CN1681922A

CN1681922A - 转谷氨酰胺酶生产菌

Info

Publication number: CN1681922A
Application number: CNA038215160A
Authority: CN
Inventors: 结城健介; 鷲津欣也
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2002-09-10
Filing date: 2003-09-09
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2023-09-09
Also published as: WO2004024912A1; JP2004097099A; EP1548110A1; CN100591757C; EP1548110A4; US7329521B2; US20060035366A1; DK1548110T3; ES2432536T3; EP1548110B1; JP4323147B2

Abstract

本发明提供可高效生产转谷氨酰胺酶的菌株，以及使用该菌株的转谷氨酰胺酶的生产方法。将来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子外部导入茂原链霉菌，得到转化体。培养该转化体，生产转谷氨酰胺酶。

Description

转谷氨酰胺酶生产菌

技术领域

本发明涉及来自放线菌的、生产转谷氨酰胺酶的菌株以及利用该菌株生产转谷氨酰胺酶的方法。

背景技术

转谷氨酰胺酶是催化肽链内谷氨酰胺残基转化为γ-羧基酰氨基的酰基转移反应的酶，特别是与蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基在蛋白质分子内和分子间形成ε-(γ-Gln)-Lys交联键。利用该性质，该酶在食品领域、医药领域等被广泛地应用于蛋白质的加工。

一直以来，人们已经知道转谷氨酰胺酶来自动物，例如已有报告指出：其在豚鼠的肝脏、哺乳动物的内脏、血液中广泛分布(Connellan等人.，Journal of Biological Chemistry 246卷4号，1093-1098(1971)、Folk等人.，Advances in Enzymology 38卷，109-191(1973)、Folk等人.，Advances in Protein Chemystry 31卷，1-133(1977))，并对该酶的特征进行了研究。另一方面，人们从放线菌中发现了与上述来自动物的转谷氨酰胺酶性质不同的非钙(Ca²⁺)依赖性转谷氨酰胺酶。具体地说，从茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)[旧称茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)]IF013819(日本特开昭64-27271号公报)、灰肉色链霉菌(Streptomyces griseocarneus)[旧称(Streptoverticilliumgriseocarneum)]IF012776、肉桂色链霉菌(Streptomycescinnamoneus)[旧称(Streptoverticillium cinnamoneum)]IF012852(日本特开2001-186884号公报)等中分离、鉴定出转谷氨酰胺酶。

发明内容

以往，转谷氨酰胺酶是从存在于自然界的动物、菌类等中经过提取、分离等制备的，因此，在供应量、供应成本等方面还有很多需改善之处。另一方面，对于来自微生物的转谷氨酰胺酶，人们关注于利用基因重组操作的生产方法的研究。但是，根据最早的利用基因重组操作的报告(Biosci.Biotech.Biochem.，58，82-87(1994)、日本特开平5-199883号公报)，其生产量为0.1mg/l左右，远未达到工业生产的水平。最近的报告(日本特开2001-186884号公报)中，生产水平得到了一定程度的提高，但经过2周的微生物培养，也只显示40-50mg/l左右的产率，难以说产率足够。

本发明基于以上背景，其目的在于提供可高效生产转谷氨酰胺酶的菌株，以及利用该菌株生产转谷氨酰胺酶的方法。

本发明人为解决上述课题进行了深入的研究。即，在使来自放线菌的转谷氨酰胺酶表达的情况下，对转谷氨酰胺酶的结构基因、启动子、载体以及宿主放线菌的组合进行了研究。结果成功地获得了转谷氨酰胺酶产率极高的转化体，从而完成了本发明。本发明提供以下内容。

[1]茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转化体，该茂原链霉菌转化体中外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子。

[2][1]中所述的茂原链霉菌转化体，其中所述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

[3][1]或[2]中所述的茂原链霉菌转化体，其中所述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

[4][1]-[3]中任意一项所述的茂原链霉菌转化体，其中所述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，该序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的一部分发生变异的序列。

[5]茂原链霉菌转化体，该茂原链霉菌转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述序列是SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

[6][1]-[5]中任意一项所述的茂原链霉菌转化体，该茂原链霉菌转化体为茂原链霉菌S-8112或其突变株的转化体。

[7]转谷氨酰胺酶的生产方法，该方法包括：将外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子的茂原链霉菌转化体在可使上述结构基因表达的条件下进行培养的步骤，以及回收产生的转谷氨酰胺酶的步骤。

[8][7]的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

[9][7]或[8]的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

[10][7]-[9]中任意一项所述的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，该序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的一部分发生变异的序列。

[11][7]-[9]中任意一项所述的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述茂原链霉菌转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述的序列是外部导入的SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

[12][7]-[11]中任意一项所述的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述茂原链霉菌转化体为茂原链霉菌S-8112或其突变株的转化体。

[13]变铅青链霉菌转化体(Streptomyces lividans)，该变铅青链霉菌转化体中外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子。

[14][13]的变铅青链霉菌转化体，其中上述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

[15][13]或[14]的变铅青链霉菌转化体，其中上述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

[16][13]-[15]中任意一项所述的变铅青链霉菌转化体，其中上述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，该序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的一部分发生变异的序列。

[17]变铅青链霉菌转化体，该变铅青链霉菌转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述的序列是外部导入的SEQ IDNO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

[18][13]-[17]中任意一项所述的变铅青链霉菌转化体，该变铅青链霉菌转化体为变铅青链霉菌3131或其突变株的转化体。

[19]转谷氨酰胺酶的生产方法，该方法包括：将外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子的变铅青链霉菌转化体在可使上述结构基因表达的条件下进行培养的步骤，以及回收产生的转谷氨酰胺酶的步骤。

[20][19]的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

[21][19]或[20]的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

[22][19]-[21]中任意一项所述的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，该序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的一部分发生变异的序列。

[23][19]-[21]中任意一项所述的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述变铅青链霉菌转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述的序列是外部导入的SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

