CN1086737C

CN1086737C - 超热稳定蛋白酶基因

Info

Publication number: CN1086737C
Application number: CN95194487A
Authority: CN
Inventors: 三田正范; 山本克彦; 森下美男; 浅田起代藏; 纲泽进; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc; Takara Holdings Inc
Priority date: 1994-06-13
Filing date: 1995-06-05
Publication date: 2002-06-26
Anticipated expiration: 2015-06-05
Also published as: DE69524422D1; JP3708946B2; US5756339A; DK0776971T3; EP0776971B1; JP2004329217A; JP4106085B2; WO1995034645A1; EP0776971A1; DE69524422T2; ATE210181T1; EP0776971A4; CN1154717A

Abstract

一种源自Pyrococcus furiosus的超热稳定蛋白酶基因，具体地说，是一种包括序列表中SEQ ID NO.1所表示的全部氨基酸序列并编码蛋白酶活性部位的超热稳定的蛋白酶基因；以及一种通过培养转化体而产生蛋白酶的方法，其中转化体是通过使用将上述基因整合至其中的质粒而制备的。

Description

超热稳定蛋白酶基因

发明领域

本发明涉及一种编码用于工业用途的超热稳定的蛋白酶的基因以及用基因工程方法生产该酶的方法。

发明背景

蛋白酶是可以裂解蛋白质中肽键的酶并且已经在动物、植物和微生物中发现了各种蛋白酶。它们不仅被用作研究工作和医疗用品的试剂，而且还在工业领域中被用作如洗涤剂、食品加工和利用其逆反应的化学合成中的添加剂，并且从工业角度看它们可以说是很重要的酶。对用于工业领域的蛋白酶来说，由于要求很高的物理和化学稳定性，因此特别优选使用具有高的热稳定性的酶。目前，在工业领域中主要使用的是产自芽胞杆菌属细菌的蛋白酶，因为它们具有相对高的热稳定性。

但是，仍需要具有更进一步的优良性状的酶，并且已试图从可在高温下生长的微生物和芽胞杆菌属的嗜热菌中获取酶。

另一方面，一种称为超嗜热菌(hyperthermophiles)的微生物很适于高温环境，因此它们被希望成为提供各种热稳定酶的来源。已知这些超嗜热菌的一种，Pyrococcus furiosus，可产生蛋白酶[应用与环境微生物学，56，1992-1998(1990)；欧洲微生物学联合会微生物学快报(FEMS Microbiol.Letters)，71，17-20(1990)；普通微生物学杂志，137，1193-1199(1991)]。

另外，对Thermococcus，Staphylothermus和Thermobacteroides属的超嗜热菌来说，也已知其是产蛋白酶的[应用微生物学和生物工程学，34，715-719，(1991)]。

发明目的

因为这些超嗜热菌所产的蛋白酶具有高的热稳定性，它们被期望可用于其它任何已知的酶未曾用到过的新的应用中。但是，上述的公开仅仅说明热稳定的蛋白酶活性存在于无细胞提取物中或来自培养上清的粗酶溶液中，没有关于分离纯化的酶性质等的公开。而且，因为为了从这些超嗜热菌中获取酶，必需在高温下培养微生物，所以在这些酶的工业生产中仍存在问题。为了解决上述的问题，本发明的一个目的就是分离一种编码一种超嗜热菌的蛋白酶的基因。本发明的另一个目的是提供一种通过使用该基因的遗传工程方法而制备该蛋白酶的方法。

发明公开

为了获取超热稳定的蛋白酶基因，本发明人试图从Pyrococcus furiousDSM 3638的微生物细胞和培养上清中纯化一种蛋白酶以便独立地确定该酶的部分氨基酸序列。但是，无论使用微生物细胞或培养上清，纯化该蛋白酶都是十分困难的，并且本发明人未能获得具有足够纯度的用于确定其部分氨基酸序列的酶样品。

作为一种克隆无任何关于该酶的一级结构信息的目标酶的基因的方法，存在一种表达克隆的方法，例如，根据这种方法获取了源自PyrococcusWoesei的支链淀粉酶基因(WO92/02614)。但是，在表达克隆方法中，通常使用质粒载体并且，在这种情况下，必须使用可将目标基因切割为相对小的DNA片段的限制酶，以便在不切割目标基因任何内部位点的情况下将片段插入质粒载体中。并且该方法并不是对克隆各种酶基因都是可用的。而且，必须检测大量克隆的酶活性，而该操作是很复杂的。

本发明人已尝试通过使用柯斯质粒载体并研究文库中的柯斯质粒克隆来找出表达蛋白酶活性的克隆而分离蛋白酶基因，其中柯斯质粒载体能替代质粒载体保持大的DNA片段(30-50kb)以制备Pyrococcusfuriosus基因组的柯斯质粒文库。通过使用柯斯质粒载体，除降低了该酶基因内部位点的裂解可能性之外，减少了需要筛选的转化体的个数。另一方面，由于柯斯质粒载体在宿主中的拷贝不如质粒载体的高，可能会使所表达的酶的量太少而不足以检测其酶活。

从目标酶的高的热稳定性来看，首先本发明人已分别培养了柯斯质粒文库中独立的转化体，并且将该步骤与制备仅含来自由此得到的微生物细胞的热稳定蛋白的溶胞产物的步骤结合起来。这一组溶胞产物被称为柯斯质粒蛋白文库。通过在检测酶活性中使用柯斯质粒蛋白文库，检测敏感性比使用转化体克隆的方法得到了提高。

另外，本发明通过用含明胶的凝胶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳而使对痕量酶活性的检测成为可能。根据该方法，可高敏感性地检测浓缩在凝胶中的一条带的样品中的痕量蛋白酶活性。

用这种方法，本发明人已筛选了一个源自Pyrococcus furiosus的柯斯质粒蛋白文库并得到了几个表达蛋白酶活性的柯斯质粒克隆。

而且，本发明人已用各种基因工程技术成功地从包含在该等克隆中的插入的DNA片段中分离了超热稳定的蛋白酶基因，并且还发现了该基因的表达产物是抗表面活性剂的。

将从该基因的核苷酸序列推测而来的超热稳定的蛋白酶的氨基酸序列与已知的来自微生物的蛋白酶的氨基酸序列进行比较，该基因编码的蛋白酶的前半部分的氨基酸序列与一组碱性蛋白酶的氨基酸序列同源，已表明碱性蛋白酶的代表性的例子是枯草蛋白酶，尤其是，发现在围绕这四个已知对酶的催化活性很重要的残基的区域中是高度同源的。因此，由于已证明产自Pyrococcus furiosus的蛋白酶保留有与来自的常温菌(mesophiles)相似的结构，这也提示类似的蛋白酶也可由Pyrococcusfuriosus之外的其它超嗜热菌产生，其中产自Pyrococcus furiosus的蛋白酶在如此高的温度下仍是有活性的，而来自常温菌的这些蛋白酶在此温度下则是无活性的。

而且，本发明人已注意到这种可能性，即在所得到的超热稳定蛋白酶基因的核苷酸序列中，编码区的核苷酸序列与枯草蛋白酶高度同源并且其类似物可被用作研究超热稳定蛋白酶基因的探针，并已试图用PCR去检测超嗜热菌中的蛋白酶基因，其中PCR使用以上述核苷酸序列为基础设计的合成的DNA为引物来克隆含蛋白酶基因的DNA片段。结果是，本发明人在一种超嗜热菌Thermococcus celer DSM 2476中发现了一种蛋白酶基因并得到含该基因的DNA片段。而且，本发明人已确定由该DNA片段编码的氨基酸序列包含与序列表中SEQ ID No.1所表示的超热稳定蛋白酶的氨基酸序列具有高度同源性的氨基酸序列。这样，本发明人即完成了本发明。

也就是说，本发明提供了一种源自Pyrococcus furiosus的分离的超热稳定的蛋白酶基因，具体地说，是一种包含由序列表中SEQ ID No.1所表示的氨基酸序列的热稳定蛋白酶基因或其编码该超热稳定蛋白酶活性部位的一部分，特别是，具有序列表中的SEQ ID No.2所表示的DNA序列的超热稳定蛋白酶基因。

另外，本发明提供了可与上述超热稳定蛋白酶基因杂交的超热稳定蛋白酶基因。例如，本发明提供了含有如序列表中SEQ ID No.7中所示的核苷酸序列的超热稳定蛋白酶基因。

而且，本发明提供了一种生产超热稳定蛋白酶的方法，包括培养用重组质粒转化的转化体，并从培养物中收集超热稳定蛋白酶，其中本发明的超热稳定的蛋白酶基因已被插入到该重组质粒中。

可通过筛选超嗜热菌的基因文库而获取本发明的超热稳定蛋白酶基因。做为超嗜热菌，可使用属于Pyrococcus属的细菌并且可通过对Pyrococcus furiosus基因组的柯斯质粒文库的筛选而得到所希望的基因。

例如，可使用Pyrococcus furiosus，DSM3638作为Pyrococcus furiosus，并且该菌株可从德意志微生物保藏中心获得。

Pyrococcus furiosus的柯斯质粒文库的例子可按如下方法获得：用限制酶Sau3AI(Takara Shuzo有限公司生产)部分消化Pyrococcusfuriosus的基因组DNA，得到DNA片段，用三螺旋柯斯质粒载体(Stratagene生产)连接DNA片段并使用体外包装方法将其包装入λ噬菌体颗粒中。接着，将该文库转导进入合适的大肠杆菌如大肠杆菌DH5αMCR(BRL生产)中。以获得转化体，接着培养它们，收集微生物细胞，将其进行热处理(100℃ 10分钟)，超声破碎并接着再进行热处理(100℃ 10分钟)。可通过进行含明胶的SDS-聚酰胺凝胶电泳而对所得到的溶胞产物进行蛋白酶活性筛选。

用这种方法，可以获得一种含一种能表达蛋白酶的超热稳定的蛋白酶基因的柯斯质粒克隆，其中所表达的蛋白酶抗上述的热处理。

进一步，从上面所得的柯斯质粒克隆制得的柯斯质粒DNA可被合适的限制酶消化以产生片段，以制备将由此所得到的各片段插入其中的重组质粒。可通过周上述得到的质粒转化一个合适的微生物并测试所得到的转化体所表达的蛋白酶活性而获得含所希望的超热稳定蛋白酶基因的重组质粒。

也就是说，从上面得到的柯斯质粒克隆之一制备的柯斯质粒DNA可被Sph I(Takara Shuzo有限公司生产)消化，接着将得到的DNA片段插入到一个质粒载体pUC119(Takara Shuzo有限公司生产)的Sph I位点以获得重组质粒。接下来，重组质粒被导入大肠杆菌JM109中(Takara Shuzo有限公司生产)并用筛选柯斯蛋白文库的相同的方法检测所得到的转化体的蛋白酶活性。其有活性的转化体被用于制备质粒。

从下文的实施例中可以看到，重组质粒之一被称为pTPR1并且用该质粒转化的大肠杆菌JM109并称为大肠杆菌JM109/pTPR1。图1示质粒pTPR1的限制性图谱。在图1中，粗实线表示插入到质粒载体pUC119中的DNA片段。重组质粒含约7.0kb的Sph I片段。

另外，大约2.5kb的不含超热稳定蛋白酶基因的DNA片段可被从重组质粒中去除。也就是说，在三个约2.5kb，3.3kb和4.3kb的用Xba I(Takara Shuzo有限公司生产)消化上述质粒pTPR1而获得的片段中，只有约2.5kb的片段被去除而其余的片段被连接并被导入大肠杆菌JM109中。用筛选柯斯质粒蛋白文库同样的方法检测所得到的转化体的蛋白酶活性。所得到的具有蛋白酶活性的转化体被用于制备质粒。该质粒被称为pTPR9，用该质粒转化的大肠杆菌JM109被称为大肠杆菌JM109/pTPR9。图2示质粒pTPR9的限制性图谱。在图2中，粗实线代表插入到质粒载体pUC119中的DNA片段。

质粒pTPR1和pTPR9所表达的蛋白酶活性都表现出很高的热稳定性。但是，由于在含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上所看到的活性与上述柯斯质粒克隆所表达的蛋白酶活性位置不同，估计这些质粒在柯斯质粒DNA的蛋白酶基因上有部分缺损。可通过例如使用上述质粒pTPR9的部分插入DNA片段为探针，从柯斯质粒DNA获得含蛋白酶基因全长的DNA片段。即，将用于制备质粒pTPR1的柯斯质粒DNA用Not I和几个不切割任何插入到质粒pTPR1中的DNA片段的内部位点的限制酶(Takara Shuzo有限公司生产)消化在琼脂糖凝胶电泳之后，胶中的DNA片段被印迹到尼龙膜上。关于如上得到的膜，通过用得自插入到质粒pTPR9中的DNA片段的约0.7kb的PstI-XbaI片段为探针去检测含与PstI-XbaI片段的相同序列的DNA片段来进行杂交。

