CN1183808A

CN1183808A - 具有碱性支链淀粉酶和碱性α－淀粉酶两种活性的酶的基因

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Publication number: CN1183808A
Application number: CN96193821A
Authority: CN
Inventors: 秦田勇二; 五十岚一晓; 尾崎克也; 荒胜俊; 川合修次; 伊藤进
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1995-05-10
Filing date: 1996-05-10
Publication date: 1998-06-03
Anticipated expiration: 2016-05-10
Also published as: EP0830454A1; US6338959B1; CN1150323C; JP3025625B2; WO1996035794A1; US6689874B2; US20020182699A1; JPH08298988A

Abstract

本发明提供了一种编码显示出碱性α－淀粉酶活性的碱性支链淀粉酶的DNA片段、具有3号序列所描述的氨基酸序列和编码该淀粉酶的DNA片段的碱性α－淀粉酶、具有4号序列所描述的氨基酸序列和编码该支链淀粉酶的DNA片段的碱性支链淀粉酶、包含所述DNA片段的重组DNA以及包含该重组DNA的转化过的微生物。本发明的技术使得可以大量生产显示出碱性α－淀粉酶活性的碱性支链淀粉酶。

Description

具有碱性支链淀粉酶和碱性α-淀粉酶两种活性的酶的基因

发明所属技术领域

本发明涉及了一种编码显示出了碱性支链淀粉酶活性和碱性α-淀粉酶活性(碱性淀粉支链淀粉酶)两种活性的酶的基因，本发明也涉及可从编码完整的碱性淀粉支链淀粉酶的基因片段的表达中获得的碱性α-淀粉酶和碱性支链淀粉酶，本发明也涉及编码这些酶促活性的基因和其片段，本发明还涉及携带这些基因和其片段的重组DNA和转化体。

背景技术

α-淀粉酶长期用于各种领域。例如，它已用于在发酵工业中糖化谷物和土豆，在纺织的工业中作为淀粉糊状物清除剂，在制药工业上中作为消化剂，在食品工业中制造浓的麦芽糖糖浆。α-淀粉酶是这样一种酶，它作用于直链淀粉或支链淀粉之类的与淀粉相关的多糖类，可单独切割多糖分子的α-1，4-葡糖苷键。从包括细菌、真菌、植物种子和动物消化腺在内的大量不同来源中，已获得α-淀粉酶的晶体样品或电泳上均一样品。支链淀粉酶是这样一种酶，它可单独水解存在于淀粉、糖原、支链淀粉和茁芽多糖中的α-1，6-葡糖苷键。在一特定的产气气杆菌菌株中首先发现支链淀粉酶(Bender，H.和Wallenfels，K.，生物化学杂志，334，79(1961))，此后，也在包括芽孢杆菌属、链球菌属和梭状芽胞杆菌属在内的许多其它微生物中发现该酶。由于支链淀粉酶在与外型淀粉酶和内型淀粉酶一起使用时，能够从淀粉产生麦芽寡糖(如葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽戊糖和麦芽己糖)，在淀粉制造业中人们已产生了对支链淀粉酶的兴趣。

为了简化如上所述的使用两种或多种酶的糖类的制造过程，非常需要也作用于α-1，4-葡糖苷键的支链淀粉酶，即显示出α-淀粉酶活性的支链淀粉酶。已知枯草芽孢杆菌TU菌株产生支链淀粉酶-淀粉酶复合酶(Takasaki，Y.，农业生物化学，51，9(1987)，日本专利出版物(kokoku) No.1-18717)。此外，已报道上述显示出两种不同的酶促活性的酶或所谓的淀粉支链淀粉酶(amylopul lulanase)由许多细菌产生，这些细菌包括环状芽胞杆菌(日本专利申请公开(kokai)No.64-60376)、Bacillus sp.(Saha，B.C.，等，酶微生物技术，11，760(1989))、布氏热厌氧细菌(Co1eman，R.D.，等.细菌学杂志，169，4302(1987))、Thermoanaerobium sp.(Plant，A.R.，等，应用微生物生物技术，26，427(1987))、Clostidiumthermohydrosulfuricum(Saha，B.C.，等，生物化学杂志，252，343(1988))、热产硫梭菌(Spreinat，A.等，应用微生物生物技术，33，511(1990))、水生栖热菌(Plant，A.R.，等，酶微生物技术，8，668(1986))、Thermus sp.(Nakamura，N.等，淀粉/Starke，41，112(1989))、Thermoanaerobacteriu Msaccharolyticum(Saha，B.C.，等，应用环境微生物，56，881(1990))以及激烈热球菌和Thermococcuslitoralis(Brown，S.H.和Kelley，R.M.，应用环境微生物，59，2614(1993))。

发明人最近发现，当α-淀粉酶和支链淀粉酶掺入去垢剂中时，洗碟去垢剂和洗衣去垢剂的功效能够大大地得到提高(日本专利申请放置-打开(kokai)No.2-132-193)，特别是对淀粉污垢而言。然而，大多数以前在自然界中发现的α-淀粉酶和支链淀粉酶，在中性到碱性的pH值范围内显示出了最大的和稳定的酶促活性，而在pH值9-10的碱性溶液中的几乎不起作用。在碱性的pH值范围内存在很少的可显示出最大活性的酶(碱性支链淀粉酶)，仅有两份报告报到过这样的酶(Nakamura，N.和Horikoshi，K.，生物化学和生物物理学报，397，188(1975)，日本专利出版物(kokoku)No.53-27786和Ara等，日本专利出版物(kokoku)No.6-32613)。此外，直到本发明发明人发现在碱性范围内具有其最佳生长pH值的嗜碱Bacillussp.KSM-AP1378(FERM BP-3048，1989年7月24日保藏在的工业科学和技术机构的发酵研究所，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，305日本)产生一种新的具有碱性支链淀粉酶和碱性α-淀粉酶两种活性的碱性淀粉支链淀粉酶(正式命名为支链淀粉酶Y)之前，具有碱性α-淀粉酶和碱性支链淀粉酶两种活性的酶还未见报道。本发明发明人指出：这种酶可用作为自动洗碗机的去垢组合物和衣服的去垢组合物中的添加剂(日本专利中请公开(kakai)No.3-290498)。这种酶虽然由单一的酶分子构成，但是它显示出碱性α-淀粉酶活性和碱性支链淀粉酶活性。这种酶的开发已证明：与这两种酶分别由不同的细菌独立地产生的现状相比，这种酶的开发在细菌培养及酶的纯化中具有极大的优点。

本发明发明人曾试图通过培养方法的优化来提高碱性淀粉支链淀粉酶(正式命名为支链淀粉酶Y)产生细菌Bacillus sp.KSM-AP1378的生产力。然而，这仍然需要进一步提高细菌的酶生产力，以便在工业规模上有利地生产碱性淀粉支链淀粉。值得注意的是，通过基因工程，酶的生产力可以进一步提高；同时，通过利用蛋白质工程方法改变编码酶的基因，酶本身的活性可以得到提高。这些方法的应用均需要有编码碱性淀粉支链淀粉的基因。

因此，本发明的目的是提供编码碱性淀粉支链淀粉酶的基因、包含该基因的重组DNA以及包含该重组DNA的转化体。

还可以用编码碱性淀粉支链淀粉酶的基因的DNA来产生探针，该探针用于把其它同源碱性淀粉支链淀粉酶基因从其它微生物中分离出来。因而，本发明的另一个目的是提供一种筛选和分离其它碱性淀粉支链淀粉酶的方法。

发明的说明

本发明发明人利用鸟枪法克隆和聚合酶链式反应从嗜碱Bacillus菌株的染色体DNA分离出了一种编码碱性淀粉支链淀粉酶的DNA片段。当他们用连接到适当载体上的这一DNA片段转移微生物时，证实了所形成的重组微生物产生碱性淀粉支链淀粉酶。此外，还发现，由该DNA片段编码的碱性淀粉支链淀粉酶的氨基酸序列完全有别于以前已知的淀粉酶和支链淀粉酶的氨基酸序列，而且，这种酶有一个特征，即酶分子的氨基末端部分是碱性α-淀粉酶，酶分子的羧基末端部分是碱性支链淀粉酶。本发明是基于这个发现完成的。

因此，本发明提供了一种编码碱性淀粉支链淀粉酶的DNA片段。

本发明也提供了具有下文的3号序列所描述的氨基酸序列的碱性α-淀粉酶以及编码该碱性α-淀粉酶的DNA片段。

本发明也提供了具有下文的4号序列所描述的氨基酸序列的碱性支链淀粉酶以及编码该碱性支链淀粉酶的DNA片段。

本发明也提供了包含一种DNA片段的重组DNA，所述DNA片段编码上述碱性淀粉支链淀粉酶，碱性α-淀粉酶或碱性支链淀粉酶。

本发明也提供了一包含重组DNA的转移微生物，该重组体包含一个编码上述的碱性淀粉支链淀粉酶、碱性α-淀粉酶或碱性支链淀粉酶的DNA片段。

本发明还提供了一种产生碱性淀粉支链淀粉酶、碱性α-淀粉酶或碱性支链淀粉酶的方法。该方法的特征是培养上述转化过的微生物并收集任何一种所表达的酶。

附图简要描述

图1显示得自Bacillus sp.KSM-AP1378的碱性淀粉支链淀粉酶基因的限制酶图和引物的位置。

图2显示得自Bacillus sp.KSM-AP1378的碱性淀粉支链淀粉酶基因的亚克隆方案。

图3是显示碱性淀粉支链淀粉酶的α-淀粉酶和支链淀粉酶活性的pH值关系图。

图4显示得自Bacillus sp.KSM-AP1378的KSM-AP1378菌株的染色体DNA的PstI消化产物的Southern杂交分析结果(用片段A为探针)。在Southern滤膜的左侧，同时经历电泳的λDNA-HindIII消化产物(Boehringer Mannheim)的大小标记的位置与各自的DNA片段的大小一道标明。

图5显示得自Bacillus sp.KSM-AP1378的KSM-AP1378菌株的染色体DNA的XbaI消化产物的Southern杂交分析结果(用片段C为探针)。在Southern滤膜的左侧，同时经历电泳的λDNA-HindIII消化产物(Boehringer Mannheim)的大小标记的位置与各自的DNA片段的大小一道标明。

图6显示用于聚合酶链式反应的引物的核苷酸序列。引物1、3、5和B用作互补序列。

图7显示得自Bacillus sp.KSM-AP1378的KSM-AP1378菌株的染色体DNA的EcoRI消化产物的Southern杂交分析结果(用片段D为探针)。在Southern滤膜的左侧，同时经历电泳的λDNA-HindIII消化产物(Boehringer Mannheim)的大小标记的位置与各自的DNA片段的大小一道标明。

图8显示得自Bacillus sp.KSM-AP1378的KSM-AP1378菌株的染色体DNA的XbaI消化产物的Southern杂交分析结果(用片段E为探针)。在Southern滤膜的左侧，同时经历电泳的λDNA-HindIII消化产物(Boehringer Mannheim)的大小标记的位置与各自的DNA片段的大小一道标明。

优选实施方案的详尽描述

在本发明中，一种用作碱性淀粉支链淀粉酶基因供体的有用微生物，可以是如Bacillus sp.KSM-AP1378，其是嗜碱芽孢杆菌。该菌株由本发明发明人从位于日本Tochigi Prefeture的Tochigi市附近的土壤中分离出来，并且鉴定为可产生大量的碱性淀粉支链淀粉酶的菌株。该菌株已以保藏号BP-3048保藏在发酵研究所。

为了从微生物供体中获得染色体DNA，可以使用由Marmur，J.(分子生物学杂志，3，208(1961))及Saito，H.和Miura，K.(Biochim.Biophys.Acta.，72，619(1963))提出的方法。也可以使用其它类似的方法。

