
℃において培養を行い、ブルースターチを分解してコロ
ニーの周辺にハローを形成する株を１株分離した。更に
実施例３と同様にこの株からプラスミド（ｐＡＭＹ１０
０）を調製した。

【００４１】実施例１２ アルカリプルラナーゼＹ遺伝子のアルカリプルラナーゼ
領域を含むプラスミドｐＨＹＰＵＬ（実施例３）をＰｓ
ｔＩで切断して得られた７．7kb の断片と同遺伝子のア
ルカリα−アミラーゼ領域を含むｐＡＭＹ１００（実施
例１１）をＰｓｔＩで切断して調製した５．７ｋｂの断
片をＴ４リガーゼによって結合させた組換えプラスミド
混合物を大腸菌ＨＢ１０１に導入し、出現してきた形質
転換体を０．４％ブルースターチとアンピシリン５０μ
g ／mlを含むＬＢ培地及び、０．８％レッドプルラン
〔Ｋａｎｎｏ，Ｍ．ａｎｄ Ｔｏｍｉｕｒａ，Ｅ，．Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，１５２９（１
９８５）〕とアンピシリン５０μg ／mlを含むＬＢ培地
に各々レプリカ法で移植し３７℃にて１２時間生育させ
た。この結果、両プレート上で透明なハローをコロニー
周辺に形成した株をα−アミラーゼ活性を有するアルカ
リプルラナーゼＹを生産する組換え大腸菌として分離し
た。

【００４２】実施例１３ 実施例１２で得られた組換え大腸菌から、実施例３と同
様にして組換えプラスミド約５００μg を調製した。得
られた組換えプラスミドの制限酵素切断地図を作成した
ところ、図１に示した約７．０ｋｂのＤＮＡ断片（断片
Ｈ）が含まれていることが明らかになり、これをプラス
ミドｐＡＰ１０１と命名した（図２）。また、ｐＡＰ１
０１によって形質転換された大腸菌ＨＢ１０１株をＨＢ
１０１（ｐＡＰ１０１）株と命名した。

【００４３】実施例１４ 実施例４と同様にしてＨＢ１０１（ｐＡＰ１０１）株か
ら無細胞抽出液を調製し、また対照として、ＨＢ１０１
（ｐＢＲ３２２）株の無細胞抽出液を調製し、これらの
α−アミラーゼ活性及びプルラナーゼ活性を測定した。
尚、α−アミラーゼ活性は５０mMグリシン−ＮａＣｌ−
ＮａＯＨ緩衝液（pH１０）中に可溶性澱粉を含む反応液
中、５０℃で、１５分間の反応を行った後生成した還元
糖をＤＮＳ法で定量することによって測定した。また、
プルラナーゼ活性は実施例４と同様にして測定した。い
ずれも酵素の力価は、１分間に１μmolのグルコースに
相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。この
結果、ＨＢ１０１（ｐＡＰ１０１）株の無細胞抽出液に
はアルカリα−アミラーゼ活性及びアルカリプルラナー
ゼ活性が認められ、実施例４と同様にα−アミラーゼと
プルラナーゼの作用至適pHを求めたところ、α−アミラ
ーゼ活性がpH８〜９の範囲、プルラナーゼ活性がpH９〜
１０の範囲であることが明らかとなった。

【００４４】実施例１５ 本発明者らにより、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＡＰ
１３７８株の培養液より精製された５０mgのアルカリプ
ルラナーゼＹ酵素〔２１０キロダルトン（ＫＤａ）；特
公平６−３２６１３号公報〕に０．１mgのパパイン（シ
グマ社製；５Ｕ／mg）を加え、１０mMトリス−ＨＣｌ緩
衝液（pH８．０）中で３０℃、２分間の加水分解反応を
行った後、１０μg のアンチパイン（フルカ社製）を添
加することによって反応を停止した。この分解産物をＤ
ＥＡＥ ５ＰＷカラム（７．５mm×７．５cm；東ソー社
製）を用いて分画すると、１１４ＫＤａ及び１０２ＫＤ
ａの蛋白断片が得られた。これら２つの蛋白断片の酵素
活性を測定した結果、１１４ＫＤａ蛋白断片はアルカリ
プルラナーゼ活性のみを有し、１０２ＫＤａ蛋白断片は
アルカリα−アミラーゼ活性のみを有することが明らか
となった。プルラナーゼ活性のみを有する１１４ＫＤａ
蛋白断片のＮ末アミノ酸配列を決定したところThr-Val-
Pro-Leu-Ala-Leu-Val-Ser-Gly-Glu-Val-Leu-Ser-Asp-Ly
s-Leu からなる配列が認められ、この配列は配列番号２
の塩基配列から推定されるアミノ酸配列１０１４番号目
から１０２９番号目までと完全に一致した。同様に、α
−アミラーゼ活性のみを有する１０２ＫＤａ蛋白断片の
Ｎ末アミノ酸配列Glu-Thr-Gly-Asp-Lys-Arg-Ile-Glu-Ph
e-Ser-Tyr-Glu-Arg-Pro は配列番号２の１番号目から１
４番号目までの推定アミノ酸配列と完全に一致した。以
上の結果からも本遺伝子がプルラナーゼ活性及びα−ア
ミラーゼ活性をそれぞれ異なった活性中心を持つアルカ
リプルラナーゼＹ蛋白をコードしていることが証明され
た。

【００４５】参考例１ α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹを
生産するバチルス エスピー ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株
を１０mlのＡ培地（表１）に接種し、３０℃で２日間振
盪培養を行った後、この１０mlを１リットルの同培地に
接種して３０℃で更に３日間振盪培養した後、遠心分離
してアルカリプルラナーゼＹの粗酵素液を得た。粗酵素
液に対しＤＥＡＥ−セルロースによる吸着、セファロー
ス−α−サイクロデキストリン アフィニティーカラム
処理、セファクリルＳ−２００カラム処理の順での精製
過程を経て、電気泳動的に均一な酵素標品を得た。本酵
素のＮ末アミノ酸配列をプロテインシークエンサー４７
６Ａ（アプライド バイオシステム社製）を用いて決定
したところGlu-Thr-Gly-Asp-Lys-Arg-Ile-Glu-Phe-Ser-
Tyr-Glu-Arg-Pro であることが判明した。

【００４６】参考例２ 参考例１で得られたアルカリプルラナーゼＹの完全精製
標品のα−アミラーゼ活性とプルラナーゼ活性の最適pH
を実施例４及び実施例１４に示した酵素活性測定法を用
いて測定したところ図３に示したように、前者でpH８．
５付近、後者でpH９．５付近であった。

