KR20060015550A - 유전자 도입 부위의 분석 방법 - Google Patents

Abstract

더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시킬 수 있는 화합물의 존재하에 프라이머 신장 반응 및 핵산 증폭 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는, 그 안에 통합된 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA에서 벡터에 인접한 염색체로부터 유래된 DNA 영역을 분석하는 방법. 추가로 본 방법에 사용하기 위한 키트 및 완충액을 제공하는 것이다.

Description

유전자 도입 부위의 분석 방법{Method of analyzing gene introduction site}

본 발명은 도입된 유전자를 갖는 세포의 염색체상의 유전자 통합 부위를 분석하는 방법에 관한 것이다.

유전자 요법은 예를 들면, 세포 기능을 수복시키기 위하여 정확한 유전 정보를 제공하거나, 세포가 본질적으로는 갖고 있지 않은 신규한 "보호 유전자"를 가하여 "유전 정보 이상"에 기인한 난치성 질환, 예로서, 유전병 또는 암을 치료하거나 예방하는 요법이다.

유전자를 세포로 도입시키기 위한 유전자 요법에서 사용되는 공지 방법은 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 세포내이입, 전기 천공 또는 유전자 건(Gun)에 의해 네이키드(naked) DNA를 도입시키는 방법, 및 리포솜과 같은 유전자 도입제를 사용하는 방법을 포함한다.

바이러스 벡터는 기본 및 임상적인 목적을 포함하는 다양한 목적을 위한 유전자 요법에서 사용된다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터는 표적 세포에서 관심의 대상이 되는 유전자를 풍부하게 일시적으로 발현시키는 것에 적절할 수 있다. 한편, 레트로바이러스 벡터는 관심의 대상이 되는 유전자를 숙주 염색체내로 안정하 게 통합시키는 기능을 갖고 유전자를 장기간 안정적으로 발현시킬 수 있기 때문에 유전병에 대한 유전자 요법 또는 트랜스제닉 동물 생산 분야에서 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 관심의 대상이 되는 유전자는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 도입시키는 방법에 따라 무작위적으로 숙주 염색체내로 통합되기 때문에 통합 부위에 따른 세포의 발암 가능성이 지적되었다. 따라서, 숙주 염색체상에서의 레트로바이러스 벡터-매개 유전자 통합 부위의 분석 및 테스트 세포 군집의 클론 종(모노클로날, 올리고클로날, 폴리클로날)을 결정하는 민감한 모니터링이 중요하게 되었다.

역 PCR 방법 (참조 J. Virol., 63:1924-1928 (1989)) 또는 LM PCR 방법(참조 Science, 246:780-786 (1989))은 일반적으로 바이러스, 트랜스포손, 트랜스진 등의 염색체 DNA 내 삽입 또는 통합 부위를 분석하는 방법으로서 사용된다. 그러나, 상기 방법은 검출 감도가 낮거나(다수의 주형 DNA 요구됨) 또는 특이성이 낮은 것과 같은 문제점을 갖고 있다는 점이 지적되었다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 선형 증폭 매개 PCR (LAM PCR) 방법이 개발되었다(참조 WO 00/24929; Blood, 100:2737-2743 (2002)). 먼저, 이 방법에 따라 주형으로서의 염색체 DNA 및 프라이머를 사용하는 선형 PCR을 수행한다. 프라이머는, 레트로바이러스의 특징적이며 그의 말단에 바이오틴으로 표지된 서열인 롱 터미널 리피트 (LTR) 서열에 상보적이다. 단 하나의 프라이머가 프라이머가 어닐링되는 위치의 하류 부위에 상응하는 싱글-스트랜드 DNA를 증폭시키는 선형 PCR에서 사용된다. LTR 서열 및 염색체로부터 유래된 서열을 갖는 싱글-스트랜드 증폭된 DNA 단편을 효율적으로 회수하기 위하여 고정화된 스트렙타비딘을 갖는 자기 비드에 선형 PCR 산물에 흡착시킨다. 상보적인 스트랜드를 합성하여 싱글-스트랜드 DNA를 더블-스트랜드 DNA로 전환시킨다. 4개의 염기 서열을 인식하고 상기 서열에서 더블-스트랜드 DNA를 절단하는 제한 효소로 더블-스트랜드 DNA를 절단한다. 링커 카세트로 명명되는 더블-스트랜드 DNA를 말단에 결찰시킨다. 주형으로서의 수득한 결찰 산물뿐만 아니라 LTR에 상보적인 프라이머 및 링커 카세트에 상보적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다. LTR 및 상기 LTR 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA을 포함하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 따라서, 레트로바이러스 통합 부위를 분석할 수 있다. 추가로, 아가로스 겔등을 사용하여 PCR-증폭 단편을 회수하고, 그것을 적절한 벡터로 서브클로닝하고, 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 숙주 염색체 DNA에서 통합 부위를 분석할 수 있다.