使用限制酶切割这样获得的染色体DNA，制备包含碱性淀粉支链淀粉酶基因的DNA片段。对所使用的限制酶没有特别的限制，只要它们不破坏所述基因。也可由聚合酶链式反应获得碱性淀粉支链淀粉酶基因。例如，可以通过合成引物(具有与位于必需区5-末端的上游侧和3′-末端的下游侧的序列相对应的序列，所述必需区基于在2号序列中所描述的核苷酸序列)、用产生碱性淀粉支链淀粉酶的微生物的染色体DNA作为模板进行聚合酶链式反应获得所述基因。另外，可以用以下两种方法中的任何一种方法获得一个完整的基因：首先用任一方法从产生碱性淀粉支链淀粉酶的微生物中获得碱性支链淀粉酶基因片段，而后经聚合酶链式反应扩增一个存在于前一片段上游侧的碱性α-淀粉酶基因片段；或者反过来，首先获得碱性α-淀粉酶基因，其后经聚合酶链式反应扩增存在于该基因下游侧的碱性支链淀粉酶基因片段。

克隆这样制备的片段。可利用的受体/载体系统没有特别的限制，只要受体细菌菌株能表达本发明的碱性淀粉支链淀粉酶基因；重组DNA能够在受体细菌中复制；并且重组DNA能够稳定地携带整合的基因。例如，可以使用其中受体是E.coli k-12的EK系统的成员和其中受体是枯草芽胞杆菌Marburg的BS系统的成员。EK系统包括许多种载体且在遗传学上进行了广泛的研究，使用该系统可以提供良好的结果，因而是优选的。受体细菌的特定的例子包括EK系统的HB101、C600和JM109菌株以及BS系统的BD170、MI11和ISW1214菌株。载体的特定的例子包括EK系统的pBR322和pUC18以及BS系统的pUB110和pHY300PLK。用限制酶切割载体，随后与以上提到的染色体DNA或聚合酶链式反应扩增的DNA片段连接来获得重组质粒DNA。可以通过使用例如DNA连接酶完成该连接。

对用重组DNA转化受体细菌菌株的方法没有特别的限制。例如，在EK系统的受体的情况下可以使用氯化钙方法(Mandel，M.，和Higa，A.，分子生物学杂志，53，159(1970))，而在BS系统的受体的情况下可以使用原生质体方法(Chang，C.和Cohen，S.N.，分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)，168，111(1978))。

重组微生物的选择按如下步骤进行。第一，使用作为指示的载体DNA编码的抗生素抗性(其不被外源染色体DNA片段和聚合酶链式反应扩增的DNA片段的插入灭活)之类的特征，选择已由包含载体来源的DNA片段的DNA转化过的微生物。例如在其中EK系统的pBR322用作载体并且将染色体DNA的BamHI片段插入到pBR322的BamHI切割位点的特定的情况下，四环素抗性基因被灭活，因此，可以利用在基因中不具有BamHI切割位点的氨苄青霉素抗性作为指示进行初步选择。其次，使用例如复制方法，把所选择的微生物转移到包含直链淀粉或者支链淀粉的琼脂平板上，然后培养该微生物形成菌落。检测分解淀粉、在包含直链淀粉的琼脂平板上形成晕圈，也在包含支链淀粉的琼脂平板上形成晕圈的菌落。

可以用制备质粒或噬菌体DNA的标准步骤(Maniatis，T.等，分子克隆，冷泉港实验室，纽约(1982))提取如此获得的重组微生物所携带的重组DNA。利用各种限制酶切割所提取的重组DNA，并分析电泳裂解模式，这两个步骤证实重组DNA是载体DNA和包含碱性淀粉支链淀粉酶基因的DNA片段的连接产物。

编码碱性支链淀粉酶活性，本发明的碱性淀粉支链淀粉酶部分的片段包含在一个约9.4kb的DNA片段中(如图1的限制酶图所示)并存在于约6.2kb的区段上(如斜划线条所示)。

包含碱性淀粉支链淀粉酶基因的大小约6.2kb的片段具有如2号序列所示的核苷酸序列。在这个序列中，5末端和3末端分别对应于约6.2kb的片段的左侧和右侧。在这个序列中观察到一个开放读框，该开放读框在第145个ATG上开始翻译，并编码由1号序列所描述的1938个氨基酸残基形成的序列。在该开放读框上游的15个碱基(15b)中，存在序列GAAAGGGG，该序列高度互补于枯草芽胞杆菌的16s核糖体RNA的3末端序列(McLaughlin，J.R.等，生物化学杂志，256，11283(1981))。在从35位核苷酸中延伸的较远上游侧上，存在一个序列TTTACA......20B......TAAATT，该序列与σ^A型启动子的共有序列具有高度同源性(Gitt，M.A.等，生物化学杂志，260，7178(1985))。在5959位核苷酸的翻译终止密码子TAA的下游侧上，存在一个反向重复序列(核苷酸编号5961-6015)，该序列大概是一个转录终止子。此外，通过纯化Bacillus sp.KSM-AP1378的培养物，获得碱性淀粉支链淀粉酶中的氨基末端侧上的14个残基的氨基酸序列，该序列与由本发明的DNA片段的核苷酸序列推定的从第一个氨基酸延伸的序列(2号序列中1-14位氨基酸)相符合。

通过将本发明的基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列同迄今为止已知的α-淀粉酶和支链淀粉酶的核苷酸序列和氨基酸序列进行比较，证实本发明的基因是一种具有独特的核苷酸序列的新基因，该基因编码的氨基酸序列不同于α-淀粉酶或支链淀粉酶的氨基酸序列。

此外，本发明的基因的特征在于：该基因编码具有两个活性中心的酶，一个活性中心是碱性α-淀粉酶的，另一个是碱性支链淀粉酶的，两个活性中心都在蛋白质的一个单一肽链中。存在从淀粉酶(430-613位氨基酸)和支链淀粉酶(1364-1549位氨基酸)的活性中心唯一观察到的四种序列中的每一种(区域I-IV；Nakajima，R.等，应用微生物生物技术，23，355(1986))。具体地说，在2号序列的氨基酸序列中，I区的碱性α-淀粉酶＝430-435，II区的碱性α-淀粉酶＝514-522，III区的碱性α-淀粉酶＝547-550，IV区的＝608-613，I区的碱性支链淀粉酶＝1364-1369，II区的碱性支链淀粉酶＝1428-1436，III区的碱性支链淀粉酶＝1461-1464，IV区的碱性支链淀粉酶＝1544-1549。此外，在可能是分别编码α-淀粉酶和碱性支链淀粉酶的结构基因之间，一种由33个氨基形成的间插序列出现了两次(在2号序列的氨基酸中，802-834和912-944)。因此，利用这个典型特征，以一种独立方式表达碱性α-淀粉酶部分和碱性支链淀粉酶部分也是可能的。例如，如果将编码从起始密码子开始延伸到间插序列之前的氨基酸骨架的基因插入到质粒载体DNA中，并把该氨基酸引入到一种合适的受体细菌中，那么就可能单独产生碱性α-淀粉酶(3号序列)。同样地，如果编码从间插序列之后延伸到1906位氨基酸的氨基酸骨架的基因插入到质粒载体DNA中，并把该氨基酸引入到一种合适的受体细菌中，那么就可能单独产生碱性支链淀粉酶(4号序列)。

一种包含碱性淀粉支链淀粉酶基因的整个区的优选的重组DNA的实例是质粒pAP101(图2)。该质粒大小为13.4kb，具有包含6.2kb的碱性淀粉支链淀粉酶基因及pHY300PLK和pUC18的部分片段。一种包含重组DNA的优选的重组微生物的实例是大肠杆菌HB101(pAP101)菌株。该菌株是利用标准转化方法用重组质粒pAP101转化大肠杆菌HB101菌株获得的一种产物。当利用日常用于培养大肠杆菌的培养基培养该菌株时，该菌株产生碱性淀粉支链淀粉酶。这样产生的酶的最佳反应pH，对α-淀粉酶活性而言是pH值8-9，对支链淀粉酶活性而言是pH值9-10。这与为碱性淀粉支链淀粉酶(由基因供体细菌Bacillus Sp.KSM-AP1378产生)测定的酶活性-pH值关系轮廓(图3)吻合得很好。

本发明的DNA片段不必仅限于那些编码以下序列表中所显示的氨基酸的DNA片段，只要这些片段能编码一种具有人们感兴趣的酶促活性的蛋白质，并且它们包含编码其中一个或多个氨基酸被取代、添加、缺失、反向、或插入的氨基酸序列的DNA片段。一种这样的DNA的例子是编码等同于1号序列所描述的氨基酸序列(从中N-末端侧上32个氨基酸被缺失)的DNA。因此本发明包括1号序列所示的碱性淀粉支链淀粉酶，其中1至32位之间的氨基酸已从氨基末端缺失。

用已知方法培养这样获得的转化体时，可产生碱性α-淀粉酶，碱性支链淀粉酶或碱性淀粉支链淀粉酶。那就是说，如果利用一种包含仅能编码碱性α-淀粉酶的结构域的转化体，将获得碱性α-淀粉酶；如果利用一种包含仅能编码碱性支链淀粉酶的结构域的转化体，将获得碱性支链淀粉酶；如果利用一种包含编码整个碱性淀粉支链淀粉酶的结构域的转化体，将获得碱性淀粉支链淀粉酶。

本发明的DNA片段还可用作探针，从其它有机体分离同源碱性淀粉支链淀粉酶基因。

实施例

下一步将通过实施例更详细地描述本发明，但不应该理解为是对本发明的限制。在实施例中的浓度都是依据重量％的。实施例1-染色体DNA的分离

把产生碱性淀粉支链淀粉酶的Bacillus sp.KSM-AP1378接种到5毫升培养基A(表1)中，并使之在30℃下经历24小时的震荡培养。把1毫升培养物接种在100毫升相同的培养基中，随后在30℃下再震荡培养12小时。其后，离心收集细胞，按照Saito和Miura提出的方法(Saito，H.和Miura K.，生物化学生物物理学报，72，619(1963))，获得约1毫克染色体DNA。

表 1

培养基A的组成支链淀粉 1.0％胰化蛋白胨 0.2％酵母提取物 0.1％KH₂PO₄ 0.03％(NH₄)₂SO₄ 0.1％MgSO₄·7H₂O 0.02％CaCl₂·2H₂O 0.02％FeSO₄·7H₂O 0.001％MnCL₂·4H₂O 0.0001％Na₂CO₃ 0.5％(已单独地灭菌)

PH值：10实施例2-编码碱性支链淀粉酶的DNA片段的分离利用限制酶PstI切割由实施例1所获得的染色体DNA(10微克)，而后，添加同样被限制酶PstI切割的载体质粒pBR322(1微克，BoehringerMannheim)，并且利用T4 DNA连接酶进行连接反应，进而产生重组质粒的混合物。经重组质粒混合物的转化产生大肠杆菌的悬液，把该悬液扩散到包含15微克/毫升四环素的LB琼脂平板培养基(1.0％胰胨(Difco)、0.5％酵母抽提物(Difco)、1.0％NaCl及1.5％琼脂(Wako化学纯化的))上，并在37℃下培养12小时。在出现的转化细胞菌落中，覆盖包含0.2％支链淀粉的0.8％琼脂、0.8％红色支链淀粉(red pullulan)(Kanno，M.和Tomiura，E.，农业生物化学，49，1529(1985))、1毫克/毫升的溶菌酶和甘氨酸-NaCl-NaOH缓冲液(pH值9.0)；并在37℃下进行反应5小时。结果获得一种单一菌株，由于红色支链淀粉的分解，该菌株在其菌落周围形成一个透明晕圈。分离该菌株作为能够产生碱性支链淀粉酶的重组微生物。实施例3-具有碱性支链淀粉酶的DNA质粒的限制图

把实施例2所获得的重组微生物接种到包含15微克/毫升四环素的5毫升LB培养基(1.0％胰胨(Difco)、0.5％酵母抽提物(Difco)、1.0％NaCl)中，并在37℃下培养一夜。此后，把培养物转移到500毫升LB培养基中，然后震荡培养24小时。从培养物中分离收集细胞，利用标准方法(Maniatis，T.等，分子克隆，冷泉港实验室(1982))，获得约500毫克重组质粒。如图1所示，从所形成的重组质粒的限制酶图谱中可以看出：该质粒包含约6.3kb的PstI片段。该质粒命名为pPU100。而利用质粒pPU100所转化的大肠杆菌HB101菌株则命名为HB101(pPU100)。实施例4-碱性支链淀粉酶活性的测量：