【００４７】

【配列番号】

配列番号：１ 配列の長さ：１９３８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Lys Arg Phe Gln Arg Gly Met Ala Gly Leu Leu Ser Ile Leu -30 -25 -20 Leu Ile Val Ser Met Phe Ala Gly Tyr Leu Pro Ala Arg Ala Ala Ala -15 -10 -5 Glu Thr Gly Asp Lys Arg Ile Glu Phe Ser Tyr Glu Arg Pro Asp Gly 1 5 10 15 Asn Tyr Glu Gly Trp Asn Leu Trp Val Trp Gly Thr Gly Val Lys Asp 20 25 30 Asp Gln Ile Asp Phe Thr Glu Phe Lys Glu Gly Lys Ala Tyr Ala Asp 35 40 45 Ile Ala Val Ser Asp Asn Ala Asp Lys Val Gly Phe Ile Ile Arg Lys 50 55 60 Gly Asp Trp Glu Glu Lys Asp Phe Asp Gly Asp Arg Ser Ile Thr Ile 65 70 75 80 Asn Lys Ile Asp Asn Ile Thr Lys Val His Val Thr Ser Gln Gln Glu 85 90 95 Lys Phe Gly Gln Ile Pro Asp Gly Ser Pro Pro Val Val Ala Asp Gly 100 105 110 Asn Ala Asp Phe Phe Phe Arg Asp Lys Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Glu 115 120 125 Met Asp Lys Val Glu Lys Val Glu Leu Ser Ile Leu Gly Glu Lys Tyr 130 135 140 Glu Met Asn Gly Glu Pro Glu Lys Glu Arg Phe Thr Tyr Thr Leu Ser 145 150 155 160 Asp Leu Pro Thr Gly Glu His Glu Tyr Thr Tyr Leu Val Thr Val Asp 165 170 175 Gly Gln Thr Glu Glu Val Thr Asp Pro Tyr Asn Thr Val Asp Gly Arg 180 185 190 Ser Val Val Glu Tyr Val Thr Ser Asp Val Gln Val Ser Ala Ser Phe 195 200 205 Ile Pro Ala Lys Val Asp Tyr Asn Gln Asn Ala Val Val Lys Val Asp 210 215 220 Ile Glu Ser Glu Thr Glu Thr Lys Ile Arg Glu Met Ser Ile Asn Leu 225 230 235 240 Ser Glu Ile Gly Gly Lys Glu Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ala Leu Asn 245 250 255 Glu Leu Thr Val Ala Val Lys Gln Gly Val Thr Ala Gly Val Lys Asn 260 265 270 Leu Pro Ile Thr Ala Ile Asp Glu Phe Gly Asn Arg His Glu Gly Ser 275 280 285 Ala Thr Leu Glu Val Gln Ala Arg Thr Ile Thr Gly Glu Lys Ala Asp 290 295 300 Phe Asp Trp Asp Gln Ser Val Val Tyr Phe Met Leu Thr Asp Arg Phe 305 310 315 320 Phe Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Asp Pro His Gly Ile Gly Tyr Asp 325 330 335 Thr Ser Lys Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Gly Asp Phe Lys Gly Ile Thr 340 345 350 Gln Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Leu Gly Ile Asn Thr Ile Trp Ile 355 360 365 Ser Pro Val Val Asp Asn Ile Lys Phe Asp Val Arg His Ser Glu Gly 370 375 380 Pro Asp Thr Pro Tyr Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Ala Asp Asn Phe 385 390 395 400 Gly Glu Leu Asn Pro His Phe Gly Ser Met Ala Asp Phe His Glu Met 405 410 415 Ile Asp Ala Ala His Glu Arg Gly Ile Lys Ile Met Val Asp Val Val 420 425 430 Leu Asn His Thr Gly Tyr Gly Leu Lys Pro Gly Asp Ser Ser Ser Val 435 440 445 Ala Asn Phe Pro Thr Asp Glu Asp Arg Ala Arg Phe Asp Gly Met Leu 450 455 460 Arg Asp Gly Gly Ser Gly Glu Val Arg Gly Glu Leu Ala Gly Leu Pro 465 470 475 480 Asp Phe Leu Thr Glu Asn Pro Asp Val Arg Glu Gln Val Val Gln Trp 485 490 495 Gln Thr Asp Trp Ile Glu Lys Ser Arg Thr Ala Lys Gly Asn Thr Ile 500 505 510 Asp Tyr Phe Arg Val Asp Thr Val Lys His Val Glu Asp Thr Thr Trp 515 520 525 Met Ala Phe Lys Asn Ala Leu Thr Lys Ala Met Pro Glu His Lys Leu 530 535 540 Ile Gly Glu Ala Trp Gly Ala Asn Val Asn Asp Asp Leu Gly Tyr Leu 545 550 555 560 Asn Ser Gly Met Met Asp Ser Leu Leu Asp Phe Asp Phe Lys Asn Tyr 565 570 575 Ala Arg Asp Phe Ala Asn Gly Gln Leu Asp Ala Val Gln Gln Lys Leu 580 585 590 Glu Ala Arg Asn Ser Lys Leu Asn Asn Thr Ala Thr Leu Gly Gln Phe 595 600 605 Leu Gly Ser His Asp Glu Asp Arg Phe Tyr Glu Val Val Glu Gly Asp 610 615 620 Leu Gly Lys Tyr Gln Val Ala Ala Ser Leu Gln Leu Thr Ala Lys Gly 625 630 635 640 Gln Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Glu Glu Leu Gly Leu Pro Gly Lys Asn 645 650 655 Asp Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Gln Asn Met Pro Trp Asp Asp Val 660 665 670 Asp Gly Asn Glu Ile Leu Glu His Tyr Gln Lys Leu Leu Ala Phe Arg 675 680 685 Asn Asp Asn Pro Asn Thr Phe Ala Lys Gly Asp Arg Lys Lys Val Ala 690 695 700 Gly Ser Asp Ser Glu Gly Tyr Leu Leu Phe Ser Arg Thr Tyr Gly Glu 705 710 715 720 Asn Ser Val Tyr Val Gly Leu Asn Thr Glu Ala Ala Ala Lys Asp Val 725 730 735 Thr Leu Asn Phe Gly Ser Ser Glu Ala Val Val Thr Asp Arg Tyr Ser 740 745 750 Gly Gln Glu Tyr Gln Ala Asn Glu Glu Gly Gln Val Thr Phe Ser Ile 755 760 765 Pro Ala Met Glu Asp Gly Gly Thr Val Leu Leu Glu Val Glu Asn Gly 770 775 780 Ala Val Pro Pro Val Glu Glu Glu Pro Thr Glu Pro Gly Glu Ile Glu 785 790 795 800 Glu Asn Thr Leu Arg Ile His Tyr Gln Arg Thr Asp Asn Ser Tyr Glu 805 810 815 Asn Leu Gly Leu Trp Leu Trp Gly Asp Val Ala Ala Pro Ser Glu Asn 820 825 830 Trp Pro Ser Gly Gly Thr Pro Phe Gln Ala Gly Asn Val Thr Asp Tyr 835 840 845 Gly Ala Tyr Val Asp Val Glu Leu Ala Glu Asp Ala Gln Asn Ile Gly 850 855 860 Phe Leu Val Leu Asn Thr Thr Asn Gly Asp Lys Asp Gly Gly Asp Lys 865 870 875 880 Ala Val Glu Leu Phe Ser Pro Asp Leu Asn Glu Ile Trp Ile Lys Gln 885 890 895 Gly Ser Asp Glu Val Phe Leu Tyr Glu Pro Val Asp Leu Pro Ala Asn 900 905 910 Thr Val Arg Ile His Tyr Glu Arg Thr Asn Ala Asp Tyr Glu Gly Trp 915 920 925 Gly Leu Trp Asn Trp Glu Asp Val Glu Ser Pro Ser Asp Gly Trp Pro 930 935 940 Asn Gly Ala Ala Asp Ala Ala Gly Ile Gly Lys Tyr Gly Ala Tyr Tyr 945 950 955 960 Asp Ile Lys Leu Lys Glu Asp Ala Asn Lys Ile Gly Phe Leu Phe Val 965 970 975 Asn Lys Gln Ser Gly Gly Gln Thr Gly Asp Met Thr Phe Asp Met Leu 980 985 990 Lys Gln Tyr Asn Gln Leu Phe Val Lys Glu Gly Glu Asp Lys Val Tyr 995 1000 1005 Thr Asn Pro Tyr Gly Thr Val Pro Leu Ala Leu Val Ser Gly Glu Val 1010 1015 1020 Leu Ser Asp Lys Leu Ile Ser Leu Thr Phe Thr Arg Thr Glu Gly Leu 1025 1030 1035 1040 Asp Leu Glu Glu Leu Lys Glu Gln Leu Glu Ile Lys Asp Val Asp Gly 1045 1050 1055 Asn Asp Val Ser Phe Thr Asp Val Thr Ile Glu Gly Glu Lys Thr Val 1060 1065 1070 His Val His Gly Glu Phe Asp Leu Glu Lys Ile Pro Phe Ser Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Leu Asp Arg Thr Ile Ser Val Lys Ser Gly Trp Lys Leu Ile Asp 1090 1095 1100 Glu Met Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Leu Gly Ala Glu Leu His Glu Asp 1105 1110 1115 1120 Gly Thr Ala Thr Leu Lys Val Trp Ser Pro Lys Ala Asp Asn Val Ser 1125 1130 1135 Val Val Leu Tyr Asp Lys Val Asp Gln Asn Glu Val Val Asp Thr Ile 1140 1145 1150 Glu Met Val Lys Gly Asp Arg Gly Val Trp Ser Val Lys Leu Thr Lys 1155 1160 1165 Asp Asn Thr Gly Leu Asp Ser Leu Lys Gly Tyr Tyr Tyr His Tyr Glu 1170 1175 1180 Ile Thr His Gly Asp Val Thr Asn Leu Ala Leu Asp Pro Tyr Ala Lys 1185 1190 1195 1200 Ser Met Ala Ala Trp Asn Asn Glu Ala Gly Asp Lys Val Gly Lys Ala 1205 1210 1215 Ala Ile Val Asp Ile Gly Ser Ile Gly Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Asp 1220 1225 1230 Ile Pro Gly Phe Glu Lys Arg Glu Asp Thr Ile Ile Tyr Glu Val His 1235 1240 1245 Val Arg Asp Phe Thr Ser Asp Pro Asn Ile Gly Glu Asp Leu Lys Ala 1250 1255 1260 Gln Phe Gly Thr Phe Ala Ser Phe Val Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln 1265 1270 1275 1280 Glu Leu Gly Val Thr His Ile Gln Leu Leu Pro Val Met Ser Tyr Tyr 1285 1290 1295 Phe Ser Asn Glu Phe Glu Ser Gly Glu Arg Met Leu Glu Tyr Ala Ser 1300 1305 1310 Thr Gly Thr Asn Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro His Asn Tyr Phe Ser 1315 1320 1325 Leu Ser Gly Met Tyr Ser Glu Asn Pro Glu Asp Pro Glu Leu Arg Ile 1330 1335 1340 Lys Glu Phe Lys Asn Leu Ile Asn Glu Ile His Lys Arg Asp Met Gly 1345 1350 1355 1360 Val Val Leu Asp Val Val Phe Asn His Thr Ala Gln Val His Ile Phe 1365 1370 1375 Glu Asp Leu Val Pro Asn Tyr Tyr His Phe Met Asp Ala Asp Gly Thr 1380 1385 1390 Pro Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Arg Leu Gly Thr Thr His Glu Met 1395 1400 1405 Ser Arg Arg Val Leu Val Asp Ser Ile Lys His Trp Val Asp Glu Tyr 1410 1415 1420 Lys Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Met Met Gly Asp His Asp Ala Glu 1425 1430 1435 1440 Ser Ile Gln Ile Ala Phe Asp Glu Ala Lys Lys Leu Asn Pro Asn Ile 1445 1450 1455 Val Met Ile Gly Glu Gly Trp Val Thr Phe Ala Gly Asp Glu Gly Glu 1460 1465 1470 Pro Val Gln Ala Ala Asp Gln Gln Trp Met Gln Tyr Thr Glu Ala Val 1475 1480 1485 Gly Ser Phe Ser Asp Glu Phe Arg Asn Glu Leu Lys Ser Gly Phe Gly 1490 1495 1500 Ser Glu Gly Gln Pro Arg Phe Ile Thr Gly Gly Ala Val Asn Val Gln 1505 1510 1515 1520 Gln Ile Phe Asp Asn Ile Lys Ala Gln Pro His Asn Phe Met Ala Asp 1525 1530 1535 Gln Pro Gly Asp Val Val Gln Tyr Ile Glu Ala His Asp Asn Leu Thr 1540 1545 1550 Leu Tyr Asp Val Ile Ala Gln Ser Ile Lys Lys Asp Pro Glu Ile Ala 1555 1560 1565 Glu Asn Asp Leu Glu Ile His Lys Arg Ile Arg Val Gly Asn Ala Met 1570 1575 1580 Val Leu Thr Ser Gln Gly Thr Ala Phe Leu His Ala Gly Gln Glu Phe 1585 1590 1595 1600 Gly Arg Thr Lys Gln Trp Arg Ala Pro Ala Thr Glu Ala Pro Tyr Lys 1605 1610 1615 Ser Thr Tyr Met Thr Asp Ala Asp Gly Asn Pro Phe Val Tyr Pro Tyr 1620 1625 1630 Phe Ile His Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Asp Ile Ile Asn Arg Phe Asp 1635 1640 1645 Trp Glu Lys Ala Thr Asp Ala Glu Lys Tyr Pro Val Asn Asn Val Thr 1650 1655 1660 Arg Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Glu Leu Arg Arg Ser Ser Asp Ala 1665 1670 1675 1680 Phe Arg Leu Gly Ser Arg Glu Leu Val Asp Ser Asn Val Thr Met Val 1685 1690 1695 Asp Ala Pro Glu Ile Lys Glu Gln Asp Leu Val Val Ala Tyr Arg Ser 1700 1705 1710 Val Ser Thr Ala Gly Val Glu Tyr Tyr Thr Phe Val Asn Ala Asp Thr 1715 1720 1725 Ser Ser Arg Thr Leu Thr Leu Gly Gln Asp Leu Thr Glu Gly Val Val 1730 1735 1740 Val Val Asp Ala Glu Glu Ala Asn Val Ala Gly Val Ala Glu Pro Ala 1745 1750 1755 1760 Gly Phe Glu Leu Thr Ala Glu Gly Ile Thr Leu Glu Pro Leu Thr Thr 1765 1770 1775 Val Val Val Arg Val Gly Glu Gln Glu Gly Thr Asp Pro Gly Asp Gly 1780 1785 1790 Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly 1795 1800 1805 Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro 1810 1815 1820 Pro Gly Asn Gly Asn Gly Asn Asn Pro Gly Thr Pro Pro Gly Lys Gly 1825 1830 1835 1840 Gly Glu Asn Pro Gly Lys Gly Lys Asn Asp Lys Thr Pro Pro Gly Lys 1845 1850 1855 Gly Gly Asp Asn Pro Gly Lys Gly Asn Lys Leu Pro Leu Thr Ala Thr 1860 1865 1870 Gly Thr Leu Asn Tyr Ile Leu Phe Gly Ala Ile Met Leu Val Leu Gly 1875 1880 1885 Thr Leu Leu Tyr Leu Gly Val Arg Arg Lys Ala Gly Leu Lys Glu Lys 1890 1895 1900 Thr Leu 1905