[24][19]-[23]中任意一项所述的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述变铅青链霉菌转化体为变铅青链霉菌3131或其突变株的转化体。

附图简述

图1是表示实施例中的穿梭载体pSV1的构建方法的图。

图2是表示具有转谷氨酰胺酶基因的分泌表达质粒pUJ51BD的构建方法的图。

图3是表示在实施例中确定的转谷氨酰胺酶(BTG)基因的启动子区的碱基序列的图。

图4是表示转谷氨酰胺酶(BTG)基因的启动子区和结构基因的部分碱基序列的图。

图5是表示转谷氨酰胺酶(BTG)基因的结构基因的一部分和终止子区的碱基序列的图。

图6是将测定转化体ABL-1和ABM-1的培养上清中BTG量的结果汇总的表。

图7是表示对转化体ABL-1和ABM-1的培养上清进行电泳的结果(银染后的凝胶)。泳道1、2、3、4和5分别为泳变铅青链霉菌3131-TS的培养上清、ABL-1的培养上清、纯化BTG、茂原链霉菌S-8112的培养上清以及ABM-1的培养上清的泳道。泳道M为所用分子量标记(Pharmacia)的泳道。

实施发明的最佳方式

以下对本发明的内容进行详细说明。本发明提供作为转化体的放线菌(茂原链霉菌或变铅青链霉菌)，该转化体中外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子。

这里所述的转谷氨酰胺酶的结构基因只要来自茂原链霉菌即可，对其种类并没有特别限定。例如可以使用茂原链霉菌S-8112所具有的转谷氨酰胺酶的结构基因。结构基因的具体例子有：含有SEQ ID NO.1的碱基序列的DNA。茂原链霉菌S-8112的保藏号为FERM P-18980，保藏于以下的国际机构。

国际保藏机构

名称：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心

地址： 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号中央第6

保藏日：2002年8月20日

转谷氨酰胺酶的结构基因例如可如下获得。即，构建茂原链霉菌的染色体DNA文库，使用转谷氨酰胺酶的结构基因特异性探针对该文库进行筛选。通过限制酶处理，由所选择的克隆中获得已插入的DNA片段。可以通过利用PCR法等的公知的合成方法，制备转谷氨酰胺酶的结构基因。

即使SEQ ID NO.1记载的DNA的部分发生变异(以下称为“变异DNA”)，只要它所编码的蛋白质具有转谷氨酰胺酶活性，则可用于本发明的结构基因。另外优选该转谷氨酰胺酶的活性程度尽可能高。例如，优选活性与包含SEQ ID NO.1序列的DNA所编码的蛋白质的转谷氨酰胺酶等同。

变异DNA的具体例子有：与包含SEQ ID NO.1序列的DNA在严紧条件下杂交，且编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质DNA。这里所述“严紧条件”是指所谓的形成特异性杂交体，不形成非特异性杂交体的条件。例如用杂交液(50％甲醛、10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))，在42℃下孵育，之后用0.1×SSC、0.1％SDS在68℃下洗涤的条件。进一步优选的严紧条件例如使用50％甲醛、5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5)作为杂交液的条件。

变异DNA的其它例子如：编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的DNA序列，所述DNA序列包含SEQ ID NO.1所示的碱基序列中1个或多个碱基的置换、缺失、插入、附加或倒位的碱基序列。碱基置换等突变可以在多个位点发生。这里的“多个”根据作为突变对象的碱基所编码的氨基酸的种类、位置等而不同，通常为2-40个，优选2-20个，更优选2-10个。上述变异还包括将限制酶切断的序列导入5’末端、3’末端或其它位点，或者附加编码信号肽的序列等。

上述变异DNA例如可采用定点突变法，通过使包含SEQ ID NO.1的序列的DNA发生基因工程性的变异，使其特定位点的氨基酸残基发生置换、缺失、插入、附加或倒位来获得。还可以通过将具有转谷氨酰胺酶基因的茂原链霉菌用紫外线处理，再分离发生了变异的转谷氨酰胺酶的结构基因等公知的突变处理的方法来获得。

上述碱基的置换、缺失、插入、附加或倒位等突变也包括因茂原链霉菌的个体差异等而天然发生的突变。

例如，当天然存在的茂原链霉菌具有如上所述的变异DNA时，由该菌株提取基因组(染色体)DNA，将其用适当的限制酶处理，然后以SEQID NO.1的DNA或其一部分作为探针进行筛选，从中选择、分离在严紧条件下杂交的DNA，由此可获得变异DNA。

启动子采用作用于上述结构基因的启动子。优选采用来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。进一步优选采用与所使用的结构基因来源相同的启动子。例如如上所述，从茂原链霉菌获得转谷氨酰胺酶的结构基因时，可获得包括该结构基因及其启动子区的DNA片段，将该DNA片段作为本发明的结构基因和启动子使用。

终止子也采用作用于上述结构基因的终止子。优选采用来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。进一步优选采用与所使用的结构基因来源相同的终止子。例如如上所述，从茂原链霉菌获得转谷氨酰胺酶的结构基因时，可获得包括该结构基因及其终止子区的DNA片段，将该DNA片段作为本发明的结构基因和启动子使用。

其中，特别优选启动子、结构基因和终止子全部来自相同的茂原链霉菌。这样的实施例可例举使用包含下述含有SEQ ID NO.2的序列的DNA片段的茂原链霉菌宿主的情况。例如如上所述，这样的DNA片段可如下制备：从茂原链霉菌获得转谷氨酰胺酶的结构基因时，除该结构基因外还包括其启动子和终止子区。

这里，即使含有SEQ ID NO.2序列的DNA的部分发生变异(变异DNA)，只要它所编码的蛋白质具有转谷氨酰胺酶活性，则可同样地利用。另外优选该转谷氨酰胺酶活性的程度尽可能高。例如，优选活性与含有SEQ ID NO.2序列的DNA所编码的蛋白质的转谷氨酰胺酶等同。