将菌株HB101(pPU100)在5毫升LB培养基(包含四环素)培养一整夜，获得该菌株的的培养物，把1毫升培养物接种到100毫升LB培养基(包含四环素)中，而后在37℃下震荡培养24小时。其后，把通过离心分离的细胞悬浮在Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)中，并超声处理破裂这些细胞。通过离心分离除去细胞碎片，上清液则用作无细胞提取物。同样地，利用菌株HB101(pBR322)制备对照的无细胞提取物。测量这些提取物的支链淀粉酶活性。测量支链淀粉酶活性的步骤是：首先进行一个反应，该反应在包含40mM甘氨酸-NaCl-NaOH缓冲液(pH值10)和支链淀粉(最后的浓度＝0.25％)的反应混合物中进行；同时，利用3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法(Miller，G.L.等，Anal.Biochem.，2，127(1960))定量测定所产生的还原糖。把每分钟产生数量相当于1μmol葡萄糖的还原糖时的酶量作为一个单位。结果检测到：在菌株HB101(pPU100)的无细胞提取物中存在支链淀粉酶活性。另外，测量产生支链淀粉酶的最佳作用pH值时发现：支链淀粉酶实际上是一种具有最佳作用pH值为9.5的碱性支链淀粉酶。为了测量酶促活性，需要利用下列缓冲液(各40mM)：pH值3.5-5.5：醋酸缓冲液pH值5.5-8.5：Tris-顺丁烯二酸缓冲液pH值8.5-10.5：甘氨酸-NaCl-NaOH缓冲液pH值10.5-11.0：Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液实施例5-碱性淀粉支链淀粉酶基因与用PstI消化的Bacillus sp.KSM-AP1378染色体DNA的Southern杂交

用限制酶PstI切割约5微克的pPU100，并使之在琼脂糖凝胶上电泳。利用Geneclean试剂盒(Biolol公司)，从该凝胶中分离出约0.5微克的大小约6.3kb的PstI片段。用DNA标记检测试剂盒(Boehringer Mannheim)标记PstI片段制备DNA探针。独立地，用PstI切割来源于Bacillus sp.KSM-AP1378的染色体DNA(各3μg)，在琼脂糖凝胶上电泳；并利用由Southern提出的方法(Southern，E.M.，分子生物学杂志，98，503(1975))，把DNA带转移至尼龙膜(Amersham)上。利用DNA标记和检测试剂盒研究用DNA探针杂交的情况。结果表明：如图4所示，KSM-AP1378菌株的染色体DNA的PstI裂解产物中，检测到一种大小约6.3kb的与DNA探针杂交的DNA片段的存在。这样可以证实：包含在质粒pPU100中的大小约6.3kb的PstI片段是来源于Bacillus sp.KSM-AP1378染色体DNA的片段。实施例6-包含编码碱性支链淀粉酶的DNA片段之质粒的构建

在质粒pHY300PLK的PstI位点和BamHl位点之间，通过插入约3.5kb大小的片段(片段B，图1)产生重组质粒pHYPUL，所述3.5kb片段通过用BamHI切割包含在质粒pPU100中的大小约6.3kb的PstI片段获得。用这样产生的重组质粒转移大肠杆菌，同时，通过类似于实施例4的方法测量支链淀粉酶活性。结果观察到支链淀粉酶活性，该活性在pH值9-10范围内具有最佳作用pH。这说明碱性支链淀粉酶的必需结构域是从PstI位点到BamHI位点的大小约3.5kb的一段。实施例7-编码碱性支链淀粉酶的DNA片段的测序

用实施例6中获得的片段B、市售的缺失试剂盒(千序列缺失试剂盒，Takara Shuzo)和两种合适的限制酶，产生包含所产生的已被还原的片段的重组质粒DNA，并测定所插入的片段的核苷酸序列。依据使用荧光标记引物的方法(Smith L.M.等，自然，321，674(1986))，利用DNA测序仪序列(370A型，应用生物系统)和Taq-Dydeoxy循环测序试剂盒(应用生物系统测定核苷酸序列。从各自的DNA样品中重叠具有约300-450个bp大小的核苷酸序列，从而测定在片段B的Pst1位点侧面上的3038bp序列。结果发现：碱性支链淀粉酶基因的开放读框(开放读框)延续到PstI位点的上游侧，其是所获得的约6.3kb大小的片段的末端。碱性淀粉支链淀粉酶基因的限制性作图实施例8：

使用如图1所示的约6.3kb大小的片段，产生约1.5kb大小的PstI-XbaI片段(片段C)，同时以类似于实施例5所描述的的方式标记该片段，从而制备DNA探针(探针1)。单独地，使已用XbaI(各3微克)切割的Bacillus sp.KSM-AP1378的染色体DNA在琼脂糖凝胶上电泳；同时，用类似于实施例5所描述的方式把所产生的DNA带转移至尼龙膜(Amersham)上，其后以探针杂交该DNA带。结果发现：探针1同具有约2.3kb大小的Xba1片段杂交，且从这推论出，在约6.3kb大小的片段PstI-PstI的上游约0.8 kb存在XbaI位点，片段PstI-PstI位于KSM-AP1378菌株的染色体DNA上(图1)。按照反向聚合酶链式反应方法(Triglia，T.等，核酸研究，16，81(1988)；一个循环＝94℃×1分钟+55℃×1分钟+72℃×3分钟，30个循环)，用聚合酶链式反应试剂盒(应用生物系统)，以环状DNA(通过分子内连接用XbaI切割的KSM-AP1378的染色体DNA获得)作为模板，用引物1和引物2(各引物都具有24个核苷酸并基于实施例7所测定的核苷酸序列合成)(图1和图6)扩增从PstI位点到XbaI位点的一段大小约0.8kb片段。以类似于实施例7所描述的方式，测定经过上述扩增的0.8kb片段(片段D)的序列。结果发现：碱性支链淀粉酶的开放读框从片段C延伸至片段D的上游(图1)。实施例9：

以类似于实施例5所描述的方法，标记实施例8所获得的从XbaI伸展至PstI的大小约0.8kb的片段，从而制备DNA探针(探针2)。单独地，使已由EcoRI(各3微克)切割的Bacillus sp.KSM-AP1378的染色体DNA在琼脂糖凝胶上进行电泳；并以类似于实施例5所描述的方式，把所产生的DNA带转移到尼龙膜(Amersham)上，其后以探针2杂交该染色体。从杂交后的EcoRI片段的大小(3.6kb，图7)，可以推论出：在实施例8所获得的片段D上游1.2kb存在EcoRI位点。按照类似实施例8所描述的反向聚合酶链式反应方法，以环状DNA(通过分子内连接用EcoRI切割的KSM-AP1378的染色体DNA获得)作为模板，用引物3和引物4(各引物都具有24个核苷酸并基于实施例8所测定的核苷酸序列合成)(图1和图6)扩增从XbaI位点到这一位点上游1.2kb的一段(片段E)。以类似于实施例7所描述的方式，测定经过上述扩增的1.2kb片段的序列。结果发现：碱性支链淀粉酶的开放读框从片段D延伸至片段E的上游。实施例10：

以类似于实施例5中所描述的方式，标记实施例9所获得的片段E，从而制备DNA探针(探针3)。以类似于实施例8和9的方式，在菌株KSM-AP1378的染色体DNA的XbaI裂解产物上进行杂交分析(图8)。从图1显示的结果可推论出：在片段D的EcoRI位点的上游1.1kb存在XbaI位点，片段D位于菌株KSM-AP1378的染色体DNA中。按照类似实施例8所描述的反向聚合酶链式反应方法，以环状DNA(通过分子内连接用XbaI切割的KSM-AP1378的染色体DNA获得)作为模板，用引物5和引物6(各引物都具有24个核苷酸并基于实施例9所测定的核苷酸序列合成)(图1和图6)扩增从EcoRI位点到这一位点上游1.1kb的一段。以类似于实施例7所描述的方式，测定经过上述扩增的1.1kb片段(片段E)的序列。结果证实：碱性支链淀粉酶基因开放读框的5区从存在于这一片段中的片段E延伸。2号序列描述了本发明基因的完整的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。推定的1号序列14个氨基酸与用碱性淀粉支链淀粉酶在Bacillus sp.KSM-AP1378上实际测定的氨基末端序列相符合，基于这个事实，可以假定本发明基因编码碱性淀粉支链淀粉酶。实施例11：

按照聚合酶链式反应方法(循环＝94℃×1分钟+55℃×1分钟+72℃×3分钟，30个循环)，用聚合酶链式反应试剂盒(应用生物系统)，以菌株KSM-AP1378的染色体DNA为模板，使用各具有25个核苷酸的引物A和B(基于实施例7和10所测定的核苷酸序列合成)(图1和6)扩增包含碱性淀粉支链淀粉酶基因的α-淀粉酶域的3.5kb片段。把所产生的DNA片段插入到pUC18质粒载体的SmaI位点中，然后利用市售的大肠杆菌HB101感受态细胞进行转化。把获得的转化体复制到包含0.4％蓝色淀粉(天青淀粉，σ)和50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基上，其后在37℃下培养12个小时。分离分解蓝色淀粉从而在它的菌落周围形成晕圈的单一菌株。按类似于实施例3所描述的方式，从该菌株中制备质粒(pAMY100)。实施例12-碱性淀粉支链淀粉酶的重组产生

经采用T4连接酶、7.7kb片段(通过切割包含碱性淀粉支链淀粉酶的碱性支链淀粉酶域的质粒pHYPUL获得(实施例3))以及pAMY100(包含相同基因的碱性α-淀粉酶域(实施例11))连接制备重组质粒混合物。用该重组质粒混合物转化大肠杆菌HB101；把出现的各转化体分别复制到两种LB培养基上，一种LB培养基包含0.4％蓝色淀粉和50微克/毫升的氨苄青霉素，另一种LB培养基包含0.8％红色支链淀粉(Kanno，M.和Tomiura，E.，农业生物化学，49，1529(1985))和50微克/毫升的氨苄青霉素；随后在37℃下生长培养12小时。一种菌株在两个平板上的其菌落周围形成晕圈，分离该菌株作为能够产生碱性淀粉支链淀粉酶的重组大肠杆菌。实施例13：

利用实施例12所获得的重组大肠杆菌，以类似于实施例3所描述的方式制备约500微克的重组质粒。从所产生的重组质粒的限制性图谱中可以发现：如图1中所示，该质粒包含约7.0kb的DNA片段(片段H)。这一质粒命名为pAP101(图2)，用质粒pAP101转化的大肠杆菌HB101命名为HB101(pAP101)。实施例14：

以类似于在实施例4所描述的方式，使用大肠杆菌HB101(pAP101)制备无细胞提取物。同时，利用HB101(pBR322)菌株制备对照无细胞提取物。测定这些提取物的α-淀粉酶和支链淀粉酶活性。测定α-淀粉酶的活性的方法是：在包含50mM甘氨酸-NaCl-NaOH缓冲液(pH值10)和可溶淀粉的反应混合物中，在50℃下进行反应15分钟；同时，用DNS方法定量测定所产生的还原糖。以类似于在实施例4中所描述的方式测量支链淀粉酶活性。在这两种情况下，把每分钟产生数量相当于1μmol葡萄糖的还原糖时的酶量作为一个单位。结果检测到在菌株HB101(pAP101)的无细胞提取物中存在α-淀粉酶和支链淀粉酶活性。当用如实施例4所描述的方法测量α-淀粉酶和支链淀粉酶的最佳作用pH值时，发现在pH值8-9和9-10的范围内，分别观测到最大的α-淀粉酶活性和最大的支链淀粉酶活性。实施例15-碱性淀粉支链淀粉酶的特征确定