이 방법에 따라 검출 감도는 통상의 방법과 비교하여 개선된다. 추가로, 자기 비드를 사용하므로써 반응 단계 사이의 샘플의 정제를 간소화하고 주형으로서 염색체 DNA의 양을 감소시키기 때문에 이 방법이 유리하다.

그러나, 다수의 상이한 통합 부위(폴리클론)을 갖는, 생물학적 샘플-유도 군집으로부터 수득한 염색체 DNA를 분석하고자 하는 경우, 현 반응 조건을 사용하는 것은 주형으로서의 DNA의 종류 또는 양에 따라 특정 클론(들)로부터의 편향된 단편 증폭 현상을 일으킬 수 있다. 이 경우 증폭 결과는 사용된 샘플중 세포 군집에 존재하는 클론의 실제 상태를 반영하지 못한다. 추가로 샘플중 낮은-과다(low-abundance) 클론은 검출될 수 없다. 따라서, 통상의 LAM PCR 방법은 그의 감도, 재 현성 및 정확성과 관련된 문제점을 안고 있다. 따라서, 유전자-도입 세포 군집의 실제 상태를 반영하고 정확한 판단을 형성하는 정보를 수득한다는 것은 어렵다.

상기 기술한 바와 같이, LAM PCR 방법은 레트로바이러스 벡터를 사용하여 통합된 유전자를 분석하기 위한 효과적인 시스템인 것으로 여겨지고 있다. 그러나, 군집 (폴리클로날, 올리고클로날 또는 모노클로날)에서 통합된 유전자를 갖는 세포의 함량, 또는 군집내 특정 세포의 비를 정확하고 고감도로 재현성을 갖고 모니터할 수 있도록 하기 위해서는 상기 방법은 개선되어야 한다.

발명의 개시

본 발명의 목적은 예로서, 다양한 레트로바이러스-매개 유전자 통합 부위를 갖는 세포 군집을 사용하고, 그에 의해 군집에 포함된 특정의 증폭된 단편을 고감도로 검출하여, PCR 반응에 의해 특정 클론으로부터 증폭된 단편에 대하여 편향되지 않고 더욱 많은 통합 단편을 증폭시키는 시스템을 구축하기 위하여 LAM PCR 방법을 사용하여 통합 부위를 분석하는 통상의 방법을 개선시키는 것이다. 이로써, 테스트 세포 군집의 클론 종(모노클로날, 올리고클로날, 폴리클로날)을 판단할 수 있고, 세포 군집중 특정 세포의 함량을 판단할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 집중적으로 연구한 결과, 본 발명자들은 PCR 조건을 포함하는 반응안을 개선하기 위하여 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에서 프라이머 신장 반응을 수행하여 비편향적인 증폭 단편을 고감도로 검출할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 이로써 본 발명은 완성되었다.

본 발명의 제 1면은 (1) 레트로바이러스 벡터의 LTR의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 및 주형으로서 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA를 사용하는 프라이머 신장 반응을 수행하여 프라이머 신장 산물을 수득하고;

(2) 단계 (1)에서 수득한 프라이머 신장 산물을 회수하고 프라이머 신장 산물에 상보적인 DNA를 합성하여 더블-스트랜드 DNA를 수득하고;

(3) 더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드를 단계 (2)에서 수득한 더블-스트랜드 DNA 말단에 가하고;

(4) 주형으로서 단계 (3)에서 수득한 첨가된 올리고뉴클레오티드를 갖는 더블-스트랜드 DNA, 및 레트로바이러스 벡터의 LTR의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 및 더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 반응을 수행하여 증폭 산물을 수득하는 것을 포함하며,

여기에서, 단계 (1)의 프라이머 신장 반응 및 단계 (4)의 핵산 증폭 반응을 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에 수행하는,

통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA의 부위를 분석하는 방법에 관한 것이다.

