CN1820081A - 分析基因导入位点的方法 - Google Patents

Abstract

一种在整合了反转录病毒载体的染色体DNA中分析载体附近的来源于染色体的DNA区域的方法，其特征为在存在可降低双链核酸Tm值的化合物时进行引物延伸反应和核酸扩增反应。进一步提供了用于本方法的试剂盒和缓冲液。

Description

分析基因导入位点的方法

技术领域

本发明涉及一种用来分析转基因细胞中染色体上基因整合位点的方法。

技术背景

基因治疗是，例如，通过提供正确的遗传信息来修复细胞功能、或通过添加细胞中原本没有的新的“保护基因”，来治疗或预防诸如由于细胞中“遗传信息错误”所导致的遗传病或者癌症这样的难治性疾病的疗法。

已知基因治疗中将基因转移到细胞中的方法包括使用病毒载体的方法、通过内吞作用、电穿孔或基因枪转入裸DNA的方法、以及使用诸如脂质体这样的转基因试剂的方法。

病毒载体应用在包括基础和临床用途在内的多种用途的基因治疗领域。例如，腺病毒载体适用于在靶细胞中大量地瞬时表达某个基因。在另一方面，期望反转录病毒载体可用于遗传病的基因治疗和转基因动物生产领域，这是因为反转录病毒载体可将目的基因稳定整合至宿主的染色体中，使该基因长期稳定表达。但是，由于根据反转录病毒转移基因的方法，目的基因是随机整合在宿主染色体上的，而已知整合位点会使细胞具有癌化的可能。因此，对宿主染色体上反转录病毒介导的基因整合位点进行分析以及用于测定被测细胞群的克隆种类(单克隆，寡克隆及多克隆)的灵敏监测是非常重要的。

反向PCR方法(参见J.Virol.，63：1924-1928(1989))或LM PCR方法(参见Science，246：780-786(1989))是常用的分析病毒、转座子、转基因等在染色体DNA中的插入或整合位点的方法。但是，已知这些方法存在诸如低检测灵敏度(需要较多的模板DNA)或低特异性这样的问题。

随后，发展了线性扩增介导的PCR(LAM PCR)方法来克服这些问题(参见WO 00/24929；Blood，100：2737-2743(2002))。根据该方法，首先进行的是以染色体DNA为模板，用一条引物进行线性PCR。引物与作为反转录病毒特征的序列——长末端重复(LTR)序列互补，并在其末端用生物素标记。在线性PCR中，仅用一个引物扩增对应于该引物退火位置下游部分的单链DNA。用固定了链亲和素的磁珠吸收线性PCR的产物，从而有效回收具有LTR序列及来源于染色体序列的扩增的单链DNA片段。通过合成互补链而将单链DNA转变成双链DNA。用识别4个碱基序列并切割双链DNA序列的限制性内切酶切割双链DNA。将称为接头盒的双链DNA连接到末端。用所获得的连接产物为模板，通过一个与LTR互补的引物和一个与接头盒互补的引物进行PCR。从而扩增包含LTR与来源于染色体的LTR侧翼DNA在内的DNA片段。因此可分析反转录病毒的整合位点。另外，可通过使用琼脂糖凝胶等回收PCR扩增片段、将其亚克隆到合适的载体、并测定片段的核苷酸序列的方式，来分析宿主染色体DNA中的整合位点。

与传统方法相比，依据这一方法可提高检测灵敏度。此外，该方法的优势在于使用磁珠简化了样品在反应步骤间的纯化过程，并降低染色体DNA作为模板的量。

然而，如果所分析的染色体DNA来源于具有多个不同的整合位点的(多克隆)的生物样品群体，使用目前的反应条件可能会依据作为模板的DNA的种类与数量的差异，导致对来源于特定克隆的片段进行偏向性扩增的现象。在这种情况下，扩增的结果并不反映所用样品的细胞群中所存在的克隆的实际状态。此外，可能无法检测到样品中的低丰度的克隆。因此，传统的LAM PCR方法在其灵敏度、重复性和精确性方面存在问题。因此，难以获得可反映转基因细胞群的实际状态的信息，作出正确的判断。

如上所述，LAM PCR方法目前被认为是一个用来分析通过逆转录病毒载体来进行整合的基因的有效系统。不过，该方法需要进行改进，从而精确地、灵敏地、重复性地监测在多个位点整合逆转录病毒的生物样品(多克隆，寡克隆或单克隆)确定群体中具有整合基因的细胞在怎样的范围内存在，或特定细胞在群体中的比例。

发明内容

本发明的主要目的是改进传统的用LAM PCR方法分析整合位点的方法，从而构建一个，例如，对于具有多个逆转录病毒介导的基因整合位点的细胞群，通过PCR反应可扩增更多的整合片段而不偏向来自某个特定克隆的片段的系统，其中群体中所含的特定扩增片段可被灵敏地检测出来。从而，可高灵敏度高重复性地判断被测细胞群中克隆的种类(单克隆，寡克隆，多克隆)，并监测细胞群中特定细胞的含量。

作为为完成上述目标而进行的透彻研究的结果，本发明人已发现，通过在存在用于降低双链核酸Tm值的化合物的情况下，构建一个引物延伸反应，改善包括PCR条件在内的反应方案，由此对非偏向性扩增的片段进行灵敏的检测，从而完成本发明。

本发明的第一个方面涉及分析整合有逆转录病毒载体的染色体DNA中逆转录病毒载体侧翼的来源于染色体DNA的区域，该方法包括：

(1)使用其序列与反转录病毒载体LTR的核苷酸序列互补的引物、以整合了反转录病毒载体的染色体DNA为模板，进行引物延伸反应，从而获得引物延伸产物；

(2)回收步骤(1)获得的引物延伸产物，并合成与引物延伸产物互补的DNA，从而获得双链DNA；

(3)对步骤(2)获得的双链DNA末端加上双链寡核苷酸；并且

(4)以步骤(3)获得的添加了寡核苷酸的双链DNA为模板，以与反转录病毒载体LTR核苷酸序列互补的序列为一个引物，另一个引物的序列与所述双链寡核苷酸的核苷酸序列互补，进行核酸扩增反应，从而获得扩增产物，

其中步骤(1)中的引物延伸反应和步骤(4)中的核酸扩增反应是在可降低双链核酸Tm值的化合物存在的条件下进行的。

根据第一方面中的方法，步骤(1)中的引物延伸反应和/或步骤(4)中的核酸扩增反应可通过聚合酶链式反应进行。在聚合酶链式反应中可使用包含具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物的DNA聚合酶组分。例如，聚合酶链式反应的温度循环由95℃，60秒；58℃，45秒；和72℃，90秒所构成。

作为第一方面的方法中所用的可降低双链核酸Tm值的化合物的例子，可以是选自甜菜碱、甲酰胺、二甲基亚砜和四甲基铵盐的某种物质。例如三甲铵基乙内盐可用作一种甜菜碱。

在第一方面的步骤(4)中可使用两步聚合酶链式反应。

在第一方面的步骤(3)中，可用限制性内切酶消化步骤(2)中获得的双链DNA，从而将双链寡核苷酸加到产生的双链DNA末端。步骤(1)中的染色体DNA可以预先用的限制性酶消化。

根据第一方面，可在步骤(1)中使用具有标记的引物，通过步骤(2)的标记来回收引物延伸产物。例如进行生物素标记。

第一方面的方法可进一步包括测定步骤(4)中所获得的扩增产物的核苷酸序列的步骤。例如，在本方法中，可通过以将步骤(4)中获得的产物整合到载体上而得到的重组DNA为模板来测定其核苷酸序列。

本发明的第二方面涉及测定整合了反转录病毒载体的染色体DNA上反转录病毒载体侧翼的来源于染色体DNA的核苷酸序列的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)可与反转录病毒LTR部分退火的引物；

(b)接头盒；

(c)可与(b)中接头盒退火的引物；

(d)DNA聚合酶；

(e)限制性内切酶；及

(f)包含可降低双链核酸Tm值的化合物的用于引物延伸反应的缓冲液。

第二方面的试剂盒中所包含的DNA聚合酶可以是包含具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物的DNA聚合酶组分。可降低双链核酸Tm值的化合物的例子，可以是选自甜菜碱、甲酰胺、二甲基亚砜(DMSO)和四甲基铵盐的某种物质。三甲铵基乙内盐可用作一种甜菜碱。