在用两个酶，Not I和Pvu II(Takara Shuzo有限公司生产)消化的柯斯质粒DNA中，一个约7.5kb的DNA片段可与PstI-XbaI片段杂交。该7.5kb的片段可被分离插入到质粒载体pUC19(Takara Shuzo有限公司生产)中，其中在该质粒的HincII位点即在NotI和SmaI位点的中间被导入Not I接头(Takara Shuzo有限公司生产)。该质粒被称为pTPR12，用该质粒转化的大肠杆菌JM109被命名和称为大肠杆菌JM109/pTPR12。根据布达佩斯条约该菌株于1994年5月24日(原始保藏日期)被保藏在国际贸易和工业省，工业科学和技术厅，国立生命科学和人体技术研究所，保藏号为FEPM BP-5103。

大肠杆菌JM109/pTPR12的溶胞产物表明在含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上其蛋白酶活性与柯斯质粒克隆的活性相同。图3示质粒pTPR12的限制性图谱。在图3中，粗实线是插入到质粒载体pUC19中的DNA片段。

图4示来源自Pyrococcus furiosus的分别被插入到质粒pTPR1、pTPR9和pTPR12中的DNA片段和限制性图谱。根据图4，一个大约1kb的不含超热稳定蛋白酶基因的片段可被从插入到质粒pTPR12中的DNA片段中去除。即，质粒pTPR12被Xba I和Kpn I(Takara Shuzo，有限公司生产)消化并且由此得到的约3.3kb的Xba I-Xba I片段和约3.2kb的Xba I-Kpn I片段被分别分离。接下来，首先，约3.2kb的Xba I-Kpn I片段被在Xba I和Kpn I之间的位点插入到质粒载体pUC19中以制备重组质粒。该质粒被称为pTPR14。图5示其限制性图谱。在图5中，粗实线代表插入到质粒载体pUC19中的DNA片段。

接下来，上述的约3.3kb的Xba I-Xba I片段被在Xba I位点插入到质粒pTPR14中并且被导入大肠杆菌JM109中。用筛选柯斯质粒蛋白文库相同的方法检测转化体的蛋白酶活性。用具有活性的转化体制备质粒。该质粒被称为pTPR15，用该质粒转化的大肠杆菌JM109被称为大肠杆菌JM109/pTPR15。图6示pTPR15的限制性图谱。在图6中，粗实线代表被插入到质粒载体pTPR19中的DNA片段。

而且，在来源自Pyrococcus furiosus并插入到质粒pTPR15中的DNA片段的核苷酸序列中，约4.8kb的位于两个Dra I位点之间的DNA片段的核苷酸序列示于序列表SEQ ID No.8中。即，序列表中的SEQ ID No.8是本发明的超热稳定的蛋白酶基因的核苷酸序列的一个例子。并且，自SEQID No.8的核苷酸序列推导的该基因产物的一个氨基酸序列被示于序列表SEQ ID No.9中。即，序列表中的SEQ ID No.9是用根据本发明得到的超热稳定蛋白酶基因产生的酶蛋白的氨基酸序列的一个实例。

因为已经发现本发明的超热稳定蛋白酶基因被在包含在插入到上述质粒pTPR15中的DNA片段中的Dra I片段中，所以可以制备仅包含该Dra I段的重组质粒。

即，用Dra I(Takara Shuzo有限公司制)消化上述的质粒pTPR15以分离所得到的约4.8kb的DNA片段。接着，可将片段在Sma I位点插入到质粒载体pUC19k以制得重组质粒。重组质粒被称为pTPR13，用该质粒转化的大肠杆菌JM109被称为大肠杆菌JM109/pTPR13。

在一个含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，大肠杆菌JM109/pTPR13的溶胞产物表现出与柯斯质粒克隆溶胞产物同样的蛋白酶活性。图7示质粒pTPR13的限制性图谱。在图7中，粗实线代表插入到质粒载体pUC19中的DNA片段。

另外，本发明的超热稳定蛋白酶基因可在枯草杆菌中表达。对枯草杆菌来说，枯草杆菌DB104可被使用，并且该菌株为描述在《基因》，Vol，83，pp215-233(1989)的已知菌株。做为克隆载体，可使用质粒pUB18-P43，并且该质粒由Calgary大学Dr.Sui-Lam Wong赠送。该质粒含一个卡那霉素抗性基因做为选择标记。

上述的质粒pTPR13可被Kpn I(Takara Shuzo有限公司产)和BamHI(Takara Shuzo有限公司产)消化以获得约408kb的DNA片段，接着分离并将该片段连接在质粒pUB18-P43的KpnI和BamHI位点之间以得到重组质粒。该质粒被称为pUBP13，被该质粒转化的枯草杆菌DB104并称为枯草杆菌DB104/pUBP13。在一个含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，枯草杆菌DB104/pUBP13的溶胞产物表现出与柯斯质粒克隆的溶胞产物同样的蛋白酶活性。图8示质粒pUBP13的限制性图谱。在图8中，粗实线代表插入到质粒载体pUB18-P43中的DNA片段。

通过将序列表中SEQ ID No.9中所示的氨基酸序列同来自已知微生物的蛋白酶的氨基酸序列进行比较，证明本发明的超热稳定蛋白酶的前半部分序列和一组碱性丝氨酸蛋白酶的序列具有同源性，其中碱性丝氨酸蛋白酶代表性的实例是枯草蛋白酶I《蛋白质工程》，Vol，4，pp.719-737(1991)]，更具体地说，在每个围绕四个已知对蛋白酶活性起重要作用的氨基酸残基的区域之间有高度的同源性。另一方面，在氨基酸序列的后半部分之间观察不到这样的同源性，并且因此认为这一部分对蛋白酶活性来说可能不是必须的。因此，一个从其后半部分去掉了一个合适的肽链的突变蛋白酶可期望其有酶的活性。这类突变蛋白酶的实例包括含有对应于序列表中SEQ ID No.9的氨基酸序列，其中第904位的氨基酸Ser及以后的序列已被去除的蛋白酶。该酶可用下述方法制得。

首先，从上面的质粒pTPR13制备一个约2.8kb的其EcoRI位点已被平末端的Kpn I-EcoR I片段并且该片段被连接在质粒载体pUC19的KpnI位点和平末端的Xba I位点之间。由此得到的包含在重组质粒中的蛋白酶基因编码对应于序列表中SEQ ID No.9的氨基酸序列，除了编码904位氨基酸Ser的TCA密码子已被终止密码子TAG取代并且后面的核苷酸序列已被删去之外。该质粒被称为pTPR36，被质粒转化的大肠杆菌JM109被称为JM109/pTPR36。在含明胶的SDS-聚丙烯凝胶上大肠杆菌JM109/pTPR36表现出蛋白酶活性。图9示质粒pTPR36的限制性图谱。在图9中，粗实线代表插入到质粒载体pUC119中的DNA片段。序列表中的SEQ ID No.2是包含在插入到质粒pTPR36中的DNA片段的开放阅读框的核苷酸序列。即，序列表中SEQ ID No.2是本发明所获得的超热稳定的蛋白酶基因的核苷酸序列的一个实例。另外，序列表中SEQ ID No.1是由SEQ ID No.2的核苷酸序列的推导而来的基因产物的氨基酸序列。即，序列表中SEQ ID No.1是用本发明的超热稳定的蛋白酶基因制得的酶蛋白的氨基酸序列的一个实例。

如上所述，已经发现通常存在于来自常温菌的碱性丝氨酸蛋白酶中的区域在产自超嗜热菌Pyrococcus furiosus的超热稳定蛋白酶的氨基酸序列中是保守的。因此，期望在Pyrococcus furiosus之外的超嗜热菌所产的同样类型的蛋白酶中有这样的区域存在。即，有可能通过以序列表中SEQID No.2的部分核苷酸序列为基础制备合适的合成DNA片段并用它们为探针或引物而得到与上述的超热稳定的蛋白酶相类似的超热稳定的蛋白酶的基因，其中合成DNA片段编码与这些枯草蛋白酶等的氨基酸序列有高度同源性的氨基酸序列。

图10、11和12示与本发明的与枯草蛋白酶等氨基酸序列有高度同源性的超热稳定的蛋白酶的氨基酸序列的区域中氨基酸序列，本发明的编码这些区域的超热稳定蛋白酶基因的核苷酸序列，和以上述序列为基础分别合成的寡核苷酸PRO-1F，PRO-2F，PRO-2R和PRO-4R的核苷酸序列之间的关系。另外，序列表中的SEQ ID No.3，4，5和6示寡核苷酸PRO-1F，PRO-2F，PRO-2R和PRO-4R的核苷酸序列。即，序列表的SEQ ID No.3，4，5和6是可用于通过杂交而检测本发明的超热稳定蛋白酶基因的寡核苷酸的实例。

上述寡核苷酸的结合可被周作引物以各种超嗜热菌的基因组DNA为模板来进行PCR以检测存在于超嗜热菌中的蛋白酶基因。对超嗜热菌来说，属于Pyrococcus，Thermococcus，Staphylothermus，Thermobacteroides等属的细菌可被利用。由于Thermococcus celer DSM2476属于Thermococcus属细菌，它可被使用并且该菌株可从德意志微生物保藏中心获得。当用Thermococcus celer DSM2476的基因组DNA为模板并以上面的寡核苷酸PRO-1F和PRO-2R的结合或PRO-2F和PRO-4R的结合做为引物进行PCR时，可看到DNA片段的特异性扩增并可提示蛋白酶基因的存在。另外，可通过将该片段与合适的质粒载体相连以制备重组质粒并用双脱氧法确定所插入的DNA片段的核苷酸序列来估测该片段所编码的氨基酸序列的情况。

将用寡核苷酸PRO-1F和PRO-2R扩增的约150bp的DNA片段和用寡核苷酸PRO-2F和PRO-4R扩增的约550bp的DNA片段分别连入质粒载体pUC18的Hinc II位点以获得重组质粒。重组质粒分别称为PIF-2R(2)和p2F-4R。序列表中SEQ ID 10示插入到质粒p1F-2R(2)中的DNA片段的核苷酸序列以及由其推导而来的氨基酸的序列。序列表中的SEQ ID NO11示插入到质粒p2F-4R中的DNA片段的核苷酸序列和由其推导而来的氨基酸序列。在序列表的SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列中，第1位到第21位的核苷酸序列，第113位至第145位的核苷酸序列，在序列表的SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列中，第1位到第32位的核苷酸序列和从第532位到第564位的核苷酸序列分别是来源自做为引物的寡核苷酸(分别对应于寡核苷酸PRO-1F，PRO-2R，PRO-2F和PRO-4R)的核苷酸序列。在SEQ ID NO 10和11所示的氨基酸序列中，在来源于自本发明的Pyrococcus furiosus的超热稳定蛋白酶的氨基酸序列和来源于各种微生物的碱性丝氨酸蛋白酶之间的序列具有同源性，并且已知表明上述用PCR扩增的DNA片段是用该蛋白酶基因为模板扩增的。

图13示质粒p2F-4R的限制性图谱。在图13中，粗实线表示插入到质粒载体pUC18中的DNA片段。

另一方面，当用Thermobacteroids Proteoliticus DSM5265和Staphylothermus Marinus DSM3639的基因组DNA作为模板时，在Thermococcus celer中所观察到的扩增未被识别。

业已知PCR的基因扩增的效率受引物31末端部分和模板DNA的退火效率的影响。甚至当在上述的PCR中观察不到扩增的DNA片段时，也可通过合成具不同的序列但编码相同的氨基酸序列的寡核苷酸并用它们作为引物来对蛋白酶基因进行检测。另外，也可用这些寡核苷酸为探针对各种超嗜热菌的基因组DNA进行Southern杂交而对蛋白酶基因进行检测。

然后，上述的寡核苷酸或由上面的PCR得到的扩增的DNA片段可被用作探针对超嗜热菌的基因组DNA文库进行筛选以得到超热稳定蛋白酶基因，例如由Thermococcus celer制得的超热稳定蛋白酶基因。

做为Thermococcus celer的基因组DNA文库的一个实例，可这样制备一个文库；用限制酶Sau 3AI部分消化Thermococcus celer DSM 2476的基因组DNA以获得DNA片段，将片段与λGEM-11载体(Promega产)连接并根据体外包装方法将其包装入λ噬菌体颗粒中。然后，该文库被转导进入合适的大肠杆菌，如大肠杆菌LE592(Promega产)中以在平板上形成噬菌斑，然后用上述PCR中获得的扩增的DNA片段进行噬菌斑杂交。以这种方法，可以得到含超热稳定蛋白酶基因的噬菌体克隆。