제 1면의 방법에 따라, 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 단계 (1)에서 프라이머 신장 반응 및/또는 단계 (4)에서 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있다. 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물인 DNA 폴리머라제 조성물은 중합효소 연쇄 반응을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응의 온도 싸이클은 95℃에서 60 초; 58℃에서 45 초; 및 72℃에서 90 초으로 구성된다.

제 1면의 방법에서 사용되는 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물은 베타인, 포름아미드, 디메틸 설폭시드 및 테트라메틸암모늄 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질에 의해 예시된다. 예를 들면, 트리메틸글리신을 베타인으로서 사용할 수 있다.

제 1면의 단계 (4)에서 2 단계 중합효소 연쇄 반응을 사용할 수 있다.

제 1면의 단계 (3)에서는, 단계 (2)에서 수득한 더블-스트랜드 DNA는 제한 효소로 분해될 수 있고, 더블-스트랜드 DNA의 형성된 말단에 더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드를 가할 수 있다. 단계 (1)의 염색체 DNA는 미리 제한 효소로 분해될 수 있다.

제 1면에 따라, 단계 (1)에서 라벨을 갖는 프라이머를 사용하여 단계 (2)에서 라벨을 이용하여 프라이머 신장 산물을 회수할 수 있다. 라벨의 예로서 바이오틴이 예시된다.

제 1면의 방법은 추가로 단계 (4)에서 수득한 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 이다. 이 방법에서는 단계 (4)에서 수득한 산물이 벡터내로 도입된 재조합 DNA를 주형으로서 사용하여 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다.

본 발명의 제 2면은 (a) 레트로바이러스의 LTR 부분에 어닐링할 수 있는 프 라이머;

(b) 링커 카세트;

(c) (b)의 링커 카세트에 어닐링할 수 있는 프라이머;

(d) DNA 폴리머라제;

(e) 제한 효소; 및

(f) 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함하는 프라이머 신장 반응을 위한 완충액을 포함하는, 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 키트에 관한 것이다.

제 2면의 키트에 포함된 DNA 폴리머라제는 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물인 DNA 폴리머라제 조성물일 수 있다. 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물은 베타인, 포름아미드, 디메틸 설폭시드 (DMSO) 및 테트라메틸암모늄 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질에 의해 예시된다. 트리메틸글리신은 베타인으로서 사용될 수 있다.

제 2면의 키트에 포함된 프라이머는 프라이머 신장 산물을 회수하기 위한 라벨을 가질 수 있다.

본 발명의 제 3면은 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함하는, 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA의 부위를 분석하는 방법에 사용하기 위한 프라 이머 신장 반응용 완충액에 관한 것이다.

본 발명의 제 4면은 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함하는, 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA의 부위를 분석하는 방법에 사용하기 위한 프라이머 신장 반응용 완충액을 제조하기 위한 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명을 수행하기 위한 최선의 모드

1. 본 발명의 유전자 통합 부위 분석 방법

(1) LTR 측면에 위치하는 염색체 DNA를 포함하는 DNA(프라이머 신장 산물) 합성

본 발명에 따른 주형으로서 염색체 DNA를 사용항 프라이머 신장 반응에 사용되는 프라이머는 레트로바이러스 벡터의 LTR의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 프라이머와 관련하여 DNA 폴리머라제에 의해 프라이머 신장 반응이 일어나는 조건하에서 LTR 부위에 어닐링할 수 있는 한 특별히 제한하지 않는다. 임의대로 LTR의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 디자인하고 제조할 수 있다. LTR 부위에 어닐링할 수 있는 한 프라이머는 LTR 서열에 상보적인지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 길이와 관련하여 특별히 제한하지 않지만, 예를 들면, 쇄 길이가 12-50 뉴클레오티드, 바람직하게 15-40 뉴클레오티드인 프라이머를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 적용시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 레트로바이러스 벡터의 LTR 서열이 공지되어 있는 경우 서열에 기초하여 프라이머를 제조할 수 있고 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 프라이머는 서열번호: 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머에 의해 예시된다.