第二方面的试剂盒中所包含的引物可以包含用来回收引物延伸产物的标记。

本发明的第三方面涉及使用引物延伸反应来分析整合了反转录病毒载体的染色体DNA上反转录病毒载体侧翼的来源于染色体DNA的区域的方法中所用的缓冲液，其中包括可降低双链核酸Tm值的化合物。

本发明的第四方面涉及使用可降低双链核酸Tm值的化合物，来制备使用引物延伸反应分析整合了反转录病毒载体的染色体DNA上反转录病毒载体侧翼的来源于染色体DNA的区域的方法中所用的缓冲液。

发明的优选实施方式

1.本发明中分析基因整合位点的方法

(1)合成包含LTR侧翼的染色体DNA的DNA(引物延伸产物)

根据本发明，用于以染色体DNA为模板的引物延伸反应的引物的核苷酸序列互补于反转录病毒载体上LTR的核苷酸序列。对引物长度没有特别限定，只要在用DNA聚合酶进行引物延伸反应时可与LTR部分退火即可。引物可根据LTR的核苷酸序列进行任意设计和制备。引物可含有不与LTR序列互补的核苷酸，只要它可与LTR部分退火即可。虽然长度不进行特别限定，例如，可使用链长度为12-50个核苷酸的引物，优选地为15-40个核苷酸。

对本发明的方法中所用的反转录病毒载体没有特别限定。如果已知反转录病毒载体LTR的序列，则可根据序列制备引物，并应用于本发明的方法。作为根据本发明所用的引物，例如可以是核苷酸序列为SEQ ID NO：2的引物。

引物优选地具有利于回收引物延伸产物的标记。可使用已知有特定受体的配体(例如生物素)、半抗原及其它类似物质标记引物。

虽然根据本发明对作为样品的染色体DNA没有特别限定，但通常是使用已通过反转录病毒载体将基因转移(或可以转移)进去的细胞所制备的染色体DNA。作为制备染色体DNA材料的细胞可以来源于单克隆、寡克隆或多克隆细胞群。对细胞也没有特别限定。可以是从活体收集的细胞或先体外后体内培养的细胞。根据本发明中的方法，对从活体收集的细胞而言，如果诸如造血干细胞这样的造血细胞是转基因的靶标的话，那么该细胞，从该细胞分化的细胞(例如T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞等)或其混合物均可作为制备染色体DNA的材料。

引物与整合具有反转录病毒载体的染色体DNA退火，通过该引物进行引物延伸反应，从而合成含LTR以及LTR侧翼的染色体DNA的DNA链。在该步骤使用DNA聚合酶。

对本发明中所用的DNA聚合酶没有特别限定，只要它可以以互补的DNA链为模板合成DNA链即可。例如，根据本发明，可使用来源于大肠杆菌的DNA聚合酶、来源于芽胞杆菌属的嗜热细菌的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶等)、来源于Thermus属的细菌的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等)、来源于古细菌的DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、DeepVent DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等)或其变异体。

另外，可使用两个或多个酶的混合物。例如，根据本发明，一个特别优选的方法是使用具备3’外切酶活性的DNA聚合酶(例如，PfuDNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等)和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的外切酶缺陷变异体等)的混合物。这种方法在，例如，美国专利No.5436149中有所描述。另外，TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA Taq(均来自Takara生物公司)或其他类似的酶是已商品化的作为DNA聚合酶组分的物质，它们是具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物。

为了获得大量引物的延伸产物，则需要重复进行几次引物延伸反应。在这种情况下，引物延伸产物的合成可通过重复以下三个步骤的PCR而进行：从DNA上解链引物延伸产物作为模板；新的引物与作为模板的DNA退火；及引物延伸反应。

根据传统的LAM PCR方法，获得引物延伸产物的步骤是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的。根据作为模板的染色体DNA的种类和数量，在很多情况下可以通过可富集特定分子的PCR反应而获得大量的引物延伸产物。但可能不能获得种类丰富的引物延伸产物。

本发明人已表明通过在修改的PCR反应条件下，用含可降低双链核酸Tm值的化合物的反应混合物进行引物延伸反应，可获得比传统LAM PCR方法包含更多分子的引物延伸产物。这种化合物的例子包括甜菜碱(例如三甲铵基乙内盐)、有机溶剂(例如甲酰胺、二甲基亚砜)和四甲基铵盐(氯化四甲基铵(TMAC)、醋酸四甲基铵(TMAA)、氢氧化四甲基铵(TMAH))。优选地，可使用具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物作为DNA聚合酶进行PCR。

可根据已知文献或其它类似资料中所确定的条件进行PCR。在上述聚合酶中，可使用高度耐热的聚合酶(例如，来源于Thermus属细菌的DNA聚合酶或来源于古细菌的DNA聚合酶)或其混合物作为DNA聚合酶。可选择适于DNA聚合酶的反应混合物的组分，并向其中可加入上述可降低双链核酸Tm值的化合物。也可联合加入两个或多个这种化合物。对浓度没有特别限定，只要能获得所需的效果即可。例如根据本发明，所用甜菜碱的终浓度为0.1-3M，优选地为0.1-1M，二甲基亚砜的终浓度为0.5-15％，优选地为1-10％，或四甲基铵的终浓度为0.1-100mM，优选地为1-50mM。

而且对PCR反应循环没有特别限定。一个示例的循环由95℃，60秒；58℃，45秒；及72℃，90秒所构成。温度可在±2℃的范围变动，和/或时间可在±30％的范围变动。循环数可根据扩增效率及其它考虑进行确定。例如，可进行20-150个反应循环，优选地为40-100个循环。

在引物延伸反应中所用的合适的引物量为每100ng染色体DNA或50μl反应混合物中0.025-1.0pmol。

(2)将引物延伸产物转变为双链

例如，通过使用添加了标记的引物从反应混合物中回收上述步骤中所合成的引物延伸产物。

如果将作为标记的配体加到引物上，则可使用与配体结合的受体。对使用半抗原进行标记的情况而言，可使用识别该半抗原的抗体。通过使用将与标记物质相结合的物质固定在其上的固相可容易地从反应混合物中回收引物延伸产物。例如，可通过下述方法，将使用标记了生物素的引物所获得引物延伸产物与作为模板的染色体DNA分离。将固定亲和素的珠子添加到延伸反应混合物中，从而可在珠子上捕获延伸产物。洗涤珠子，便可延伸产物从珠子上解离下来。

另外，可在回收引物延伸产物前将未反应的引物除去。例如，可通过用具有合适孔大小的过滤器进行过滤，或仅有长核酸可被选择性沉淀下来的分级沉淀方法来除去引物。

然后将以单链DNA形式回收的引物延伸产物转变成双链DNA。对转变方法没有特别限定。例如，可通过随机引物与引物延伸产物退火，并用DNA聚合酶从随机引物开始合成出与引物延伸产物互补的DNA的方式来获得双链核酸。

(3)加入接头盒

使用限制性酶消化上述步骤(2)中获得的转变为双链的引物延伸产物，然后将双链寡核苷酸添加到消化反应后形成的末端。

虽然对本发明所用的限制性酶没有特别限定，但不适于使用其识别/切割位点位于引物延伸产物所含的LTR部分核苷酸序列中的酶。根据本发明，可产生粘末端的限制性酶是优选的，以利于随后有效地添加双链寡核苷酸。另外，识别四个碱基序列的限制性酶是优选的，以获得合适长度的DNA片段。例如，可使用Tsp509I(Sse9I)、MboI(Sau3AI)或其它类似的酶。在适于所用的限制性酶的条件下进行限制性酶的消化。

将双链寡核苷酸(接头盒)添加到使用限制性酶消化的双链引物延伸产物的末端。该接头盒具有与限制性酶消化产生的末端(优选地是粘末端)相对应的末端，并具有可与随后核酸扩增步骤中的引物退火的序列。只要接头盒满足上述要求，其序列和链长度则没有特别限定。根据本发明，通常使用的接头盒为20-100个碱基对，优选地为30-60个碱基对。对可退火的引物序列也没有特别限定。除了不适于引物设计(偏向性GC含量，可能形成分子内或分子间氢键)的序列外，可以使用任何序列。