与上述SEQ ID NO.1的DNA的情形同样，变异DNA的具体例子例如有：与包含SEQ ID NO.2的序列的DNA在严紧条件下杂交，且编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的DNA；编码SEQ ID NO.2所示的碱基序列中，有1个或多个碱基发生置换、缺失、插入、附加或倒位的碱基序列，且编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的DNA。除此之外，在变异的允许范围内，对于变异DNA的制备方法等也与SEQ ID NO.1的DNA的情形相同。

外部导入了上述的结构基因、启动子、终止子的转化体放线菌(茂原链霉菌或变铅青链霉菌)可通过用含有上述结构基因等的表达载体转化放线菌(茂原链霉菌或变铅青链霉菌)宿主来制备。

用于被转化的茂原链霉菌例如可以使用茂原链霉菌S-8112(保藏号FERM P-18980)或其突变株。而变铅青链霉菌例如可以使用变铅青链霉菌3131(ATCC 35287)或其突变株。突变株的制备例如可以采用紫外线照射等公知的方法。

表达载体的构建可以利用可用于放线菌的转化的市售的载体等公知的载体。例如可以将pUC19、pBR322、pBluescript等以大肠杆菌为宿主的质粒与变铅青链霉菌3131所包含的质粒p1J702等以放线菌为宿主的质粒组合，构建表达载体。表达质粒的具体例子如下所示。首先，使用pUC19和p1J702构建同时具有大肠杆菌的复制起点和放线菌的复制起点的穿梭载体。另一方面，从茂原链霉菌中分离含有转谷氨酰胺酶的启动子、结构基因和终止子的DNA片段，插入pUC19的适当的限制酶切位点。接着，用p1J702和上述穿梭载体将tsr(硫链丝菌肽抗性)基因插入该质粒，得到含有大肠杆菌的复制起点、Amp^r(氨苄青霉素抗性)基因、放线菌的复制起点和tsr(硫链丝菌肽抗性)基因，以及转谷氨酰胺酶的启动子、结构基因以及终止子的表达载体。

构建载体时的限制酶处理、DNA片段的插入等可按照常规方法进行。

这样的含有来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因以及作用于该结构基因的启动子和终止子的表达载体也可用于转化变铅青链霉菌和除茂原链霉菌以外的链霉菌属微生物。

使用如上构建的表达载体转化放线菌(茂原链霉菌或变铅青链霉菌)，可通过向原生质体化的放线菌宿主中导入表达载体的方法进行。优选在放线菌宿主可生长的条件下进行上述转化。本发明人在研究时发现，这样的方法使转化效率显著提高。其它的条件、操作方法等可适当选择使用常规方法(例如Turner等人的方法Gene，36，321-331(1985))中采用的方法。这里所述“放线菌宿主可生长的条件”是指反应液中含有放线菌生长所必需的营养素的条件，具体来说，例如反应液中含有肉膏、酵母提取物和/或蛋白胨(包括聚胨、胰胨、酪蛋白胨等)的条件。为了获得更高的转化率，进一步优选将宿主的原生质体化步骤和将载体导入原生质体化的宿主的步骤均在上述条件下进行。

转化体的选择可利用预先引入表达载体的tsr基因等的选择标记进行。

通过在可表达转谷氨酰胺酶的结构基因的条件下，培养所选择的转化体，即外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、启动子和终止子的放线菌宿主(茂原链霉菌或变铅青链霉菌)，可以产生转谷氨酰胺酶。用于培养转化体的培养基可以使用含有碳源、氮源、以及根据需要含有无机盐(无机离子)的培养基。为了促进转化体的生长，可以使用添加了维生素、氨基酸等的培养基。碳源例如可以采用葡萄糖、淀粉、糊精等，氮源例如可以采用聚胨、酵母提取物、肉膏等，无机盐例如可以采用磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钾等。

培养转化体时的培养温度例如为15℃-37℃的范围，优选25℃-35℃的范围。另外，培养基的pH例如调节至5.0-8.0，优选6.0-7.5。

将转化体培养规定时间后，可由培养液或菌体回收转谷氨酰胺酶。由培养液回收时，例如可将培养上清进行过滤、离心处理，除去不溶物，然后组合进行硫酸铵等的盐析、透析、各种层析等，进行分离、纯化，由此获得转谷氨酰胺酶。而由菌体内回收时，例如可通过对菌体进行加压处理、超声波处理等进行破碎，然后与上述同样地进行分离、纯化，获得转谷氨酰胺酶。还可通过过滤、离心处理等，预先由培养液回收菌体，然后进行上述一连串步骤(菌体的破碎、分离、纯化)。

实施例

本实施例中，如无特别说明，限制酶以及其它基因操作用的酶使用宝酒造株式会社或东洋纺织株式会社的产品。另外，酶的反应条件等依据所附使用说明书。

[实施例1]放线菌用载体p1J702的获得

在以下培养基条件下将包含质粒p1J702的变铅青链霉菌3131(ATCC 35287)在30℃下培养2天。

YEME培养基+0.5％甘氨酸+50μg/ml硫链丝菌肽

酵母提取物 3g

蛋白胨 5g

麦芽汁 3g

氯化镁 1g

葡萄糖 10g

蔗糖 340g

甘氨酸 5g

50mg/ml硫链丝菌肽溶液1ml/L(pH7.0)

(シグマ：二甲基亚砜溶液)

将200ml培养后的培养基离心(12,000g、4℃、10分钟)，将所得菌体悬浮于10ml 50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、25％蔗糖(以下称为“TE-Sucrose”)中。接着，加入2ml含有30mg/ml溶菌酶(シグマアルドリツチジヤパン公司)的TE-Sucrose和4ml0.25mM EDTA，将其在37℃培养30分钟。培养后加入2ml 20％SDS，再加入5ml 5M NaCl，轻缓搅拌，在0℃培养过夜。