而且，由如此得到的克隆制备的噬菌体DNA被合适的限制酶消化，在进行琼脂糖凝胶电泳后，凝胶中的DNA片段被印迹到尼龙膜上。使用如此得到的膜，用根据上面PCR而获得的扩增的DNA片段为探针进行杂交以检测含蛋白酶基因的DNA片段。

当上述的噬菌体DNA用KpnI消化时，一个约9kb的DNA片段与探针杂交并且该约9kb片段可被分离并插入到质粒载体pUC119的KpnI位点中以获得重组质粒。该质粒被称为pTC1，被该质粒转化的大肠杆菌JM109被称为大肠杆菌JM109/pTC1。

图14示质粒pTC1的限制性图谱。在图14中，粗实线代表插入到质粒载体pUC119中的DNA片段。

而且，可以将约4kb的不合超热稳定的蛋白酶基因的DNA片段从质粒pTC1中去掉。即，将质粒pTC1用KpnI和几个切割插入到质粒pTC1中的片段内的区域的限制酶消化，并且在琼脂糖凝胶电泳之后，根据上面的用于噬菌体DNA的相同的方式检测含蛋白酶基因的DNA片段。当质粒pTC4被KpnI和Bam HI消化时，一个约5kb的DNA片段与探针杂交并且该约5kb的片段可被分离并导入质粒载体pUC119的KpnI-BamH位点以获得一个重组质粒。该质粒被称为pTC3，被该质粒转化的大肠杆菌JM109被称为大肠杆菌JM109/pTC3。图15示质粒pTC3的限制性图谱。在图15中，粗实线代表插入到质粒载体pUC119中的DNA片段。

包含在插入到质粒pTC3中的DNA片段中的超热稳定蛋白酶基因的核苷酸序列可通过使用特异的引物即以序列表中SEQ ID NO 10和11所示的核苷酸序列为基础的合成的合适的寡核苷酸做为引物进行确定。SEQ ID NO 12，13，14，15，16和17代表曾被用作用于确定该超热稳定蛋白酶基因的核苷酸序列的引物的寡核苷酸TCE-2，TCE-4，SEF-3，SER-1，SER-3和TCE-6R的核苷酸序列。另外，序列表中SEQ ID NO 7代表由此得到的超热稳定性的蛋白酶基因的部分核苷酸序列。而且，SEQ ID NO18代表本发明所得到的超热稳定蛋白酶基因编码的酶的氨基酸序列的一个实例。在插入到质粒pTC3的DNA片段中，来自λGEM-11载体的序列与由序列表中SEQ ID NO 7所代表的核苷酸序列的5′端相邻，这提示在蛋白酶基因5′区的一部分具有陷损。另外，通过将该核苷酸序列与序列表中SEQ ID NO 10和11的核苷酸序列进行比较，发现插入到质粒pTC3中的DNA片段包含SEQ ID NO 10所表示的核苷酸序列中第41位和以后的核苷酸以及包含SEQ ID NO 11的全部的核苷酸序列。

尽管从Thermococcus celer得到的超热稳定蛋白酶基因是部分缺损的，但对本领域的技术人员显而易见的是，可以这样得到含超热稳定蛋白酶基因的全长的DNA片段，例如(1)通过重复筛选基因组DNA文库，(2)通过对基因组DNA做Southern杂交，(3)通过使用盒(Cassette)(Takara Shuzo有限公司产)和盒样引物(Takara Shuzo有限公司制)的PCR获得5′上游区的DNA片段(Takara Shuzo基因产品指南，1994-1995版，250-251页)，等等。

一个含超热稳定蛋白酶基因的重组质粒被导入其中的转化体，如，大肠杆菌JM109/pTPR13或大肠杆菌JM109/pTPR36可被培养在常规条件下，如将转化体在37℃培养在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中[胰蛋白胨(10g/升)，酵母提取物(5g/升)，NaCl(5g/升)，pH7.2]中以在培养物中表达超热稳定的蛋白酶。在培养完成后，收集培养的细胞并将其超声破碎并离心。将上清在100℃热处理5分钟以变性和去除污染蛋白。用这种方法，可得到粗酶样品。由此从大肠杆菌JM109/pTPR13和大肠杆菌JM109/pTPR36得到的粗酶样品被称为PF-13和PF-36。

另外，含超热稳定蛋白酶基因的重组质粒被转导进入其中的转化体，枯草杆菌DB104/pUBP13可被培养在常规条件下，例如，将其培养在37℃含10μg/ml卡那霉素的LB培养基中以在培养物中表达超热稳定的蛋白酶。在完成培养之后，收集培养细胞并超声破碎和离心。将上清100℃热处理5分钟以变性和去除污染蛋白，接着用硫酸铵盐析后并透析。用这种方法，可得到部分纯化的酶样品。由此由枯草杆菌DB104/pUBP13得到的粗纯化的酶样品被称为PF-BS13.

由转化体生产的超热稳定蛋白酶样品如PF-13，PF-36，和PF-BS13的酶促和物理化学特性如下所示，其中转化体是将含本发明的来自Pyrococcus furiosus的超热稳定蛋白酶基因的重组质粒被导入其中的转化体。

(1)活化

本发明获得的酶水解明胶而形成短链多肽。另外，该酶等可水解酪蛋白而形成短链多肽。

(2)酶活检测方法

酶活的检测是通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上检测该酶对明胶的水解而进行。即，将待测酶样品适当稀释并且向10μl样品稀释溶液中加入2.5μl样品缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.6，5％SDS，5％2-巯基乙醇，0.005％溴酚兰，50％甘油)。将混合液在100℃热处理5分钟，然后用含0.05％明胶的0.1％SDS-10％聚丙烯酰胺进行电泳。在电泳结束之后，将凝胶浸在50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，并在95℃温育2小时进行酶促反应。然后，将凝胶用溶于25％乙醇和10％乙酸的2.5％考马斯亮兰R250染色30分钟，进一步将凝胶转移到25％乙醇和7％乙酸中3～15小时以去除多余的染料。被蛋白酶水解成肽的明胶在酶促反应中扩散到凝胶外，其相应的位置不被考马斯亮兰染色，从而检出蛋白酶活性的存在。本发明获得的酶样品PF-13，PF-36和PF-BF13在95℃具有明胶水解活性。

另外，除了使用了含0.05％酪蛋白的0.1％SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶之外，根据上述的同样方法检测了酪蛋白水解活性。本发明得到的酶样品PF-13，PF-36，和PF-BS13在95℃具有酪蛋白水解活性。

而且，用下述方法确定了本发明获得的酶样品PF-BS13的酪蛋白水解活性。向100μl 0.1M的含0.2％酪蛋白的磷酸钾缓冲液中(pH7.0)加入100μl适当稀释的酶溶液并在95℃温育1小时。向其中加入100μl 15％三氯乙酸终止反应并离心反应混合物。通过测定280nm的吸光率确定包含在上清中的酸可溶的短链多肽的量，并且与不含酶的对照的吸光率进行比较而确定酶活。本发明的酶样品，PF-BS13在95℃ pH7.0的实验条件下具有酪蛋白水解活性。

(3)稳定性

酶的稳定性是通过用含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上述的方法(2)检测被热处理的酶的残留的酶促活性而测定的。即，将酶样品在95℃处理3小时，然后对其合适量进行酶活检测，并与其未在95℃处理的样品的活性相比较。尽管由于在95℃的温育而使凝胶上酶活的位置有所改变，但却几乎没有看到酶活的降低。本发明获得的酶样品PF-13，PF-36和PF-BS13在95℃热处理3小时后仍是稳定的。

另外，测试了本发明得到的酶样品PF-13和PF-36在表面活性剂存在下的稳定性。即，向酶样品中加入终浓度为0.1％的Triton X-100，SDS或氯化苄烷铵。将混合物在95℃温育3小时并取其合适量做酶活检测。对每种表面活性剂来说，与不存在表面活性剂时相比，酶活性基本无变化。因此，本发明得到的酶样品PF13和PF-36在表面活性剂的存在下在95℃热处理3小时仍是稳定的。

而且，用下述方法对本发明获得的酶样品，PF-BS13的稳定性进行了测试。即，这样的酶样品或加有1％终浓度的SDS的酶样品在95℃温育不同的时间段，并且用上述的以酸可溶多肽的量的增加为基础的分光光度方法(2)来确定残留的活性。图16示本发明获得的酶样品，PF-BS13的热稳定性。纵坐标示残留活性1％，而横坐标示温育时间(hr)。在图16中，空心三角代表不加SDS时得到的结果而实心三角代表含0.1％SDS时的结果。从图16可看出，在95℃温育4小时后不管0.1％SDS的存在与否，PF-BS13保留有几乎100％的活性。

(4)各种试剂的影响

将酶样品加入到含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，然后在含2mMEDTA或2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中进行酶促反应以检测试剂对酶活的影响。本发明获得的酶样品PF-13，PF-36和PF-BS13在所观察的含2mM EDTA和只含50mM磷酸钾缓冲液之间的酶活性基本无差别。另一方面，当使用含2mM PMSF的缓冲液时，在所有样品中的凝胶中水解的明胶的量减少，这表明酶样品的活性被PMSF抑制。

(5)分子量

在含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上对本发明所得到的酶样品的分子量进行了估测。酶样品，PF-13在95KD～51KD有多个活性带。尽管由于根据所用样品的量的不同等而使迁移距离有变化，84KDa，79KDa，66KDa，54KDa和51KDa的主要的带都出现了。当酶样品在终浓度0.1％的SDS的存在下在95℃热处理3小时后进行电泳时，63KDa和51KDa的带增强了。对于酶样品PF-BS13来说，获得了与上面的酶样品PF-13同样的结果。对于酶样品PF-36来说，除了63KDa和59KDa的主带之外，还观察到了几个次要的带。

(6)最适pH

对本发明所获得的酶样品PF-13和PF-36的最适pH进行了测试。在将酶样品进行含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，将凝胶浸在不同pH值的缓冲液中，进行酶促反应以测试最适pH。对于缓冲液，使用了pH4.0到6.0的50mM的乙酸钠缓冲液，pH6.0到8.0的50mM的磷酸钾缓冲液，pH9.0到10.0的50mM的硼酸钠缓冲液。两个酶样品都在pH6.0到10.0具有明胶水解活性，其最适pH是pH8.0到9.0。

另外，用基于酸可溶多肽的量的增加的上述的分光光度法(2)对本发明获得的酶样品，PF-BF13的最适pH进行了测定。用pH4.0～6.0的0.1M的乙酸钠缓冲液，pH6.0～8.0的0.1M的磷酸钾缓冲液，pH9.0～10.0的0.1M的在硼酸钠缓冲液和pH11.0的0.1M的磷酸钠氢氧化钠缓冲液配制测定用的0.2％的酪蛋白溶液。图17示本发明获得的酶样品PF-BS13的酪蛋白水解活性与pH之间的关系。纵坐标示相对活性而横坐标示pH。在图17中，空心圆圈，实心圆圈，空心方块和实心方块代表通过使用分别用0.1M乙酸钠缓冲液，0.1M磷酸钾缓冲液、0.1M硼酸钠缓冲液和0.1M磷酸钠-氢氧化钠缓冲液配制的底物溶液所得到的结果。从图17可得到，酶样品PF-BS13，在pH5.0～11.0有酪蛋白分解活性，其最适pH是9.0～10.0。

如上文所详细描述的，根据本发明，可提供编码超热稳定蛋白酶的基因以及用该基因生产超热稳定蛋白酶的工业方法。该酶具有高的热稳定性，并且还表现出对表面活性剂的抗性。因此，它们特别有用于对在高温下对蛋白质的热处理。

另外，通过与本发明的分离基因杂交而得到的DNA片段或作为探针的该分离基因的部分核苷酸序列可被转导入合适的微生物中，并且可根据对柯斯质粒蛋白文库所描述的同样的方法制备其热处理过的溶胞产物。然后，用适当的方法检测蛋白酶的活性。用这种方法，一种编码一种其序列与上述的酶不同但却具有类似活性的酶的超热稳定蛋白酶基因可被得到。

上述的杂交可在如下的条件下进行。即，将固定在膜上的DNA在6×SSC中与探针一起在50℃温育12-20小时，其中6×SSC中含有0.5％SDS，0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％Ficoll 400，和0.01％变性鲑精DNA(1×SSC指0.15MNaCl和0.015M柠檬酸钠，pH7.0)。在温育结束之后，用如下方法洗膜：开始用含0.5％SDS的2×SSC，在37℃洗，接着改变SSC的浓度至0.1×，并使温度达50℃洗膜，直到来自固定的DNA的信号可与背景信号区别开来为止。

而且，本发明分离的基因，用部分分离的基因为引物通过体外基因扩增方法获得的DNA片段，或者通过用上面扩增得到的片段为探针而杂交获得的DNA片段被转导入合适的微生物中，并且根据上述同样的方法进行蛋白酶活性测定。用这种方法，可获得编码其活性不与上述酶相同但却相似的热稳定蛋白酶基因。