可通过已知的连接DNA的方法(连接反应)来添加接头盒。例如，可使用已商品化的试剂盒等。

(4)双链DNA的扩增

这样所获得的双链DNA一端具有来源于LTR的核苷酸序列，另一端具有接头盒的核苷酸序列。可用该DNA为模板，以可与来源于LTR的核苷酸序列退火的引物以及与接头盒的核苷酸序列退火的引物来进行核酸扩增反应，扩增双链DNA。

对本发明的方法中所用的核酸扩增方法无特别限定。已知的核酸扩增方法，例如PCR方法、ICAN方法、SDA方法或TMA方法均可使用。

如果使用PCR方法，则可根据已知方法确定合适的反应条件(反应混合物的组成，循环条件)。根据上述(1)中的方法，优选地，使用含有可降低双链核酸Tm值的化合物，以及具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物的反应混合物。对于循环条件，虽然可使用上述(1)中的条件，但也可以使用更少的循环数。可使用已知的称为巢式PCR方法的两步PCR方法。

可通过步骤(1)到(4)获得包含反转录病毒载体LTR部分核苷酸序列以及载体整合位点侧翼的染色体区域(例如LTR侧翼)核苷酸序列的DNA片段。

选择性地，步骤(1)中用作模板的染色体DNA可预先用合适的限制性酶，例如(3)中所述的酶进行消化，然后用消化的染色体DNA进行引物延伸反应。在这种情况下，得到的延伸产物转变成双链DNA，并可在不用限制性酶消化的情况下在其上添加接头盒。也可使用具有平末端的接头盒实现该目的。

根据本发明中的方法，可通过例如琼脂糖凝胶电泳来分析所获得的扩增DNA片段，从而检测整合位点在细胞群中的变化程度。

另外，可根据已知方法(例如双脱氧方法)测定扩增DNA片段的核苷酸序列。

将扩增的DNA片段从反应混合物中回收，然后连接到合适的载体(质粒载体，噬菌体载体等)上。然后用重组的DNA分子转化合适的宿主。从得到的转化子中制备重组DNA分子。以重组DNA分子为模板进行测序反应，从而测定DNA片段的核苷酸序列。虽然本发明不进行限定，但在其3’末端具有一个突出的T核苷酸的载体(T载体)是优选的用来克隆使用PCR方法进行扩增的DNA片段的载体。

如果扩增的DNA片段的分子种类是有限的，则可通过琼脂糖凝胶电泳或类似技术分离DNA片段，然后用分离的扩增DNA片段为模板进行直接测序。

在这样获得的核苷酸序列信息中，包括作为来源于起始材料的染色体DNA上反转录病毒载体序列侧翼的序列。因此，可通过与已知的染色体DNA的核苷酸序列进行比较，从而获得反转录病毒载体整合在染色体上的位点的信息。

即使以来源于多克隆的染色体DNA为样品，仍然可根据本发明中的方法获得由具有多种序列的DNA片段所组成的文库，其中具有特定序列的DNA片段没有被富集。通过分析这种文库中DNA片段的序列，可以做到，例如，测定反转录病毒载体在染色体上的整合位点、估计整合效率较高的序列或区域的、以及监测活体中特定转基因细胞的分布或比例。

由于本发明中方法的灵敏度与传统LAM PCR方法相比更为优秀，因此即使用具有相对较低的转基因效率的染色体DNA也可获得重复性很好的结果。

2.本发明中分析方法所用的试剂盒

本发明中基因整合位点分析方法所用的试剂盒包含上述1中各步骤所用的试剂。例如，它包括下列成分：

(a)可与反转录病毒LTR部分退火的引物；

(b)接头盒；

(c)可与(b)中接头盒退火的引物；

(d)DNA聚合酶；

(e)限制性酶；和

(f)用于引物延伸并含有可降低双链核酸Tm值的化合物的缓冲液。

在这些成分中，(f)中的缓冲液含有可降低双链核酸Tm值的化合物。这种化合物的实施例如上所述。优选地，其中的组分适于(d)中的DNA聚合酶的应用。本发明的试剂盒在形式上包括，例如，其中引物和DNA聚合酶预先加到缓冲液中，或者dNTPs和/或Mg盐在缓冲液之外单独提供。

如果通过PCR进行引物延伸反应，那么可选择耐热的酶作为(d)中所用的DNA聚合酶。同时含有具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物的这种DNA聚合酶组分可作为DNA聚合酶。

可在(a)中的引物上添加诸如生物素这样的适于回收延伸产物的标记。在这种情况下，优选地，试剂盒进一步含有与标记相对应的用于纯化延伸产物的组分，例如固定亲和素的珠子。

除了上述组分之外，本发明中的试剂盒可以包括诸如将引物延伸产物转变为双链的试剂、限制性酶反应缓冲液或用于接头盒连接反应的试剂这样的组分。

根据本发明，使用该试剂盒可容易地分析反转录病毒的整合位点。

如果对从具有多个不同整合位点的细胞群(多克隆)获得的染色体DNA进行分析，则根据模板DNA的种类和量，可能会从特定克隆中获得偏向性扩增的片段。该现象已成为与使用传统的LAM PCR方法进行反转录病毒整合位点分析相关的一个问题。根据本发明可克服这种现象。因此，根据本发明中的方法，可精确地、高灵敏度和高特异性地监测群体(多克隆，寡克隆或单克隆)中具有通过反转录病毒载体所整合基因的细胞的程度，或特定细胞在细胞群中的比例。

用传统的LAM PCR方法来分析反转录病毒整合位点的方法根据作为模板的基因组DNA的种类和量，可能导致PCR扩增产物偏向性地来源于特定的克隆。因此不能观察到片段数量与整合位点数量的对应关系，这种问题——例如低重复性，会阻碍进行精确的判断。不过，这种问题根据本发明中的方法可以得到解决，从而使进行精确的判断成为可能。

实施例

下述实施例将更详细地阐明本发明，但并不对其范围进行限定。

实施例1

对整合了反转录病毒的293细胞和CD34阳性细胞的分析(多克隆分析)

(1)制备反转录病毒上清

在含10％胎牛血清(JRH)、50μg/ml青霉素(Gibco)和50μg/ml链霉素(Gibco)的Dulbecco′s改进的Eagle培养基(DMEM，Sigma)中，于37℃在存在5％CO₂的条件下培养293细胞(ATCC CRL-1573)或PG13细胞(ATCC CRL-10686)。在所有情况下，以下流程中所用的DMEM均含有50μg/ml青霉素和50μg/ml链霉素。

如下所述制备双嗜性病毒载体。简要的说，将质粒pQBI25(Quantum Biotechnologies Inc.)中编码红位移绿色荧光蛋白(以下称为GFP)的基因(SEQ ID NO：1)插入到质粒pDON-AI(Takara Bio)中，构建pDON-GFP。

用反转录病毒包装试剂盒Ampho(Takara Bio)将质粒pDON-GFP转移到293细胞中，并根据试剂盒的说明书收集培养液上清。通过0.45微米过滤膜(Millipore)过滤培养上清，从而制备amphoGFP病毒上清的储液，并储存在-80℃备用。amphoGFP病毒上清对NIH/3T3细胞的感染滴度是4×10⁶感染性病毒颗粒/ml。

如下所述制备假型反转录病毒载体GALV。简要的说，根据RetroNectin方法(J.Biochem.，130：331-334(2001))用200μl上述制备的amphoGFP病毒上清储液对2×10⁴PG13细胞进行两轮转基因。细胞在含500μg/ml G418和10％胎牛血清的DMEM培养基中选择性地培养两周。所得到的细胞用作假型反转录病毒GALV的生产细胞。将生产细胞在10cm培养皿中生长到半满度。然后将培养基换成7ml含10％FBS的新鲜DMEM。在37℃、5％CO₂下继续培养24小时。通过0.45微米过滤膜(Millipore)过滤上清，从而制备galvGFP病毒上清储液，并储存在-80℃备用。galvGFP病毒上清对HT1080细胞的感染滴度是6×10⁵感染性病毒颗粒/ml。

(2)将反转录病毒载体转移到293细胞和CD34阳性细胞中

将1×10⁷个与2ml实施例1(1)中制备的galvGFP病毒上清混合的293细胞接种到两个RetroNectin包被的10cm的平板(Takara Bio)中，进行病毒感染。在37℃、5％CO₂条件下培养细胞24小时，用胰蛋白酶分散细胞，并分配到6个10cm组织培养平板中，在37℃、5％CO₂条件下继续培养48小时。然后通过胰蛋白酶化收集细胞，将其转移到离心管中，用PBS洗涤两次，并储存在-80℃。该转染细胞组命名为293R1。通过荧光激活细胞分选法(FACS)分析293R1，结果表明转基因效率为59％。