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：６１４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチルス エスピー 株名：ＫＳＭ−ＡＰ１３７８ 配列 TCTA GATGTGCAAT TTTGCGCAAA 24 CGATTTCACA TTTACATAAA CAATCTTGGC ATCAATTAAA TTATTTATTG TGCAACTTTG 84 TGCAAACGCT TCCACATTTT AGCAAGAAAT GCAAATCATT GTATGGAAAG GGGCAGGGAT 144 ATG AAG AAA AGG TTT CAA AGG GGT ATG GCT GGT TTA CTT TCT ATT TTA 192 Met Lys Lys Arg Phe Gln Arg Gly Met Ala Gly Leu Leu Ser Ile Leu -30 -25 -20 CTT ATT GTT TCC ATG TTT GCA GGC TAT CTA CCG GCA AGA GCA GCG GCC 240 Leu Ile Val Ser Met Phe Ala Gly Tyr Leu Pro Ala Arg Ala Ala Ala -15 -10 -5 GAA ACG GGA GAC AAG CGG ATA GAA TTC AGT TAT GAA CGG CCA GAT GGA 288 Glu Thr Gly Asp Lys Arg Ile Glu Phe Ser Tyr Glu Arg Pro Asp Gly 1 5 10 15 AAT TAT GAA GGC TGG AAT TTA TGG GTC TGG GGA ACT GGT GTG AAG GAT 336 Asn Tyr Glu Gly Trp Asn Leu Trp Val Trp Gly Thr Gly Val Lys Asp 20 25 30 GAC CAG ATA GAC TTT ACA GAA TTC AAG GAA GGC AAG GCA TAT GCC GAC 384 Asp Gln Ile Asp Phe Thr Glu Phe Lys Glu Gly Lys Ala Tyr Ala Asp 35 40 45 ATA GCA GTA AGC GAT AAT GCG GAT AAA GTC GGT TTC ATT ATC CGT AAA 432 Ile Ala Val Ser Asp Asn Ala Asp Lys Val Gly Phe Ile Ile Arg Lys 50 55 60 GGG GAT TGG GAA GAA AAG GAC TTT GAT GGG GAC AGG TCG ATT ACG ATC 480 Gly Asp Trp Glu Glu Lys Asp Phe Asp Gly Asp Arg Ser Ile Thr Ile 65 70 75 80 AAT AAG ATC GAT AAC ATC ACC AAA GTG CAT GTA ACA AGC CAG CAG GAA 528 Asn Lys Ile Asp Asn Ile Thr Lys Val His Val Thr Ser Gln Gln Glu 85 90 95 AAA TTC GGG CAA ATT CCT GAC GGC AGC CCA CCT GTT GTT GCG GAC GGG 576 Lys Phe Gly Gln Ile Pro Asp Gly Ser Pro Pro Val Val Ala Asp Gly 100 105 110 AAT GCT GAC TTC TTT TTC CGT GAT AAA GAA CTG TAC GCA GCA GGA GAA 624 Asn Ala Asp Phe Phe Phe Arg Asp Lys Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Glu 115 120 125 ATG GAT AAG GTT GAG AAA GTC GAA CTG TCC ATT TTA GGC GAA AAA TAC 672 Met Asp Lys Val Glu Lys Val Glu Leu Ser Ile Leu Gly Glu Lys Tyr 130 135 140 GAG ATG AAT GGT GAG CCG GAA AAG GAG CGT TTT ACA TAT ACA TTA AGC 720 Glu Met Asn Gly Glu Pro Glu Lys Glu Arg Phe Thr Tyr Thr Leu Ser 145 150 155 160 GAT CTT CCT ACA GGC GAG CAT GAA TAT ACT TAT TTG GTG ACA GTG GAT 768 Asp Leu Pro Thr Gly Glu His Glu Tyr Thr Tyr Leu Val Thr Val Asp 165 170 175 GGA CAG ACA GAG GAA GTT ACC GAT CCA TAT AAC ACG GTG GAT GGA AGG 816 Gly Gln Thr Glu Glu Val Thr Asp Pro Tyr Asn Thr Val Asp Gly Arg 180 185 190 TCT GTT GTG GAG TAT GTG ACA TCC GAT GTG CAA GTA TCG GCT TCA TTT 864 Ser Val Val Glu Tyr Val Thr Ser Asp Val Gln Val Ser Ala Ser Phe 195 200 205 ATA CCC GCA AAG GTT GAT TAT AAC CAG AAC GCT GTG GTG AAG GTA GAC 912 Ile Pro Ala Lys Val Asp Tyr Asn Gln Asn Ala Val Val Lys Val Asp 210 215 220 ATC GAA TCA GAA ACG GAG ACA AAA ATC CGT GAG ATG TCT ATC AAT CTT 960 Ile Glu Ser Glu Thr Glu Thr Lys Ile Arg Glu Met Ser Ile Asn Leu 225 230 235 240 TCA GAA ATC GGC GGC AAA GAG AAA GCA ACC ATT GAT CCT GCG CTG AAT 1008 Ser Glu Ile Gly Gly Lys Glu Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ala Leu Asn 245 250 255 GAA TTG ACA GTT GCG GTC AAG CAA GGT GTG ACG GCA GGT GTG AAA AAC 1056 Glu Leu Thr Val Ala Val Lys Gln Gly Val Thr Ala Gly Val Lys Asn 260 265 270 TTG CCT ATC ACT GCG ATT GAT GAA TTC GGA AAT CGC CAT GAG GGA TCT 1104 Leu Pro Ile Thr Ala Ile Asp Glu Phe Gly Asn Arg His Glu Gly Ser 275 280 285 GCT ACC TTA GAA GTT CAG GCG CGT ACT ATT ACA GGT GAA AAA GCA GAT 1152 Ala Thr Leu Glu Val Gln Ala Arg Thr Ile Thr Gly Glu Lys Ala Asp 290 295 300 TTC GAC TGG GAT CAG TCT GTG GTT TAT TTT ATG CTG ACA GAT CGA TTC 1200 Phe Asp Trp Asp Gln Ser Val Val Tyr Phe Met Leu Thr Asp Arg Phe 305 310 315 320 TTT GAT GGG GAT TCA TCG AAC AAT GAC CCT CAT GGT ATT GGC TAT GAC 1248 Phe Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Asp Pro His Gly Ile Gly Tyr Asp 325 330 335 ACA AGC AAG TCT GGT ACA TAC CAA GGC GGA GAT TTT AAG GGG ATC ACG 1296 Thr Ser Lys Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Gly Asp Phe Lys Gly Ile Thr 340 345 350 CAA AGG CTT GAT TAC TTG GAC GAG CTT GGA ATC AAT ACG ATC TGG ATC 1344 Gln Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Leu Gly Ile Asn Thr Ile Trp Ile 355 360 365 AGT CCG GTT GTC GAT AAT ATC AAA TTT GAT GTT CGA CAC AGT GAA GGA 1392 Ser Pro Val Val Asp Asn Ile Lys Phe Asp Val Arg His Ser Glu Gly 370 375 380 CCT GAT ACA CCA TAT TAT GCT TAC CAC GGC TAT TGG GCG GAT AAT TTC 1440 Pro Asp Thr Pro Tyr Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Ala Asp Asn Phe 385 390 395 400 GGG GAA TTG AAC CCG CAT TTC GGT TCC ATG GCG GAT TTC CAT GAA ATG 1488 Gly Glu Leu Asn Pro His Phe Gly Ser Met Ala Asp Phe His Glu Met 405 410 415 ATT GAT GCG GCA CAT GAA CGC GGC ATT AAA ATC ATG GTT GAT GTG GTG 1536 Ile Asp Ala Ala His Glu Arg Gly Ile Lys Ile Met Val Asp Val Val 420 425 430 TTG AAT CAC ACT GGT TAT GGA TTG AAA CCA GGT GAC AGC AGC AGT GTG 1584 Leu Asn His Thr Gly Tyr Gly Leu Lys Pro Gly Asp Ser Ser Ser Val 435 440 445 GCG AAC TTC CCG ACA GAT GAG GAC CGA GCT CGC TTT GAC GGA ATG CTT 1632 Ala Asn Phe Pro Thr Asp Glu Asp Arg Ala Arg Phe Asp Gly Met Leu 450 455 460 CGT GAT GGC GGA TCT GGT GAA GTT CGA GGC GAG CTT GCT GGC CTT CCA 1680 Arg Asp Gly Gly Ser Gly Glu Val Arg Gly Glu Leu Ala Gly Leu Pro 465 470 475 480 GAT TTT CTG ACG GAA AAC CCG GAT GTC CGT GAA CAG GTG GTG CAA TGG 1728 Asp Phe Leu Thr Glu Asn Pro Asp Val Arg Glu Gln Val Val Gln Trp 485 490 495 CAG ACG GAC TGG ATC GAA AAG TCC AGG ACG GCA AAG GGC AAC ACC ATC 1776 Gln Thr Asp Trp Ile Glu Lys Ser Arg Thr Ala Lys Gly Asn Thr Ile 500 505 510 GAT TAT TTC CGT GTC GAC ACC GTC AAG CAT GTG GAA GAC ACC ACT TGG 1824 Asp Tyr Phe Arg Val Asp Thr Val Lys His Val Glu Asp Thr Thr Trp 515 520 525 ATG GCG TTT AAA AAT GCT TTG ACA AAA GCG ATG CCG GAA CAC AAG CTG 1872 Met Ala Phe Lys Asn Ala Leu Thr Lys Ala Met Pro Glu His Lys Leu 530 535 540 ATT GGG GAA GCA TGG GGA GCA AAT GTC AAT GAC GAC CTA GGT TAT CTG 1920 Ile Gly Glu Ala Trp Gly Ala Asn Val Asn Asp Asp Leu Gly Tyr Leu 545 550 555 560 Asn Ser Gly Met Met Asp Ser Leu Leu Asp Phe Asp Phe Lys Asn Tyr 565 570 575 GCC CGT GAC TTT GCA AAC GGA CAG CTG GAT GCG GTT CAG CAA AAA CTT 2016 Ala Arg Asp Phe Ala Asn Gly Gln Leu Asp Ala Val Gln Gln Lys Leu 580 585 590 GAG GCG CGT AAC AGC AAG TTG AAC AAT ACT GCA ACA CTT GGT CAA TTT 2064 Glu Ala Arg Asn Ser Lys Leu Asn Asn Thr Ala Thr Leu Gly Gln Phe 595 600 605 TTA GGA AGC CAT GAC GAA GAC CGC