从Bacillus sp.KSM-AP1378的培养物中，纯化50毫克碱性淀粉支链淀粉酶(210kDa；日本专利出版物(kokoku)No.6-32613)，将0.1毫克木瓜蛋白酶(σ，5U/微克)添加到该碱性淀粉支链淀粉酶中，同时让其在30℃下水解2分钟。其后，向其中添加10微克的抗蛋白酶(Furuka)，停止该反应。利用DEAE 5PW层析柱(7.5mm×7.5cm；Tsoh)分级分离所形成的分解产物，从而获得具有114kDa和102kDa的蛋白质片段。这两种蛋白质片段的酶促活性测定表明102kDa蛋白质片段仅具有碱性支链淀粉酶活性，114kDa蛋白质片段仅具有碱性α-淀粉酶活性。在仅具有支链淀粉酶活性的102kDa蛋白质片段的氨基酸序列N-末端测定中，测出有序列苏氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-缬氨酸-亮氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-亮氨酸，这完全同从2号序列所描述的核苷酸序列中推论出的第1014至第1029位氨基酸的序列一致。同样地，在仅具有α-淀粉酶活性的114kDa蛋白质片段的氨基酸序列N-末端的测定中，测出有序列谷氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-谷氨酸-精氨酸-脯氨酸的测定，该序列完全同从2号序列所描述的核苷酸序列中推论出的第1至第14位氨基酸的序列一致。这些结果也证明：本发明基因编码碱性淀粉支链淀粉酶蛋白质，该蛋白质具有不同的活性中心，具体地说，即支链淀粉酶活性的活性中心和α-淀粉酶活性的活性。实施例16：

把重组质粒pAP101引入枯草芽孢杆菌ISW1214中，同时通过振荡，在31℃下使转化细胞在包含15微克/毫升四甘氨酸的LB培养基中生长60小时。根据碱性支链淀粉酶活性，发现碱性淀粉支链淀粉酶以每升60个单位的水平分泌。所表达的酶具有一定的最佳pH值范围：直链淀粉酶活性最佳pH值约为8-9，支链淀粉酶活性最佳pH值约为9.5，其值接近于各自的Bacillus sp.KSM-AP1378的碱性淀粉支链淀粉酶的酶促活性的最佳pH值。通过十二烷磺酸钠凝胶电泳测定，所表达的淀粉支链淀粉酶蛋白质的分子质量大约是200-210kDa，其值接近于菌株KSM-AP1378的酶的质量。参考实施例1：

把产生碱性淀粉支链淀粉酶的Bacillus sp.KSM-AP1378菌株接种到10ml的A培养基(表1)中，并使之在30℃下经历2天的震荡培养。把10ml培养物接种到1升的相同培养基中，接着在30℃下再震荡培养3天。其后，离心处理细胞，获得一种包含碱性淀粉支链淀粉酶的粗酶液。通过包括在DEAE纤维素上吸附、在琼脂糖凝胶-α-环(化)糊精的层析柱上亲和层析和在聚丙烯酰氨葡萄糖s-200的层析柱上凝胶过滤等在内的各种处理，纯化该粗酶液，获得一种该酶的电泳上均一的样品。利用蛋白质测序仪476A(应用生物系统)测定这种酶的氨基酸序列的N-末端，测定表明该N-末端具有序列：谷氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-谷氨酸-精氨酸-脯氨酸。参考实施例2：

利用实施例4和14所描述的方法，测定参考实施例1所获得的碱性淀粉支链淀粉酶的α-淀粉酶活性和支链淀粉酶活性的最佳pH。结果观测到：α-淀粉酶活性的最佳pH值在8.5附近，支链淀粉酶活性的最佳pH值在9.5附近。

工业适用性：

按照本发明，获得一种编码在碱性pH值范围内显示出最大活性的碱性淀粉支链淀粉酶基因以及一种包含该基因的微生物是可能的。本发明的应用有利于碱性淀粉支链淀粉酶的大量生产。碱性淀粉支链淀粉酶的特点是：在该酶中有不同的活性中心，一个是支链淀粉酶的，一个是α-淀粉酶的，二者都存在于该酶的单一蛋白质中。

序列表1号序列的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1938个氨基酸

(B)型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：1号序列：Met Lys Lys Arg Phe Gln Arg Gly Met Ala Gly Leu Leu Ser Ile Leu

-30 -25 -20Leu I1e Val Ser Met Phe Ala Gly Tyr Leu Pro Ala Arg Ala Ala Ala

-15 -10 -5Glu Thr Gly Asp Lys Arg Ile Glu Phe Ser Tyr Glu Arg Pro Asp Gly1 5 10 15Asn Tyr Glu Gly Trp Asn Leu Trp Val Trp Gly Thr Gly Val Lys Asp

20 25 30Asp Gln Ile Asp Phe Thr Glu Phe Lys Glu Gly Lys Ala Tyr Ala Asp

35 40 45Ile Ala Val Ser Asp Asn Ala Asp Lys Val Gly Phe Ile Ile Arg Lys

50 55 60Gly Asp Trp Glu Glu Lys Asp Phe Asp Gly Asp Arg Ser Ile Thr Ile65 70 75 80Asn Lys Ile Asp Asn Ile Thr Lys Val His Val Thr Ser Gln Gln Glu

85 90 95Lys Phe Gly Gln Ile Pro Asp Gly Ser Pro Pro Val Val Ala Asp Gly

100 105 110Asn Ala Asp Phe Phe Phe Arg Asp Lys Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Glu

115 120 125Met Asp Lys Val Glu Lys Val Glu Leu Ser Ile Leu Gly Glu Lys Tyr

130 135 140Glu Met Asn Gly Glu Pro Glu Lys Glu Arg Phe Thr Tyr Thr Leu Ser145 150 155 160Asp Leu Pro Thr Gly Glu His Glu Tyr Thr Tyr Leu Val Thr Val Asp

165 170 175Gly Gln Thr Glu Glu Val Thr Asp Pro Tyr Asn Thr Val Asp Gly Arg

180 185 190Ser Val Val Glu Tyr Val Thr Ser Asp Val Gln Val Ser Ala Ser Phe

195 200 205Ile Pro Ala Lys Val Asp Tyr Asn Gln Asn Ala Val Val Lys Val Asp

210 215 220Ile Glu Ser Glu Thr Glu Thr Lys Ile Arg Glu Met Ser Ile Asn Leu225 230 235 240Ser Glu Ile Gly Gly Lys Glu Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ala Leu Asn

245 250 255Glu Leu Thr Val Ala Val Lys Gln Gly Val Thr Ala Gly Val Lys Asn

260 265 270Leu Pro Ile Thr Ala Ile Asp Glu Phe Gly Asn Arg His Glu Gly Ser

275 280 285Ala Thr Leu Glu Val Gln Ala Arg Thr Ile Thr Gly Glu Lys Ala Asp

290 295 300Phe Asp Trp Asp Gln Ser Val Val Tyr Phe Met Leu Thr Asp Arg Phe305 310 315 320Phe Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Asp Pro His Gly Ile Gly Tyr Asp

325 330 335Thr Ser Lys Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Gly Asp Phe Lys Gly Ile Thr

340 345 350Gln Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Leu Gly Ile Asn Thr Ile Trp Ile

355 360 365Ser Pro Val Val Asp Asn Ile Lys Phe Asp Val Arg His Ser Glu Gly

370 375 380Pro Asp Thr Pro Tyr Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Ala Asp Asn Phe385 390 395 400Gly Glu Leu Asn Pro His Phe Gly Ser Met Ala Asp Phe His Glu Met

405 410 415Ile Asp Ala Ala His Glu Arg Gly Ile Lys Ile Met Val Asp Val Val

420 425 430Leu Asn His Thr Gly Tyr Gly Leu Lys Pro Gly Asp Ser Ser Ser Val

435 440 445Ala Asn Phe Pro Thr Asp Glu Asp Arg Ala Arg Phe Asp Gly Met Leu

450 455 460Arg Asp Gly Gly Ser Gly Glu Val Arg Gly Glu Leu Ala Gly Leu Pro465 470 475 480Asp Phe Leu Thr Glu Asn Pro Asp Val Arg Glu Gln Val Val Gln Trp

485 490 495Gln Thr Asp Trp Ile Glu Lys Ser Arg Thr Ala Lys Gly Asn Thr Ile

500 505 510Asp Tyr Phe Arg Val Asp Thr Val Lys His Val Glu Asp Thr Thr Trp

515 520 525Met Ala Phe Lys Asn Ala Leu Thr Lys Ala Met Pro Glu His Lys Leu

530 535 540Ile Gly Glu Ala Trp Gly Ala Asn Val Asn Asp Asp Leu Gly Tyr Leu545 550 555 560Asn Ser Gly Met Met Asp Ser Leu Leu Asp Phe Asp Phe Lys Asn Tyr

565 570 575Ala Arg Asp Phe Ala Asn Gly Gln Leu Asp Ala Val Gln Gln Lys Leu

580 585 590Glu Ala Arg Asn Ser Lys Leu Asn Asn Thr Ala Thr Leu Gly Gln Phe

595 600 605Leu Gly Ser His Asp Glu Asp Arg Phe Tyr Glu Val Val Glu Gly Asp

610 615 620Leu Gly Lys Tyr Gln Val Ala Ala Ser Leu Gln Leu Thr Ala Lys Gly625 630 635 640Gln Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Glu Glu Leu Gly Leu Pro Gly Lys Asn

645 650 655Asp Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Gln Asn Met Pro Trp Asp Asp Val

660 665 670Asp Gly Asn Glu Ile Leu Glu His Tyr Gln Lys Leu Leu Ala Phe Arg

675 680 685Asn Asp Asn Pro Asn Thr Phe Ala Lys Gly Asp Arg Lys Lys Val Ala

690 695 700Gly Ser Asp Ser Glu Gly Tyr Leu Leu Phe Ser Arg Thr Tyr Gly Glu705 710 715 720Asn Ser Val Tyr Val Gly Leu Asn Thr Glu Ala Ala Ala Lys Asp Val

725 730 735Thr Leu Asn Phe Gly Ser Ser Glu Ala Val Val Thr Asp Arg Tyr Ser

740 745 750Gly Gln Glu Tyr Gln Ala Asn Glu Glu Gly Gln Val Thr Phe Ser lle

755 760 765Pro Ala Met Glu Asp Gly Gly Thr Val Leu Leu Glu Val Glu Asn Gly

770 775 780Ala Val Pro Pro Val Glu Glu Glu Pro Thr Glu Pro Gly Glu Ile Glu785 790 795 800Glu Asn Thr Leu Arg Ile His Tyr Gln Arg Thr Asp Asn Ser Tyr Glu

805 810 815Asn Leu Gly Leu Trp Leu Trp Gly Asp Val Ala Ala Pro Ser Glu Asn

820 825 830Trp Pro Ser Gly Gly Thr Pro Phe Gln Ala Gly Asn Val Thr Asp Tyr

835 840 845Gly Ala Tyr Val Asp Val Glu Leu Ala Glu Asp Ala Gln Asn Ile Gly

850 855 860Phe Leu Val Leu Asn Thr Thr Asn Gly Asp Lys Asp Gly Gly Asp Lys865 870 875 880Ala Val Glu Leu Phe Ser Pro Asp Leu Asn Glu Ile Trp Ile Lys Gln

885 890 895Gly Ser Asp Glu Val Phe Leu Tyr Glu Pro Val Asp Leu Pro Ala Asn

900 905 910Thr Val Arg Ile His Tyr Glu Arg Thr Asn Ala Asp Tyr Glu Gly Trp

915 920 925Gly Leu Trp Asn Trp Glu Asp Val Glu Ser Pro Ser Asp Gly Trp Pro

930 935 940Asn Gly Ala Ala Asp Ala Ala Gly Ile Gly Lys Tyr Gly Ala Tyr Tyr945 950 955 960Asp Ile Lys Leu Lys Glu Asp Ala Asn Lys Ile Gly Phe Leu Phe Val

965 970 975Asn Lys Gln Ser Gly Gly Gln Thr Gly Asp Met Thr Phe Asp Met Leu

980 985 990Lys Gln Tyr Asn Gln Leu Phe Val Lys Glu Gly Glu Asp Lys Val Tyr

995 1000 1005Thr Asn Pro Tyr Gly Thr Val Pro Leu Ala Leu Val Ser Gly Glu Val1010 1015 1020Leu Ser Asp Lys Leu Ile Ser Leu Thr Phe Thr Arg Thr Glu Gly Leu1025 1030 1035 1040Asp Leu Glu Glu Leu Lys Glu Gln Leu Glu lle Lys Asp Val Asp Gly