如下所述将基因转移到人CD34阳性造血干细胞中。将用细胞因子刺激24小时，并与1ml amphoGFP病毒上清混合的CD34阳性细胞加到RetroNectin包被的6cm平板(Takara Bio)上，进行第一次病毒感染。进行感染的总细胞数是1.14×10⁶。细胞在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。通过离心除去上清。在另外加入2ml细胞因子培养基(300ng/ml干细胞因子(Genzyme)、100ng/ml血小板刺激因子(PeproTechHouse)、60ng/ml人白介素-3(Genzyme)、300ng/ml人flt-3/flk-2配体(R&D Systems)和4％胎牛血清(BioWhittaker))和1ml amphoGFP病毒上清后，将细胞在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。通过离心除去上清。在另外加入2ml细胞因子培养基和1ml amphoGFP病毒上清后，将细胞在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。培养后，通过胰蛋白酶化收集细胞，并储存在-80℃。将转染细胞组命名为CD+R1。通过FACS分析CD+R1的转基因效率是20.3％。

(3)制备染色体DNA

将储存在-80℃的冻存细胞(293R1或CD+R1，对应的约2.0×10⁶细胞)悬浮在5ml悬浮溶液(10mM tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)，10mMEDTA，150mM氯化钠)中。另外加入1μl RNase A溶液(10mg/ml)，50μl10％SDS溶液和25μl蛋白酶K(20mg/ml，Takara Bio)。将混合物于50℃颠倒混合3小时。然后再加入等体积的酚溶液，并将混合物颠倒混合15分钟。在室温下离心回收上清，然后再加入等体积的酚：氯仿：异戊醇溶液，并将混合物颠倒混合15分钟。加入1/25体积的5M氯化钠，混合后离心回收上清。另外加入2.5体积乙醇。混合物在室温下静置，并回收得到的沉淀。在70％乙醇中洗涤沉淀，并空气干燥10分钟，然后加入TE缓冲液(10mM tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)，1mMEDTA)，并在冷藏室中静置24小时，使其溶解。通过以上流程可从293R1或CD+R1中得到染色体DNA样品。

(4)基因整合位点的分析

将25μl×2PCR缓冲液(100mM tris-盐酸缓冲液(pH 9.2)，28mM硫酸铵，20mM氯化钾，5.0mM氯化镁，0.02％(w/v)BSA，10％(v/v)DMSO，0.5M甜菜碱(三甲铵基乙内盐))、5μl dNTP mix(每种浓度为2.5mM)、0.1pmol 5’端有生物素标记的LTR I引物(LTR I的序列与反转录病毒载体的LTR互补；序列号为SEQ ID NO：2)、0.25μlEx Taq(5U/μl，Takara Bio)以及无菌水，加到从实施例1-(3)的293R1或CD34+R1中制备的100ng基因组DNA中，至终体积为50μl。将混合物置于自动基因扩增仪器——热循环仪(Takara Bio)中，并进行以下PCR反应：95℃变性5分钟；然后进行50个循环：95℃，60秒(变性)，58℃，45秒(引物退火)，72℃，90秒(合成反应)；最后在72℃温育10分钟。

反应后，通过以下方法将未反应的引物除去：将300μl TE溶液加到50μl PCR反应混合液中。向混合物加入Suprec02(Takara Bio)，并在5000rpm离心约7分钟。然后再加入350μl TE溶液，并在相似方式下离心以洗涤滤膜。然后向滤膜上加入体积为40μl的TE溶液，从而回收DNA溶液，其中引物已除去。

向溶液中加入固定链亲和素(MPG链亲和素，Takara Bio)的磁珠(40μl，相当于200μg)。混合物在室温下静置1小时，并不时混合。将含反应混合物的管子置于磁座(Magnetight Separation Stand，Takara Bio)上1分钟。然后丢弃上清，回收磁珠。将磁珠与100μl BW缓冲液(5mM tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)，0.5mM EDTA，1.0M氯化钠)轻轻混合。吸附到磁珠上后，以相似方式将上清丢弃。用100μl无菌水进行类似操作，以回收磁珠(该操作称为磁珠清洗流程)。

将洗涤的磁珠轻轻悬浮在14.1μl无菌水中。并向磁珠中加入2μl×10Klenow缓冲液(对应下面的Klenow片段)，2.4μl dNTP混合物(每种浓度为2.5mM)，1μl随机引物(随机6寡核苷酸，100pmol/μl，Takara Bio)及0.5μl Klenow片段(Takara Bio)，从而得到20μl混合液。将混合液在37℃反应1小时，并不时混合，以合成互补链。反应后，洗涤磁珠。将回收的磁珠悬浮在17.5μl无菌水中。另外加入2μl×10 NE缓冲液1(对应下面的Tsp509I)，及0.5μl限制酶Tsp509(10U/μl，New England Biolabs)。将混合物在65℃下温育1小时，并不时混合。在进行磁珠清洗流程后，向磁珠中加入2μl接头盒A(50pmol/μl)(组成接头盒A的两个寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNOS：3和4所示)，16μl溶液A(Takara Ligation kit ver.1，TakaraBio)和2μl溶液B(Takara Ligation kit ver.1，Takara Bio)。将混合物在16℃下反应1小时，并不时混合。

用无菌水清洗磁珠1次后，回收磁珠，并悬浮在5μl 0.1N氢氧化钠中，室温下静置10分钟。在磁座上收集上清(约5μl)，将1μl上清进行如下PCR反应。向1μl该溶液中加入25μl×2PCR缓冲液，5μldNTP混合物(每种浓度为2.5mM)，1μl与LTR互补的引物LTR II(序列号为SEQ ID NO：5，25pmol/μl)及序列与接头盒互补的引物LC1(序列号为SEQ ID NO：6，25pmol/μl)，0.25μl Ex Taq及无菌水，至终浓度为50μl。将反应混合物放在自动基因扩增仪器——热循环仪上，并进行如下PCR反应：95℃变性5分钟；然后进行30个循环：95℃，60秒(变性)，58℃，45秒(引物退火)，72℃，90秒(合成反应)；72℃温育10分钟(第一轮循环)。然后以1μl第一轮PCR的反应混合物为模板，用引物LTR III(SEQ ID NO：7，25pmol/μl)和引物LC2(SEQ ID NO：8，25pmol/μl)进行第二轮OCR反应。引物LTRIII的序列与LTRII退火序列的下游部分互补，而LC2与LC1退火序列下游的接头盒部分互补。第二轮PCR的反应条件与第一轮PCR相同。

将5μl反应混合物(50μl)在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳，从而确定获得的反应混合物中的扩增产物。结果表明以来源于293R1或CD+R1的染色体DNA为模板所得到的多种约500bp或更小的扩增片段形成一个较宽的条带。这些结果表明作为模板的染色体DNA可从由已在染色体上的多个位置整合了反转录病毒载体的细胞所组成的多克隆群制备。而且，已表明根据上述方法可使扩增不偏向来源于特定颗粒的片段。

将以来源于CD34+R1基因组DNA为模板扩增的片段从3.0％低熔点琼脂糖凝胶中回收，并连接到pT7BlueT载体(Takara Bio)上。用连接产物转化大肠杆菌JM109。从生长在含X-gal和IPTG(均来自Takara Bio)的固体培养板上白色克隆中筛选出68个连接了插入片段的载体的候选克隆株。用引物LTR III和LC2及Ex Taq(Takara Bio)通过PCR测定克隆中插入片段的大小。根据Ex Taq所附说明书制备反应混合物。如下进行PCR：95℃变性5分钟；进行30个循环：95℃60秒，58℃，45秒，及72℃90秒。扩增后，对部分反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳。然后检测各种长度的扩增片段。因此，根据本发明中的方法可扩增来源于各个克隆的整合位点区。

另外筛选出384白色克隆，并根据如下方法制备测序用的模板DNAs。将每个克隆接种到40μl含氨苄青霉素的LB肉汤(每100ml含1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g氯化钠)中，于37℃培养18小时。向培养物中加入20μl 60％甘油溶液，从而制备甘油储液(终浓度为20％)。从0.5μl甘油储液中用TempliPhi DNA测序模板扩增试剂盒(Amersham Biosciences)根据试剂盒所附说明书制备用于测序的样品。然后用测序仪MegaBACE 4000(Amersham Biosciences)对反应混合物进行核苷酸序列分析。结果获得115个代表不同整合位点的来源于人的序列。这些结果也表明根据本发明中的方法可获得来源于多种克隆的扩增片段。