TTC TAT GAG GTG GTG GAA GGA GAC 2112 Leu Gly Ser His Asp Glu Asp Arg Phe Tyr Glu Val Val Glu Gly Asp 610 615 620 CTT GGC AAG TAT CAA GTT GCT GCA TCC CTT CAA CTG ACG GCA AAG GGT 2160 Leu Gly Lys Tyr Gln Val Ala Ala Ser Leu Gln Leu Thr Ala Lys Gly 625 630 635 640 CAG CCT GTT ATC TAT TAC GGA GAA GAG CTG GGC TTG CCT GGT AAG AAC 2208 Gln Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Glu Glu Leu Gly Leu Pro Gly Lys Asn 645 650 655 GAT TAT CCG TAT TAT ACG AAC CGC CAG AAC ATG CCT TGG GAT GAT GTG 2256 Asp Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Gln Asn Met Pro Trp Asp Asp Val 660 665 670 GAT GGT AAT GAA ATT CTA GAG CAT TAT CAA AAA TTA CTG GCA TTC CGT 2304 Asp Gly Asn Glu Ile Leu Glu His Tyr Gln Lys Leu Leu Ala Phe Arg 675 680 685 AAT GAT AAT CCG AAC ACA TTT GCT AAA GGA GAC CGC AAA AAG GTA GCG 2352 Asn Asp Asn Pro Asn Thr Phe Ala Lys Gly Asp Arg Lys Lys Val Ala 690 695 700 GGA TCT GAC AGT GAA GGA TAT CTT TTA TTT TCA CGG ACG TAC GGG GAA 2400 Gly Ser Asp Ser Glu Gly Tyr Leu Leu Phe Ser Arg Thr Tyr Gly Glu 705 710 715 720 AAT TCC GTT TAT GTA GGT TTG AAT ACG GAA GCT GCT GCG AAA GAC GTA 2448 Asn Ser Val Tyr Val Gly Leu Asn Thr Glu Ala Ala Ala Lys Asp Val 725 730 735 ACC TTG AAC TTC GGT TCT TCA GAA GCA GTG GTG ACG GAC CGC TAT TCC 2496 Thr Leu Asn Phe Gly Ser Ser Glu Ala Val Val Thr Asp Arg Tyr Ser 740 745 750 GGT CAG GAG TAC CAA GCA AAT GAA GAA GGC CAA GTG ACG TTC TCT ATT 2544 Gly Gln Glu Tyr Gln Ala Asn Glu Glu Gly Gln Val Thr Phe Ser Ile 755 760 765 CCG GCG ATG GAA GAC GGG GGA ACG GTC CTG CTT GAA GTG GAA AAT GGA 2592 Pro Ala Met Glu Asp Gly Gly Thr Val Leu Leu Glu Val Glu Asn Gly 770 775 780 GCA GTG CCA CCT GTG GAG GAA GAA CCA ACT GAG CCA GGT GAA ATC GAA 2640 Ala Val Pro Pro Val Glu Glu Glu Pro Thr Glu Pro Gly Glu Ile Glu 785 790 795 800 GAA AAC ACG CTT CGG ATT CAC TAC CAG CGC ACA GAC AAC AGC TAC GAA 2688 Glu Asn Thr Leu Arg Ile His Tyr Gln Arg Thr Asp Asn Ser Tyr Glu 805 810 815 AAC CTT GGT CTA TGG TTA TGG GGA GAC GTC GCG GCA CCA TCT GAA AAC 2736 Asn Leu Gly Leu Trp Leu Trp Gly Asp Val Ala Ala Pro Ser Glu Asn 820 825 830 TGG CCA TCA GGC GGC ACA CCG TTC CAA GCA GGT AAT GTA ACA GAC TAT 2784 Trp Pro Ser Gly Gly Thr Pro Phe Gln Ala Gly Asn Val Thr Asp Tyr 835 840 845 GGT GCA TAT GTC GAT GTG GAA TTG GCA GAA GAT GCT CAA AAT ATT GGA 2832 Gly Ala Tyr Val Asp Val Glu Leu Ala Glu Asp Ala Gln Asn Ile Gly 850 855 860 TTC CTT GTT TTG AAC ACC ACA AAC GGT GAC AAG GAC GGC GGC GAC AAA 2880 Phe Leu Val Leu Asn Thr Thr Asn Gly Asp Lys Asp Gly Gly Asp Lys 865 870 875 880 GCA GTA GAA TTG TTC AGT CCG GAT TTA AAT GAG ATT TGG ATC AAA CAA 2928 Ala Val Glu Leu Phe Ser Pro Asp Leu Asn Glu Ile Trp Ile Lys Gln 885 890 895 GGC TCT GAT GAA GTA TTT TTA TAT GAA CCG GTG GAC CTT CCG GCA AAT 2976 Gly Ser Asp Glu Val Phe Leu Tyr Glu Pro Val Asp Leu Pro Ala Asn 900 905 910 ACG GTC CGC ATT CAT TAT GAA AGA ACC AAT GCC GAC TAT GAA GGC TGG 3024 Thr Val Arg Ile His Tyr Glu Arg Thr Asn Ala Asp Tyr Glu Gly Trp 915 920 925 GGG TTA TGG AAC TGG GAG GAT GTC GAG TCC CCA TCT GAC GGG TGG CCG 3072 Gly Leu Trp Asn Trp Glu Asp Val Glu Ser Pro Ser Asp Gly Trp Pro 930 935 940 AAC GGT GCC GCA GAT GCT GCA GGT ATC GGT AAA TAC GGT GCT TAC TAC 3120 Asn Gly Ala Ala Asp Ala Ala Gly Ile Gly Lys Tyr Gly Ala Tyr Tyr 945 950 955 960 GAC ATC AAG CTG AAA GAA GAT GCT AAT AAA ATT GGT TTC CTT TTT GTG 3168 Asp Ile Lys Leu Lys Glu Asp Ala Asn Lys Ile Gly Phe Leu Phe Val 965 970 975 AAC AAA CAA TCT GGT GGC CAA ACG GGA GAT ATG ACG TTT GAT ATG CTG 3216 Asn Lys Gln Ser Gly Gly Gln Thr Gly Asp Met Thr Phe Asp Met Leu 980 985 990 AAA CAA TAC AAC CAA CTT TTT GTA AAA GAG GGC GAG GAC AAG GTC TAC 3264 Lys Gln Tyr Asn Gln Leu Phe Val Lys Glu Gly Glu Asp Lys Val Tyr 995 1000 1005 ACC AAT CCT TAC GGG ACC GTG CCA TTG GCG CTT GTG TCT GGA GAG GTA 3312 Thr Asn Pro Tyr Gly Thr Val Pro Leu Ala Leu Val Ser Gly Glu Val 1010 1015 1020 TTG TCA GAC AAG TTG ATC AGT CTT ACT TTT ACC AGG ACA GAA GGA TTG 3360 Leu Ser Asp Lys Leu Ile Ser Leu Thr Phe Thr Arg Thr Glu Gly Leu 1025 1030 1035 1040 GAT TTG GAG GAA TTG AAA GAA CAG CTA GAA ATC AAG GAT GTG GAC GGG 3408 Asp Leu Glu Glu Leu Lys Glu Gln Leu Glu Ile Lys Asp Val Asp Gly 1045 1050 1055 AAC GAT GTT TCG TTT ACA GAT GTG ACA ATT GAA GGC GAG AAA ACG GTC 3456 Asn Asp Val Ser Phe Thr Asp Val Thr Ile Glu Gly Glu Lys Thr Val 1060 1065 1070 CAT GTC CAC GGC GAG TTT GAC TTG GAG AAA ATC CCG TTC TCT GTG ACC 3504 His Val His Gly Glu Phe Asp Leu Glu Lys Ile Pro Phe Ser Val Thr 1075 1080 1085 TAT CTG GAC CGC ACC ATT TCT GTA AAA TCA GGC TGG AAA CTG ATC GAC 3552 Tyr Leu Asp Arg Thr Ile Ser Val Lys Ser Gly Trp Lys Leu Ile Asp 1090 1095 1100 GAA ATG TAT GCC TAT GAT GGA AAG CTT GGG GCA GAA TTG CAT GAA GAC 3600 Glu Met Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Leu Gly Ala Glu Leu His Glu Asp 1105 1110 1115 1120 GGG ACG GCT ACT TTG AAA GTA TGG TCG CCA AAA GCG GAC AAT GTG TCT 3648 Gly Thr Ala Thr Leu Lys Val Trp Ser Pro Lys Ala Asp Asn Val Ser 1125 1130 1135 GTT GTA CTT TAT GAC AAA GTT GAC CAG AAC GAG GTT GTA GAC ACC ATT 3696 Val Val Leu Tyr Asp Lys Val Asp Gln Asn Glu Val Val Asp Thr Ile 1140 1145 1150 GAA ATG GTA AAA GGG GAC CGC GGT GTC TGG TCT GTA AAG CTA ACT AAG 3744 Glu Met Val Lys Gly Asp Arg Gly Val Trp Ser Val Lys Leu Thr Lys 1155 1160 1165 GAT AAT ACA GGC CTT GAT AGT TTG AAA GGT TAC TAT TAC CAC TAT GAA 3792 Asp Asn Thr Gly Leu Asp Ser Leu Lys Gly Tyr Tyr Tyr His Tyr Glu ATC ACG CAT GGT GAC GTA ACG AAT CTT GCT CTA GAT CCG TAT GCC AAA 3840 Ile Thr His Gly Asp Val Thr Asn Leu Ala Leu Asp Pro Tyr Ala Lys 1185 1190 1195 1200 TCA ATG GCG GCG TGG AAT AAC GAA GCG GGG GAC AAG GTA GGA AAA GCG 3888 Ser Met Ala Ala Trp Asn Asn Glu Ala Gly Asp Lys Val Gly Lys Ala 1205 1210 1215 GCG ATC GTG GAC ATC GGC TCC ATT GGG CCT GAG CTT GAT TAT GCC GAC 3936 Ala Ile Val Asp Ile Gly Ser Ile Gly Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Asp 1220 1225 1230 ATC CCT GGC TTT GAA AAG CGC GAA GAC ACC ATC ATC TAC GAG GTG CAT 3984 Ile Pro Gly Phe Glu Lys Arg Glu Asp Thr Ile Ile Tyr Glu Val His 1235 1240 1245 GTA CGT GAC TTC ACT TCC GAC CCG AAT ATC GGT GAG GAC CTG AAG GCA 4032 Val Arg Asp Phe Thr Ser Asp Pro Asn Ile Gly Glu Asp Leu Lys Ala 1250 1255 1260 CAG TTC GGT ACA TTT GCT TCT TTC GTG GAA AAG CTG GAT TAC ATT CAA 4080 Gln Phe Gly Thr Phe Ala Ser Phe