프라이머는 바람직하게 프라이머 신장 산물의 회수를 촉진시키기 위한 라벨을 갖는다. 특정 수용체가 공지되어 있는 리간드(예: 바이오틴), 합텐 등으로 표지된 프라이머를 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 샘플로서 사용되는 염색체 DNA와 관련하여 특별히 제한하지 않지만, 레트로바이러스 벡터를 사용하여 유전자가 도입되거나(도입될 수 있는) 세포로부터 제조된 염색체 DNA이다. 염색체 DNA를 제조하기 위한 재료로 사용되는 세포는 모노클로날, 올리고클로날 또는 폴리클로날 군집으로부터 유래될 수 있다. 세포와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 생체외에서 배양된 세포 또는 생체로부터 수집된 세포일 수 있다. 생체로부터 수집된 세포일 경우, 조혈 줄기 세포와 같은 조혈 세포가 유전자 도입을 위한 표적일 때 세포로부터 분화된 세포(예: T 세포, B 세포, 단핵세포, 대식세포 등) 또는 그의 세포를 본 발명의 방법에 따라 사용되는 염색체 DNA를 제조하기 위한 재료로서 사용할 수 있다.

프라이머를 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA에 어닐링시키고, 프라이머로부터 DNA 신장 반응을 수행하여 LTR 및 LTR 측면에 위치하는 염색체 DNA를 포함하는 DNA 스트랜드를 합성한다. DNA 폴리머라제를 이 단계에 사용한다.

주형으로서 DNA 스트랜드에 상보적인 DNA 스트랜드를 합성하기 위하여 사용할 수 있는 한, 본 발명에 따라 사용되는 DNA 폴리머라제와 관련하여 특별히 제한 하지 않는다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)로부터 유래된 DNA 폴리머라제, 바실러스(Bacillus) 속 고온성 박테리움으로부터 유래된 DNA 폴리머라제(Bst DNA 폴리머라제, Bca DNA 폴리머라제, 등), 써무스(Thermus) 속 박테리움으로부터 유래된 DNA 폴리머라제(Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제, 등), 원시세균(archaebacterium)으로부터 유래된 DNA 폴리머라제(Pfu DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, Deep Vent DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제, 등) 또는 그의 변이체를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

또한, 2개 이상의 효소의 혼합물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제(예: Pfu DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, Deep Vent DNA 폴리머라제, KOD DNA 폴리머라제 등) 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물(예: Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제, 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제의 엑소뉴클레아제-결핍 뮤턴트) 혼합물을 사용하는 방법이 본 발명에 따라 특히 바람직할 수 있다. 상기 방법은 예를 들면, United States Patent No. 5436149에 기술되어 있다. 추가로 TaKaRa Ex Taq, TaKaRa LA Taq (Takara Bio) 등을 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물인 DNA 폴리머라제 조성물로서 상업적으로 이용할 수 있다.

더욱 다량의 프라이머 신장 산물을 수득하기 위하여 프라이머 신장 반응을 수회 반복하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 하기 3단계를 반복하여 PCR을 사용하여 프라이머 신장 산물 합성을 수행할 수 있다: 주형으로서의 DNA로부터의 신 장 산물을 해리시키고; 주형으로서의 DNA에 신규한 프라이머를 어닐링하고; 프라이머 신장 반응을 수행한다.

통상의 LAM PCR 방법에 따라 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 프라이머 신장 산물을 수득한 단계를 수행한다. 주형으로서 염색체 DNA의 종류 또는 양에 따라 다수의 경우에는 PCR을 사용하여 특정 분자가 풍부한 프라이머 신장 산물을 수득한다. 다양하게 프라이머 신장 산물을 풍부하게 수득할 수 없을 수 있다.

본 발명자들은 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 변형된 PCR 반응 조건을 사용하여 프라이머 신장 반응을 수행하여 통상의 LAM PCR 방법보다는 보다 다수의 분자 종으로 구성된 프라이머 신장 산물을 수득할 수 있다는 것을 보여주었다. 화합물의 예로서, 베타인 (예: 트리메틸글리신), 유기 용매 (예: 포름아미드, 디메틸 설폭시드) 및 테트라메틸암모늄 염 (테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC), 테트라메틸암모늄 아세테이트(TMAA), 테트라메틸암모늄 하이드록시드 (TMAH))를 포함한다.

3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물을 PCR에 대한 DNA 폴리머라제로서 바람직하게 사용된다.