接着，在由离心(100,000g、4℃、40分钟)得到的上清中加入30％聚乙二醇6000，使终浓度为10％，在0℃培养4.5小时。然后离心(900g、4℃、5分钟)，将沉淀溶解于10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、50mM NaCl。加入16.8g氯化铯和1.2ml、10mg/ml溶解于10mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(以下称为“TE”)的溴化乙锭溶液，通过离心(1,300g、室温、15分钟)去除残余物，然后再次进行离心(230,000g、20℃、12小时)。离心后在紫外线照射下获得质粒DNA层。接着通过用TE饱和的丁醇进行提取，除去溴化乙锭。将该提取反复进行3次。以TE作为透析液，在4℃对所得质粒DNA溶液透析过夜。之后用TE饱和的酚提取一次，用氯仿·异戊醇提取两次。接着，加入1/10容量的3M乙酸钠(pH5.2)溶液和2倍容量的乙醇，在-80℃静置30分钟。然后通过离心(12,000g、4℃、15分钟)回收沉淀，将沉淀用70％乙醇洗涤，干燥。将其溶解于200μl TE中。通过以上操作，最终得到的DNA量约为10μg。

[实施例2]由包含p1J702的变铅青链霉菌3131(ATCC 35287)中获得硫链丝菌肽敏感性菌株

在YEME培养基中将包含p1J702的变铅青链霉菌3131(ATCC35287)在30℃培养7天。接着将培养液用YEME培养基稀释至10⁵-10⁹倍，分别将100μl稀释液分别铺于5块YEME琼脂培养板(YEME中加入1.5％琼脂的琼脂培养基平板)，在30℃培养一周。培养后用Repliplate^TM Colony Transfer Pad(宝酒造株式会社)，在含有200μg/ml硫链丝菌肽的YEME培养基中复制，在30℃培养一周。使质粒p1J702脱落，选择具有硫链丝菌肽敏感性的菌株，以此作为变铅青链霉菌3131-TS。将其作为后述的转化宿主使用。

[实施例3]穿梭载体pSV1的获得

用图1所示的方法构建穿梭载体pSV1。首先，准备用限制酶BamHI消化大肠杆菌用载体pUC19(宝酒造株式会社)所得的DNA片段，和用Bcll(宝酒造株式会社)消化放线菌用载体p1J702得到含有tsr的DNA片段，用DNA连接试剂盒(宝酒造株式会社)将它们连接，由此制备pUCTSR。接着，将用Kpnl、Clal(宝酒造株式会社)消化pUCTSR得到的DNA片段(长片段)和用Kpnl、Clal(宝酒造株式会社)消化p1J702得到的DNA片段(短片段)，用DNA连接试剂盒(宝酒造株式会社)连接，然后转化大肠杆菌DH5菌株(东洋纺株式会社)。将这样得到的转化体所具有的、由pUC19片段和p1J702片段相连接的质粒作为穿梭载体pSV1，用于以后的操作。

[实施例4]转谷氨酰胺酶分泌表达质粒pUJ51BD的制备

用图2所示的方法构建具有转谷氨酰胺酶基因的分泌表达质粒pUJ51BD。首先，从含有由茂原链霉菌S-8112(保藏号FERMP-18980)分离的转谷氨酰胺酶(以下称为“BTG”)基因BamHI片段的噬菌体DNA(λBTG、日本特开平5-199883号公报)切取约6.6kb的Bglll-BamHI片段，插入pUC19的BamHI位点，制备pBTG-BB质粒。用Kilo-Sequence用缺失试剂盒(宝酒造株式会社)使3’不需要的区域从pBTG-BB中缺失，制备含有约3.9kb的BTG基因的质粒pU51B。接着在pU51B的Pstl位点插入放线菌用载体p1J702经Pstl消化的DNA片段，制备质粒pUJ51B。由pUJ51B切取Xbal-Clal片段，通过与实施例3得到的大肠杆菌-放线菌穿梭载体pSVl的Xbal-Clal片段置换，构建除去了来自p1J702的mel(酪氨酸酶)基因的BTG分泌表达质粒pUJ51BD。

[实施例5]启动子区的碱基序列分析

由BTG的结构基因的序列(SEQ ID NO.1)合成碱基序列分析用的合成引物BB-23[インヴイトロジエン(株)]5’-ACACCGCACTCATAGTGGCG-3’(SEQ ID NO.3)。使用引物BB-23，从启动子区的3’一侧，使用M13-RV(宝酒造株式会社)从5’一侧，分析质粒pBTG-BB的碱基序列。再根据所得碱基序列分析的结果，进一步合成引物BB-19 5’-TCCGTGCGAGTGGAAGAACG-3’(SEQ ID NO.4)、SP6-20 5’-GACGGCCTCCGAATAAC-3’(SEQ ID NO.5)，用它们通过引物步移，确定启动子区约700bp的全部碱基序列(图3)。同样，使用合成引物SP6-32 5’-ATGTCGAGGGACAGGAAC-3’(SEQ ID NO.6)和SP6-36 5’-CACCACGAAAGTCGCTAC-3’(SEQ ID NO.7)，通过引物步移，确定约500bp的终止子区的碱基序列。结果，鉴定出含有启动子区、结构基因和终止子区的碱基序列(SEQ ID NO.2)(图4、图5)。用BigDye^TMTerminator Cycle Sequencing FS Ready Kit(アプライド·バイオシステムズ)进行序列反应，使用ABI PRISM 310测序仪(アプライド·バイオシステムズ)进行分析。

[实施例6]变铅青链霉菌3131-TS原生质体的制备

在YEME培养基(0.5％甘氨酸)中将实施例2中获得的变铅青链霉菌3131-TS在30℃培养2天。将200ml培养后的培养基离心(1,300g、室温、10分钟)，将所得菌体悬浮于72mL 0.35M蔗糖溶液中。接着，将该悬浮液离心(1,300g、室温、10分钟)，再将菌体悬浮于60ml含有1mg/ml溶菌酶(シグマアルドリツチジヤパン公司)的P缓冲液中，将其在30℃培养2.5小时。用脱脂棉过滤培养后的悬浮液，去除残余物。接着，将所得滤液进行离心(1,300g、室温、10分钟)，用25ml P缓冲液洗涤残余物。将该洗涤重复2次，然后将沉淀悬浮于1ml P缓冲液，以此作为原生质体悬浮液。