实施例2

以多克隆来源的染色体DNA和单克隆来源的染色体DNA混合物为样品进行分析

(1)分离已转入反转录病毒的293细胞克隆

将实施例1(1)中制备的100μl稀释了10²倍的amphoGFP病毒上清储液，添加到1ml含浓度为8μg/ml的Polybrene的DMEM培养基中的293细胞(5×10⁴细胞)中，用来进行感染。2小时后更换培养基，然后细胞在37℃、5％CO₂条件培养24小时。第二天，将细胞以每孔1个细胞的浓度重新接种到含浓度为500μg/ml G418的培养基的96孔板的孔中，在37℃、5％CO₂条件下培养。然后分离出两个抗G418的细胞(克隆)，并扩大培养，从而每个克隆得到2×10⁶个细胞。将这两个克隆命名为克隆1和克隆2，并根据实施例1(3)中所述方法从每个克隆中分别制备染色体DNA。

(2)以来源于单克隆的染色体DNA为模板进行扩增

以实施例2(1)中制备的0、0.1、1、10、50或100ng克隆1或克隆2的染色体DNA为模板，根据实施例1(4)中所述的方法检测反转录病毒载体整合到克隆中基因组上的位点。将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳。用溴化乙啶对凝胶进行染色以观察扩增产物。结果表明，用1ng染色体DNA可观察到来自克隆1的扩增片段，而用10ng染色体DNA可观察到来自克隆2的扩增片段。因此表明可高灵敏度地检测来源于特定克隆的扩增片段。

(3)对混和含有来源于克隆的染色体DNA及来源于多克隆的染色体DNA的样品进行分析

将从293R1(实施例1中所用)制备的染色体DNA与克隆1或克隆2的染色体DNA(实施例2(1)制备)以浓度0、0.1、1、10、50或100％(w/w)混和，从而制备含有总量为100ng染色体DNA的样品。以该样品为模板，根据实施例1(4)中所述的方法检测混有来源于293R1的染色体DNA的来源于克隆的DNA。将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。结果表明，即使293R1来源的染色体DNA的浓度低至10％，仍能观察到来自克隆1的扩增片段，即使293R1来源的染色体DNA的含量低至50％，仍能观察到来自克隆2的扩增片段。用含来源于293R1的染色体DNA的样品仍可观察到与实施例1中那样形成较宽条带的扩增片段。

除了上述结果，还用与给定量(100ng)来源于293R1的染色体DNA与添加了0、0.1、1、10、50或100ng来源于克隆1或克隆2的染色体DNA的混和物为模板，检测从来源于克隆的DNA中扩增的片段。根据实施例1(4)中所述方法进行检测。结果表明，对每个反应样品均观察到形成较宽条带的扩增片段。使用少至10ng来源于克隆1的染色体DNA和50ng来源于克隆2的染色体DNA分别检测到了扩增片段。因此表明可高灵敏度地检测与多克隆样品混和的来源于特定克隆的扩增片段。

实施例3

以来源于多克隆的染色体DNA和来源于单克隆的染色体的混合物作为样品进行分析(2)

(1)以来源于两个克隆的染色体DNA的混合物为模板进行扩增

根据实施例1(4)中所述方法，以实施例2(1)中所制备的等量的(每个为0、1、10、50或100ng)来自克隆1和克隆的染色体DNA混合物为模板，检测两个基因组中来源于整合位点的片段。将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。结果表明，使用1ng每种染色体DNA的混合物可观察到来自克隆1的扩增片段，而用10ng每种染色体DNA的混合物可观察到来自克隆2的扩增片段。因此表明，可高灵敏度地检测来源于两个克隆的扩增片段。

(2)以与来源于多克隆的染色体DNA相混和的来源于两个克隆的染色体DNA的混合物为模板进行扩增

将从293R1(实施例1中所用)制备的染色体DNA与等量来自克隆1和克隆2(实施例2(1)中制备)的染色体DNA混合物以浓度0、0.1、1、10、50或100％(w/w)混和，制备每个均含总量为100ng染色体DNA的样品。以该样品为模板，根据实施例1(4)中所述方法检测与来源于293R1的染色体DNA相混和的来源于克隆的DNA。

将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。结果表明，含浓度为10％的染色体DNA混合物的样品可观察到来自克隆1的扩增片段，而含浓度为50％的染色体DNA混合物的样品可观察到来自克隆2的扩增片段。用含来源于293R1的染色体DNA的样品可观察到实施例1中那样的形成了较宽条带的扩增片段。

除了以上结果，还用与给定量(100ng)来源于293R1的染色体DNA相混和的、等量(每种0、0.1、1、10、50或100ng)来源于克隆1和克隆2的染色体DNA的混合物为模板，从克隆中检测扩增的片段。根据实施例1(4)中所述方法进行检测。结果表明，每个反应样品的扩增片段在琼脂糖凝胶上电泳后均形成较宽的条带。使用用含有10ng每种染色体DNA的混合物的样品可检测到来自克隆1的扩增片段，而使用含有50ng每种染色体DNA的混合物的样品可检测到来自克隆2的扩增片段。因此表明可高灵敏度地检测与多克隆样品混和的来源于两个克隆的扩增片段。

(3)以各种比例的来源于两个克隆的染色体DNA的混合物为模板的应用

将来源于克隆1和克隆2的染色体DNA(实施例2(1)中制备)以质量比(克隆1∶克隆2，w∶w)1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4或0∶1混和，制备总量为100ng染色体DNA的样品。另外，除了上述混合物之外，还制备了含有100ng来源于293R1的染色体DNA(实施例1所用)的样品。以该样品为模板，根据实施例1(4)中所述方法检测以多种比例混和的克隆1和克隆2的扩增片段。

将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。结果表明，对克隆1和克隆2的混合物而言，在与原混合物几乎相同的比例下可观察到来自克隆的扩增片段。对加入来源于293R1的染色体DNA的样品而言，观察到来源于克隆1和克隆2的DNA片段在扩增片段中形成较宽的条带。在这种情况下也观察到来源于克隆1和克隆2的扩增片段的量的变化。因此表明根据比例可高灵敏度地检测与多克隆样品相混和的两个克隆。

实施例4

以来源于4个克隆的染色体DNA混合物为样品进行分析

(1)分离已转入反转录病毒的HL60细胞克隆

将质粒pDON-GFP转移到包装细胞GP+E-86中，根据实施例1(1)中所述的方法从所获得的病毒生产细胞中制备amphoGFP病毒上清储液。

将100μl稀释了10²倍的amphoGFP病毒上清储液加到1ml含浓度为8μg/ml的Polybrene的DMEM培养基中的HL60细胞(BioWhittaker，5×10⁴细胞)中，进行感染。2小时后更换培养基，然后细胞在37℃、5％CO₂的条件下培养24小时。细胞用胰蛋白酶进行分散，然后分到6个10cm组织培养板中，进一步在37℃、5％CO₂的条件下培养48小时。第二天，将细胞以每孔1个细胞的浓度重新接种到含浓度为500μg/ml G418的培养基的96孔板的孔中，在37℃、5％CO₂条件下培养。将细胞(克隆)重新接种到24孔板的孔中，培养4天，重新接种到6孔板的孔中，培养4天。然后分离出4个抗G418的细胞(克隆)，并扩大培养，从而每个克隆得到1×107细胞。将这4个克隆命名为克隆a、克隆b、克隆c、和克隆d，并根据实施例1(3)中所述方法从每个克隆中制备染色体DNA。

(2)以来源于4个克隆的染色体DNA混合物为模板进行反应

制备含有从克隆a-d中所制备的100ng某种染色体DNA或者4种染色体DNA等量(每种为0、0.1、1、10、25、50或100ng)混合的样品。以该样品为模板，根据实施例1(4)中所述方法检测各个克隆的扩增片段或者来源于4个染色体的条带混合物。

将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。结果表明，使用仅含其中一种染色体DNA的样品可观察到来自克隆a、b、c或d的扩增片段。另外，使用4种染色体DNA的混合物可检测到4个扩增片段。对于灵敏度，可用约含1ng每种染色体DNA的混合物进行检测。因此表明可高灵敏度地检测来源于4个克隆(寡克隆)的扩增片段。