공지 문헌 등에 기술된 것에 기초하여 결정된 조건하에서 PCR 반응을 수행할 수 있다. 상기-언급된 폴리머라제중 열-내성인 폴리머라제(예: 써무스(Thermus) 속 박테리움으로부터 유래된 DNA 폴리머라제 또는 원시세균(archaebacterium)으로부터 유래된 DNA 폴리머라제) 또는 그의 혼합물을 DNA 폴리머라제로서 사용할 수 있다. 사용하고자 하는 DNA 폴리머라제로서 적절한 반응 혼합물의 조성물을 선택할 수 있고, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 상기-언급된 화합물을 그에 가할 수 있다. 2개 이상의 화합물을 배합하여 가할 수 있다. 원하는 효과를 얻을 수 있는 한 농도와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 베타인의 최종 농도는 0.1-3 M, 바람직하게 0.1-1 M, 디메틸 설폭시드의 최종 농도는 0.5-15%, 바람직하게 1-10%, 또는 테트라메틸암모늄 염의 최종 농도는 0.1-100 mM, 바람직하게 1-50 mM인 것을 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

또한, PCR 반응 싸이클과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 예시적인 싸이클은 95℃에서 60 초; 58℃에서 45 초; 및 72℃에서 90 초로 구성된다. 온도는 ±2℃의 범위로 다양할 수 있고/거나 , 시간은 ±30% 범위로 다양할 수 있다. 싸이클 횟수는 증폭율을 고려하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 20-150 싸이클, 바람직하게 40-100 싸이클의 반응을 수행할 수 있다.

프라이머 신장 반응에 사용되는 프라이머의 적절한 양은 100 ng의 염색체 DNA 또는 50㎕의 반응 혼합물중 0.025-1.0 pmol이다.

(2) 프라이머 신장 산물의 더블 스트랜드로의 전환

상기 기술된 바와 같은 단계에서 합성된 프라이머 신장 산물을 예를 들면 프라이머에 첨가된 라벨을 사용하여 혼합물로부터 회수한다.

라벨로서 리간드를 프라이머에 가할 경우 리간드에 결합하는 수용체를 사용할 수 있다. 합텐으로 표지화할 경우, 합텐을 인식하는 항체를 사용할 수 있다. 표지 물질에 결합하는 물질이 고정화된 고체상을 사용하여 반응 혼합물로부터 프라이 머 신장 산물을 용이하게 회수될 수 있다. 예를 들면, 바이오틴으로 표지된 프라이머를 사용하여 수득한 프라이머 신장 산물을 하기와 같이 주형으로서의 염색체 DNA로부터 분리할 수 있다. 고정화된 아비딘을 갖는 비다를 신장 반응 혼합물에 가하여 비드상의 신장 산물을 포획한다. 비드를 세척하고 신장 산물을 비드로부터 분리한다.

추가로, 프라이머 신장 산물를 회수하기 전에 비반응 프라이머를 제거할 수 있다. 예를 들면, 오직 장쇄의 핵산만이 선택적으로 침전되는 조건하에 분별 침전 또는 적절한 공극 크기를 갖는 필터를 사용하여 여과하여 제거할 수 있다.

싱글-스트랜드 DNA 형태의 회수된 프라이머 신장 산물 더블-스트랜드 DNA로 전환시킨다. 전환 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 랜덤 프라이머를 프라이머 신장 산물에 어닐링하고, DNA 폴리머라제를 사용하여 랜덤 프라이머로부터 프라이머 신장 산물에 상보적인 DNA를 합성하여 더블-스트랜드 핵산을 수득할 수 있다.

(3) 링커 카세트 첨가

상기 단계 (2)에서 더블 스트랜드로 전환된 프라이머 신장 산물을 제한 효소로 분해하고 더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드를 분해 결과 생성된 말다에 가한다. 본 발명에 따라 사용되는 제한 효소와 관련하여 특별히 제한하지 않지만, 인식/절단 부위가 프라이머 신장 산물에 포함된 LTR 부위의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 것을 사용하는 것은 부적절하다. 이후 더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드 첨가에 대한 효율을 위해서는 본 발명에 따라 결합성이 있는 말단을 초래하는 제한 효소가 바람직할 수 있다. 추가로 4개의 염기 서열을 인식하는 제한 효소는 적절한 길이의 DNA 단편을 수득하기 위해 바람직할 수 있다. 예를 들면, Tsp509I (Sse9I), MboI (Sau3AI) 등을 사용할 수 있다. 사용하는 제한 효소에 적절한 조건하에서 제한 효소로 분해를 수행한다.