P缓冲液

TES[N-三(羟甲基)甲基-2-氨乙基亚磺酸] 5.73g

蔗糖 103g

氯化镁 2.03g

硫酸钾 0.5g

氯化钙 3.68g

痕量元素溶液 2ml/L(pH7.4)

另外制备磷酸二氢钾溶液，在使用前，每100ml P缓冲液中加入1ml使用。

痕量元素溶液

氯化锌 40mg

三氯化铁 200mg

氯化铜 10mg

氯化锰 10mg

四硼酸钠 10mg

钼酸铵 10mg/L

[实施例7]转化变铅青链霉菌3131-TS

将以下各溶液混合，使总量为140μl。

BTG分泌表达质粒pUJ51D的DNA溶液 20μl

变铅青链霉菌3131-TS原生质体 100μl

0.35M蔗糖溶液 20μl

接着，加入1.5ml含有20％聚乙二醇1000的P缓冲液，通过移液轻缓混合，在室温下静置2分钟。将该混合液离心(1,700g、室温、10分钟)，收集沉淀。将作为沉淀得到的原生质体用P缓冲液反复洗涤2次。将颗粒再悬浮于1ml的P缓冲液中，然后取200μl涂布于R-2培养基。

另一方面，另行制备以下所示的R-2/A和R-2/B。

R-2/A

硫酸钾 0.5g

氯化镁 20.2g

氯化钙 5.9g

葡萄糖 20.0g

脯氨酸 6.0g

酪蛋白水解物 0.2g

痕量元素溶液 4.0ml

琼脂 44.0g/L

R-2/B

TES 11.5g

酵母提取物 10.0g

蔗糖 203g/L(pH7.4)

制备平板培养基时，将R-2/A和R-2/B混合，再以终容量每200ml混合1ml的比例混合1％的KH₂PO₄。将它们在30℃培养18小时。之后加入1ml含有200μg/ml硫链丝菌肽和400μg/ml酪氨酸的P缓冲液，覆盖平板表面。再将平板在30℃培养7天，得到获得了硫链丝菌肽抗性的转化体(ABL-1)。

[实施例8]茂原链霉菌的原生质体的制备

作为预培养，在YEME培养基+1％蔗糖+25mM氯化镁(pH7.0)中将茂原链霉菌S-8112在27℃培养3天。接着将0.5％预培养后的培养液接种于YEME培养基+1％蔗糖+4mM氯化镁+1％甘氨酸(pH7.0)中，在27℃培养3天。将培养后的培养基离心(3,000g、4℃、10分钟)，测定所得菌体的湿重。相对于0.6g湿的菌体，用10ml 0.3M的蔗糖溶液洗涤，然后再次离心(3,000g、4℃、10分钟)，将菌体悬浮于4ml含有0.4mg/ml溶菌酶(日本ロツシユ株式会社)和0.1mg/ml消色肽酶(アクロモペプチダ一ゼ)(和光纯药工业株式会社)的BS-L缓冲液中，在30℃缓慢搅拌30分钟。接着在冰中加入5ml BS-P缓冲液，一边用3ml BS-P缓冲液洗涤，一边用脱脂棉过滤。将所得悬浮液离心(1,500g、4℃、5分钟)，用10ml BS-P缓冲液再悬浮，然后再次离心(1,500g、4℃、5分钟)。将所得沉淀用0.5ml BS-P缓冲液再次悬浮，以所得溶液作为原生质体悬浮液，用于后述的转化。

BS-L缓冲液

10％肉膏 10ml

酵母提取物 1g

蛋白胨 2g

葡萄糖 10g

蔗糖 171.15g

氯化钙 0.277g

氯化镁 0.508g/L(pH7.0)

BS-P缓冲液

10％肉膏 10ml

酵母提取物 1g

蛋白胨 2g

葡萄糖 10g

蔗糖 171.15g

氯化钙 2.77g

氯化镁 2.03g/L(pH7.0)

[实施例9]转化茂原链霉菌

将100μl实施例8中得到的原生质体悬浮液(原生质体浓度1×10⁹/ml)与10μl含有1μg实施例4中得到的BTG分泌表达质粒pUJ51D的2M蔗糖溶液混合，然后立即在冰中静置10秒钟，接着加入0.5ml含有25％聚乙二醇1000(シグマアルドリツチジヤパン公司)的P缓冲液，立即在冰中静置1分钟，再加入2ml BS-P缓冲液，立即进行离心(1,500g、4℃、10分钟)。将所得沉淀用0.5ml BS-P缓冲液悬浮，分别取0.1ml分注于SBS琼脂培养基，用3ml SBS软琼脂培养基一边搅拌一边覆盖其上。打开盖子，准确地干燥2小时，然后在27℃准确地培养24小时。再覆盖3ml含有200μg/ml硫丝菌肽的SBS软琼脂培养基，在27℃下培养。以上操作得到的转化体为ABM-1。

SBS琼脂培养基(pH7.0)

肉膏 10g

酵母提取物 7.5g

胰胨 1g

葡萄糖 10g

蔗糖 308.07g

琼脂 25g/L(pH7.0)

SBS软琼脂培养基(pH7.0)

肉膏 10g

酵母提取物 7.5g

胰胨 1g

葡萄糖 10g

蔗糖 308.07g

シ一プラ一ク琼脂糖 25g/L(pH7.0)

[实施例10]引入了BTG基因的转化体的培养

将实施例7中得到的转化体ABL-1和实施例9中得到的转化体ABM-1分别在以下的培养基条件下，在30℃培养7天。

聚胨 20g

可溶性淀粉 20g

酵母提取物 2g

磷酸氢二钾 2g

硫酸镁 1g

アデカノ-ルLG126 0.5g

50mg/ml硫链丝菌肽溶液 0.5ml/L(pH7.0)