Val Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln 1265 1270 1275 1280 GAG TTA GGT GTC ACT CAC ATT CAA TTG TTG CCT GTG ATG AGC TAT TAT 4128 Glu Leu Gly Val Thr His Ile Gln Leu Leu Pro Val Met Ser Tyr Tyr 1285 1290 1295 TTC AGC AAT GAA TTT GAG TCT GGG GAG CGC ATG CTG GAG TAT GCT TCA 4176 Phe Ser Asn Glu Phe Glu Ser Gly Glu Arg Met Leu Glu Tyr Ala Ser 1300 1305 1310 ACG GGG ACG AAT TAC AAT TGG GGC TAT GAC CCG CAC AAT TAC TTC TCC 4224 Thr Gly Thr Asn Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro His Asn Tyr Phe Ser 1315 1320 1325 TTA TCC GGC ATG TAC TCC GAA AAC CCT GAG GAC CCG GAA CTG AGA ATC 4272 Leu Ser Gly Met Tyr Ser Glu Asn Pro Glu Asp Pro Glu Leu Arg Ile 1330 1335 1340 AAA GAA TTC AAG AAT CTG ATC AAC GAG ATT CAT AAG CGC GAC ATG GGT 4320 Lys Glu Phe Lys Asn Leu Ile Asn Glu Ile His Lys Arg Asp Met Gly 1345 1350 1355 1360 GTG GTA CTT GAT GTG GTG TTT AAC CAC ACC GCA CAG GTT CAC ATT TTC 4368 Val Val Leu Asp Val Val Phe Asn His Thr Ala Gln Val His Ile Phe 1365 1370 1375 GAG GAC CTT GTA CCA AAC TAC TAT CAC TTC ATG GAT GCG GAC GGA ACC 4416 Glu Asp Leu Val Pro Asn Tyr Tyr His Phe Met Asp Ala Asp Gly Thr 1380 1385 1390 CCA AGA ACT AGC TTT GGC GGT GGA CGT CTT GGA ACG ACA CAT GAA ATG 4464 Pro Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Arg Leu Gly Thr Thr His Glu Met 1395 1400 1405 TCC CGC CGT GTG CTC GTA GAT TCC ATC AAG CAT TGG GTG GAT GAA TAT 4512 Ser Arg Arg Val Leu Val Asp Ser Ile Lys His Trp Val Asp Glu Tyr 1410 1415 1420 AAG GTG GAC GGA TTC CGT TTT GAC ATG ATG GGT GAC CAT GAT GCA GAG 4560 Lys Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Met Met Gly Asp His Asp Ala Glu 1425 1430 1435 1440 AGT ATT CAG ATT GCT TTT GAC GAA GCC AAA AAA TTG AAC CCG AAT ATC 4608 Ser Ile Gln Ile Ala Phe Asp Glu Ala Lys Lys Leu Asn Pro Asn Ile 1445 1450 1455 GTC ATG ATC GGG GAA GGC TGG GTA ACA TTT GCT GGT GAC GAG GGC GAG 4656 Val Met Ile Gly Glu Gly Trp Val Thr Phe Ala Gly Asp Glu Gly Glu 1460 1465 1470 CCG GTC CAG GCG GCC GAT CAA CAA TGG ATG CAA TAT ACC GAA GCA GTG 4704 Pro Val Gln Ala Ala Asp Gln Gln Trp Met Gln Tyr Thr Glu Ala Val 1475 1480 1485 GGT AGC TTC TCG GAT GAA TTC CGC AAC GAG CTG AAA TCC GGT TTC GGA 4752 Gly Ser Phe Ser Asp Glu Phe Arg Asn Glu Leu Lys Ser Gly Phe Gly 1490 1495 1500 AGC GAA GGA CAG CCA CGT TTC ATC ACA GGT GGC GCG GTC AAT GTG CAA 4800 Ser Glu Gly Gln Pro Arg Phe Ile Thr Gly Gly Ala Val Asn Val Gln 1505 1510 1515 1520 CAA ATT TTC GAT AAC ATC AAA GCA CAG CCT CAT AAC TTT ATG GCC GAT 4848 Gln Ile Phe Asp Asn Ile Lys Ala Gln Pro His Asn Phe Met Ala Asp 1525 1530 1535 CAA CCA GGC GAT GTG GTC CAA TAC ATC GAG GCC CAT GAC AAC CTG ACG 4896 Gln Pro Gly Asp Val Val Gln Tyr Ile Glu Ala His Asp Asn Leu Thr 1540 1545 1550 TTA TAC GAT GTC ATC GCA CAA TCT ATC AAA AAA GAT CCG GAA ATC GCG 4944 Leu Tyr Asp Val Ile Ala Gln Ser Ile Lys Lys Asp Pro Glu Ile Ala 1555 1560 1565 GAA AAC GAT TTA GAG ATT CAT AAG CGT ATT CGC GTG GGT AAT GCC ATG 4992 Glu Asn Asp Leu Glu Ile His Lys Arg Ile Arg Val Gly Asn Ala Met 1570 1575 1580 GTC TTG ACG TCT CAA GGT ACG GCA TTC TTA CAC GCA GGA CAG GAA TTT 5040 Val Leu Thr Ser Gln Gly Thr Ala Phe Leu His Ala Gly Gln Glu Phe 1585 1590 1595 1600 GGT CGT ACA AAG CAA TGG AGA GCA CCT GCA ACG GAG GCA CCG TAC AAG 5088 Gly Arg Thr Lys Gln Trp Arg Ala Pro Ala Thr Glu Ala Pro Tyr Lys 1605 1610 1615 TCT ACG TAT ATG ACA GAT GCT GAT GGC AAT CCG TTC GTG TAT CCA TAT 5136 Ser Thr Tyr Met Thr Asp Ala Asp Gly Asn Pro Phe Val Tyr Pro Tyr 1620 1625 1630 TTC ATC CAC GAT TCC TAT GAT TCC TCG GAT ATC ATC AAT CGT TTT GAT 5184 Phe Ile His Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Asp Ile Ile Asn Arg Phe Asp 1635 1640 1645 TGG GAA AAA GCG ACA GAT GCC GAG AAA TAC CCT GTC AAC AAT GTG ACA 5232 Trp Glu Lys Ala Thr Asp Ala Glu Lys Tyr Pro Val Asn Asn Val Thr 1650 1655 1660 CGT GAC TAC ACG GCA GGC TTG ATC GAG CTG CGT CGT TCA TCT GAT GCT 5280 Arg Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Glu Leu Arg Arg Ser Ser Asp Ala 1665 1670 1675 1680 TTC CGT TTA GGT TCT CGT GAA TTG GTC GAT TCC AAT GTG ACA ATG GTT 5328 Phe Arg Leu Gly Ser Arg Glu Leu Val Asp Ser Asn Val Thr Met Val 1685 1690 1695 GAT GCC CCG GAA ATC AAG GAG CAG GAT CTC GTT GTT GCC TAC CGC AGT 5376 Asp Ala Pro Glu Ile Lys Glu Gln Asp Leu Val Val Ala Tyr Arg Ser 1700 1705 1710 GTT TCG ACT GCC GGT GTG GAG TAT TAC ACA TTC GTG AAT GCG GAC ACT 5424 Val Ser Thr Ala Gly Val Glu Tyr Tyr Thr Phe Val Asn Ala Asp Thr 1715 1720 1725 TCC AGT AGA ACA TTG ACC TTA GGG CAG GAT TTG ACA GAG GGC GTA GTG 5472 Ser Ser Arg Thr Leu Thr Leu Gly Gln Asp Leu Thr Glu Gly Val Val 1730 1735 1740 GTG GTC GAT GCA GAA GAG GCT AAT GTA GCC GGT GTA GCT GAG CCT GCT 5520 Val Val Asp Ala Glu Glu Ala Asn Val Ala Gly Val Ala Glu Pro Ala 1745 1750 1755 1760 GGT TTC GAA TTG ACG GCA GAA GGC ATC ACA CTT GAG CCA TTG ACT ACG 5568 Gly Phe Glu Leu Thr Ala Glu Gly Ile Thr Leu Glu Pro Leu Thr Thr 1765 1770 1775 GTT GTC GTC CGT GTA GGC GAG CAG GAA GGG ACA GAC CCG GGT GAT GGG 5616 Val Val Val Arg Val Gly Glu Gln Glu Gly Thr Asp Pro Gly Asp Gly 1780 1785 1790 GAC GGC GAT GGC AAT ACG CCG CCA CCA GGC GAC GGC GAT GGC GAT GGA 5664 Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly 1795 1800 1805 AAC ACG CCA CCA CCA GGG GAT GGG GAT GGC GAT GGA AAC ACG CCT CCT 5712 Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro 1810 1815 1820 CCA GGC AAC GGT AAT GGC AAT AAT CCA GGA ACA CCA CCA GGA AAG GGT 5760 Pro Gly Asn Gly Asn Gly Asn Asn Pro Gly Thr Pro Pro Gly Lys Gly 1825 1830 1835 1840 GGA GAA AAC CCT GGT AAA GGC AAA AAC GAC AAA ACA CCG CCT GGC AAA 5808 Gly Glu Asn Pro Gly Lys Gly Lys Asn Asp Lys Thr Pro Pro Gly Lys 1845 1850 1855 GGT GGG GAC AAT CCA GGT AAG GGG AAC AAG CTA CCA CTT ACC GCA ACC 5856 Gly Gly Asp Asn Pro Gly Lys Gly Asn Lys Leu Pro Leu Thr Ala Thr 1860 1865 1870 GGA ACA CTT AAT TAC ATC CTG TTT GGT GCA ATA ATG TTG GTT CTT GGG 5904 Gly Thr Leu Asn Tyr Ile Leu Phe Gly Ala Ile Met Leu Val Leu Gly 1875 1880 1885 ACG CTG CTG TAT CTA GGG GTC AGA AGA AAA GCA GGA TTG AAA GAA AAA 5952 Thr Leu Leu Tyr Leu Gly Val Arg Arg Lys Ala Gly Leu Lys Glu Lys 1890 1895 1900 ACC TTA TAA AAACAACGGA AAAGTGTGGC AGGGGAATAT CCCGCCACAC 6001 Thr Leu 1905 TTTTTCGTTA TTATAAGGCA TTATTTGCTT GTAGATTAAG GATTCGCTAT 6051 AGGTTATTTT GTGTAACGTA CATTACTTTT CCGTTGGGCC ATATTTATTT 6101 TCCATACCGC TCATTTTTCT TTTCCATTGG GACCACATTT A 6142