더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드(링커 카세트)를 제한 효소로 분해된 더블-스트랜드 프라이머 신장 산물 말단에 가한다. 링커 카세트는 제한 효소 분해 결과 생성된 말단에 상응하는 말단(바람직하게, 결합성이 있는 말단), 및 다음 핵산 증폭 단계에 사용되는 프라이머와 어닐링할 수 있는 서열을 갖는다. 링커 카세트가 상기 요건을 만족하는 한 서열 또는 그의 길이와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 일반적으로, 20-100 염기쌍, 바람직하게 30-60 염기쌍의 링커 카세트를 본 발명에 따라 사용한다. 프라이머가 어닐링되는 서열과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 프라이머 디자인에 부적절한 서열(GC 함량의 편향성, 분자내 또는 분자간 수소 결합 형성 가능성)을 제외하고 모든 서열을 사용할 수 있다.

DNA을 연결하는 공지 수단을 사용하여(결찰 반응) 링커 카세트를 가할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 키트 등을 사용할 수 있다.

(4) 더블-스트랜드 DNA 증폭

수득된 더블-스트랜드 DNA는 한쪽 말단에는 LTR-유도된 뉴클레오티드 서열을, 또다른 말단에는 링커 카세트의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 주형으로써의 상기 DNA, 및 LTR-유도된 뉴클레오티드 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머 및 링커 카세트의 뉴클레오티드 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 반응을 수행하여 더블-스트랜드 DNA를 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 방법을 위해 사용되는 핵산 증폭 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 공지 핵산 증폭 방법, 예롯 PCR 방법, ICAN 방법, SDA 방법 또는 TMA 방법을 사용할 수 있다.

PCR 방법을 사용할 경우 공지된 방법에 따라 적절한 조건(반응 혼합물의 조성, 사이클링 조건)을 결정할 수 있다. 바람직하게, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함하는 반응 혼합물 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물을 상기 (1)에 기술된 방법에 따라 사용한다. 사이클링 조건과 관련하여 상기(1)에 기술된 것을 사용할 수 있지만 싸이클 횟수를 감소시켜 사용할 수 있다. 네이스트(nested) PCR 방법으로서 공지된 2단계 PCR 방법을 사용할 수 있다.

레트로바이러스 벡터의 LTR 부위의 뉴클레오티드 서열 및 벡터가 통합되는 부위 측면에 위치하는(즉, LTR 측면) 염색체 부위의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 (1) 내지 (4) 시리즈에 의해 수득할 수 있다.

다르게는 단계(1)에서 사용된 염색체 DNA를 (3)에 기술된 것과 같은 적절한 제한 효소로 미리 분해할 수 있고, 분해된 염색체 DNA를 사용하여 프라이머 신장 반응을 수행할 수 있다. 이 경우, 생성된 신장 산물을 더블-스트랜드 DNA로 전환시키고 이를 제한 효소로 분해시키기 않고 링커 카세트를 그에 가할 수 있다. 둔화(blunt)된 말단을 갖는 링커 카세트를 본 목적을 위해 사용한다.

예를 들면, 아가로스 겔 전기영동를 사용하여 본 발명의 방법에 따라 수득된 증폭 DNA 단편을 분석하여 샘플로서 사용되는 세포 군집내 통합 부위의 변형 정도를 조사할 수 있다.

추가로, 공지된 방법(예: 디데옥시 방법)에 따라 증폭된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다.

증폭된 DNA 단편을 반응 혼합물로부터 회수하고 적절한 벡터(플라스미드 벡터, 파지 벡터, 등)에 결찰시킨다. 재조합 DNA 분자를 사용하여 적절한 숙주를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 제조한다. DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위하여 주형으로서의 재조합 DNA 분자를 사용하여 서열화 반응을 수행한다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 그의 3' 말단에서 돌출된 T 뉴클레오티드를 갖는 벡터(T-벡터)가 PCR 방법을 사용하여 증폭된 DNA 단편을 클로닝하기에 바람직할 수 있다.

증폭된 DNA 단편 분자 종이 제한되고 아가로스 겔 전기영동 등을 사용하여 DNA 단편을 분리할 수 있다면 주형으로서의 분리된 증폭된 DNA 단편을 사용하여 직접 서열화할 수 있다.