将在上述条件下培养后的培养基进行离心(12,000g、4℃、10分钟)，得到的上清用于以下的ELISA法。

[实施例11]BTG生产量的定量(ELISA法)

通过使用Blue Sepharose CL-6B(Pharmacia)的亲和层析，由茂原链霉菌S-8112的培养上清得到纯化BTG，以此作为抗原，使用通过免疫兔而制备的抗BTG抗体，通过ELISA法，对实施例10中得到的培养上清中的BTG量进行定量。

首先，向96孔微量滴定板的各孔中各分注100μl用PBS缓冲液稀释的抗BTG抗体溶液，在37℃孵育1小时，将抗体在滴定板上固定。除去抗体溶液，然后用200μl含有0.1％吐温20的ブロツクエ-ス(大日本制药株式会社)的10倍稀释液(以下称为“洗涤液”)洗涤各孔。连续进行3次洗涤操作。接着，将200μlブロツクエ-ス的4倍稀释液分注各孔中，在37℃孵育1小时，进行封闭。除去ブロツクエ-ス的4倍稀释液，然后将各孔用洗涤液洗涤3次。接着将作为测定样品的培养上清(ABL-1或ABM-1的培养上清)用ブロツクエ-ス的10倍稀释液适当稀释，将稀释液各以50μl分注各孔中，在37℃孵育1小时。将纯化BTG用ブロツクエ-ス的10倍稀释液分别制备成不同的浓度，以此作为标准品，与测定样品同样地添加到封闭处理后的孔中。

由各孔中除去样品溶液后，用洗涤液对各孔洗涤3次。接着，将100μl含有Fab′-HRP的ブロツクエ-ス的10倍稀释液分注到各孔中，在37℃孵育1小时，其中所述Fab′-HRP是使辣根过氧化物酶(HRP)与抗BTG抗体的Fab’片段交联而形成。之后，除去Fab′-HRP溶液，然后将各孔用洗涤液洗涤3次。接着将各150μl含有0.04％邻苯二胺(o-PDA)、0.42％过氧化氢液的50mM柠檬酸钠溶液(pH4.5)分注到各孔中，在37℃孵育，使o-PDA与过氧化氢通过HRP反应显色。反应开始后正确地计数20分钟，然后分别向各孔中分注作为反应中止液的50μl 3M硫酸溶液，测定各孔在波长492nm下的吸光度。使用由标准品的吸光度求出的标准曲线，计算各培养上清ABL-1或ABM-1中的BTG量。各培养上清的BTG量表示在图6中。正如该表所表示，ABL-1生产了0.7g/l、ABM-1生产了0.5g/L的BTG。与目前报道的产率(40mg/L-50mg/L)相比，ABL-1获得了10倍或以上，ABM-1获得了约10倍的产率，表明可以以极高的效率进行BTG的生产。

PBS缓冲液

氯化钠 8.0g

磷酸氢二钠 1.1g

氯化钾 0.2g

磷酸二氢钾 0.2g/L(pH7.4)

[实施例12]SDS-PAGE

将转化体ABL-1和转化体ABM-1的培养上清分别与电泳用2×SDS缓冲液以1∶1的比例混合，制成SDS-PSGE样品。另外，准备变铅青链霉菌3131-TS的培养上清、纯化BTG用缓冲液稀释得到的溶液、茂原链霉菌S-8112的培养上清作为对照。将各样品供给使用12.5％凝胶的SDS-PAGE。SDS-PAGE采用フアルマシア·バイオテク公司制造的快速系统，染色为银染。染色后的凝胶照片如图7所示。图7中，泳道1、2、3、4和5分别为变铅青链霉菌3131-TS的培养上清、ABL-1的培养上清、纯化BTG、茂原链霉菌S-8112的培养上清以及ABM-1的培养上清的泳道。泳道M为分子量标记(Pharmacia)的泳道。

如图4所示，ABL-1(泳道2)和ABM-1(泳道5)中，在与纯化BTG(泳道3)几乎相同的位置可观察到清晰的条带。可判定其含有高浓度的BTG。另一方面，变铅青链霉菌3131-TS的培养上清(泳道1)和茂原链霉菌S-8112的培养上清(泳道4)中未观察到可判定为BTG的条带。由此可以证明ABL-1和ABM-1特异性生产BTG。

2×SDS缓冲液

Tris-盐酸盐 2.42g

EDTA 0.744g

SDS 50g

B-巯基乙醇 100ml/L(pH8.0)

本发明并不受上述发明的实施例的任何限定，只要不脱离权利要求的范围，在本领域人员可容易地联想到的范围内，各种变形的实施方案均包含在本发明中。

以下公开以下内容。

(1)转谷氨酰胺酶的生产方法，该方法包括：用含有来自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的转谷氨酰胺酶结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子的载体转化茂原链霉菌宿主的步骤；在可使上述结构基因表达的条件下培养转化体的步骤；以及回收产生的转谷氨酰胺酶的步骤。

(2)(1)的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述转化步骤在所述茂原链霉菌宿主可生长的条件下进行。

(3)(1)或(2)的转谷酰胺酶的生产方法，其中上述载体包含改造质粒p1J702所得的质粒。

(4)(1)-(3)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

(5)(1)-(4)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

(6)(1)-(5)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述茂原链霉菌宿主为茂原链霉菌S-8112或其突变株。

(7)(1)-(6)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，所述序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的一部分发生变异的序列。

(8)(1)-(6)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述序列是SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

(11)转谷氨酰胺酶的生产方法，该方法包括：用含有来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子的载体转化宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的步骤；在可使上述结构基因表达的条件下培养转化体的步骤；以及回收产生的转谷氨酰胺酶的步骤。

(12)(11)的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述转化步骤在所述变铅青链霉菌宿主可生长的条件下进行。