1045 1050 1055Asn Asp Val Ser Phe Thr Asp Val Thr lle Glu Gly Glu Lys Thr Val

1060 1065 1070 His Va1 His Gly Glu Phe Asp Leu Glu Lys Ile Pro Phe Ser Val Thr

1075 1080 1085Tyr Leu Asp Arg Thr Ile Ser Val Lys Ser Gly Trp Lys Leu Ile Asp1090 1095 1100Glu Met Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Leu Gly Ala Glu Leu His Glu Asp1105 1l10 1115 1120Gly Thr Ala Thr Leu Lys Val Trp Ser Pro Lys Ala Asp Asn Val Ser

1125 1130 1135Val Val Leu Tyr Asp Lys Val Asp Gln Asn Glu Val Val Asp Thr Ile

1140 1145 1150Glu Met Val Lys Gly Asp Arg Gly Val Trp Ser Val Lys Leu Thr Lys

1155 1160 1165Asp Asn Thr Gly Leu Asp Ser Leu Lys Gly Tyr Tyr Tyr His Tyr Glu

1170 1175 1180Ile Thr His Gly Asp Val Thr Asn Leu Ala Leu Asp Pro Tyr Ala Lys1185 1190 1195 1200Ser Met Ala Ala Trp Asn Asn Glu Ala Gly Asp Lys Val Gly Lys Ala

1205 1210 1215Ala Ile Val Asp Ile Gly Ser Ile Gly Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Asp

1220 1225 1230Ile Pro Gly Phe Glu Lys Arg Glu Asp Thr Ile lle Tyr Glu Val His

1235 1240 1245Val Arg Asp Phe Thr Ser Asp Pro Asn Ile Gly Glu Asp Leu Lys Ala

1250 1255 1260Gln Phe Gly Thr Phe Ala Ser Phe Val Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln1265 1270 1275 1280Glu Leu Gly Val Thr His Ile Gln Leu Leu Pro Val Met Ser Tyr Tyr

1285 1290 1295Phe Ser Asn Glu Phe Glu Ser Gly Glu Arg Met Leu Glu Tyr Ala Ser

1300 1305 1310Thr Gly Thr Asn Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro His Asn Tyr Phe Ser

1315 1320 1325Leu Ser Gly Met Tyr Ser Glu Asn Pro Glu Asp Pro Glu Leu Arg Ile

1330 1335 1340Lys Glu Phe Lys Asn Leu Ile Asn Glu Ile His Lys Arg Asp Met Gly1345 1350 1355 1360Val Val Leu Asp Val Val Phe Asn His Thr Ala Gln Val His Ile Phe

1365 1370 1375Glu Asp Leu Val Pro Asn Tyr Tyr His Phe Met Asp Ala Asp Gly Thr

1380 1385 1390Pro Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Arg Leu Gly Thr Thr His Glu Met

1395 1400 1405Ser Arg Arg Val Leu Val Asp Ser Ile Lys His Trp Val Asp Glu Tyr

1410 1415 1420Lys Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Met Met Gly Asp His Asp Ala Glu1425 1430 1435 1440Ser Ile Gln Ile Ala Phe Asp Glu Ala Lys Lys Leu Asn Pro Asn Ile

1445 1450 1455Val Met Ile Gly Glu Gly Trp Val Thr Phe Ala Gly Asp Glu Gly Glu

1460 1465 1470Pro Val Gln Ala Ala Asp Gln Gln Trp Met Gln Tyr Thr Glu Ala Val

1475 1480 1485Gly Ser Phe Ser Asp Glu Phe Arg Asn Glu Leu Lys Ser Gly Phe Gly

1490 1495 1500Ser Glu Gly Gln Pro Arg Phe Ile Thr Gly Gly Ala Val Asn Val Gln1505 1510 1515 1520Gln Ile Phe Asp Asn Ile Lys Ala Gln Pro His Asn Phe Met Ala Asp

1525 1530 1535 Gln Pro Gly Asp Val Val Gln Tyr lle Glu Ala His Asp Asn Leu Thr

1540 1545 1550Leu Tyr Asp Val Ile Ala Gln Ser Ile Lys Lys Asp Pro Glu Ile Ala

1555 1560 1565Glu Asn Asp Leu Glu Ile His Lys Arg Ile Arg Val Gly Asn Ala Met

1570 1575 1580Val Leu Thr Ser Gln Gly Thr Ala Phe Leu His Ala Gly Gln Glu Phe1585 1590 1595 1600Gly Arg Thr Lys Gln Trp Arg Ala Pro Ala Thr Glu Ala Pro Tyr Lys

1605 1610 1615Ser Thr Tyr Met Thr Asp Ala Asp Gly Asn Pro Phe Val Tyr Pro Tyr

1620 1625 1630Phe lle His Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Asp lle Ile Asn Arg Phe Asp

1635 1640 1645Trp Glu Lys Ala Thr Asp Ala Glu Lys Tyr Pro Val Asn Asn Val Thr

1650 1655 1660Arg Asp Tyr Thr Ala Gly Leu lle Glu Leu Arg Arg Ser Ser Asp Ala1665 1670 1675 1680Phe Arg Leu Gly Ser Arg Glu Leu Val Asp Ser Asn Val Thr Met Val

1685 1690 1695Asp Ala Pro Glu Ile Lys Glu Gln Asp Leu Val Val Ala Tyr Arg Ser

1700 1705 1710Val Ser Thr Ala Gly Val Glu Tyr Tyr Thr Phe Val Asn Ala Asp Thr

1715 1720 1725Ser Ser Arg Thr Leu Thr Leu Gly Gln Asp Leu Thr Glu Gly Val Val

1730 1735 1740Val Val Asp Ala Glu Glu Ala Asn Val Ala Gly Val Ala Glu Pro Ala1745 1750 1755 1760Gly Phe Glu Leu Thr Ala Glu Gly Ile Thr Leu Glu Pro Leu Thr Thr

1765 1770 1775Val Val Val Arg Val Gly Glu Gln Glu Gly Thr Asp Pro Gly Asp Gly

1780 1785 1790Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly

1795 1800 1805Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro

1810 1815 1820Pro Gly Asn Gly Asn Gly Asn Asn Pro Gly Thr Pro Pro Gly Lys Gly1825 1830 1835 1840Gly Glu Asn Pro Gly Lys Gly Lys Asn Asp Lys Thr Pro Pro Gly Lys

1845 1850 1855Gly Gly Asp Asn Pro Gly Lys Gly Asn Lys Leu Pro Leu Thr Ala Thr

1860 1865 1870Gly Thr Leu Asn Tyr Ile Leu Phs Gly Ala Ile Met Leu Val Leu Gly

1875 1880 1885Thr Leu Leu Tyr Leu Gly Val Arg Arg Lys Ala Gly Leu Lys Glu Lys

1890 1895 1900Thr Leu19052号序列的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：6142个碱基对

(B)型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)来源：

(A)生物体：Bacillus sp.

(B)菌株：KSM-AP1378

(xi)序列描述：2号序列：

TCTA GATGTGCAAT TTTGCGCAAA 24CGATTTCACA TTTACATAAA CAATCTTGGC ATCAATTAAA TTATTTATTG TGCAACTTTG 84TGCAAACGCT TCCACATTTT AGCAAGAAAT GCAAATCATT GTATGGAAAG GGGCAGGGAT 144ATG AAG AAA AGG TTT CAA AGG GGT ATG GCT GGT TTA CTT TCT ATT TTA 192Met Lys Lys Arg Phe Gln Arg Gly Met Ala Gly Leu Leu Ser Ile Leu

-30 -25 -20CTT ATT GTT TCC ATG TTT GCA GGC TAT CTA CCG GCA AGA GCA GCG GCC 240Leu Ile Val Ser Met Phe Ala Gly Tyr Leu Pro Ala Arg Ala Ala Ala

-15 -10 -5GAA ACG GGA GAC AAG CGG ATA GAA TTC AGT TAT GAA CGG CCA GAT GGA 288Glu Thr Gly Asp Lys Arg Ile Glu Phe Ser Tyr Glu Arg Pro Asp Gly

1 5 10 15AAT TAT GAA GGC TGG AAT TTA TGG GTC TGG GGA ACT GGT GTG AAG GAT 336Asn Tyr Glu Gly Trp Ash Leu Trp Val Trp Gly Thr Gly Val Lys Asp

20 25 30GAC CAG ATA GAC TTT ACA GAA TTC AAG GAA GGC AAG GCA TAT GCC GAC 384Asp Gln Ile Asp Phe Thr Glu Phe Lys Glu Gly Lys Ala Tyr Ala Asp

35 40 45ATA GCA GTA AGC GAT AAT GCG GAT AAA GTC GGT TTC ATT ATC CGT AAA 432Ile Ala Val Ser Asp Asn Ala Asp Lys Val Gly Phe Ile Ile Arg Lys

50 55 60GGG GAT TGG GAA GAA AAG GAC TTT GAT GGG GAC AGG TCG ATT ACG ATC 480Gly Asp Trp Glu Glu Lys Asp Phe Asp Gly Asp Arg Ser Ile Thr Ile

65 70 75 80AAT AAG ATC GAT AAC ATC ACC AAA GTG CAT GTA ACA AGC CAG CAG GAA 528Asn Lys Ile Asp Asn Ile Thr Lys Val His Val Thr Ser Gln Gln Glu

85 90 95AAA TTC GGG CAA ATT CCT GAC GGC AGC CCA CCT GTT GTT GCG GAC GGG 576Lys Phe Gly Gln Ile Pro Asp Gly Ser Pro Pro Val Val Ala Asp Gly

100 105 110AAT GCT GAC TTC TTT TTC CGT GAT AAA GAA CTG TAC GCA GCA GGA GAA 624Asn Ala Asp Phe Phe Phe Arg Asp Lys Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Glu

115 l20 125ATG GAT AAG GTT GAG AAA GTC GAA CTG TCC ATT TTA GGC GAA AAA TAC 672Met Asp Lys Val Glu Lys Val Glu Leu Ser Ile Leu Gly Glu Lys Tyr

130 l35 140GAG ATG AAT GGT GAG CCG GAA AAG GAG CGT TTT ACA TAT ACA TTA AGC 720Glu Met Asn Gly Glu Pro Glu Lys Glu Arg Phe Thr Tyr Thr Leu Ser145 150 155 160GAT CTT CCT ACA GGC GAG CAT GAA TAT ACT TAT TTG GTG ACA GTG GAT 768Asp Leu Pro Thr Gly Glu His Glu Tyr Thr Tyr Leu Val Thr Val Asp

165 170 175GGA CAG ACA GAG GAA GTT ACC GAT CCA TAT AAC ACG GTG GAT GGA AGG 816Gly Gln Thr Glu Glu Val Thr Asp Pro Tyr Asn Thr Val Asp Gly Arg

180 185 190TCT GTT GTG GAG TAT GTG ACA TCC GAT GTG CAA GTA TCG GCT TCA TTT 864Ser Val Val Glu Tyr Val Thr Ser Asp Val Gln Val Ser Ala Ser Phe

195 200 205ATA CCC GCA AAG GTT GAT TAT AAC CAG AAC GCT GTG GTG AAG GTA GAC 912Ile Pro Ala Lys Val Asp Tyr Asn Gln Asn Ala Val Val Lys Val Asp

210 215 220ATC GAA TCA GAA ACG GAG ACA AAA ATC CGT GAG ATG TCT ATC AAT CTT 960Ile Glu Ser Glu Thr Glu Thr Lys Ile Arg Glu Met Ser Ile Asn Leu225 230 235 240TCA GAA ATC GGC GGC AAA GAG AAA GCA ACC ATT GAT CCT GCG CTG AAT 1008Ser Glu Ile Gly Gly Lys Glu Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ala Leu Asn

245 250 255GAA TTG ACA GTT GCG GTC AAG CAA GGT GTG ACG GCA GGT GTG AAA AAC 1056Glu Leu Thr Val Ala Val Lys Gln Gly Val Thr Ala Gly Val Lys Asn

260 265 270TTG CCT ATC ACT GCG ATT GAT GAA TTC GGA AAT CGC CAT GAG GGA TCT 1104Leu Pro Ile Thr Ala Ile Asp Glu Phe Gly Asn Arg His Glu Gly Ser