实施例5

提高检测灵敏度

通过将293R1染色体DNA(实施例1(3)中制备)与克隆2的染色体DNA(实施例2(1)中制备)以浓度0、0.1、1、10、50或100％(w/w)混合而制备含总量为100ng染色体DNA的样品。然后向其中加入0.5μl×10NE缓冲液，0.5μl限制性酶Tsp509I(10U/μl)及无菌水至体积为5μl。将混合物在65℃温育1小时。然后向反应混合物中加入25μl×2PCR缓冲液，5μl dNTP混合液(每种浓度为2.5mM)，1μl 5’端添加了生物素的引物LTR I(0.1pmol/μl)，0.25μl Ex Taq及无菌水至体积为50μl。将反应混合物置于自动基因扩增仪器——热循环仪上，并进行以下PCR反应：95℃变性5分钟；然后进行50个循环：95℃，60秒，58℃，45秒，72℃，90秒。然后，如实施例1(4)所述除去未反应的引物，从而获得40μl DNA溶液。

向溶液中加入链亲和素包被的磁珠(40μl，MPG链亲和素)。混合物在室温下静置1小时，并不时混合。将含反应混合物的管子置于磁力架上1分钟。然后除去上清，收集磁珠，并洗涤磁珠。将洗涤的磁珠轻轻悬浮在14.1μl无菌水中。向磁珠中加入2μl×10Klenow缓冲液，2.4μl dNTP混合液(每种浓度为2.5mM)，1μl随机引物(6mer，100pmol/μl)及0.5μl Klenow片段，从而制备了20μl混合液。混合液于37℃反应1小时。

反应后，洗涤磁珠，并向磁珠中加入2μl接头盒B(50pmol/μl)(组成接头盒B的两个寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NOS：9和10所示)、16μl溶液A(Takara Ligation kit ver.1)及2μl溶液B(TakaraLigation kit ver.1)。将混合物在16℃反应1小时，并不时混合。用无菌水洗涤磁珠一次后，回收磁珠，悬浮在5μl 0.1N氢氧化钠中，并在室温下静置10分钟。在磁力架上收集上清(约5μl)，用1μl上清进行实施例1(4)所述的PCR反应。使用5μl第二轮PCR(50μl)的反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳，从而验证扩增片段。

作为对照，用同样模板进行实施例1(4)中所述流程。结果表明，根据实施例1(4)至中所述方法，用含浓度低至50％的来源于克隆2的染色体DNA的样品可观察到来自克隆2的扩增条带。另外，根据本方法，用含浓度低至10％的样品可观察到条带。因此可增加来源于混合克隆的扩增产物的检测灵敏度。

实施例6

与传统LAM PCR方法比较(1)

(1)制备具有转移的pDON-GFP的HL60细胞群

通过将实施例4(1)中制备的质粒pDON-GFP转移到包装细胞GP+E-86中，构建AmphoGFP病毒生产细胞，然后从其中收集病毒颗粒。

将100μl实施例4(1)中制备的稀释了10²倍的amphoGFP病毒上清储液加到1ml含浓度为8μg/mlPolybrene的DMEM培养基中的HL60细胞(5×10⁴细胞)中，进行感染。2小时后更换培养基，然后细胞在37℃、5％CO₂的条件下培养24小时。细胞用胰蛋白酶进行分散，然后分到6个10cm组织培养板中，进一步在37℃、5％CO₂的条件下培养48小时。

然后用胰蛋白酶处理细胞，在离心管中收集，用PBS洗涤2次，并储存在-80℃。转移的细胞组命名为HL60R1。通过FACS分析HL60R1表明转移效率约为20％。根据实施例1(3)中所述方法从HL60R1(约2.0×10⁶细胞)制备染色体DNA。

(2)扩增基因整合区域的DNA

根据Blood，100：2737-2743(2002)中所述方法所进行传统的LAMPCR方法如下。向由实施例6(1)中HL60R1所制备的1、10或100ng的基因组DNA中加入10μl×10PCR缓冲液(Qiagen)，8μl dNTP混合液(每种浓度为2.5mM)，0.25pmol 5’端添加了生物素的引物LTRI，0.5μl Taq聚合酶(5U/μl，Qiagen)及无菌水至体积为100μl。将反应混合物置于自动基因扩增仪器——热循环仪(Takara Bio)上，并进行以下PCR反应：95℃变性5分钟；然后进行100个循环：95℃，60秒，60℃，45秒，72℃60秒；最后在72℃温育10分钟。在前50个循环结束后加入等量的Taq聚合酶，然后进行后50个循环(共100个循环)。

向反应混合物中加入具有固定的链亲和素(MPG链亲和素)的磁珠(100μl，相当于200μg)。混合物在室温下静置1小时，并不时混合。将含反应混合物的管子置于磁力架上1分钟。然后除去上清，收集磁珠。将洗涤的磁珠与100μl BW缓冲液(5mM tris-盐酸缓冲液(pH7.5)，0.5mM EDTA，1.0M氯化钠)轻轻混合。在磁力架上静置后，以相似方式除去上清。用100μl无菌水进行类似流程以收集磁珠(该流程称为磁珠清洗流程)。

将洗涤的磁珠轻轻悬浮在14.1μl无菌水中。向磁珠中加入2μl×10Klenow缓冲液，2.4μl dNTP混合液(每种浓度为2.5mM)，1μl随机引物(6mer，100pmol/μl，Takara Bio)及0.5μl Klenow片段(TakaraBio)，从而制备了20μl混合液。混合液于37℃反应1小时。并不时混合，从而合成互补链。

反应后，洗涤磁珠。将收集的磁珠悬浮在17.5μl无菌水中。向其中加入2μl×10NE缓冲液和0.5μl限制性酶Tsp509I(10U/μl)。将混合物置于65℃温育1小时，并不时混合。在磁珠清洗流程之后，向磁珠中加入2μl接头盒A(50pmol/μl)、16μl溶液A(Takara Ligationkit ver.1)和2μl溶液B(Takara Ligation kit ver.1)。混合液置于16℃反应1小时，并不时混合。

反应后，用无菌水洗涤磁珠1次，然后收集磁珠，悬浮在5μl 0.1N氢氧化钠中，并在室温下静置10分钟。在磁力架上收集上清(约5μl)，并用1μl上清进行如下PCR反应。向1μl溶液中加入10μl×10Taq缓冲液，8μl dNTP混合液(每种浓度为2.5mM)，引物LTR II(25pmol/μl)和引物LC1(25pmol/μl)每个1μl，0.5μl Taq聚合酶(Qiagen)及无菌水至体积为100μl。将反应混合物置于自动基因扩增仪器——热循环仪上，并进行以下PCR反应：95℃变性5分钟；然后进行35个循环：95℃，60秒，60℃，45秒，72℃，60秒；最后在72℃温育10分钟(第一轮循环)。然后，用0.2μl第一轮PCR的反应混合物为模板，使用引物LTR III(25pmol/μl)和引物LC2(25pmol/μl)进行第二轮PCR。第二轮PCR所用的条件与第一轮PCR中的条件相同。

也可根据实施例1(4)中所述方法，用1、10或100ng HL60R1染色体DNA为样品，扩增反转录病毒载体整合位点侧翼的DNA片段。

用5μl反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳而确定扩增产物。结果表明，根据实施例1(4)中所述方法，在使用100或10ng染色体DNA的情况下可观察到约500bp或更小的形成了较宽条带的扩增片段。另外，根据Blood中所述的传统LAM PCR方法可观察到使用10ng染色体DNA可偏向性地观察到来自特定克隆的扩增条带。基于这些结果可表明，与传统LAM PCR方法相比较，即使模板量很少，或具有转基因的染色体的比例很低，根据本发明中如实施例1(4)所述的方法不会有偏向性的对特定克隆进行扩增，而是来源于各种转基因细胞的DNA片段均可扩增。

额外重复了同样的流程。结果表明，与前面实验中观察的一样，根据实施例1(4)中所述方法，在使用100或10ng染色体DNA的情况下，可观察到约500bp或更小的形成较宽条带的扩增片段。另一方面，根据Blood中所述的传统LAM PCR方法可观察到不仅是使用10ng，而且使用100ng染色体DNA仍可偏向性地观察到来源于特定克隆的扩增条带。这些结果表明，与传统LAM PCR方法相比较，本发明中的方法可重复性地分析反转录病毒的整合位点。