(13)(11)或(12)的转谷酰胺酶的生产方法，其中上述载体包含改造质粒p1J702所得的质粒。

(14)(11)-(13)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

(15)(11)-(14)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

(16)(11)-(15)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述变铅青链霉菌宿主为变铅青链霉菌3131或其突变株。

(17)(11)-(16)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，所述序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的一部分发生变异的序列。

(18)(11)-(16)中任意一项所述的转谷酰胺酶的生产方法，其中所述转化体包含下述含有编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述序列是外部导入的SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

(21)表达载体，该表达载体含有来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子。

(22)(21)的表达载体，其中所述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

(23)(21)或(22)的表达载体，其中所述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

(24)(21)-(23)中任意一项所述的表达载体，其中所述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，所述序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQID NO.1的一部分发生变异的序列。

(25)表达载体，该表达载体包含编码转谷氨酰胺酶的序列，所述序列是SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

(26)一种微生物，该微生物是由(21)-(25)中任意一项所述的表达载体转化的、属于链霉菌属的微生物。

(31)转化放线菌的方法，该方法包括将放线菌在其可生长的条件下进行原生质化的步骤；在上述放线菌宿主可生长的条件下，将含有来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子的表达载体导入放线菌宿主的步骤。

(32)(31)的转化方法，其特征在于：所述放线菌宿主为变铅青链霉菌或茂原链霉菌。

产业实用性

本发明可提供转谷酰胺酶的产率极高的放线菌。通过使用该放线菌，可以高效地进行转谷氨酰胺酶的生产。

序列表

<110>AMANO ENZYME INC.

YUUKI，Kensuke

WASHIZU，Kinya

<120>转谷氨酰胺酶生产菌

<130>P0201101

<150>JP P2002-263834

<151>2002-09-10

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1224

<212>DNA

<213>茂原链霉菌

<220>

<221>来源

<222>(1)..(1224)

<223>转谷氨酰胺酶基因

<400>1

atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga gtgcggtgtt atgcaccgcc 60