下面的实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对发明范围的限制。在实施例中，所有的“百分比”都指重量百分比。

实施例1

Pyrococcus furiosus基因组DNA的制备

Pyrococcus furiosus DSM3638的培养如下。

将培养用培养基放入2升培养基的培养瓶中并在120℃灭菌20分钟，其中培养基的组成有：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％可溶性淀粉，3.5％Jamarin S^*Solid(Jamarin实验室制)0.5％JamarinS^*Liquid(Jamarin实验室制)，0.03％ MgSO₄，0.001％ NaCl，0.0001％FeSO₄·7H₂O，0.0001％ CoSO₄，0.0001％ CaCl₂·7H₂O，0.0001％ ZnSO₄，0.1ppm CuSO₄·5H₂O，0.1ppm KAl(SO₄)₂，0.1ppm H₃BO₃，0.1ppmNa₂MoO₄·2H₂O和0.25ppm NiCl₂·6H₂O。然后，向培养基中吹入氮气以挤出溶解氧，并将上述菌转接到培养基中，接着在95℃做平台期培养16小时。培养结束后，离心收集细菌细胞。

接着，将收集的细胞悬于4ml含25％蔗糖的0.05M的Tris-HCl(pH8.0)中。并向该悬液中加入0.8ml溶菌酶[5mg/ml，0.25M Tris-HCl(pH8.0)]和2ml 0.2M EDTA。将混合物在20℃温育1小时。然后，向混合物中加入24ml SET溶液[150mM NaCl，1mM EDTA和20mM Tris-HCl(pH8.0)]。以及进一步加入4ml 5％ SDS和400μl蛋白酶K(10mg/ml)，并将混合物在37℃温育1小时。在反应结束之后，将反应混合物用苯酚-氯仿抽提并用乙醇沉淀以制备约3.2mg基因组DNA。

柯斯质粒蛋白文库的制备

将400μg Pyrococcus furiosus DSM3633的基因组DNA用Sau3AI部分消化并通过密度梯度超离心35～50kb的大N₁分级分离。然后，将1μg三股螺旋柯斯质粒载体用XbaI消化，用碱性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司产)脱磷酸化，并进一步用Bam HI消化。该载体与140μg上述被分级分离的35～50kb的DNA连接。Pyrococcus furiosus的基因组DNA片段被使用Gigapack Gold(Stratagene产)的体外包装方法包装入λ噬菌体颗粒中以制备一个文库。然后，使用这样获得的部分文库，进行向大肠杆菌DH5αMCR的转导，在所获得的转化体中，选择几个转化体以制备柯斯质粒DNA。在确定了有合适大小的插入片段的存在之后，从上述文库中再选择约500个转化体，并将其独立地培养在150ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(胰蛋白胨·10g/升，酵母提取物5g/升，NaCl 5g/升，pH7.2)中。将每个培养物离心，回收的微生物细胞被悬浮于1ml20mM Tris-HCl(pH8.0)中，将该悬液在100℃热处理10分钟。然后，将悬液超声破碎并再热处理10分钟。离心后作为上清得到的溶胞产物被用作柯斯质粒蛋白文库。

含超热稳定蛋白酶基因的柯斯质粒的筛选

蛋白酶活性的检测是通过对聚丙烯酰胺凝胶中的水解明胶的测试而实现的。

即，从来自上面柯斯质粒蛋白文库的溶胞产物中取出5μl等分级分，并用含0.05％明胶的0.1％SDS-10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后，将凝胶在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中在95℃温育2小时。将凝胶在25％乙醇和10％乙酸，和2.5％考马斯亮兰R-250中染色30分钟。然后，将凝胶转移到25％甲醇和7％乙酸中脱色3～15小时。筛选了8个具有蛋白酶活性的柯斯质粒克隆，这些克隆在凝胶上显示出由于明胶的水解而未被考马斯亮兰R250染色的带。

含超热稳定蛋白酶基因的质粒pTPR1的制备

在8个具有蛋白酶活性的柯斯质粒克隆中选择一个柯斯质粒(304号柯斯质粒)用于制备柯斯质粒DNA，用Sph1消化柯斯质粒DNA，然后将其连接到质粒载体pUC119的SphI位点上。该重组质粒被转导进入大肠杆菌JM109中，并根据用于柯斯质粒蛋白文库筛选的同样方法对所得到的转化体进行了蛋白酶活性测定。从具有蛋白酶活性的转化体制备了一种质粒，所得到的重组质粒被称为pTPR1。该质粒转化的大肠杆菌JM109被称为大肠杆菌JM109/pTPR1。

图1示质粒pTPR1的限制性图谱。

含超热稳定蛋白酶基因的质粒pTPR9的制备

将上述的质粒pTPR1用XbaI消化并进行琼脂糖凝胶电泳以分离为约2.5kb，3.3kb和4.3kb的三个DNA片段。在三个如此分离的片段中，回收为约3.3kb和4.3kb的两个片段。将约4.3kb的DNA片段用碱性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司生产)脱磷酸化，然后与约3.3kb的DNA片段混合以使它们相互连接。将其转导进入大肠杆菌JM109中。用筛选柯斯质粒蛋白文库同样的方法对所得到的转化体蛋白酶活性进行检测。从具有蛋白酶活性的转化体制备了一种质粒。该质粒称为pTPR9，被该质粒转化的大肠杆菌JM109被称为大肠杆菌JM109/pTPR9。

图2示质粒pTPR9的限制性图谱

对含全长的超热稳定蛋白酶基因的DNA片段的检测

将用于制备上述质粒pTPR1的柯斯质粒DNA用Not I消化，然后进一步分别用Bam HI，Bln I，EcoT22I，Nsp(7524)V，PvuII，Sal I，SmaI和SpeI消化。然后，将消化的DNA进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。在电泳后，将凝胶溶于含1.5M NaCl的0.5N NaOH中以变性凝胶中的DNA片段，然后在含3M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH7.5)中将凝胶中和。通过Southern印迹将凝胶中的DNA片段印迹到Hybond-N⁺尼龙膜(Amasham制)上。在印迹之后，用6×SSC洗膜(1×SSC指0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)，空气干燥，用一个紫外透射仪(Transilluminator)用紫外照线3分钟而将DNA固定在膜上。

另一方面，将质粒pTPR9用Pst I和XbaI消化，并进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收分离的约0.7kb的DNA片段。通过用该DNA片段为模板，使用随机引物DNA标记试剂盒Ver2(Takara Shuzo有限公司产)和[α-³²P]dCTP(Amasham产)，制备一种³²P标记的DNA探针。

将上述的用于固定DNA的膜用杂交缓冲液(含0.5％SDS，0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％Ficoll 400和0.01％变性鲑精的6×SSC)在68℃处理2小时。然后，将其转入同样的含³²P标记DNA探针的杂交缓冲液中在68℃杂交14小时。在杂交结束后，用含0.5％SDS的2×SSC在室温洗膜，然后用含0.5％SDS的0.1×SSC在68℃洗膜。在用0.1×SSC漂洗膜之后，将其空气干燥。用X-光胶片对膜在-80℃曝光60小时。将胶片显影以制成放射自显影图。该放射自显影图表明在由NotI和PvuII消化柯斯质粒DNA所获得的约7.5kb的DNA片段中存在该蛋白酶基因。

含全长超热稳定蛋白酶基因的质粒pTPR12的制备

将用于制备上述质粒pTPR1的柯斯质粒DNA用NotI和PvuII消化，并进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳以一起回收约7～8kb的DNA片段。将这些DNA片段与质粒载体pUC19混合，其中在质粒载体pUC19的Hinc II位点导入了一个Not I接头并且其已被Not I和Sma I消化。然后，进行连接反应。重组质粒被转导进入大肠杆菌JM109中，并且通过如用于筛选柯斯质粒蛋白文库的同样的方法对所得到的转化体的蛋白酶活性进行检测。从具有蛋白酶活性的转化体中制备了一种质粒。该质粒被称为pTPR12，被该质粒转化的大肠杆菌JM109称为大肠杆菌JM109/pTPR12。

图3示质粒pTPR12的限制性图谱。

含全长超热稳定蛋白酶基因的质粒pTPR15的制备

将上述的质粒pTPR12用Xba I消化，并进行1％琼脂糖凝胶电泳以分别回收分离的约为3.3kb和7kb的两个DNA片段。然后，将回收的约7kb的DNA片段用Kpn I消化，再次进行1％琼脂糖凝胶电泳以分离约为3.2kb和3.8kb的两个片段。在这些片段中，回收约3.2kb的片段并将其与用Xba I和Kpn I消化的质粒载体pUC19连接。将其转导入大肠杆菌JM109中。制备了得到的转化体中所含的质粒，并筛选了仅含单分子的上述3.2kb片段的质粒。该质粒被称为pTPR14。

图5示质粒pTPR14的限制性图谱。

然后，上述的质粒pTPR14被XbaI消化并被用碱性磷酸酶去磷酸化。将其与上述的约3.3Kb的片段混合以进行连接，并将其导入大肠杆菌JM109中。通过使用如用于柯斯质粒蛋白文库的筛选的同样的方法对所获得的转化体的蛋白酶的活性进行了筛选。从具有蛋白酶活性的转化体制备了一种质粒。该质粒被称为pTPR15，被该质粒转化的大肠杆菌JM109称为大肠杆菌JM109/pTPR15。

图6示质粒pTPR15的限制性图谱。

施例2

超热稳定蛋白酶基因核苷酸序列的确定

为了确定插入上述质粒pTPR15中的超热稳定蛋白酶基因的核苷酸序列，用Kilo。序列缺失试剂盒(Takara Shuzo有限公司产)制备了插入到质粒中的DNA片段部分被以各种长度缺失的缺失突变体。其中，选择了几个具适宜缺失长度的突变体，并用Bca BEST以双脱氧测序试剂盒(由Takara Shuzo有限公司产)通过双脱氧法对各自插入DNA片段部分的核苷酸序列进行了确定。综合这些结果，包含于质粒pIPR15中的插入DNA片段的核苷酸序列即被确定。在获得的核苷酸序列中，序列表中的SEQ ID NO 8显示了位于两个Dra I位点之间的4765bp的片段。而且，SEQ ID NO 9显示了包含于上述核苷酸序列中的开放阅读框所编码的超热稳定蛋白酶的氨基酸序列。

含超热稳定蛋白酶基因的质粒pTPR13的制备

将上面的质粒pTPR15用Dra I消化并进行1％琼脂糖凝胶电泳，接着回收约48kb的分离的DNA片段。然后，将质粒载体pUC19用SmaI消化，并且，在被碱性磷酸酶去磷酸化后，将其与上面的约48kb的DNA片段混合进行连接并且被转导进入大肠杆菌JM109中。通过如用于柯斯质粒蛋白文库筛选的相同的方法对所得到的转化体的蛋白酶活性进行了检测。从具有蛋白酶活性的转化体中制备了一种质粒。该质粒被称为pTPR13，该质粒转化的大肠杆菌JM109称为大肠杆菌JM109/pTPR13。

图7示质粒pTPR13的限制性图谱。

含超热稳定蛋白酶基因的用于枯草杆菌转化的质粒pUB13的制备

将上面的质粒pTPR13用KpnI和BamHI消化，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，接着回收分离约48kb的DNA片段。然后，将质粒载体pUB18-P43用KpnI和BamHI消化并与上面的约48kb的DNA片段混合以进行连接。将其转导进入枯草杆菌DB104中。通过如用于柯斯质粒蛋白文库筛选的同样的方法对所获得含卡那霉素抗性的转化体的蛋白酶活性进行了检测。从具有活性的转化体中制备了一种质粒。该质粒被称为pUB13，被该质粒转化的枯草杆菌DB104称为枯草杆菌DB104/pUBP13。

图8示质粒pUBP13的限制性图谱。

含后半部分缺失的超热稳定蛋白酶基因的质粒pTPR36的制备

将上述质粒pTPR13用EcoRI消化，并将所得到的末端用DNA末端平齐试剂盒(Takara Shuzo有限公司造)进行平齐化。进一步，将其用KpnI消化并进行1％琼脂糖凝胶电泳，接着回收约2.8kb的分离的DNA片段。接下来，将质粒载体pUC119用XbaI消化，并将所得开端平齐化。进一步用KpnI消化，接着与上面的约2.8kb的DNA片段混合以进行连接。并被转导进入大肠杆菌JM109中。

用柯斯质粒蛋白文库筛选的同样方法对所获得的转化体的蛋白酶活性进行了检测。从具有活性的转化体制备了一种质粒。该质粒被称为pTPR36，被该质粒转化的大肠杆菌JM109称为大肠杆菌JM109/pTPR36。