【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：８０１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Lys Arg Phe Gln Arg Gly Met Ala Gly Leu Leu Ser Ile Leu -30 -25 -20 Leu Ile Val Ser Met Phe Ala Gly Tyr Leu Pro Ala Arg Ala Ala Ala -15 -10 -5 Glu Thr Gly Asp Lys Arg Ile Glu Phe Ser Tyr Glu Arg Pro Asp Gly 1 5 10 15 Asn Tyr Glu Gly Trp Asn Leu Trp Val Trp Gly Thr Gly Val Lys Asp 20 25 30 Asp Gln Ile Asp Phe Thr Glu Phe Lys Glu Gly Lys Ala Tyr Ala Asp 35 40 45 Ile Ala Val Ser Asp Asn Ala Asp Lys Val Gly Phe Ile Ile Arg Lys 50 55 60 Gly Asp Trp Glu Glu Lys Asp Phe Asp Gly Asp Arg Ser Ile Thr Ile 65 70 75 80 Asn Lys Ile Asp Asn Ile Thr Lys Val His Val Thr Ser Gln Gln Glu 85 90 95 Lys Phe Gly Gln Ile Pro Asp Gly Ser Pro Pro Val Val Ala Asp Gly 100 105 110 Asn Ala Asp Phe Phe Phe Arg Asp Lys Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Glu 115 120 125 Met Asp Lys Val Glu Lys Val Glu Leu Ser Ile Leu Gly Glu Lys Tyr 130 135 140 Glu Met Asn Gly Glu Pro Glu Lys Glu Arg Phe Thr Tyr Thr Leu Ser 145 150 155 160 Asp Leu Pro Thr Gly Glu His Glu Tyr Thr Tyr Leu Val Thr Val Asp 165 170 175 Gly Gln Thr Glu Glu Val Thr Asp Pro Tyr Asn Thr Val Asp Gly Arg 180 185 190 Ser Val Val Glu Tyr Val Thr Ser Asp Val Gln Val Ser Ala Ser Phe 195 200 205 Ile Pro Ala Lys Val Asp Tyr Asn Gln Asn Ala Val Val Lys Val Asp 210 215 220 Ile Glu Ser Glu Thr Glu Thr Lys Ile Arg Glu Met Ser Ile Asn Leu 225 230 235 240 Ser Glu Ile Gly Gly Lys Glu Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ala Leu Asn 245 250 255 Glu Leu Thr Val Ala Val Lys Gln Gly Val Thr Ala Gly Val Lys Asn 260 265 270 Leu Pro Ile Thr Ala Ile Asp Glu Phe Gly Asn Arg His Glu Gly Ser 275 280 285 Ala Thr Leu Glu Val Gln Ala Arg Thr Ile Thr Gly Glu Lys Ala Asp 290 295 300 Phe Asp Trp Asp Gln Ser Val Val Tyr Phe Met Leu Thr Asp Arg Phe 305 310 315 320 Phe Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Asp Pro His Gly Ile Gly Tyr Asp 325 330 335 Thr Ser Lys Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Gly Asp Phe Lys Gly Ile Thr 340 345 350 Gln Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Leu Gly Ile Asn Thr Ile Trp Ile 355 360 365 Ser Pro Val Val Asp Asn Ile Lys Phe Asp Val Arg His Ser Glu Gly 370 375 380 Pro Asp Thr Pro Tyr Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Ala Asp Asn Phe 385 390 395 400 Gly Glu Leu Asn Pro His Phe Gly Ser Met Ala Asp Phe His Glu Met 405 410 415 Ile Asp Ala Ala His Glu Arg Gly Ile Lys Ile Met Val Asp Val Val 420 425 430 Leu Asn His Thr Gly Tyr Gly Leu Lys Pro Gly Asp Ser Ser Ser Val 435 440 445 Ala Asn Phe Pro Thr Asp Glu Asp Arg Ala Arg Phe Asp Gly Met Leu 450 455 460 Arg Asp Gly Gly Ser Gly Glu Val Arg Gly Glu Leu Ala Gly Leu Pro 465 470 475 480 Asp Phe Leu Thr Glu Asn Pro Asp Val Arg Glu Gln Val Val Gln Trp 485 490 495 Gln Thr Asp Trp Ile Glu Lys Ser Arg Thr Ala Lys Gly Asn Thr Ile 500 505 510 Asp Tyr Phe Arg Val Asp Thr Val Lys His Val Glu Asp Thr Thr Trp 515 520 525 Met Ala Phe Lys Asn Ala Leu Thr Lys Ala Met Pro Glu His Lys Leu 530 535 540 Ile Gly Glu Ala Trp Gly Ala Asn Val Asn Asp Asp Leu Gly Tyr Leu 545 550 555 560 Asn Ser Gly Met Met Asp Ser Leu Leu Asp Phe Asp Phe Lys Asn Tyr 565 570 575 Ala Arg Asp Phe Ala Asn Gly Gln Leu Asp Ala Val Gln Gln Lys Leu 580 585 590 Glu Ala Arg Asn Ser Lys Leu Asn Asn Thr Ala Thr Leu Gly Gln Phe 595 600 605 Leu Gly Ser His Asp Glu Asp Arg Phe Tyr Glu Val Val Glu Gly Asp 610 615 620 Leu Gly Lys Tyr Gln Val Ala Ala Ser Leu Gln Leu Thr Ala Lys Gly 625 630 635 640 Gln Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Glu Glu Leu Gly Leu Pro Gly Lys Asn 645 650 655 Asp Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Gln Asn Met Pro Trp Asp Asp Val 660 665 670 Asp Gly Asn Glu Ile Leu Glu His Tyr Gln Lys Leu Leu Ala Phe Arg 675 680 685 Asn Asp Asn Pro Asn Thr Phe Ala Lys Gly Asp Arg Lys Lys Val Ala 690 695 700 Gly Ser Asp Ser Glu Gly Tyr Leu Leu Phe Ser Arg Thr Tyr Gly Glu 705 710 715 720 Asn Ser Val Tyr Val Gly Leu Asn Thr Glu Ala Ala Ala Lys Asp Val 725 730 735 Thr Leu Asn Phe Gly Ser Ser Glu Ala Val Val Thr Asp Arg Tyr Ser 740 745 750 Gly Gln Glu Tyr Gln Ala Asn Glu Glu Gly Gln Val Thr Phe Ser Ile 755 760 765 Pro Ala Met Glu Asp Gly Gly Thr Val Leu Leu Glu Val Glu Asn Gly 770 775 780 Ala Val Pro Pro Val Glu Glu Glu Pro Thr Glu Pro Gly Glu Ile Glu 785 790 795 800 Glu