ggattcatgc cgtcggccgg cgaggccgcc gccgacaatg gcgcggggga agagacgaag 120

tcctacgccg aaacctaccg cctcacggcg gatgacgtcg cgaacatcaa cgcgctcaac 180

gaaagcgctc cggccgcttc gagcgccggc ccgtcgttcc gggcccccga ctccgacgac 240

agggtcaccc ctcccgccga gccgctcgac aggatgcccg acccgtaccg tccctcgtac 300

ggcagggccg agacggtcgt caacaactac atacgcaagt ggcagcaggt ctacagccac 360

cgcgacggca ggaagcagca gatgaccgag gagcagcggg agtggctgtc ctacggctgc 420

gtcggtgtca cctgggtcaa ttcgggtcag tacccgacga acagactggc cttcgcgtcc 480

ttcgacgagg acaggttcaa gaacgagctg aagaacggca ggccccggtc cggcgagacg 540

cgggcggagt tcgagggccg cgtcgcgaag gagagcttcg acgaggagaa gggcttccag 600

cgggcgcgtg aggtggcgtc cgtcatgaac agggccctgg agaacgccca cgacgagagc 660

gcttacctcg acaacctcaa gaaggaactg gcgaacggca acgacgccct gcgcaacgag 720

gacgcccgtt ccccgttcta ctcggcgctg cggaacacgc cgtccttcaa ggagcggaac 780

ggaggcaatc acgacccgtc caggatgaag gccgtcatct actcgaagca cttctggagc 840

ggccaggacc ggtcgagttc ggccgacaag aggaagtacg gcgacccgga cgccttccgc 900

cccgccccgg gcaccggcct ggtcgacatg tcgagggaca ggaacattcc gcgcagcccc 960

accagccccg gtgagggatt cgtcaatttc gactacggct ggttcggcgc ccagacggaa 1020

gcggacgccg acaagaccgt ctggacccac ggaaatcact atcacgcgcc caatggcagc 1080

ctgggtgcca tgcatgtcta cgagagcaag ttccgcaact ggtccgaggg ttactcggac 1140

ttcgaccgcg gagcctatgt gatcaccttc atccccaaga gctggaacac cgcccccgac 1200

aaggtaaagc agggctggcc gtga 1224

<210>2

<211>2393

<212>DNA

<213>茂原链霉菌

<400>2

gatcttccgg gacatctgag gcgccggagg cgatccgagg cgcccgaggc gtctgcgcga 60

agggcgccgc cgtgccgtcc atccccgtcc gcgtcgacgc gggccgggag ggggtgcggc 120

ggcgcccttc ggctgtgtgg acgaagcgtc gggtcggagg ggcggccgga tatcgtcctt 180

ggggcggggt ggccggaatt gccgccatgg tgttgccggg gaatcgaccc gaagacatga 240

tcacttctcg tatccacccg atcacgtatc cgggagtcga gaagtgttac gccgtgcccc 300

tgtccgcgtc ctcacccctg tcgccgtgac agcgacccgc gttcttccac tcgcacggac 360

ggccccacag gacctttcgg cccgggctcg ccccgccgcc tcggtgacgg cctccgaata 420

acgcggccgc cggggcctcg gccggttgac cgatccgggt cacgcgcccc gccgggcggg 480

cggccacgtc cggtctcgcc ccgcccgaca tcggctgcga ctgccttcgc tcgcacttct 540

tcccgcctcc cggccgcgtt tttccgccgc cgaaggtgcg gcgacgcgta ccgaatcccc 600

cttcatcgcg acgtgcttcc gcacggccgc gttcaacgat gttccacgac aaaggagttg 660

caggtttcca tgcgcatacg ccggagagct ctcgtcttcg ccactatgag tgcggtgtta 720

tgcaccgccg gattcatgcc gtcggccggc gaggccgccg ccgacaatgg cgcgggggaa 780

gagacgaagt cctacgccga aacctaccgc ctcacggcgg atgacgtcgc gaacatcaac 840

gcgctcaacg aaagcgctcc ggccgcttcg agcgccggcc cgtcgttccg ggcccccgac 900

tccgacgaca gggtcacccc tcccgccgag ccgctcgaca ggatgcccga cccgtaccgt 960

ccctcgtacg gcagggccga gacggtcgtc aacaactaca tacgcaagtg gcagcaggtc 1020

tacagccacc gcgacggcag gaagcagcag atgaccgagg agcagcggga gtggctgtcc 1080

tacggctgcg tcggtgtcac ctgggtcaat tcgggtcagt acccgacgaa cagactggcc 1140

ttcgcgtcct tcgacgagga caggttcaag aacgagctga agaacggcag gccccggtcc 1200

ggcgagacgc gggcggagtt cgagggccgc gtcgcgaagg agagcttcga cgaggagaag 1260

ggcttccagc gggcgcgtga ggtggcgtcc gtcatgaaca gggccctgga gaacgcccac 1320

gacgagagcg cttacctcga caacctcaag aaggaactgg cgaacggcaa cgacgccctg 1380

cgcaacgagg acgcccgttc cccgttctac tcggcgctgc ggaacacgcc gtccttcaag 1440

gagcggaacg gaggcaatca cgacccgtcc aggatgaagg ccgtcatcta ctcgaagcac 1500

ttctggagcg gccaggaccg gtcgagttcg gccgacaaga ggaagtacgg cgacccggac 1560

gccttccgcc ccgccccggg caccggcctg gtcgacatgt cgagggacag gaacattccg 1620

cgcagcccca ccagccccgg tgagggattc gtcaatttcg actacggctg gttcggcgcc 1680

cagacggaag cggacgccga caagaccgtc tggacccacg gaaatcacta tcacgcgccc 1740

aatggcagcc tgggtgccat gcatgtctac gagagcaagt tccgcaactg gtccgagggt 1800

tactcggact tcgaccgcgg agcctatgtg atcaccttca tccccaagag ctggaacacc 1860

gcccccgaca aggtaaagca gggctggccg tgatgtgagc ggggtggagg ggagccggtt 1920

gcccggctcc cctccaccct ctcccccgcc accacgaaag tcgctacagc tcgtgtcccg 1980

tcgtgctgtc gacgtgcgcc gggagttcgc cctcgtggcg gtcgcccgtc gtcggggtgc 2040

ccgtgggttc gaacatgagg atggaggcgc ccggggagga cggcttgtgt tcggtgccct 2100

tgggcaccac gaaggtgtcg cccttgtgca ggcgcaccgt gtgttccgtt ccgtcggagt 2160

cgcggagcgc cacgtcgaag cggccgtcca ggacgaggaa gaactcgtcg gtgtcctcgt 2220

ggacgtgcca gacgtgctcg cctcgggtgt gggcgacgcg gacgtcgtag tcgttcatgc 2280

gggcgacgat gcgcgggctg tagacgtcgt cgaaggaggc gagggccttg gcgaggttga 2340

cgggctcggt gtcgttcatg gtccgagtct cggcgggagc ccgccgcggc gtc 2393

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>3

acaccgcact catagtggcg 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>4

tccgtgcgag tggaagaacg 20

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>5

gacggcctcc gaataac 17

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

atgtcgaggg acaggaac 18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

caccacgaaa gtcgctac 18

Claims

1.茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转化体，该茂原链霉菌转化体中外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子。

2.权利要求1的茂原链霉菌转化体，其中上述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

3.权利要求1的茂原链霉菌转化体，其中上述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

4.权利要求1的茂原链霉菌转化体，其中上述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，该序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的一部分发生变异的序列。

5.茂原链霉菌转化体，该茂原链霉菌转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述的序列是外部导入的SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

6.权利要求1的茂原链霉菌转化体，该茂原链霉菌转化体为茂原链霉菌S-8112或其突变株的转化体。

7.转谷氨酰胺酶的生产方法，该方法包括：将外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子的茂原链霉菌转化体在可使上述结构基因表达的条件下进行培养的步骤，以及回收产生的转谷氨酰胺酶的步骤。

8.权利要求7的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

9.权利要求7的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

10.权利要求7的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，该序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ IDNO.1的一部分发生变异的序列。

11.权利要求7的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述茂原链霉菌转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述的序列是外部导入的SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

12.权利要求7的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述茂原链霉菌转化体为茂原链霉菌S-8112或其突变株的转化体。

13.变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)转化体，该变铅青链霉菌转化体中外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子。

14.权利要求13的变铅青链霉菌转化体，其中上述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

15.权利要求13的变铅青链霉菌转化体，其中上述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

16.权利要求13的变铅青链霉菌转化体，其中上述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，该序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的一部分发生变异的序列。

17.变铅青链霉菌转化体，该变铅青链霉菌转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述的序列是外部导入的SEQ IDNO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

18.权利要求13的变铅青链霉菌转化体，该变铅青链霉菌转化体为变铅青链霉菌3131或其突变株的转化体。

19.转谷氨酰胺酶的生产方法，该方法包括：将外部导入了来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的结构基因、以及作用于该结构基因的启动子和终止子的变铅青链霉菌转化体在可使上述结构基因表达的条件下进行培养的步骤，以及回收产生的转谷氨酰胺酶的步骤。

20.权利要求19的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述启动子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的启动子。

21.权利要求19的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述终止子是来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的终止子。

22.权利要求19的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述结构基因包含编码转谷氨酰胺酶的序列，该序列是SEQ ID NO.1的序列或SEQ IDNO.1的一部分发生变异的序列。

23.权利要求19的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中上述变铅青链霉菌转化体含有下述包含编码转谷氨酰胺酶的序列的DNA片段，所述的序列是外部导入的SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的一部分发生变异的序列。

24.权利要求19的转谷氨酰胺酶的生产方法，其中所述变铅青链霉菌转化体为变铅青链霉菌3131或其突变株的转化体。