图9示质粒pTPR36的限制性图谱。序列表中SEQ ID NO 2示插入到质粒pTPR36中的DNA片段的核苷酸序列。而且，SEQ ID NO 1示可由该核苷酸序列编码的超热稳定蛋白酶的氨基酸序列。

实施例3

用于检测超热稳定蛋白酶基因的寡核苷酸的制备

通过将本发明实施例2中所得到的超热稳定蛋白酶的所估测的氨基酸序列与来自微生物的已知的碱性组氨酸蛋白酶的氨基酸序列相比较，发现通常在这些酶中有同源的氨基酸序列。其中，筛选了三个区域，并设计了在通过PCR检测超热稳定蛋白酶基因中用作引物的寡核苷酸。

图10、11和12示对应于本发明的超热稳定蛋白酶的上述三个区域的氨基酸序列，编码上述区域的本发明的超热稳定蛋白酶的核苷酸序列，以及以上述核苷酸序列为基础合成的寡核苷酸PRO-1F，PRO-2F，PRO-2R和PRO-4R的核苷酸序列之间的关系。而且，SEQ NO3、4、5和6分别示PRO-1F，PRO-2F，PRO-2R和PRO-4R的核苷酸序列。

Thermococcus celer基因组DNA的制备

通过离心从10ml获自德意志微生物保藏中心的Thermococcus celerDSM2476的培养肉汤中收集微生物细胞并将其悬于100μl含25％蔗糖的50mM的Tris-HCl(pH8.0)中。向悬液中加入20μl 0.5M EDTA和10μl溶菌酶(10mg/ml)并将悬液在20℃温育1小时。向其中加入800μlSET溶液(150mM NaCl，1mM EDTA，20mM Tris-HCl，pH8.0)，50μl 10％SDS和10μl蛋白酶K(20mg/ml)，并将悬液在37℃继续温育37℃。用苯酚-氯仿抽提以终止反应。将反应混合物进行乙醇沉淀并将回收的DNA溶解于50μl TE缓冲液中以获得基因组DNA溶液。

通过PCR检测超热稳定蛋白酶

从上面的Thermococus celer的基因组DNA和寡核苷酸PRO-1F和PRO-2R或寡核苷酸PRO-2R和PRO-4R制备PCR反应混合物，并进行PCR反应(一个循环是94℃1分钟-55℃1分钟-72℃1分钟，35个循环)。当将反应混合物的等分级分进行琼脂糖凝胶电泳后，在使用寡核苷酸PRO-1F和PRO-2R的情况下三个DNA片段的扩增以及在使用寡核苷酸PRO-2F和PRO-4R的条件下一个DNA片段的扩增被观察到。，从琼脂糖凝胶上回收这些扩增的片段并用DNA平齐化试剂盒将DNA末端平齐化，接着用T4多核苷酸激酶将其磷酸化(TakaraShuzo有限公司制)。然后，用Hinc II消化质粒载体pUC18并用碱性磷酸酶将其去磷酸化。将其与上面的PCR扩增的DNA片段混合以进行连接，然后转导进入大肠杆菌JM109中。从所获得的转化体中制备质粒，并筛选将合适的DNA片段插入其中的质粒。插入DNA片段的核苷酸序列由双脱氧法确定。在这些质粒中，当考虑到含用寡核苷酸PRO-1F和PRO-2R扩增的约150bp的DNA片段的质粒p1F-2R(2)和含用寡核苷酸PRO-2F和PRO-4R扩增的约550bp的DNA片段的质粒p2F-4R时发现由所得核苷酸序列推测而来的氨基酸序列含与来自本发明的Pyrococcus furiosus的超热稳定蛋白酶、枯草蛋白酶等的氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列。

序列表中SEQ NO 10示插入到质粒p1F-2R(2)中的DNA片段的核苷酸序列和由这核苷酸序列推导而来的氨基酸序列。而且，序列表中SEQ NO 11示插入到p2F-4R中的DNA片段的核苷酸序列和由该核苷酸序列推测而来的氨基酸序列。在序列表中SEQ NO 10所示的核苷酸序列中，从第1位到第21位的核苷酸序列以及从113位到145位的核苷酸序列，序列表中SEQ NO 11中第1位到32位核苷酸序列和从532位到564位核苷酸的序列是用于PCR的引物的序列(分别对应于寡核苷酸PRO-1F，PRO-2R，PRO-2F和PRO-4R)。

图13 p2F-4R的限制性图谱。

对来自Thermococus Celer的蛋白酶基因的筛选

上述的Thermococcus celer基因组DNA被Sau3AI部分消化并在dATP和dGTP的存在下被用klenow片段(由Takara Shuzo有限公司产)处理以部分修复其DNA末端。将该DNA片段与λGEM-11 XhoI半位点臂载体(由Promega产)混合以进行连接。然后，将其通过Grgapack Gold进行体外包装以制备含Thermococcus celer基因组DNA的λ噬菌体文库。部分文库被转导入大肠杆菌LE392中以在平板上形成噬菌斑，将噬菌斑转移到Hybond-N⁺膜上。在转移之后，将膜用含1.5M NaCl的0.5NNaOH处理，并接着用含3M NaCl的0.5 Tris-HCl(pH7.5)处理。进一步，用6×SSC漂洗，空气干燥而且在紫外透射仪上用紫外线照线以便将噬菌体的DNA固定在膜上。

另一方面，将质粒p2F-4R用Pma CI(Takara Shuzo有限公司产)和Stu I(Takara Shuzo有限公司产)消化并上1％琼脂糖凝胶电泳以回收约0.5kb的分离的DNA片段。用该片段为模板并使用随机引物DNA标记试剂盒Ver2和[α-³²P]dGTP制备了³²P标记的DNA探针。

将上面的固定有DNA的膜在杂交缓冲液(含0.5％SDS，0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1 Ficoll 400和0.01％变性鲑精DNA的6×SSC)在50℃温育2小时。将其转到相同的含³²P标记DNA探针(prove)的缓冲液中在50℃杂交15小时。杂交结束后，用含0.5％SDS的2×SSC在室温洗膜并且接着用含0.5％SDS的1×SSC在50℃洗膜。而且，在用1×SSC将膜漂冼后，空气干燥并将X-光胶片在-80℃曝光6小时以制备放射自显图。筛选了约4,000个噬菌斑。结果得到了一个含蛋白酶基因的克隆。以放射自显影的信号为基础，找到该噬菌斑克隆的位置，并且相应于平板上用于转膜的噬菌斑被分离进入1ml含1％氯仿的SM缓冲液中[50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，8mM MgSO₄.0.01％明胶(pH7.5)]。

含蛋白酶基因的噬菌体DNA片段的检测

将上面的噬菌体克隆转导进入大肠杆菌LE392中并将转化体在37℃在NZCYM培养基中(由Bto 101产)培养15小时以获得培养肉汤。收集培养物肉汤的上清并且用QIAGEN-λ试剂盒(由DIAGEN)制备噬菌体DNA。分别用Bam HI，EcoRI，EcoRV，HincII，KpnI，NcoI，PstI，SacI，SalI，SmaI和SphI(都由Takara Shuzo有限公司产)消化所得到的噬菌体DNA，并上1％琼脂糖凝胶电泳。然后，用实施例1中用于检测含超热稳定蛋白酶基因全长的DNA片段的同样的方法制备了固定有DNA片段的膜。将膜用杂交缓冲液在56℃处理4小时，然后转移到与上述筛选来自Thermococcus celer的蛋白酶基因同样的³²P标记的DNA探针的同样的杂交的缓冲液中。然后，在50℃进行杂交18小时。杂交结束后，用含0.5％SDS的1×SSC在50℃洗膜并用1×SSC漂洗。将膜用空气干燥并用X-光胶片在-80℃日曝光2小时以进行放射自显影。根据这放射自显图发现，在用KpnI消化的噬菌体DNA中，该蛋白酶基因被包含在一个约9kb的DNA片段中。

含蛋白酶基因的质粒pTC1的制备

将上述的含蛋白酶基因的噬菌体DNA用KpnI消化并进行1％琼脂糖凝胶电泳以便从凝胶中回收约9kb的DNA片段。接着将质粒载体pUC119用KpnI消化，并用碱性磷酸酶去磷酸化，随后将其与上述约9kb的DNA片段混合以进行连接。然后，将其转导入大肠杆菌JM109中。从所得到的转化体中制备质粒并筛选了只含上面的约9kb的DNA片段的质粒。该质粒被称为pTC1，被该质粒转化的大肠杆菌JM109被称为大肠杆菌JM109/pTC1。

图14示质粒pTC1的限制性图谱。

含超热稳定蛋白酶基因的质粒pTC3的制备

将上述质粒pTC1用KpnI消化并进一步分别用Bam HI，Pst I和SphI消化。在1％琼脂糖凝胶电泳后，按照检测含上面的蛋白酶基因的噬菌体DNA片段的同样的操作，将DNA片段转移到膜上并进行含超热稳定蛋白酶基因的DNA片段的检测。根据所得到的放射自显影图的信号，表明通过将质粒pTC1用KpnI和Bam HI消化而获得的约5kb的DNA片段含有该超热稳定蛋白酶基因。

然后，将质粒pTC1用Kpn I和Bam HI消化，接着上1％琼脂糖凝胶电泳以分离一个约5kb的DNA片段。将质粒载体使pUC119用Kpn I和Bam HI消化并与上述的约5kb的DNA片段混合以进行连接。将其转导入大肠杆菌JM109中。从所得到的转化体制备质粒并筛选了一个含上述约5kb的DNA片段的质粒。该质粒被称为pTC3，被该质粒转化的大肠杆菌JM109称为大肠杆菌JM109/pTC3。

图15示质粒pTC3的限制性图谱。

包含于质粒pTC3中的超热稳定蛋白酶基因的核苷酸序列的确定

为了确定包含于上面的质粒pTC3中的超热稳定蛋白酶基因的核苷酸序列，分别以序列表中SEQ NO 10和11中所示的核苷酸序列为基础合成36个寡核苷酸。合成的寡核苷酸TCE-2，TCE-4，SEF-3，SER-1，SER-3和TCE-6R的核苷酸序列由序列表中SEQ NO 12，13，14，15，16和17所示。将用上面的寡核苷酸作为引物以及质粒pTC3为模板的双脱氧法获得的结果综合起来确定该超热稳定蛋白酶基因的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID NO 7示所得的核苷酸序列的一部分。另外，序列表中的SEQ OD NO 18示由推测的该核苷酸序列编码的氨基酸的序列。

实施例4

酶样品的制备

将含有本发明的实施例2中所获得的超热稳定蛋白酶基因的质粒pTPR36转导入大肠杆菌JM109中而得到的大肠杆菌JM109/pTPR36并在37℃振荡培养在含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2)中达14小时。在一个1L的三角烧瓶中加入200ml同样的培养基并接种入2ml上述的培养肉汤并且在37℃振荡培养10小时。离心培养肉汤。将收获的微生物细胞(湿重1.6g)悬于2ml 20mM的Tris-HCl(pH8.0)中，并超声破碎和离心以获得上清。将上清在100℃处理5分钟并再次离心。得到的上清被用做粗酶溶液酶样品PF-36)。

另外，用同样的方法，含本发明的超热稳定蛋白酶基因的质粒pTPR13被转导入大肠杆菌JM109中而得到的大肠杆菌JM109/pTPR13被用于制备粗酶溶液(酶样品PF-13)。

而且，将含本发明的超热稳定蛋白酶基因的质粒pUBP13转导枯草杆菌DB104而得到的枯草杆菌DB104/pUBP13在37℃振荡培养5ml含10μg/ml卡那霉素的LB培养基中达14小时。向两个2L的三角瓶中分别接种600ml同样的培养基。向每个培养瓶中分别接种2ml上面的培养肉汤并在37℃振荡培养26小时。离心培养肉汤。将得到的微生物细胞悬浮于15ml 20mM Tris-HCl(pH8.0)中，超声破碎并离心得到上清。将上清在100℃处理5分钟并再次离心。向所得的上清中加入硫酸铵达到50％的饱和度并离心回收所得到的沉淀。将回收和沉淀悬浮于2ml 20mMTris-HCl(pH8.0)中并将悬液用同样的缓冲液透析。所得到的内部溶液被用作部分纯化的酶样品(酶样品PF-B513)

根据上面的用含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测酶活性的方法对这些酶样品和用于制备质粒的柯斯质粒克隆溶胞产物的蛋白酶活性进行检测。

图16示本发明获得的超热稳定蛋白酶的热稳定性。图17示本发明所获得的超热稳定蛋白酶的最适pH。而且，图18示在每个样品(酶样品PF-36，PF-13和PF-BS13和溶胞产物)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后的结果。在存在SDS时，每一样品在95℃以显示出活性。