275 280 285GCT ACC TTA GAA GTT CAG GCG CGT ACT ATT ACA GGT GAA AAA GCA GAT 1152Ala Thr Leu Glu Val Gln Ala Arg Thr Ile Thr Gly Glu Lys Ala Asp

290 295 300TTC GAC TGG GAT CAG TCT GTG GTT TAT TTT ATG CTG ACA GAT CGA TTC 1200Phe Asp Trp Asp Gln Ser Val Val Tyr Phe Met Leu Thr Asp Arg Phe305 310 315 320TTT GAT GGG GAT TCA TCG AAC AAT GAC CCT CAT GGT ATT GGC TAT GAC 1248Phe Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Asp Pro His Gly Ile Gly Tyr Asp

325 330 335ACA AGC AAG TCT GGT ACA TAC CAA GGC GGA GAT TTT AAG GGG ATC ACG 1296Thr Ser Lys Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Gly Asp Phe Lys Gly Ile Thr

340 345 350CAA AGG CTT GAT TAC TTG GAC GAG CTT GGA ATC AAT ACG ATC TGG ATC 1344Gln Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Leu Gly Ile Asn Thr Ile Trp Ile

355 3G0 365AGT CCG GTT GTC GAT AAT ATC AAA TTT GAT GTT CGA CAC AGT GAA GGA 1392Ser Pro Val Val Asp Asn Ile Lys Phe Asp Val Arg His Ser Glu Gly

370 375 380CCT GAT ACA CCA TAT TAT GCT TAC CAC GGC TAT TGG GCG GAT AAT TTC 1440Pro Asp Thr Pro Tyr Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Ala Asp Asn Phe385 390 395 400GGG GAA TTG AAC CCG CAT TTC GGT TCC ATG GCG GAT TTC CAT GAA ATG 1488Gly Glu Leu Asn Pro His Phe Gly Ser Met Ala Asp Phe His Glu Met

405 410 415ATT GAT GCG GCA CAT GAA CGC GGC ATT AAA ATC ATG GTT GAT GTG GTG 1536Ila Asp Ala Ala His Glu Arg Gly Ile Lys Ile Met Val Asp Val Val

420 425 430TTG AAT CAC ACT GGT TAT GGA TTG AAA CCA GGT GAC AGC AGC AGT GTG 1584Leu Asn His Thr Gly Tyr Gly Leu Lys Pro Gly Asp Ser Ser Ser Val

435 440 445GCG AAC TTC CCG ACA GAT GAG GAC CGA GCT CGC TTT GAC GGA ATG CTT 1632Ala Asn Phe Pro Thr Asp Glu Asp Arg Ala Arg Phe Asp Gly Met Leu

450 455 460CGT GAT GGC GGA TCT GGT GAA GTT CGA GGC GAG CTT GCT GGC CTT CCA 1680Arg Asp Gly Gly Ser Gly Glu Val Arg Gly Glu Leu Ala Gly Leu Pro465 470 475 480GAT TTT CTG ACG GAA AAC CCG GAT GTC CGT GAA CAG GTG GTG CAA TGG 1728Asp Phe Leu Thr Glu Asn Pro Asp Val Arg Glu Gln Val Val Gln Trp

485 490 495CAG ACG GAC TGG ATC GAA AAG TCC AGG ACG GCA AAG GGC AAC ACC ATC 1776Gln Thr Asp Trp Ile Glu Lys Ser Arg Thr Ala Lys Gly Asn Thr Ile

500 505 510GAT TAT TTC CGT GTC GAC ACC GTC AAG CAT GTG GAA GAC ACC ACT TGG 1824Asp Tyr Phe Arg Val Asp Thr Val Lys His Val Glu Asp Thr Thr Trp

515 520 525ATG GCG TTT AAA AAT GCT TTG ACA AAA GCG ATG CCG GAA CAC AAG CTG 1872Met Ala Phe Lys Asn Ala Leu Thr Lys Ala Met Pro Glu His Lys Leu

530 535 540ATT GGG GAA GCA TGG GGA GCA AAT GTC AAT GAC GAC CTA GGT TAT CTG 1920Ile Gly Glu Ala Trp Gly Ala Asn Val Asn Asp Asp Leu Gly Tyr Leu545 550 555 560AAC AGC GGA ATG ATG GAT TCT TTA CTG GAT TTT GAT TTC AAA AAT TAT 1968Asn Ser Gly Met Met Asp Ser Leu Leu Asp Phe Asp Phe Lys Asn Tyr

565 570 575GCC CGT GAC TTT GCA AAC GGA CAG CTG GAT GCG GTT CAG CAA AAA CTT 2016Ala Arg Asp Phe Ala Asn Gly Gln Leu Asp Ala Val Gln Gln Lys Leu

580 585 590GAG GCG CGT AAC AGC AAG TTG AAC AAT ACT GCA ACA CTT GGT CAA TTT 2064Glu Ala Arg Asn Ser Lys Leu Asn Asn Thr Ala Thr Leu Gly Gln Phe

595 600 605TTA GGA AGC CAT GAC GAA GAC CGC TTC TAT GAG GTG GTG GAA GGA GAC 2112Leu Gly Ser His Asp Glu Asp Arg Phe Tyr Glu Val Val Glu Gly Asp

610 615 620CTT GGC AAG TAT CAA GTT GCT GCA TCC CTT CAA CTG ACG GCA AAG GGT 2160Leu Gly Lys Tyr Gln Val Ala Ala Ser Leu Gln Leu Thr Ala Lys Gly625 630 635 640CAG CCT GTT ATC TAT TAC GGA GAA GAG CTG GGC TTG CCT GGT AAG AAC 2208Gln Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Glu Gln Leu Gly Leu Pro Gly Lys Asn

645 650 655GAT TAT CCG TAT TAT ACG AAC CGC CAG AAC ATG CCT TGG GAT GAT GTG 2256Asp Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Gln Asn Met Pro Trp Asp Asp Val

660 665 670GAT GGT AAT GAA ATT CTA GAG CAT TAT CAA AAA TTA CTG GCA TTC CGT 2304Asp Gly Asn Glu Ile Leu Glu His Tyr Gln Lys Leu Leu Ala Phe Arg

675 680 685AAT GAT AAT CCG AAC ACA TTT GCT AAA GGA GAC CGC AAA AAG GTA GCG 2352Asn Asp Asn Pro Asn Thr Phe Ala Lys Gly Asp Arg Lys Lys Val Ala

690 695 700GGA TCT GAC AGT GAA GGA TAT CTT TTA TTT TCA CGG ACG TAC GGG GAA 2400Gly Ser Asp Ser Glu Gly Tyr Leu Leu Phe Ser Arg Thr Tyr Gly Glu705 710 715 720AAT TCC GTT TAT GTA GGT TTG AAT ACG GAA GCT GCT GCG AAA GAC GTA 2448Asn Ser Val Tyr Val Gly Leu Asn Thr Glu Ala Ala Ala Lys Asp Val

725 730 735ACC TTG AAC TTC GGT TCT TCA GAA GCA GTG GTG ACG GAC CGC TAT TCC 2496Thr Leu Asn Phe Gly Ser Ser Glu Ala Val Val Thr Asp Arg Tyr Ser

740 745 750GGT CAG GAG TAC CAA GCA AAT GAA GAA GGC CAA GTG ACG TTC TCT ATT 2544Gly Gln Glu Tyr Gln Ala Asn Glu Glu Gly Gln Val Thr Phe Ser Ile

755 760 765CCG GCG ATG GAA GAC GGG GGA ACG GTC CTG CTT GAA GTG GAA AAT GGA 2592Pro Ala Met Glu Asp Gly Gly Thr Val Leu Leu Glu Val Glu Asn Gly

770 775 780GCA GTG CCA CCT GTG GAG GAA GAA CCA ACT GAG CCA GGT GAA ATC GAA 2640Ala Val Pro Pro Val Glu Glu Glu Pro Thr Glu Pro Gly Glu Ile Glu785 790 795 800GAA AAC ACG CTT CGG ATT CAC TAC CAG CGC ACA GAC AAC AGC TAC GAA 2688Glu Asn Thr Leu Arg Ile His Tyr Gln Arg Thr Asp Asn Ser Tyr Glu

805 810 815AAC CTT GGT CTA TGG TTA TGG GGA GAC GTC GCG GCA CCA TCT GAA AAC 2736Asn Leu Gly Leu Trp Leu Trp Gly Asp Val Ala Ala Pro Ser Glu Asn

820 825 830TGG CCA TCA GGC GGC ACA CCG TTC CAA GCA GGT AAT GTA ACA GAC TAT 2784Trp Pro Ser Gly Gly Thr Pro Phe Gln Ala Gly Asn Val Thr Asp Tyr

835 840 845GGT GCA TAT GTC GAT GTG GAA TTG GCA GAA GAT GCT CAA AAT ATT GGA 2832Gly Ala Tyr Val Asp Val Glu Leu Ala Glu Asp Ala Gln Asn Ile Gly

850 855 860TTC CTT GTT TTG AAC ACC ACA AAC GGT GAC AAG GAC GGC GGC GAC AAA 2880Phe Leu Val Leu Asn Thr Thr Asn Gly Asp Lys Asp Gly Gly Asp Lys865 870 875 880GCA GTA GAA TTG TTC AGT CCG GAT TTA AAT GAG ATT TGG ATC AAA CAA 2928Ala Val Glu Leu Phe Ser Pro Asp Leu Asn Glu Ile Trp Ile Lys Gln

885 890 895GGC TCT GAT GAA GTA TTT TTA TAT GAA CCG GTG GAC CTT CCG GCA AAT 2976Gly Ser Asp Glu Val Phe Leu Tyr Glu Pro Val Asp Leu Pro Ala Asn

900 905 910ACG GTC CGC ATT CAT TAT GAA AGA ACC AAT GCC GAC TAT GAA GGC TGG 3024Thr Val Arg Ile His Tyr Glu Arg Thr Asn Ala Asp Tyr Glu Gly Trp

915 920 925GGG TTA TGG AAC TGG GAG GAT GTC GAG TCC CCA TCT GAC GGG TGG CCG 3072Gly Leu Trp Asn Trp Glu Asp Val Glu Ser Pro Ser Asp Gly Trp Pro

930 935 940AAC GGT GCC GCA GAT GCT GCA GGT ATC GGT AAA TAC GGT GCT TAC TAC 3120Asn Gly Ala Ala Asp Ala Ala Gly Ile Gly Lys Tyr Gly Ala Tyr Tyr945 950 955 960GAC ATC AAG CTG AAA GAA GAT GCT AAT AAA ATT GGT TTC CTT TTT GTG 3168Asp Ile Lys Leu Lys Glu Asp Ala Asn Lys Ile Gly Phe Leu Phe Val

965 970 975AAC AAA CAA TCT GGT GGC CAA ACG GGA GAT ATG ACG TTT GAT ATG CTG 3216Asn Lys Gln Ser Gly Gly Gln Thr Gly Asp Met Thr Phe Asp Met Leu

980 985 990AAA CAA TAC AAC CAA CTT TTT GTA AAA GAG GGC GAG GAC AAG GTC TAC 3264Lys Gln Tyr Asn Gln Leu Phe Val Lys Glu Gly Glu Asp Lys Val Tyr

995 1000 1005ACC AAT CCT TAC GGG ACC GTG CCA TTG GCG CTT GTG TCT GGA GAG GTA 2312Thr Asn Pro Tyr Gly Thr Val Pro Leu Ala Leu Val Ser Gly Glu Val1010 1015 1020TTG TCA GAC AAG TTG ATC AGT CTT ACT TTT ACC AGG ACA GAA GGA TTG 3360 Leu Ser Asp Lys Leu Ile Ser Leu Thr Phe Thr Arg Thr Glu Gly Leu1025 1030 1035 1040GAT TTG GAG GAA TTG AAA GAA CAG CTA GAA ATC AAG GAT GTG GAC GGG 3408Asp Leu Glu Glu Leu Lys Glu Gln Leu Glu Ile Lys Asp Val Asp Gly

1045 1050 1055AAC GAT GTT TCG TTT ACA GAT GTG ACA ATT GAA GGC GAG AAA ACG GTC 3456Asn Asp Val Ser Phe Thr Asp Val Thr Ile Glu Gly Glu Lys Thr Val