【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：８９３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Val Pro Leu Ala Leu Val Ser Gly Glu Val Leu Ser Asp Lys Leu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Thr Phe Thr Arg Thr Glu Gly Leu Asp Leu Glu Glu Leu 20 25 30 Lys Glu Gln Leu Glu Ile Lys Asp Val Asp Gly Asn Asp Val Ser Phe 35 40 45 Thr Asp Val Thr Ile Glu Gly Glu Lys Thr Val His Val His Gly Glu 50 55 60 Phe Asp Leu Glu Lys Ile Pro Phe Ser Val Thr Tyr Leu Asp Arg Thr 65 70 75 80 Ile Ser Val Lys Ser Gly Trp Lys Leu Ile Asp Glu Met Tyr Ala Tyr 85 90 95 Asp Gly Lys Leu Gly Ala Glu Leu His Glu Asp Gly Thr Ala Thr Leu 100 105 110 Lys Val Trp Ser Pro Lys Ala Asp Asn Val Ser Val Val Leu Tyr Asp 115 120 125 Lys Val Asp Gln Asn Glu Val Val Asp Thr Ile Glu Met Val Lys Gly 130 135 140 Asp Arg Gly Val Trp Ser Val Lys Leu Thr Lys Asp Asn Thr Gly Leu 145 150 155 160 Asp Ser Leu Lys Gly Tyr Tyr Tyr His Tyr Glu Ile Thr His Gly Asp 165 170 175 Val Thr Asn Leu Ala Leu Asp Pro Tyr Ala Lys Ser Met Ala Ala Trp 180 185 190 Asn Asn Glu Ala Gly Asp Lys Val Gly Lys Ala Ala Ile Val Asp Ile 195 200 205 Gly Ser Ile Gly Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Asp Ile Pro Gly Phe Glu 210 215 220 Lys Arg Glu Asp Thr Ile Ile Tyr Glu Val His Val Arg Asp Phe Thr 225 230 235 240 Ser Asp Pro Asn Ile Gly Glu Asp Leu Lys Ala Gln Phe Gly Thr Phe 245 250 255 Ala Ser Phe Val Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Glu Leu Gly Val Thr 260 265 270 His Ile Gln Leu Leu Pro Val Met Ser Tyr Tyr Phe Ser Asn Glu Phe 275 280 285 Glu Ser Gly Glu Arg Met Leu Glu Tyr Ala Ser Thr Gly Thr Asn Tyr 290 295 300 Asn Trp Gly Tyr Asp Pro His Asn Tyr Phe Ser Leu Ser Gly Met Tyr 305 310 315 320 Ser Glu Asn Pro Glu Asp Pro Glu Leu Arg Ile Lys Glu Phe Lys Asn 325 330 335 Leu Ile Asn Glu Ile His Lys Arg Asp Met Gly Val Val Leu Asp Val 340 345 350 Val Phe Asn His Thr Ala Gln Val His Ile Phe Glu Asp Leu Val Pro 355 360 365 Asn Tyr Tyr His Phe Met Asp Ala Asp Gly Thr Pro Arg Thr Ser Phe 370 375 380 Gly Gly Gly Arg Leu Gly Thr Thr His Glu Met Ser Arg Arg Val Leu 385 390 395 400 Val Asp Ser Ile Lys His Trp Val Asp Glu Tyr Lys Val Asp Gly Phe 405 410 415 Arg Phe Asp Met Met Gly Asp His Asp Ala Glu Ser Ile Gln Ile Ala 420 425 430 Phe Asp Glu Ala Lys Lys Leu Asn Pro Asn Ile Val Met Ile Gly Glu 435 440 445 Gly Trp Val Thr Phe Ala Gly Asp Glu Gly Glu Pro Val Gln Ala Ala 450 455 460 Asp Gln Gln Trp Met Gln Tyr Thr Glu Ala Val Gly Ser Phe Ser Asp 465 470 475 480 Glu Phe Arg Asn Glu Leu Lys Ser Gly Phe Gly Ser Glu Gly Gln Pro 485 490 495 Arg Phe Ile Thr Gly Gly Ala Val Asn Val Gln Gln Ile Phe Asp Asn 500 505 510 Ile Lys Ala Gln Pro His Asn Phe Met Ala Asp Gln Pro Gly Asp Val 515 520 525 Val Gln Tyr Ile Glu Ala His Asp Asn Leu Thr Leu Tyr Asp Val Ile 530 535 540 Ala Gln Ser Ile Lys Lys Asp Pro Glu Ile Ala Glu Asn Asp Leu Glu 545 550 555 560 Ile His Lys Arg Ile Arg Val Gly Asn Ala Met Val Leu Thr Ser Gln 565 570 575 Gly Thr Ala Phe Leu His Ala Gly Gln Glu Phe Gly Arg Thr Lys Gln 580 585 590 Trp Arg Ala Pro Ala Thr Glu Ala Pro Tyr Lys Ser Thr Tyr Met Thr 595 600 605 Asp Ala Asp Gly Asn Pro Phe Val Tyr Pro Tyr Phe Ile His Asp Ser 610 615 620 Tyr Asp Ser Ser Asp Ile Ile Asn Arg Phe Asp Trp Glu Lys Ala Thr 625 630 635 640 Asp Ala Glu Lys Tyr Pro Val Asn Asn Val Thr Arg Asp Tyr Thr Ala 645 650 655 Gly Leu Ile Glu Leu Arg Arg Ser Ser Asp Ala Phe Arg Leu Gly Ser 660 665 670 Arg Glu Leu Val Asp Ser Asn Val Thr Met Val Asp Ala Pro Glu Ile 675 680 685 Lys Glu Gln Asp Leu Val Val Ala Tyr Arg Ser Val Ser Thr Ala Gly 690 695 700 Val Glu Tyr Tyr Thr Phe Val Asn Ala Asp Thr Ser Ser Arg Thr Leu 705 710 715 720 Thr Leu Gly Gln Asp Leu Thr Glu Gly Val Val Val Val Asp Ala Glu 725 730 735 Glu Ala Asn Val Ala Gly Val Ala Glu Pro Ala Gly Phe Glu Leu Thr 740 745 750 Ala Glu Gly Ile Thr Leu Glu Pro Leu Thr Thr Val Val Val Arg Val 755 760 765 Gly Glu Gln Glu Gly Thr Asp Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asn 770 775 780 Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro Pro 785 790 795 800 Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asn Gly Asn 805 810 815 Gly Asn Asn Pro Gly Thr Pro Pro Gly Lys Gly Gly Glu Asn Pro Gly 820 825 830 Lys Gly Lys Asn Asp Lys Thr Pro Pro Gly Lys Gly Gly Asp Asn Pro 835 840 845 Gly Lys Gly Asn Lys Leu Pro Leu Thr Ala Thr Gly Thr Leu Asn Tyr 850 855 860 Ile Leu Phe Gly Ala Ile Met Leu Val Leu Gly Thr Leu Leu Tyr Leu 865 870 875 880 Gly Val Arg Arg Lys Ala Gly Leu Lys Glu Lys Thr Leu 885 890