如上文所描述的，根据本发明获得了编码在95℃表现活性的超热稳定蛋白酶的基因。这些基因便提供大量的高纯度的超热稳定蛋白酶成为可能。

附图简述

图1示质粒pTPR1的限制性图谱。

图2示质粒pTPR9的限制性图谱。

图3示质粒pTPR12的限制性图谱。

图4示包含于质粒中的来自Pyrococcus furiosus的DNA的限制性图谱的比较。

图5示质粒pTPR14的限制性图谱。

图6示质粒pTPR15的限制性图谱。

图7示质粒pTPR13的限制性图谱。

图8示质粒pUBP13的限制性图谱。

图9示质粒pUBR36的限制性图谱。

图10示寡核苷酸pRO-1F的设计。

图11示寡核苷酸pRO-2F和pRO-2R的设计。

图12示寡核苷酸pRO-4R的设计。

图13示质粒p2F-4R的限制性图谱。

图14示质粒pTC1的限制性图谱

图15示质粒pTC3的限制性图谱。

图16示本发明所得到的超热稳定蛋白酶的热稳定性。

图17示本发明所得到的超热稳定蛋白酶的最适pH。

图18示本发明所获得的超热稳定蛋白酶在含明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的活性染色图。

序列表SEQ ID NO：1序列长度：903序列类型：氨基酸链型：单拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：Met Asn Lys Lys Gly Leu Thr Val Leu Phe Ile Ala Ile Met Leu

5 10 15Leu Ser Val Val Pro Val His Phe Val Ser Ala Glu Thr Pro Pro

15 20 30Val Ser Ser Glu Asn Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Asn Gln Gln

35 40 45Val Val Thr Lys Glu Val Ser Gln Ala Ala Leu Asn Ala Ile Met

50 55 60Lys Gly Gln Pro Asn Met Val Leu Ile Ile Lys Thr Lys Glu Gly

65 70 75Lys Leu Glu Glu Ala Lys Thr Glu Leu Glu Lys Leu Gly Ala Glu

80 85 90Ile Leu Asp Glu Asn Arg Val Leu Asn Met Leu Leu Val Lys Ile

95 100 105Lys Pro Glu Lys Val Lys Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Ser Leu Glu

110 115 120Lys Ala Trp Leu Asn Arg Glu Val Lys Leu Ser Pro Pro Ile Val

125 130 135Glu Lys Asp Val Lys Thr Lys Glu Pro Ser Leu Glu Pro Lys Met

140 145 150Tyr Asn Ser Thr Trp Val Ile Asn Ala Leu Gln Phe Ile Gln Glu

155 160 165Phe Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Val Val Val Ala Val Leu Asp Thr

170 175 180Gly Val Asp Pro Asn His Pro Phe Leu Ser Ile Thr Pro Asp Gly

185 190 195Arg Arg Lys Ile Ile Glu Trp Lys Asp Phe Thr Asp Glu Gly Phe

200 205 210Val Asp Thr Ser Phe Ser Phe Ser Lys Val Val Asn Gly Thr Leu

215 220 225Ile Ile Asn Thr Thr Phe Gln Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asn

230 235 240Glu Ser Thr Gly Leu Met Glu Tyr Val Val Lys Thr Val Tyr Val

245 250 255Ser Asn Val Thr Ile Gly Asn Ile Thr Ser Ala Asn Gly Ile Tyr

260 265 270His Phe Gly Leu Leu Pro Glu Arg Tyr Phe Asp Leu Asn Phe Asp

275 280 285Gly Asp Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Val Leu Leu Val Asn Ser Thr

290 295 300Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Ala Tyr Val Asp Thr Asp Leu Asp Tyr

305 310 315Asp Phe Thr Asp Glu Val Pro Leu Gly Gln Tyr Asn Val Thr Tyr

320 325 330Asp Val Ala Val Phe Ser Tyr Tyr Tyr Gly Pro Leu Asn Tyr Val

335 340 345Leu Ala Glu Ile Asp Pro Asn Gly Glu Tlr Ala Val Phe Gly Trp

350 355 360Asp Gly His Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Gly

365 370 375Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Ala Trp Asp Trp Leu Ser Met Tyr Ser

380 385 390Gly Glu Trp Glu Val Phe Ser Arg Leu Tyr Gly Trp Asp Tyr Thr

395 400 405Asn Val Thr Thr Asp Thr Val Gln Gly Val Ala Pro Gly Ala Gln

410 415 420Ile Met Ala Ile Arg Val Leu Arg Ser Asp Gly Arg Gly Ser Met

425 430 435Trp Asp Ile Ile Glu Gly Met Thr Tyr Ala Ala Thr His Gly Ala

440 445 450Asp Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Gly Asn Ala Pro Tyr Leu Asp

455 460 465Gly Thr Asp Pro Glu Ser Val Ala Val Asp Glu Leu Thr Glu Lys

470 475 480Tyr Gly Val Val Phe Val Ile Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Gly

485 490 495Ile Asn Ile Val Gly Ser Pro Gly Val Ala Thr Lys Ala Ile Thr

500 505 510Val Gly Ala Ala Ala Val Pro Ile Asn Val Gly Val Tyr Val Ser

515 520 525Gln Ala Leu Gly Tyr Pro Asp Tyr Tyr Gly Phe Tyr Tyr Phe Pro

530 535 540Ala Tyr Thr Asn Val Arg Ile Ala Phe Phe Ser Ser Arg Gly Pro

545 550 555Arg Ile Asp Gly Glu Ile Lys Pro Asn Val Val Ala Pro Gly Tyr

560 565 570Gly Ile Tyr Ser Ser Leu Pro Met Trp Ile Gly Gly Ala Asp Phe

575 580 585Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Val

590 595 600Ala Leu Leu Ile Ser Gly Ala Lys Ala Glu Gly Ile Tyr Tyr Asn

605 610 615Pro Asp Ile Ile Lys Lys Val Leu Glu Ser Gly Ala Thr Trp Leu

620 625 630Glu Gly Asp Pro Tyr Thr Gly Gln Lys Tyr Thr Glu Leu Asp Gln

635 640 645Gly His Gly Leu Val Asn Val Thr Lys Ser Trp Glu Ile Leu Lys

650 655 660Ala Ile Asn Gly Thr Thr Leu Pro Ile Val Asp His Trp Ala Asp

665 670 675Lys Ser Tyr Ser Asp Phe Ala Glu Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile

680 685 690Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Asn Ser Ile Pro Asp Ile Val Glu Trp

695 700 705His Ile Lys Tyr Val Gly Asp Thr Glu Tyr Arg Thr Phe Glu Ile

710 715 720Tyr Ala Thr Glu Pro Trp Ile Lys Pro Phe Val Ser Gly Ser Val

725 730 735Ile Leu Glu Asn Asn Thr Glu Phe Val Leu Arg Val Lys Tyr Asp

740 745 750Val Glu Gly Leu Glu Pro Gly Leu Tyr Val Gly Arg Ile Ile Ile

755 760 765Asp Asp Pro Thr Thr Pro Val Ile Glu Asp Glu Ile Leu Asn Thr

770 775 780Ile Val Ile Pro Glu Lys Phe Thr Pro Glu Asn Asn Tyr Thr Leu

785 790 795Thr Trp Tyr Asp Ile Asn Gly Pro Glu Met Val Thr His His Phe

800 805 810

Phe Thr Val Pro Glu Gly Val Asp Val Leu Tyr Ala Met Thr Thr

815 820 825

Tyr Trp Asp Tyr Gly Leu Tyr Arg Pro Asp Gly Met Phe Val Phe

830 835 840

Pro Tyr Gln Leu Asp Tyr Leu Pro Ala Ala Val Ser Asn Pro Met

845 850 855

Pro Gly Asn Trp Glu Leu Val Trp Thr Gly Phe Asn Phe Ala Pro

860 865 870

Leu Tyr Glu Ser Gly Phe Leu Val Arg Ile Tyr Gly Val Glu Ile

875 880 885

Thr Pro Ser Val Trp Tyr Ile Asn Arg Thr Tyr Leu Asp Thr Asn

890 895 900

Thr Glu PheSEQ ID NO：2序列长度：2835序列类型：核酸链型：双拓扑学：线性分子类型：基因组DNA序列描述：TTTAAATTAT AAGATATAAT CACTCCGAGT GATGAGTAAG ATACATCATT ACAGTCCCAA 60AATGTTTATA ATTGGAACGC AGTGAATATA CAAAATGAAT ATAACCTCGG AGGTGACTGT 120AGAATGAATA AGAAGGGACT TACTGTGCTA TTTATAGCGA TAATGCTCCT TTCAGTAGTT 180CCAGTGCACT TTGTGTCCGC AGAAACACCA CCGGTTAGTT CAGAAAATTC AACAACTTCT 240ATACTCCCTA ACCAACAAGT TGTGACAAAA GAAGTTTCAC AAGCGGCGCT TAATGCTATA 300ATGAAAGGAC AACCCAACAT GGTTCTTATA ATCAAGACTA AGGAAGGCAA ACTTGAAGAG 360GCAAAAACCG AGCTTGAAAA GCTAGGTGCA GAGATTCTTG ACGAAAATAG AGTTCTTAAC 420ATGTTGCTAG TTAAGATTAA GCCTGAGAAA GTTAAAGAGC TCAACTATAT CTCATCTCTT 480GAAAAAGCCT GGCTTAACAG AGAAGTTAAG CTTTCCCCTC CAATTGTCGA AAAGGACGTC 540AAGACTAAGG AGCCCTCCCT AGAACCAAAA ATGTATAACA GCACCTGGGT AATTAATGCT 600CTCCAGTTCA TCCAGGAATT TGGATATGAT GGTAGTGGTG TTGTTGTTGC AGTACTTGAC 660ACGGGAGTTG ATCCGAACCA TCCTTTCTTG AGCATAACTC CAGATGGACG CAGGAAAATT 720ATAGAATGGA AGGATTTTAC AGACGAGGGA TTCGTGGATA CATCATTCAG CTTTAGCAAG 780GTTGTAAATG GGACTCTTAT AATTAACACA ACATTCCAAG TGGCCTCAGG TCTCACGCTG 840AATGAATCGA CAGGACTTAT GGAATACGTT GTTAAGACTG TTTACGTGAG CAATGTGACC 900ATTGGAAATA TCACTTCTGC TAATGGCATC TATCACTTCG GCCTGCTCCC AGAAAGATAC 960TTCGACTTAA ACTTCGATGG TGATCAAGAG GACTTCTATC CTGTCTTATT AGTTAACTCC 1020ACTGGCAATG GTTATGACAT TGCATATGTG GATACTGACC TTGACTACGA CTTCACCGAC 1080GAAGTTCCAC TTGGCCAGTA CAACGTTACT TATGATGTTG CTGTTTTTAG CTACTACTAC 1140GGTCCTCTCA ACTACGTGCT TGCAGAAATA GATCCTAACG GAGAATATGC AGTATTTGGG 1200TGGGATGGTC ACGGTCACGG AACTCACGTA GCTGGAACTG TTGCTGGTTA CGACAGCAAC 1260AATGATGCTT GGGATTGGCT CAGTATGTAC TCTGGTGAAT GGGAAGTGTT CTCAAGACTC 1320TATGGTTGGG ATTATACGAA CGTTACCACA GACACCGTGC AGGGTGTTGC TCCAGGTGCC 1380CAAATAATGG CAATAAGAGT TCTTAGGAGT GATGGACGGG GTAGCATGTG GGATATTATA 1440GAAGGTATGA CATACGCAGC AACCCATGGT GCAGACGTTA TAAGCATGAG TCTCGGTGGA 1500AATGCTCCAT ACTTAGATGG TACTGATCCA GAAAGCGTTG CTGTGGATGA GCTTACCGAA 1560AAGTACGGTG TTGTATTCGT AATAGCTGCA GGAAATGAAG GTCCTGGCAT TAACATCGTT 1620GGAAGTCCTG GTGTTGCAAC AAAGGCAATA ACTGTTGGAG CTGCTGCAGT GCCCATTAAC 1680GTTGGAGTTT ATGTTTCCCA AGCACTTGGA TATCCTGATT ACTATGGATT CTATTACTTC 1740CCCGCCTACA CAAACGTTAG AATAGCATTC TTCTCAAGCA GAGGGCCGAG AATAGATGGT 1800GAAATAAAAC CCAATGTAGT GGCTCCAGGT TACGGAATTT ACTCATCCCT GCCGATGTGG 1860ATTGGCGGAG CTGACTTCAT GTCTGGAACT TCGATGGCTA CTCCACATGT CAGCGGTGTC 1920GTTGCACTCC TCATAAGCGG GGCAAAGGCC GAGGGAATAT ACTACAATCC AGATATAATT 1980AAGAAGGTTC TTGAGAGCGG TGCAACCTGG CTTGAGGGAG ATCCATATAC TGGGCAGAAG 2040TACACTGAGC TTGACCAAGG TCATGGTCTT GTTAACGTTA CCAAGTCCTG GGAAATCCTT 2100AAGGCTATAA ACGGCACCAC TCTCCCAATT GTTGATCACT GGGCAGACAA GTCCTACAGC 2160GACTTTGCGG AGTACTTGGG TGTGGACGTT ATAAGAGGTC TCTACGCAAG GAACTCTATA 2220CCTGACATTG TCGAGTGGCA CATTAAGTAC GTAGGGGACA CGGAGTACAG AACTTTTGAG 2280ATCTATGCAA CTGAGCCATG GATTAAGCCT TTTGTCAGTG GAAGTGTAAT TCTAGAGAAC 2340AATACCGAGT TTGTCCTTAG GGTGAAATAT GATGTAGAGG GTCTTGAGCC AGGTCTCTAT 2400GTTGGAAGGA TAATCATTGA TGATCCAACA ACGCCAGTTA TTGAAGACGA GATCTTGAAC 2460ACAATTGTTA TTCCCGAGAA GTTCACTCCT GAGAACAATT ACACCCTCAC CTGGTATGAT 2520ATTAATGGTC CAGAAATGGT GACTCACCAC TTCTTCACTG TGCCTGAGGG AGTGGACGTT 2580CTCTACGCGA TGACCACATA CTGGGACTAC GGTCTGTACA GACCAGATGG AATGTTTGTG 2640TTCCCATACC AGCTAGATTA TCTTCCCGCT GCAGTCTCAA ATCCAATGCC TGGAAACTGG 2700GAGCTAGTAT GGACTGGATT TAACTTTGCA CCCCTCTATG AGTCGGGCTT CCTTGTAAGG 2760ATTTACGGAG TAGAGATAAC TCCAAGCGTT TGGTACATTA ACAGGACATA CCTTGACACT 2820AACACTGAAT TCTAG 2835SEQ ID NO：3序列长度：35序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：GGWWSDRRTG TTRRHGTHGC DGTDMTYGAC ACSGG 35SEQ ID NO：4序列长度：32序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：KSTCACGGAA CTCACGTDGC BGGMACDGTT GC 32SEQ ID NO：5序列长度：33序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：ASCMGCAACH GTKCCVGCHA CGTGAGTTCC GTG 33SEQ ID NO：6序列长度：34序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：