1060 1065 1070CAT GTC CAC GGC GAG TTT GAC TTG GAG AAA ATC CCG TTC TCT GTG ACC 3504His Val His Gly Glu Phe Asp Leu Glu Lys Ile Pro Phe Ser Val Thr

1075 1080 1085TAT CTG GAC CGC ACC ATT TCT GTA AAA TCA GGC TGG AAA CTG ATC GAC 3552Tyr Leu Asp Arg Thr Ile Ser Val Lys Ser Gly Trp Lys Leu Ile Asp

1090 1095 1100GAA ATG TAT GCC TAT GAT GGA AAG CTT GGG GCA GAA TTG CAT GAA GAC 3600Glu Met Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Leu Gly Ala Glu Leu His Glu Asp1105 1110 1115 1120GGG ACG GCT ACT TTG AAA GTA TGG TCG CCA AAA GCG GAC AAT GTG TCT 3648Gly Thr Ala Thr Leu Lys Val Trp Ser Pro Lys Ala Asp Asn Val Ser

1125 1130 1135GTT GTA CTT TAT GAC AAA GTT GAC CAG AAC GAG GTT GTA GAC ACC ATT 3696Val Val Leu Tyr Asp Lys Val Asp Gln Asn Glu Val Val Asp Thr Ile

1140 1145 1150GAA ATG GTA AAA GGG GAC CGC GGT GTC TGG TCT GTA AAG CTA ACT AAG 3744Glu Met Val Lys Gly Asp Arg Gly Val Trp Ser Val Lys Leu Thr Lys

1155 1160 1165GAT AAT ACA GGC CTT GAT AGT TTG AAA GGT TAC TAT TAC CAC TAT GAA 3792Asp Asn Thr Gly Leu Asp Ser Leu Lys Gly Tyr Tyr Tyr His Tyr Glu

1170 1175 1180 ATC ACG CAT GGT GAC GTA ACG AAT CTT GCT CTA GAT CCG TAT GCC AAA 3840Ile Thr His Gly Asp Val Thr Asn Leu Ala Leu Asp Pro Tyr Ala Lys1185 1190 1195 1200TCA ATG GCG GCG TGG AAT AAC GAA GCG GGG GAC AAG GTA GGA AAA GCG 3888Ser Met Ala Ala Trp Asn Asn Glu Ala Gly Asp Lys Val Gly Lys Ala

1205 1210 1215GCG ATC GTG GAC ATC GGC TCC ATT GGG CCT GAG CTT GAT TAT GCC GAC 3936Ala Ile Val Asp Ile Gly Ser Ile Gly Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Asp

1220 1225 1230ATC CCT GGC TTT GAA AAG CGC GAA GAC ACC ATC ATC TAC GAG GTG CAT 3984Ile Pro Gly Phe Glu Lys Arg Glu Asp Thr Ile IIe Tyr Glu Val His

1235 1240 1245GTA CGT GAC TTC ACT TCC GAC CCG AAT ATC GGT GAG GAC CTG AAG GCA 4032Val Arg Asp Phe Thr Ser Asp Pro Asn Ile Gly Glu Asp Leu Lys Ala

1250 1255 1260CAG TTC GGT ACA TTT GCT TCT TTC GTG GAA AAG CTG GAT TAC ATT CAA 4080Gln Phe Gly Thr Phe Ala Ser Phe Val Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln1265 1270 1275 1280GAG TTA GGT GTC ACT CAC ATT CAA TTG TTG CCT GTG ATG AGC TAT TAT 4128Glu Leu Gly Val Thr His Ile Gln Leu Leu Pro Val Met Ser Tyr Tyr

1285 1290 1295TTC AGC AAT GAA TTT GAG TCT GGG GAG CGC ATG CTG GAG TAT GCT TCA 4176Phe Ser Asn Glu Phe Glu Ser Gly Glu Arg Met Leu Glu Tyr Ala Ser

1300 1305 1310ACG GGG ACG AAT TAC AAT TGG GGC TAT GAC CCG CAC AAT TAC TTC TCC 4224Thr Gly Thr Asn Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro His Asn Tyr Phe Ser

1315 1320 1325TTA TCC GGC ATG TAC TCC GAA AAC CCT GAG GAC CCG GAA CTG AGA ATC 4272Leu Ser Gly Met Tyr Ser Glu Asn Pro Glu Asp Pro Glu Leu Arg Ile

1330 1335 1340AAA GAA TTC AAG AAT CTG ATC AAC GAG ATT CAT AAG CGC GAC ATG GGT 4320Lys Glu Phe Lys Asn Leu Ile Asn Glu Ile His Lys Arg Asp Met Gly1345 1350 1355 1360GTG GTA CTT GAT GTG GTG TTT AAC CAC ACC GCA CAG GTT CAC ATT TTC 4368Val Val Leu Asp Val Val Phe Asn His Thr Ala Gln Val His Ile Phe

1365 1370 1375GAG GAC CTT GTA CCA AAC TAC TAT CAC TTC ATG GAT GCG GAC GGA ACC 4416Glu Asp Leu Val Pro Asn Tyr Tyr His Phe Met Asp Ala Asp Gly Thr

1380 1385 1390CCA AGA ACT AGC TTT GGC GGT GGA CGT CTT GGA ACG ACA CAT GAA ATG 4464Pro Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Arg Leu Gly Thr Thr His Glu Met

1395 1400 1405TCC CGC CGT GTG CTC GTA GAT TCC ATC AAG CAT TGG GTG GAT GAA TAT 4512Ser Arg Arg Val Leu Val Asp Ser Ile Lys His Trp Val Asp Glu Tyr

1410 1415 1420AAG GTG GAC GGA TTC CGT TTT GAC ATG ATG GGT GAC CAT GAT GCA GAG 4560Lys Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Met Met Gly Asp His Asp Ala Glu1425 1430 1435 1440AGT ATT CAG ATT GCT TTT GAC GAA GCC AAA AAA TTG AAC CCG AAT ATC 4608Ser Ile Gln Ile Ala Phe Asp Glu Ala Lys Lys Leu Asn Pro Asn Ile

1445 1450 1455GTC ATG ATC GGG GAA GGC TGG GTA ACA TTT GCT GGT GAC GAG GGC GAG 4656Val Met Ile Gly Glu Gly Trp Val Thr Phe Ala Gly Asp Glu Gly Glu

1460 1465 1470CCG GTC CAG GCG GCC GAT CAA CAA TGG ATG CAA TAT ACC GAA GCA GTG 4704Pro Val Gln Ala Ala Asp Gln Gln Trp Met Gln Tyr Thr Glu Ala Val

1475 1480 1485GGT AGC TTC TCG GAT GAA TTC CGC AAC GAG CTG AAA TCC GGT TTC GGA 4752 Gly Ser Phe Ser Asp Glu Phe Arg Asn Glu Leu Lys Ser Gly Phe Gly

1490 1495 1500AGC GAA GGA CAG CCA CGT TTC ATC ACA GGT GGC GCG GTC AAT GTG CAA 4800Ser Glu Gly Gln Pro Arg Phe Ile Thr Gly Gly Ala Val Asn Val Gln1505 1510 1515 1520CAA ATT TTC GAT AAC ATC AAA GCA CAG CCT CAT AAC TTT ATG GCC GAT 4848Gln Ile Phe Asp Asn Ile Lys Ala Gln Pro His Asn Phe Met Ala Asp

1525 1530 1535CAA CCA GGC GAT GTG GTC CAA TAC ATC GAG GCC CAT GAC AAC CTG ACG 4896Gln Pro Gly Asp Val Val Gln Tyr Ile Glu Ala His Asp Asn Leu Thr

1540 1545 1550TTA TAC GAT GTC ATC GCA CAA TCT ATC AAA AAA GAT CCG GAA ATC GCG 4944Leu Tyr Asp Val Ile Ala Gln Ser Ile Lys Lys Asp Pro Glu Ile Ala

1555 1560 1565GAA AAC GAT TTA GAG ATT CAT AAG CGT ATT CGC GTG GGT AAT GCC ATG 4992Glu Asn Asp Leu Glu Ile His Lys Arg Ile Arg Val Gly Asn Ala Met

1570 1575 1580GTC TTG ACG TCT CAA GGT ACG GCA TTC TTA CAC GCA GGA CAG GAA TTT 5040Val Leu Thr Ser Gln Gly Thr Ala Phe Leu His Ala Gly Gln Glu Phe1585 1590 1595 1600GGT CGT ACA AAG CAA TGG AGA GCA CCT GCA ACG GAG GCA CCG TAC AAG 5088Gly Arg Thr Lys Gln Trp Arg Ala Pro Ala Thr Glu Ala Pro Tyr Lys

1605 1610 1615TCT ACG TAT ATG ACA GAT GCT GAT GGC AAT CCG TTC GTG TAT CCA TAT 5136Ser Thr Tyr Met Thr Asp Ala Asp Gly Asn Pro Phe Val Tyr Pro Tyr

1620 1625 1630TTC ATC CAC GAT TCC TAT GAT TCC TCG GAT ATC ATC AAT CGT TTT GAT 5184Phe Ile His Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Asp Ile Ile Asn Arg Phe Asp

1635 1640 1645 TGG GAA AAA GCG ACA GAT GCC GAG AAA TAC CCT GTC AAC AAT GTG ACA 5232Trp G1u Lys Ala Thr Asp Ala Glu Lys Tyr Pro Val Asn Asn Val Thr

1650 1655 1660CGT GAC TAC ACG GCA GGC TTG ATC GAG CTG CGT CGT TCA TCT GAT GCT 5280Arg Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Glu Leu Arg Arg Ser Ser Asp Ala1665 1670 1675 1680TTC CGT TTA GGT TCT CGT GAA TTG GTC GAT TCC AAT GTG ACA ATG GTT 5328Phe Arg Leu Gly Ser Arg Glu Leu Val Asp Ser Asn Val Thr Met Val

1685 1690 1695GAT GCC CCG GAA ATC AAG GAG CAG GAT CTC GTT GTT GCC TAC CGC AGT 5376Asp Ala Pro Glu Ile Lys Glu Gln Asp Leu Val Val Ala Tyr Arg Ser

1700 1705 1710GTT TCG ACT GCC GGT GTG GAG TAT TAC ACA TTC GTG AAT GCG GAC ACT 5424Val Ser Thr Ala Gly Val Glu Tyr Tyr Thr Phe Val Asn Ala Asp Thr

1715 1720 1725TCC AGT AGA ACA TTG ACC TTA GGG CAG GAT TTG ACA GAG GGC GTA GTG 5472Ser Ser Arg Thr Leu Thr Leu Gly Gln Asp Leu Thr Glu Gly Val Val

1730 1735 1740GTG GTC GAT GCA GAA GAG GCT AAT GTA GCC GGT GTA GCT GAG CCT GCT 5520Val Val Asp Ala Glu Glu Ala Asn Val Ala Gly Val Ala Glu Pro Ala1745 1750 1755 1760GGT TTC GAA TTG ACG GCA GAA GGC ATC ACA CTT GAG CCA TTG ACT ACG 5568Gly Phe Glu Leu Thr Ala Glu Gly Ile Thr Leu Glu Pro Leu Thr Thr

1765 1770 1775GTT GTC GTC CGT GTA GGC GAG CAG GAA GGG ACA GAC CCG GGT GAT GGG 5616Val Val Val Arg Val Gly Glu Gln Glu Gly Thr Asp Pro Gly Asp Gly

1780 1785 1790GAC GGC GAT GGC AAT ACG CCG CCA CCA GGC GAC GGC GAT GGC GAT GGA 5664Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly

1795 1800 1805AAC ACG CCA CCA CCA GGG GAT GGG GAT GGC GAT GGA AAC ACG CCT CCT 5712Asn Thr Pro Pro Pro Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asn Thr Pro Pro

1810 1815 1820CCA GGC AAC GGT AAT GGC AAT AAT CCA GGA ACA CCA CCA GGA AAG GGT 5760Pro Gly Asn Gly Asn Gly Asn Asn Pro Gly Thr Pro Pro Gly Lys Gly1825 1830 1835 1840GGA GAA AAC CCT GGT AAA GGC AAA AAC GAC AAA ACA CCG CCT GGC AAA 5808Gly Glu Asn Pro Gly Lys Gly Lys Asn Asp Lys Thr Pro Pro Gly Lys