实施例7

与传统LAM PCR方法比较(2)

根据实施例6(2)中所述流程中使用的传统LAM PCR方法，以以下4种类型的模板对反转录病毒整合位点的DNA片段进行扩增：(A)0、0.1、1、10、50或100ng实施例2(1)中制备的来源于克隆1的染色体DNA；(B)与0、0.1、1、10、50或100ng来源于克隆1的DNA相混合的100ng从293R1(实施例1所用，多克隆DNA)中所制备的染色体DNA；(C)将从293R1(实施例1所用)所制备的染色体DNA与0、0.1、1、10、50或100ng来自克隆1的染色体DNA混合，从而制备的含总量为100ng染色体DNA的样品；及(D)将从无转基因的293细胞中所制备的染色体DNA与0、0.1、1、10、50或100ng来自克隆1的染色体DNA相混合，从而制备的含总量为100ng染色体DNA的样品。另外，以同样的模板根据实施例1(4)中所述的本发明的方法进行DNA扩增，以对两种方法进行比较。

将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。可观察到扩增片段的反应混合物中，所用的来自克隆1的DNA的量如表1所示。

表1

	传统方法	本发明
			(A)(B)(C)(D)	≥10ng≥50ng≥50ng≥10ng	≥1ng≥10ng≥10ng≥1ng

结果表明，本发明的方法在对各种情况中(具有转基因的多克隆DNA或与无转基因的染色体DNA共存在反应混合物中的情况下)主要存在的克隆进行检测的灵敏度，比传统方法高5到10倍。

实施例8

同以来源于5个克隆的染色体DNA的混合物为模板的传统LAMPCR方法进行比较

从实施例4(1)中制备的转基因细胞中选择5个克隆。根据本发明中的方法扩增含反转录病毒整合位点的DNA片段，可从这些克隆中生产不同长度的扩增片段。来源于5个克隆的染色体DNA的混合物被用作模板，如下所述。

以等量(1、25或100ng)来源于5个克隆的染色体DNA的混合物或进一步以含有100ng来自HL60R1的染色体DNA(实施例6-(1)中制备，多克隆DNA)的混合物为模板，比较实施例6(2)中所述传统LAM PCR方法和实施例1(4)中所述本发明中的方法。

将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。当仅以来源于5个克隆的染色体DNA混合物为模板时，使用100或25ng模板，依据传统方法和本发明的方法均观察到来源于所有5个克隆的扩增片段。当使用1ng模板时，根据本发明的方法可观察到来自4个克隆的扩增片段，而根据传统LAM PCR方法根本观察不到DNA扩增。

在模板中共存多克隆DNA的情况下，根据本发明中的方法用25ng模板可观察到来自5个克隆的扩增片段。另一方面，根据传统LAM PCR方法用25ng模板仅观察到来自1个克隆(没有来自其余4个克隆)的扩增片段。

根据这些结果表明，如果要检测多克隆中主要存在多个克隆，则本发明的方法比传统方法可获得更灵敏的检测(例如，反映现有克隆状态的扩增更精确)。

实施例9

使用来源于骨髓再生小鼠外周血克隆的染色体DNA为样品，与传统LAM PCR方法进行比较

(1)反转录病毒的制备

根据如下方法制备亲嗜性反转录病毒载体。将包含在RetrovirusPackaging Kit Eco(Takara Bio)中的pGP和pE-eco及实施例1(1)中所制备的质粒pDON-GFP根据试剂盒的说明书转入293细胞中，培养细胞，并收集培养上清。将培养上清通过0.45微米的滤膜(Millipore)过滤，从而制备ecoGFP病毒上清储液，并储存在-80℃备用。ecoGFP病毒上清对NIH/3T3细胞的感染滴度是1.6×10⁶感染病毒颗粒/ml。

(2)小鼠骨髓细胞的制备

将150mg/kg的5-氟尿嘧啶(5-FU，Sigma)腹膜内给药7周龄的C3H/He小鼠(雌性，Japan SLC)。7天后从分离的股骨和胫骨收集骨髓。将通过离心所获得的覆盖有淋巴细胞M(Daiichi PureChemicals)的骨髓细胞液而分级制备的单核细胞用作小鼠骨髓细胞。

将小鼠骨髓细胞以1.45×10⁶细胞/ml的细胞密度添加到含50ng/ml血小板生成素、100ng/ml flt-3/flk-2配体、100ng/ml干细胞因子、5μM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素及50μg/ml链霉素的StemPro-34SFM培养基(Gibco)中，于37℃、5％CO₂的条件下温育48小时进行预刺激。通过移液管的吸取来收集那些包括附着在容器上的预刺激的细胞。

(3)制备转化的骨髓细胞

将实施例9(1)中制备的ecoGFP病毒上清添加到RetroNectin包被(Takara Bio)的平板(Takara Bio)中，平板在32℃温育。4小时后，通过吸取除去上清，然后向其中加入小鼠骨髓细胞(细胞数，培养基)，并在37℃、5％CO₂的条件下温育22小时。温育后，通过吸取收集细胞，并用生理盐水洗涤1次，然后悬浮在生理盐水(OtsukaPharmaceutical)中，用作转基因的骨髓细胞。

(4)将转化细胞移植到小鼠中

将转基因骨髓细胞(0.2ml/鼠，相当于5×10⁴cells)通过尾静脉给药使用致死剂量的X射线进行处理的8周龄C3H/He小鼠(雌性)。在细胞移植21周后从2只鼠中收集外周血。用QIAamp DNA BloodMini试剂盒(Qiagen)根据试剂盒所附流程制备染色体DNA，并命名为样品I和样品II。

(5)基因整合位点的分析

以100ng样品I或样品II为模板，比较实施例6(2)中所述的传统LAM PCR方法和实施例1(4)所述的本发明的方法。通过两个实验人员对两个样品分别进行独立操作。

将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。结果表明，使用样品I，根据传统LAM PCR方法，两个实验人员中有一个观察到单一主要产物的扩增片段，而另一个没有观察到扩增片段。使用样品II两个实验人员均没有得到明显的扩增片段。另一方面，在本发明的方法中使用2个样品均清晰地观察到作为主要产物的扩增片段。也观察到次要产物。未观察到由于实验人员而造成的扩增片段图谱的差异。

以上结果表明，根据本发明使用来源于动物的样品可高灵敏度地(例如，与所存在克隆的状态相一致)进行扩增。另外，实验人员间的差异并没有破坏本发明方法的重复性。

(6)作为次要产物的扩增片段的分析

已确定根据实施例9(5)中本发明的方法进行扩增的作为次要产物的扩增片段，来源于通过反转录病毒而具有转基因的细胞，如下所述。从凝胶中回收根据本发明的方法使用样品I进行扩增的约300-bp的次要条带，并根据实施例1中所述的流程连接到pT7BlueT载体上。从使用重组质粒进行转化的大肠杆菌细胞中筛选出10个克隆，分析克隆中的质粒上的插入片段的核苷酸序列。结果进一步证实了所有的序列均来源于小鼠染色体DNA。

以上结果表明，根据本发明中的方法从再生小鼠血细胞中所扩增的次要产物是来源于转基因细胞克隆中的扩增片段。由于用传统方法并未观察到次要产物，因此表明使用本发明中的方法检测转基因细胞克隆比传统方法具有更高的灵敏度。

实施例10

用含二甲基亚砜或四甲基铵(TMAC)的混合物进行的扩增

对反应缓冲液中所添加化合物的效应进行检测。

通过将34、17或8.5ng从293R1所制备的染色体DNA(基于实施例1中所制备的293R1的转基因效率为59％，这里相当于20，10或5ng转基因DNA)与从293细胞所制备的无转基因的染色体DNA相混合，从而制备用作模板的含总量为100ng染色体DNA混合物的样品。根据实施例1(4)中所述方法进行DNA扩增。除了实施例1(4)中所述的反应混合物外，也制备含终浓度为6％二甲基亚砜(DMSO)、含终浓度为6％二甲基亚砜(DMSO)与终浓度为10mM TMAC、或含代替DMSO和甜菜碱的终浓度为10mM TMAC的反应混合物，用于反应。