CHCCGSYVAC RTGBGGAGWD GCCATBGAVG TDCC 34SEQ ID NO：7序列长度：898序列类型：核酸链型：双拓扑学：线性分子类型：基因组DNA序列描述：GATCTGAAGG GCAAGGTCAT AGGCTGGTAC GACGCCGTCA ACGGCAGGTC GACCCCCTAC 60GATGACCAGG GACACGGAAC CCACGTTGCG GGTATCGTTG CCGGAACCGG CAGCGTTAAC 120TCCCAGTACA TAGGCGTCGC CCCCGGCGCG AAGCTCGTCG GCGTCAAGGT TCTCGGTGCC 180GACGGTTCGG GAAGCGTCTC CACCATCATC GCGGGTGTTG ACTGGGTCGT CCAGAACAAG 240GACAAGTACG GGATAAGGGT CATCAACCTC TCCCTCGGCT CCTCCCAGAG CTCCGACGGA 300ACCGACTCCC TCAGTCAGGC CGTCAACAAC GCCTGGGACG CCGGTATAGT AGTCTGCGTC 360GCCGCCGGCA ACAGCGGGCC GAACACCTAC ACCGTCGGCT CACCCGCCGC CGCGAGCAAG 420GTCATAACCG TCGGTGCAGT TGACAGCAAC GACAACATCG CCAGCTTCTC CAGCAGGGGA 480CCGACCGCGG ACGGAAGGCT CAAGCCGGAA GTCGTCGCCC CCGGCGTTGA CATCATAGCC 540CCGCGCGCCA GCGGAACCAG CATGGGCACC CCGATAAACG ACTACTNCAA CAAGGGCTCT 600GGATCCAGCA TGGACACCCC GCACGTTTCG GGCGTTGGCG GGCTCATCCT CCAGGCCCAC 660CCGAGCTGGA CCCCGGACAA GGTGAAGACG CCCTCATCGA GACCGCCGAC ATAGTCGNCC 720CCAAGGAGAT AGCGGACATC GCCTACGGTG CGGGTAGGGT GAACGTCTTC AAGGGCATCA 780AGTNCGACGA CTACGNCAAG NTCACCTTCA CCGGNTCCGT CGGCGACAAG GGAAGGGGCA 840CCACACCTTC GACGTCAGNG GGGGCACTTC GTGAACGNCA CCCTCTNCTN GGACANGG 898SEQ ID NO：8序列长度：4765序列类型：核酸链型：双拓扑学：线性分子类型：基因组DNA序列描述：TTTAAATTAT AAGATATAAT CACTCCGAGT GATGAGTAAG ATACATCATT ACAGTCCCAA 60AATGTTTATA ATTGGAACGC AGTGAATATA CAAAATGAAT ATAACCTCGG AGGTGACTGT 120AGAATGAATA AGAAGGGACT TACTGTGCTA TTTATAGCGA TAATGCTCCT TTCAGTAGTT 180CCAGTGCACT TTGTGTCCGC AGAAACACCA CCGGTTAGTT CAGAAAATTC AACAACTTCT 240ATACTCCCTA ACCAACAAGT TGTGACAAAA GAAGTTTCAC AAGCGGCGCT TAATGCTATA 300ATGAAAGGAC AACCCAACAT GGTTCTTATA ATCAAGACTA AGGAAGGCAA ACTTGAAGAG 360GCAAAAACCG AGCTTGAAAA GCTAGGTGCA GAGATTCTTG ACGAAAATAG AGTTCTTAAC 420ATGTTGCTAG TTAAGATTAA GCCTGAGAAA GTTAAAGAGC TCAACTATAT CTCATCTCTT 480GAAAAAGCCT GGCTTAACAG AGAAGTTAAG CTTTCCCCTC CAATTGTCGA AAAGGACGTC 540AAGACTAAGG AGCCCTCCCT AGAACCAAAA ATGTATAACA GCACCTGGGT AATTAATGCT 600CTCCAGTTCA TCCAGGAATT TGGATATGAT GGTAGTGGTG TTGTTGTTGC AGTACTTGAC 660ACGGGAGTTG ATCCGAACCA TCCTTTCTTG AGCATAACTC CAGATGGACG CAGGAAAATT 720ATAGAATGGA AGGATTTTAC AGACGAGGGA TTCGTGGATA CATCATTCAG CTTTAGCAAG 780GTTGTAAATG GGACTCTTAT AATTAACACA ACATTCCAAG TGGCCTCAGG TCTCACGCTG 840AATGAATCGA CAGGACTTAT GGAATACGTT GTTAAGACTG TTTACGTGAG CAATGTGACC 900ATTGGAAATA TCACTTCTGC TAATGGCATC TATCACTTCG GCCTGCTCCC AGAAAGATAC 960TTCGACTTAA ACTTCGATGG TGATCAAGAG GACTTCTATC CTGTCTTATT AGTTAACTCC 1020ACTGGCAATG GTTATGACAT TGCATATGTG GATACTGACC TTGACTACGA CTTCACCGAC 1080GAAGTTCCAC TTGGCCAGTA CAACGTTACT TATGATGTTG CTGTTTTTAG CTACTACTAC 1140GGTCCTCTCA ACTACGTGCT TGCAGAAATA GATCCTAACG GAGAATATGC AGTATTTGGG 1200TGGGATGGTC ACGGTCACGG AACTCACGTA GCTGGAACTG TTGCTGGTTA CGACAGCAAC 1260AATGATGCTT GGGATTGGCT CAGTATGTAC TCTGGTGAAT GGGAAGTGTT CTCAAGACTC 1320TATGGTTGGG ATTATACGAA CGTTACCACA GACACCGTGC AGGGTGTTGC TCCAGGTGCC 1380CAAATAATGG CAATAAGAGT TCTTAGGAGT GATGGACGGG GTAGCATGTG GGATATTATA 1440GAAGGTATGA CATACGCAGC AACCCATGGT GCAGACGTTA TAAGCATGAG TCTCGGTGGA 1500AATGCTCCAT ACTTAGATGG TACTGATCCA GAAAGCGTTG CTGTGGATGA GCTTACCGAA 1560AAGTACGGTG 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5 10 15Leu Ser Val Val Pro Val His Phe Val Ser Ala Glu Thr Pro Pro

20 25 30Val Ser Ser Glu Asn Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Asn Gln Gln

35 40 45Val Val Thr Lys Glu Val Ser Gln Ala Ala Leu Asn Ala Ile Met

50 55 60Lys Gly Gln Pro Asn Met Val Leu Ile Ile Lys Thr Lys Glu Gly

65 70 75Lys Leu Glu Glu Ala Lys Thr Glu Leu Glu Lys Leu Gly Ala Glu

80 85 90Ile Leu Asp Glu Asn Arg Val Leu Asn Met Leu Leu Val Lys Ile

95 100 105Lys Pro Glu Lys Val Lys Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Ser Leu Glu

110 115 120Lys Ala Trp Leu Asn Arg Glu Val Lys Leu Ser Pro Pro Ile Val

125 130 135Glu Lys Asp Val Lys Thr Lys Glu Pro Ser Leu Glu Pro Lys Met

140 145 150Tyr Asn Ser Thr Trp Val Ile Asn Ala Leu Gln Phe Ile Gln Glu

155 160 165Phe Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Val Val Val Ala Val Leu Asp Thr

170 175 180Gly Val Asp Pro Asn His Pro Phe Leu Ser Ile Thr Pro Asp Gly

185 190 195Arg Arg Lys Ile Ile Glu Trp Lys Asp Phe Thr Asp Glu Gly Phe

200 205 210Val Asp Thr Ser Phe Ser Phe Ser Lys Val Val Asn Gly Thr Leu

215 220 225Ile Ile Asn Thr Thr Phe Gln Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asn

230 235 240Glu Ser Thr Gly Leu Met Glu Tyr Val Val Lys Thr Val Tyr Val

245 250 255Ser Asn Val Thr Ile Gly Asn Ile Thr Ser Ala Asn Gly Ile Tyr

260 265 270His Phe Gly Leu Leu Pro Glu Arg Tyr Phe Asp Leu Asn Phe Asp

275 280 285Gly Asp Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Val Leu Leu Val Asn Ser Thr

290 295 300Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Ala Tyr Val Asp Thr Asp Leu Asp Tyr

305 310 315Asp Phe Thr Asp Glu Val Pro Leu Gly Gln Tyr Asn Val Thr Tyr

320 325 330Asp Val Ala Val Phe Ser Tyr Tyr Tyr Gly Pro Leu Asn Tyr Val

335 340 345Leu Ala Glu Ile Asp Pro Asn Gly Glu Tyr Ala Val Phe Gly Trp

350 355 360Asp Gly His Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Gly

365 370 375Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Ala Trp Asp Trp Leu Ser Met Tyr Ser

380 385 390Gly Glu Trp Glu Val Phe Ser Arg Leu Tyr Gly Trp Asp Tyr Thr

395 400 405Asn Val Thr Thr Asp Thr Val Gln Gly Val Ala Pro Gly Ala Gln

410 415 420Ile Met Ala Ile Arg Val Leu Arg Ser Asp Gly Arg Gly Ser Met

425 430 435Trp Asp Ile Ile Glu Gly Met Thr Tyr Ala Ala Thr His Gly Ala

440 445 450Asp Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Gly Asn Ala Pro Tyr Leu Asp

455 460 465Gly Thr Asp Pro Glu Ser Val Ala Val Asp Glu Leu Thr Glu Lys

470 475 480Tyr Gly Val Val Phe Val Ile Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Gly

485 490 495Ile Asn Ile Val Gly Ser Pro Gly Val Ala Thr Lys Ala Ile Thr

500 505 510Val Gly Ala Ala Ala Val Pro Ile Asn Val Gly Val Tyr Val Ser

515 520 525Gln Ala Leu Gly Tyr Pro Asp Tyr Tyr Gly Phe Tyr Tyr Phe Pro

530 535 540Ala Tyr Thr Asn Val Arg Ile Ala Phe Phe Ser Ser Arg Gly Pro

545 550 555Arg Ile Asp Gly Glu Ile Lys Pro Asn Val Val Ala Pro Gly Tyr

560 565 570Gly Ile Tyr Ser Ser Leu Pro Met Trp Ile Gly Gly Ala Asp Phe

575 580 585Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Val

590 595 600Ala Leu Leu Ile Ser Gly Ala Lys Ala Glu Gly Ile Tyr Tyr Asn

605 610 615Pro Asp Ile Ile Lys Lys Val Leu Glu Ser Gly Ala Thr Trp Leu

620 625 630Glu Gly Asp Pro Tyr Thr Gly Gln Lys Tyr Thr Glu Leu Asp Gln

635 640 645Gly His Gly Leu Val Asn Val Thr Lys Ser Trp Glu Ile Leu Lys

650 655 660Ala Ile Asn Gly Thr Thr Leu Pro Ile Val Asp His Trp Ala Asp

665 670 675Lys Ser Tyr Ser Asp Phe Ala Glu Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile

680 685 690Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Asn Ser Ile Pro Asp Ile Val Glu Trp

695 700 705His Ile Lys Tyr Val Gly Asp Thr Glu Tyr Arg Thr Phe Glu Ile

710 715 720Tyr Ala Thr Glu Pro Trp Ile Lys Pro Phe Val Ser Gly Ser Val

725 730 735Ile Leu Glu Asn Asn Thr Glu Phe Val Leu Arg Val Lys Tyr Asp

740 745 750Val Glu Gly Leu Glu Pro Gly Leu Tyr Val Gly Arg Ile Ile Ile

755 760 765Asp Asp Pro Thr Thr Pro Val Ile Glu Asp Glu Ile Leu Asn Thr

770 775 780Ile Val Ile Pro Glu Lys Phe Thr Pro Glu Asn Asn Tyr Thr Leu

785 790 795Thr Trp Tyr Asp Ile Asn Gly Pro Glu Met Val Thr His His Phe

800 805 810Phe Thr Val Pro Glu Gly Val Asp Val Leu Tyr Ala Met Thr Thr

815 820 825Tyr Trp Asp Tyr Gly Leu Tyr Arg Pro Asp Gly Met Phe Val Phe

830 835 840Pro Tyr Gln Leu Asp Tyr Leu Pro Ala Ala Val Ser Asn Pro Met

845 850 855Pro Gly Asn Trp Glu Leu Val Trp Thr Gly Phe Asn Phe Ala Pro

860 865 870Leu Tyr Glu Ser Gly Phe Leu Val Arg Ile Tyr Gly Val Glu Ile

875 880 885Thr Pro Ser Val Trp Tyr Ile Asn Arg Thr Tyr Leu Asp Thr Asn

890 895 900Thr Glu Phe Ser Ile Glu Phe Asn Ile Thr Asn Ile Tyr Ala Pro

905 910 915Ile Asn Ala Thr Leu Ile Pro Ile Gly Leu Gly Thr Tyr Asn Ala

920 925 930Ser Val Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Phe Phe Ile Lys Gly Ile

935 940 945Glu Val Pro Glu Gly Thr Ala Glu Leu Lys Ile Arg Ile Gly Asn

950 955 960Pro Ser Val Pro Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Ser

965 970 975Lys Gly Asn Leu Val Ala Leu Asp Gly Asn Pro Thr Ala Glu Glu

980 985 990Glu Val Val Val Glu Tyr Pro Lys Pro Gly Val Tyr Ser Ile Val

995 1000 1005Val His Gly Tyr Ser Val Arg Asp Glu Asn Gly Asn Pro Thr Thr

1010 1015 1020Thr Thr Phe Asp Leu Val Val Gln Met Thr Leu Asp Asn Gly Asn

1025 1030 1035Ile Lys Leu Asp Lys Asp Ser Ile Ile Leu Gly Ser Asn Glu Ser

1040 1045 1050Val Val Val Thr Ala Asn Ile Thr Ile Asp Arg Asp His Pro Thr

1055 1060 1065Gly Val Tyr Ser Gly Ile Ile Glu Ile Arg Asp Asn Glu Val Tyr

1070 1075 1080Gln Asp Thr Asn Thr Ser Ile Ala Lys Ile Pro Ile Thr Leu Val

1085 1090 1095Ile Asp Lys Ala Asp Phe Ala Val Gly Leu Thr Pro Ala Glu Gly

1100 1105 1110Val Leu Gly Glu Ala Arg Asn Tyr Thr Leu Ile Val Lys His Ala

1115 1120 1125Leu Thr Leu Glu Pro Val Pro Asn Ala Thr Val Ile Ile Gly Asn

1130 1135 1140Tyr Thr Tyr Leu Thr Asp Glu Asn Gly Thr Val Thr Phe Thr Tyr

1145 1150 1155Ala Pro Thr Lys Leu Gly Ser Asp Glu Ile Thr Val Ile Val Lys

1160 1165 1170Lys Glu Asn Phe Asn Thr Leu Glu Lys Thr Phe Gln Ile Thr Val

1175 1180 1185Ser Glu Pro Glu Ile Thr Glu Glu Asp Ile Asn Glu Pro Lys Leu

1190 1195 1200Ala Met Ser Ser Pro Glu Ala Asn Ala Thr Ile Val Ser Val Glu

1205 1210 1215Met Glu Ser Glu Gly Gly Val Lys Lys Thr Val Thr Val Glu Ile

1220 1225 1230Thr Ile Asn Gly Thr Ala Asn Glu Thr Ala Thr Ile Val Val Pro

1235 1240 1245Val Pro Lys Lys Ala Glu Asn Ile Glu Val Ser Gly Asp His Val

1250 1255 1260Ile Ser Tyr Ser Ile Glu Glu Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Val Ile

1265 1270 1275Ile Thr Val Lys Phe Ala Ser Pro Val Thr Val Thr Val Thr Tyr

1280 1285 1290Thr Ile Tyr Ala Gly Pro Arg Val Ser Ile Leu Thr Leu Asn Phe

1295 1300 1305Leu Gly Tyr Ser Trp Tyr Arg Leu Tyr Ser Gln Lys Phe Asp Glu

1310 1315 1320Leu Tyr Gln Lys Ala Leu Glu Leu Gly Val Asp Asn Glu Thr Leu

1325 1330 1335Ala Leu Ala Leu Ser Tyr His Glu Lys Ala Lys Glu Tyr Tyr Glu

1340 1345 1350Lys Ala Leu Glu Leu Ser Glu Gly Asn Ile Ile Gln Tyr Leu Gly

1355 1360 1365Asp Ile Arg Leu Leu Pro Pro Leu Arg Gln Ala Tyr Ile Asn Glu

1370 1375 1380Met Lys Ala Val Lys Ile Leu Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Glu

1385 1390 1395Gly Glu Glu SEQ ID NO：10序列长度：145序列类型：核酸链型：双拓扑学：线性分子类型：其它核酸(PCR片段)反义：无序列描述：A GTT GCG GTA ATT GAC ACG GGT ATA GAC GCG AAC CAC CCC GAT CTG 46Val Ala Val Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Asn His Pro Asp Leu

5 10 15AAG GGC AAG GTC ATA GGC TGG TAC GAC GCC GTC AAC GGC AGG TCG 91Lys Gly Lys Val Ile Gly Trp Tyr Asp Ala Val Asn Gly Arg Ser

20 25 30ACC CCC TAC GAT GAC CAG GGA CAC GGA ACT CAC GTN GCN GGA ACN 136Thr Pro Tyr Asp Asp Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr

35 40 45GTT GCT GGT 145Val Ala GlySEQ ID NO：11序列长度：564序列类型：核酸链型：双拓扑学：线性分子类型：其它核酸(PCR片段)反义：无序列描述：TCT CAC GGA ACT CAC GTG GCG GGA ACA GTT GCC GGA ACA GGC AGC 45Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Gly Thr Gly Ser

5 10 15GTT AAC TCC CAG TAC ATA GGC GTC GCC CCC GGC GCG AAG CTC GTC 90Val Asn Ser Gln Tyr Ile Gly Val Ala Pro Gly Ala Lys Leu Val

20 25 30GGT GTC AAG GTT CTC GGT GCC GAC GGT TCG GGA AGC GTC TCC ACC 135Gly Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Val Ser Thr

35 40 45ATC ATC GCG GGT GTT GAC TGG GTC GTC CAG AAC AAG GAT AAG TAC 180Ile Ile Ala Gly Val Asp Trp Val Val Gln Asn Lys Asp Lys Tyr

50 55 60GGG ATA AGG GTC ATC AAC CTC TCC CTC GGC TCC TCC CAG AGC TCC 225Gly Ile Arg Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser

65 70 75GAC GGA GCC GAC TCC CTC AGT CAG GCC GTC AAC AAC GCC TGG GAC 270Asp Gly Ala Asp Ser Leu Ser Gln Ala Val Asn Asn Ala Trp Asp

80 85 90GCC GGT ATA GTA GTC TGC GTC GCC GCC GGC AAC AGC GGG CCG AAC 315Ala Gly Ile Val Val Cys Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn

95 100 105ACC TAC ACC GTC GGC TCA CCC GCC GCC GCG AGC AAG GTC ATA ACC 360Thr Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr

110 115 120GTC GGT GCA GTT GAC AGC AAC GAC AAC ATC GCC AGC TTC TCC AGC 405Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Asp Asn Ile Ala Ser Phe Ser Ser

125 130 135AGG GGA CCG ACC GCG GAC GGA AGG CTC AAG CCG GAA GTC GTC GCC 450Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala

140 145 150CCC GGC GTT GAC ATC ATA GCC CCG CGC GCC AGC GGA ACC AGC ATG 495Pro Gly Val Asp Ile Ile Ala Pro Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met

155 160 165GGC ACC CCG ATA AAC GAC TAC TAC ACC AAG GCC TCT GGA ACC TCA 540Gly Thr Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr Lys Ala Ser Gly Thr Ser

170 175 180ATG GCC ACT CCC CAT GTT ACC GGT 564Met Ala Thr Pro His Val Thr Gly

185SEQ ID NO：12序列长度：20序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：GGCAAGGTCA TAGGCTGGTA 20SEQ ID NO：13序列长度：20序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：CCAGAACAAG GATAAGTACG 20SEQ ID NO：14序列长度：20序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：GGCACCCCGA TAAACGACTA 20SEQ ID NO：15序列长度：20序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：ACGCCTATGT ACTGGGAGTT 20SEQ ID NO：16序列长度：20序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：CGTACTTATC CTTGTTCTGG 20SEQ ID NO：17序列长度：20序列类型：核酸链型：单拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成的DNA)序列描述：TGTAGTAGTC GTTTATCGGG 20SEQ ID NO：18序列长度：237序列类型：氨基酸链型：单拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：Asp Leu Lys Gly Lys Val Ile Gly Trp Tyr Asp Ala Val Asn Gly

5 10 15Arg Ser Thr Pro Tyr Asp Asp Gln Gly His Gly Thr His Val Ala

20 25 30Gly Ile Val Ala Gly Thr Gly Ser Val Asn Ser Gln Tyr Ile Gly

35 40 45Val Ala Pro Gly Ala Lys Leu Val Gly Val Lys Val Leu Gly Ala

50 55 60Asp Gly Ser Gly Ser Val Ser Thr Ile Ile Ala Gly Val Asp Trp

65 70 75Val Val Gln Asn Lys Asp Xaa Tyr Gly Ile Arg Val Ile Asn Leu

80 85 90Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ser Leu Ser

95 100 105Gln Ala Val Asn Asn Ala Trp Asp Ala Gly Ile Val Val Cys Val

110 115 120Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Val Gly Ser Pro

125 130 135Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Ser Asn

140 145 150Asp Asn Ile Ala Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly

155 160 165Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Ile Ala

170 175 180Pro Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Thr Pro Ile Asn Asp Tyr

185 190 195Xaa Asn Lys Gly Ser Gly Ser Ser Met Asp Thr Pro His Val Ser

200 205 210Gly Val Gly Gly Leu Ile Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro

215 220 225Asp Lys Val Lys Thr Pro Ser Ser Arg Pro Pro Thr

230 235

Claims

1.一种超热稳定蛋白酶基因，所述基因编码由序列表中SEQ IDNO1中所示的氨基酸序列，或编码具有超热稳定蛋白酶活性的由序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的一部分。

2.权利要求1的超热稳定蛋白酶基因，所述基因包含序列表中SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列。

3.一种超热稳定蛋白酶基因，所述基因可与权利要求2的超热稳定蛋白酶基因或与为权利要求2的超热稳定蛋白酶基因之一部分的选自由序列表中SEQ ID NO3，4，5和6所示的核苷酸序列的DNA杂交，杂交在50℃于含有0.5％的SDS，0.1％的牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％菲可400和0.01％的变性鲑精DNA的6×SSC中进行，其中所述基因编码的多肽具有超热稳定蛋白酶活性。

4.权利要求3的超热稳定蛋白酶基因，其包括SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。

5.一种生产超热稳定蛋白酶的方法，该方法包括培养用权利要求1或2的超热稳定蛋白酶基因转导的质粒转化的转化体，并从培养物中收获该超热稳定的蛋白酶。

6.一种生产超热稳定蛋白酶的方法，该方法包括培养用权利要求3的超热稳定蛋白酶基因转导的质粒转化的转化体，并从培养物中收获该超热稳定的蛋白酶。