1845 1850 1855GGT GGG GAC AAT CCA GGT AAG GGG AAC AAG CTA CCA CTT ACC GCA ACC 5856Gly Gly Asp Asn Pro Gly Lys Gly Asn Lys Leu Pro Leu Thr Ala Thr

1860 1865 1870GGA ACA CTT AAT TAC ATC CTG TTT GGT GCA ATA ATG TTG GTT CTT GGG 5904Gly Thr Leu Asn Tyr Ile Leu Phe Gly Ala Ile Met Leu Val Leu Gly

1875 l880 1885ACG CTG CTG TAT CTA GGG GTC AGA AGA AAA GCA GGA TTG AAA GAA AAA 5952Thr Leu Leu Tyr Leu Gly Val Arg Arg Lys Ala Gly Leu Lys Glu Lys

1890 1895 1900ACC TTA TAA AAACAACGGA AAAGTGTGGC AGGGGAATAT CCCGCCACAC 6001Thr Leu1905TTTTTCGTTA TTATAAGGCA TTATTTGCTT GTAGATTAAG GATTCGCTAT 6051AGGTTATTTT GTGTAACGTA CATTACTTTT CCGTTGGGCC ATATTTATTT 6101TCCATACCGC TCATTTTTCT TTTCCATTGG GACCACATTT A 61423号序列的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：801个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：3号序列：Met Lys Lys Arg Phe Gln Arg Gly Met Ala Gly Leu Leu Ser Ile Leu

-30 -25 -20Leu lle Val Ser Met Phe Ala Gly Tyr Leu Pro Ala Arg Ala Ala Ala

-15 -10 -5Glu Thr Gly Asp Lys Arg Ile Glu Phe Ser Tyr Glu Arg Pro Asp Gly1 5 l0 15Asn Tyr Glu Gly Trp Asn Leu Trp Val Trp Gly Thr Gly Val Lys Asp

20 25 30Asp Gln Ile Asp Phe Thr Glu Phe Lys Glu Gly Lys Ala Tyr Ala Asp

35 40 45Ile Ala Val Ser Asp Asn Ala Asp Lys Val Gly Phe Ile Ile Arg Lys

50 55 60Gly Asp Trp Glu Glu Lys Asp Phe Asp Gly Asp Arg Ser Ile Thr Ile65 70 75 80Asn Lys Ile Asp Asn lle Thr Lys Val His Val Thr Ser Gln Gln Glu

85 90 95Lys Phe Gly Gln Ile Pro Asp Gly Ser Pro Pro Val Val Ala Asp Gly

100 105 110Asn Ala Asp Phe Phe Phe Arg Asp Lys Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Glu

115 l20 125Met Asp Lys Val Glu Lys Val Glu Leu Ser lle Leu Gly Glu Lys Tyr

130 l35 140Glu Met Asn Gly Glu Pro Glu Lys Glu Arg Phe Thr Tyr Thr Leu Ser145 150 155 160Asp Leu Pro Thr Gly Glu His Glu Tyr Thr Tyr Leu Val Thr Val Asp

165 170 175Gly Gln Thr Glu Glu Val Thr Asp Pro Tyr Asn Thr Val Asp Gly Arg

180 185 190Ser Val Val Glu Tyr Val Thr Ser Asp Val Gln Val Ser Ala Ser Phe

195 200 205Ile Pro Ala Lys Val Asp Tyr Asn Gln Asn Ala Val Val Lys Val Asp

245 250 255Glu Leu Thr Val Ala Val Lys Gln Gly Val Thr Ala Gly Val Lys Asn

260 265 270Leu Pro Ile Thr Ala Ile Asp Glu Phe Gly Asn Arg His Glu Gly Ser

275 280 285Ala Thr Leu Glu Val Gln Ala Arg Thr Ile Thr Gly Glu Lys Ala Asp

290 295 300Phe Asp Trp Asp Gln Ser Val Val Tyr Phe Met Leu Thr Asp Arg Phe30 5 310 315 320Phe Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Asp Pro His Gly Ile Gly Tyr Asp

325 330 335Thr Ser Lys Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Gly Asp Phe Lys Gly Ile Thr

340 345 350Gln Arg Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Leu Gly Ile Asn Thr Ile Trp Ile

355 360 365Ser Pro Val Val Asp Asn Ile Lys Phe Asp Val Arg His Ser Glu Gly

405 410 415Ile Asp Ala Ala His Glu Arg Gly Ile Lys Ile Met Val Asp Val Val

420 425 430Leu Asn His Thr Gly Tyr Gly Leu Lys Pro Gly Asp Ser Ser Ser Val

435 440 445Ala Asn Phe Pro Thr Asp Glu Asp Arg Ala Arg Phe Asp Gly Met Leu

485 490 495Gln Thr Asp Trp Ile Glu Lys Ser Arg Thr Ala Lys Gly Asn Thr Ile

500 505 510Asp Tyr Phe Arg Val Asp Thr Val Lys His Val Glu Asp Thr Thr Trp

515 520 525Met Ala Phe Lys Asn Ala Leu Thr Lys Ala Met Pro Glu His Lys Leu

565 570 575Ala Arg Asp Phe Ala Asn Gly Gln Leu Asp Ala Val Gln Gln Lys Leu

580 585 590Glu Ala Arg Asn Ser Lys Leu Asn Asn Thr Ala Thr Leu Gly Gln Phe

595 600 605Leu Gly Ser His Asp Glu Asp Arg Phe Tyr Glu Val Val Glu Gly Asp

645 650 655Asp Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Gln Asn Met Pro Trp Asp Asp Val

660 665 670Asp Gly Asn Glu Ile Leu Glu His Tyr Gln Lys Leu Leu Ala Phe Arg

675 680 685Asn Asp Asn Pro Asn Thr Phe Ala Lys Gly Asp Arg Lys Lys Val Ala

725 730 735Thr Leu Asn Phe Gly Ser Ser Glu Ala Val Val Thr Asp Arg Tyr Ser

740 745 750Gly Gln Glu Tyr Gln Ala Asn Glu Glu Gly Gln Val Thr Phe Ser Ile

755 760 765Pro Ala Met Glu Asp Gly Gly Thr Val Leu Leu Glu Val Glu Asn Gly

770 775 780Ala Val Pro Pro Val Glu Glu Glu Pro Thr Glu Pro Gly Glu Ile Glu785 790 795 800Glu4号序列的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：893个碱基对

(B)类型：核酸

(D)拓扑结构：线性

(i i)分子类型：肽

(xi)序列描述：4号序列：Thr Val Pro Leu Ala Leu Val Ser Gly Glu Val Leu Ser Asp Lys Leu1 5 10 15Ile Ser Leu Thr Phe Thr Arg Thr Glu Gly Leu Asp Leu Glu Glu Leu

20 25 30Lys Glu Gln Leu Glu Ile Lys Asp Val Asp Gly Asn Asp Val Ser Phe

35 40 45Thr Asp Val Thr Ile Glu Gly Glu Lys Thr Val His Val His Gly Glu

50 55 60Phe Asp Leu Glu Lys Ile Pro Phe Ser ValThr Tyr Leu Asp Arg Thr65 70 75 80Ile Ser Val Lys Ser Gly Trp Lys Leu Ile Asp Glu Met Tyr Ala Tyr

85 90 95Asp Gly Lys Leu Gly Ala Glu Leu His Glu Asp Gly Thr Ala Thr Leu

100 105 110Lys Val Trp Ser Pro Lys Ala Asp Asn Val Ser Val Val Leu Tyr Asp

115 120 125Lys Val Asp Gln Asn Glu Val Val Asp Thr Ile Glu Met Val Lys Gly

130 135 140Asp Arg Gly Val Trp Ser Val Lys Leu Thr Lys Asp Asn Thr Gly Leu145 150 155 160Asp Ser Leu Lys Gly Tyr Tyr Tyr His Tyr Glu Ile Thr His Gly Asp

165 170 175Val Thr Asn Leu Ala Leu Asp Pro Tyr Ala Lys Ser Met Ala Ala Trp

180 185 190Asn Asn Glu Ala Gly Asp Lys Val Gly Lys Ala Ala Ile Val Asp Ile

195 200 205Gly Ser IIe Gly Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Asp Ile Pro Gly Phe Glu

210 215 220Lys Arg Glu Asp Thr Ile Ile Tyr Glu Val His Val Arg Asp Phe Thr225 230 235 240Ser Asp Pro Asn Ile Gly Glu Asp Leu Lys Ala Gln Phe Gly Thr Phe

245 250 255Ala Ser Phe Val Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Glu Leu Gly Val Thr

260 265 270His Ile Gln Leu Leu Pro Val Met Ser Tyr Tyr Phe Ser Asn Glu Phe

275 280 285Glu Ser G1y Glu Arg Met Leu Glu Tyr Ala Ser Thr Gly Thr Asn Tyr

290 295 300Asn Trp Gly Tyr Asp Pro His Asn Tyr Phe Ser Leu Ser Gly Met Tyr305 310 315 320Ser Glu Asn Pro Glu Asp Pro Glu Leu Arg Ile Lys Glu Phe Lys Asn

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355 360 365Asn Tyr Tyr His Phe Met Asp Ala Asp Gly Thr Pro Arg Thr Ser Phe

370 375 380Gly Gly Gly Arg Leu Gly Thr Thr His Glu Met Ser Arg Arg Val Leu385 390 395 400Val Asp Ser Ile Lys His Trp Val Asp Glu Tyr Lys Val Asp Gly Phe

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885 890

Claims

1.一种DNA片段，该片段编码一种显示出碱性支链淀粉酶和碱性α-淀粉酶活性的碱性淀粉支链淀粉酶。

2.如权利要求1所限定的DNA片段、该片段编码1号序列的氨基酸序列。

3.一种DNA片段，该片段编码显示出碱性α-淀粉酶活性和碱性支链淀粉酶活性并具有修饰过的1号序列所描述的氨基酸序列的蛋白质，其中所述修饰是以取代、添加、缺失、反向、或者插入一个或多个氨基酸的方式进行的。

4.碱性α-淀粉酶，该淀粉酶具有3号序列所描述的氨基酸序列。

5.一种DNA片段，该片段编码具有3号序列所描述的氨基酸序列的碱性α-淀粉酶。

6.一种DNA片段，该片段编码显示出碱性α-淀粉酶活性的并具有修饰过的3号序列所描述的氨基酸序列的蛋白质，其中所述的修饰该是以取代、添加、缺失、反向、或者插入一个或多个氨基酸的方式进行的。

7.一种碱性支链淀粉酶，该淀粉酶具有4号序列所描述的氨基酸序列。

8.一种DNA片段，该片段编码具有4号序列所描述的氨基酸序列的碱性支链淀粉酶。

9.一种DNA片段，该片段编码显示出碱性支链淀粉酶活性的蛋白质并且具有修饰过的4号序列所描述的氨基酸序列的蛋白质，其中所述的修饰该是以取代、添加、缺失、反向、或者插入一个或多个氨基酸的方式进行的。

10.一种如权利要求1、2、3、5、6、8、9或10之任一所限定的DNA片段，该片段还包含能够调节基因表达的核苷酸序列。

11.一种重组DNA，该DNA包含如权利要求1、2、3、5、6、8、9或10之任一所描述的DNA片段。

12.一种转化过的微生物，该微生物包含权利要求11的重组DNA。

13.一种用于产生碱性淀粉支链淀粉酶、碱性α-淀粉酶或者碱性支链淀粉酶的方法，该方法包括培养权利要求12的转化过的微生物和分离由该微生物产生的碱性淀粉支链淀粉酶、碱性α-淀粉酶或碱性支链淀粉酶。

14.一种DNA片段，该片段与互补于2号序列的DNA序列杂交。

15.一种蛋白质，该蛋白质由权利要求14的DNA片段编码。

16.一种DNA片段，该片段与互补于2号序列的cDNA序列杂交，其中所说的片段编码具有碱性支链淀粉酶活性和/或者碱性α-淀粉酶活性的蛋白质。

17.一种蛋白质，该蛋白质由权利要求16的DNA片段编码。