【図面の簡単な説明】

【図１】アルカリプルラナーゼＹ遺伝子の制限酵素地図
及び各プライマー位置を示す図である。

【図２】サブクローニングによるアルカリプルラナーゼ
Ｙ遺伝子の構築説明図である。

【図３】アルカリプルラナーゼＹのα−アミラーゼ及び
プルラナーゼ活性のpHプロフィールを示す図である。

【図４】ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株染色体ＤＮＡのＰｓｔ
Ｉ消化物をサザンブロッティングし、断片Ａをプローブ
としてハイブリダイゼーションを行った結果を示す図で
ある。サザンフィルターの左側には同時に電気泳動した
λＤＮＡ−ＨｉｎｄIII消化サイズマーカー（ベーリン
ガー社製）の泳動位置及びその各ＤＮＡ断片のサイズを
示した。

【図５】ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株染色体ＤＮＡのＸｂａ
Ｉ消化物をサザンブロッティングし、断片Ｃをプローブ
としてハイブリダイゼーションを行った結果を示す図で
ある。サザンフィルターの左側には同時に電気泳動した
λＤＮＡ−ＨｉｎｄIII消化物サイズマーカー（ベーリ
ンガー社製）の泳動位置及びその各ＤＮＡ断片のサイズ
を示した。

【図６】ＰＣＲに用いたプライマー位置の塩基配列を示
す図である。

【図７】ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株染色体ＤＮＡのＥｃｏ
ＲＩ消化物をサザンブロッティングし、断片Ｄをプロー
ブとしてハイブリダイゼーションを行った結果を示す図
である。サザンフィルターの左側には同時に電気泳動し
たλＤＮＡ-ＨｉｎｄIII消化物サイズマーカー（ベーリ
ンガー社製）の泳動位置及びその各ＤＮＡ断片のサイズ
を示した。

【図８】ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株染色体ＤＮＡのＸｂａ
Ｉ消化物をサザンブロッティングし、断片Ｅをプローブ
としてハイブリダイゼーションを行った結果を示す図で
ある。サザンフィルターの左側には同時に電気泳動した
λＤＮＡ−ＨｉｎｄIII消化物サイズマーカー（ベーリ
ンガー社製）の泳動位置及びその各ＤＮＡ断片のサイズ
を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 荒 勝俊 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (72)発明者 川合 修次 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (72)発明者 伊藤 進 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (56)参考文献 特開 平６−245768（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−245772（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−290498（ＪＰ，Ａ) Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．60，Ｎｏ．10, （1994），ｐ．3764−3773 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 5/28 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ （ＧＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
   配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して１若しくは２
   以上のアミノ酸が置換、付加、欠失、逆位若しくは挿入
   されたアミノ酸配列を有し、かつアルカリα−アミラー
   ゼ活性及びアルカリプルラナーゼ活性を有する蛋白質を
   コードするＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列番号３に記載のアミノ酸配列からな
   るアルカリα−アミラーゼ。
3. 【請求項３】 配列番号３に記載のアミノ酸配列、又は
   配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して１若しくは２
   以上のアミノ酸が置換、付加、欠失、逆位若しくは挿入
   されたアミノ酸配列を有し、かつアルカリα−アミラー
   ゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 遺伝子の発現調節のための塩基配列を有
   するものである請求項１又は３記載のＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 請求項１、３又は４記載のＤＮＡ断片を
   含有する組換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換えＤＮＡを保持する
   形質転換微生物。