将部分最终反应混合物在3.0％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳以观察扩增产物。结果表明，使用含6％DMSO的反应混合物可观察到与使用根据实施例1(4)中所述的缓冲液所获得的条带一样的约500bp或更小的形成较宽条带的扩增片段。与实施例1(4)中所述的反应混合物相比较，可观察到无论是否存在DMSO，使用含10mM TMAC的反应混合物可提高扩增效率。即使转基因DNA的量很小也可以观察到形成较宽条带的扩增片段。使用缓冲液中含有10mM TMAC而不含有DMSO的反应混合物时，观察到最好的结果。

另外，上述仅含10mM TMAC的反应混合液在使用引物LTR II和LC1的PCR步骤中，或使用引物LTR III和LC2的PCR步骤中，用含相同浓度四甲基铵醋酸盐代替TMAC的反应混合液进行扩增。在这种情况下，观察到扩增反应与使用TMAC所观察的几乎相同。

工业应用

根据本发明，可通过具有多种整合位点的生物样品精确地、灵敏地、重复性地监测具有整合基因的细胞在细胞群(多克隆，寡克隆或单克隆)中的范围，或特定细胞在群体中的比例。传统方法对通过反转录病毒载体而具有转基因的细胞(单克隆，寡克隆或多克隆)中整合位点的进行分析，其效果由于局限性而受到限制。本发明可应用于这种分析，而且，譬如，由于可在基因治疗领域进行高度精确的监测，所有本发明非常具有应用性。

纯文本形式的序列列表

SEQ ID NO：1；编码红位移绿色荧光蛋白的基因。

SEQ ID NO：2；扩增具有LTR序列的DNA片段的PCR引物LTRI。

SEQ ID NO：3；构成接头盒A的寡核苷酸。

SEQ ID NO：4；构成接头盒A的寡核苷酸。

SEQ ID NO：5；扩增具有LTR序列的DNA片段的PCR引物LTRII。

SEQ ID NO：6；扩增具有接头盒A的DNA片段的PCR引物LC1。

SEQ ID NO：7；扩增具有LTR序列的DNA片段的PCR引物LTRIII。

SEQ ID NO：8；扩增具有接头盒A的DNA片段的PCR引物LC2。

SEQ ID NO：9；构成接头盒B的寡核苷酸。

SEQ ID NO：10；构成接头盒B的寡核苷酸。

                         序列表

                      序列表

<110>TAKARA BIO INC.

<120>分析基因导入位点的方法

<130>664514

<150>JP 2003-129558

<151>2003-05-07

<150>JP 2003-192719

<151>2003-07-07

<160>10

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>720

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：编码红位移绿色荧光蛋白的基因

<400>1

atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat  60

ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120

ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180

ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240

cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300

ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360

gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac 420

aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480

ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540

gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600

tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660

cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增具有LTR序列的DNA片段的PCR引物LTR I

<400>2

agctgttcca tctgttcttg gccct                                          25

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：构成接头盒A的寡核苷酸

<400>3

gacccgggag atctgaattc agtggcacag cagttagg                             38

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：构成接头盒A的寡核苷酸

<400>4

aattcctaac tgctgtgcca ctgaattcag atctcccggg tc                        42

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增具有LTR序列的DNA片段的PCR引物LTR II

<400>5

gaccttgatc tgaacttctc                                                 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增具有接头盒A的DNA片段的PCR引物LC1

<400>6

gacccgggag atctgaattc                                                  20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增具有LTR序列的DNA片段的PCR引物LTR III.

<400>7

tccatgcctt gcaaaatggc                                                  20

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增具有接头盒A的DNA片段的PCR引物LC2.

<400>8

gatctgaatt cagtggcaca g                                                21

<210>9

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：构成接头盒B的寡核苷酸.

<400>9

gacccgggag atctgaattc agtggcacag cagttagg                             38

<210>10

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：构成接头盒B的寡核苷酸.

<400>10

cctaactgct gtgccactga attcagatct cccgggtc                             38

Claims (25)

1.一种分析整合了反转录病毒载体的染色体DNA上，反转录病毒载体侧翼的、来源于染色体的DNA的区域的方法，该方法包括：

(1)以与反转录病毒载体上LTR核苷酸序列互补的序列为引物，以整合了反转录病毒载体的染色体DNA为模板进行引物延伸反应，从而得到引物延伸产物；

(2)回收步骤(1)获得的引物延伸产物，并合成与引物延伸产物互补的DNA，从而得到双链DNA；

(3)在步骤(2)获得的双链DNA末端加上双链寡核苷酸；及

(4)以步骤(3)获得的添加了寡核苷酸的双链DNA为模板，以与反转录病毒载体上LTR的核苷酸序列互补的序列为一个引物，与所述双链寡核苷酸核苷酸序列互补的序列为另一个引物进行核酸扩增反应，从而获得扩增产物，

其中步骤(1)的引物延伸反应和步骤(4)的核酸扩增反应在可降低双链核酸Tm值的化合物存在下进行。

2.权利要求1的方法，其中步骤(1)的引物延伸反应可通过聚合酶链式反应进行。

3.权利要求1的方法，其中步骤(4)的核酸扩增反应可通过聚合酶链式反应进行。

4.权利要求2或3的方法，在聚合酶链式反应中可使用含有具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物的DNA聚合酶。

5.权利要求2或3的方法，其中步骤(1)或(4)所用的聚合酶链式反应的温度循环由95℃，60秒；58℃，45秒；及72℃，90秒所构成。

6.权利要求1的方法，其中可降低双链核酸Tm值的化合物是选自甜菜碱、甲酰胺、二甲基亚砜和四甲基铵盐的物质。

7.权利要求6的方法，其中可降低双链核酸Tm值的化合物是三甲铵基乙内盐。

8.权利要求1的方法，其中在步骤(4)中可使用两步聚合酶链式反应。

9.权利要求1的方法，其中在步骤(3)中，将步骤(2)获得的双链DNA用限制性酶消化，并将双链寡核苷酸连接到所生成的双链DNA的末端。

10.权利要求1的方法，其中预先用限制性酶对步骤(1)中的染色体DNA进行消化。

11.权利要求1的方法，其中在步骤(1)中所用的引物具有标记，从而在步骤(2)中用该标记回收引物延伸产物。

12.权利要求11的方法，其中使用的是生物素标记的引物。

13.权利要求1的方法，进一步包括测定步骤(4)所获得的扩增产物的核苷酸序列的步骤。

14.权利要求13的方法，其中以将步骤(4)中获得的产物整合到载体上所获得的重组DNA为模板测定核苷酸序列。

15.一种测定整合了反转录病毒载体的染色体DNA上，反转录病毒载体侧翼的、来源于染色体的DNA的核苷酸序列的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)可与反转录病毒载体LTR部分退火的引物；

(b)接头盒；

(c)可与(b)中接头盒退火的引物；

(d)DNA聚合酶；

(e)限制性酶；及

(f)包含可降低双链核酸Tm值的化合物的用于引物延伸反应的缓冲液。

16.权利要求15中的试剂盒，其中DNA聚合酶是包含具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物。

17.权利要求15中的试剂盒，其中可降低双链核酸Tm值的化合物是选自甜菜碱、甲酰胺、二甲基亚砜和四甲基铵盐的物质。

18.权利要求17中的试剂盒，其中可降低双链核酸Tm值的化合物是三甲铵基乙内盐。

19.权利要求15中的试剂盒，其中(a)中的引物具有用于回收引物延伸产物的标记。

20.一种缓冲液，其是在分析整合了反转录病毒载体的染色体DNA上反转录病毒载体侧翼的、来源于染色体的DNA的区域的方法中用于引物延伸反应的缓冲液，它包含可降低双链核酸Tm值的化合物。

21.权利要求20中的缓冲液，其中可降低双链核酸Tm值的化合物是选自甜菜碱、甲酰胺、二甲基亚砜和四甲基铵盐的物质。

22.权利要求21中的缓冲液，其中可降低双链核酸Tm值的化合物是三甲铵基乙内盐。

23.一种可降低双链核酸Tm值的化合物在制备用于分析整合了反转录病毒载体的染色体DNA上反转录病毒载体侧翼的、来源于染色体的、DNA的区域的方法中所用的引物延伸反应缓冲液中的用途。

24.权利要求23中的用途，其中可降低双链核酸Tm值的化合物是选自甜菜碱、甲酰胺、二甲基亚砜和四甲基铵盐的物质。

25.权利要求24中的用途，其中可降低双链核酸Tm值的化合物是三甲铵基乙内盐。