출발물질로서 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터-유도 서열 측면에 위치하는 서열은 수득한 뉴클레오티드 서열 정보에 포함된다. 따라서, 상기 서열과 염색체 DNA의 공지 뉴클레오티드 서열을 비교하여 레트로바이러스가 통합되는 염색체 상의 부위에 대한 정보를 얻을 수 있다.

폴리클론으로부터 유래된 염색체 DNA를 샘플로서 사용하는 경우에도 특정 서열을 갖는 DNA 단편이 풍부하지 않은, 다양한 서열을 갖는 DNA 단편으로 구성된 라 이브러리를 본 발명의 방법에 따라 수득할 수 있다. 상기 라이브러리에서 DNA 단편을 분석하여 예를 들면, 레트로바이러스 벡터가 통합되는 염색체 상의 부위를 결정하여 그의 통합율이 높은 서열 또는 부위를 평가하고, 생체내 특이적인 유전자-도입 세포의 비 또는 분포를 모니터할 수 있다.

통상의 LAM PCR 방법과 비교할 때본 발명의 방법의 감도는 탁월하기 때문에 상대적으로 유전자 도입율이 낮은 염색체 DNA를 사용하여 재현성을 갖는 우수한 결과를 얻을 수 있다.

2. 본 발명의 분석 방법에 사용되는 키트

본 발명의 유전자 통합 부위 분석 방법에 사용되는 키트는 상기 1에 기술된 바와 같은 각 단계에서 사용되는 시약을 포함한다. 예를 들면, 하기 성분을 포함한다:

(a) 레트로바이러스의 LTR 부위에 어닐링할 수 있는 프라이머;

(b) 링커 카세트;

(c) (b)의 링커 카세트에 어닐링할 수 있는 프라이머;

(d) DNA 폴리머라제;

(e) 제한 효소; 및

(f) 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함하는 프라이머 신장을 위한 완충액.

성분중 (f)의 완충액은 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함한다. 상기 화합물의 예로서 상기를 기술한다. 그의 조성물이 (d)의 DNA 폴리 머라제의 사용을 위해 적절하다는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 키트는 예를 들면, 프라이머 및 DNA 폴리머라제가 미리 완충액에 첨가되어 있거나, 완충액으로부터 분리되는 dNTPs 및/또는 Mg 염이 첨가된 형태의 것을 포함한다.

PCR을 사용하여 프라이머 신장 반응을 수행하는 경우 열-내성인 것이 (d)의 DNA 폴리머라제로서 선택된다. 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물인 DNA 폴리머라제 조성물이 DNA 폴리머라제로서 포함될 수 있다.

바이오틴과 같은 신장 산물의 회수에 적절한 표지를 (a)의 프라이머에 가할 수 있다. 이 경우, 키트는 고정화된 아비딘을 갖는 비드와 같은 표지에 상응하는, 신장 산물을 정제하기 위한 조성물을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 언급된 성분외에 프라이머 신장 산물을 더블 스트랜드로 전환시키기 위한 시약과 같은 성분, 제한 효소 반응용 완충액 또는 링커 카세트 결찰용 시약을 포함할 수 있다.

키트를 사용하여 본 발명에 따라 레트로바이러스 통합 부위를 용이하게 분석할 수 있다.

다수의 상이한 통합 부위(폴리클론)을 갖는 군집으로부터 수득된 염색체 DNA을 분석하고자 하는 경우, 주형으로서의 DNA의 종류 또는 양에 따라 특정 클론(들)로부터 편향적으로 증폭된 단편(들)을 수득할 수 있다. 이 현상은 통상의 LAM PCR 방법을 사용하여 레트로바이러스 통합 부위 분석 방법과 관련된 문제일 수 있다. 본 발명에 따라 본 현상은 극복된다. 따라서, 본 발명에 따라 군집 (폴리클로날, 올리고클로날 또는 모노클로날)에서 레트로바이러스 벡터를 사용하여 통합된 유전자를 갖는 세포의 정도, 또는 군집중 특정 세포의 비를 정확하고 높은 감도 및 재현성으로 모니터할 수 있다.

통상의 LAM PCR 방법을 사용하는 레트로바이러스 통합 부위 분석 방법은 주형으로서 사용하는 게놈 DNA의 양 또는 종류에 따라 특정 클론(들)로부터 편향적으로 유래된 PCR 증폭 산물(들)을 생성하는 경향이 있다. 통합 부위 수에 상응하는 단편 수를 관찰할 수 없고, 재현성이 낮은 문제는 정확한 판단에 대해 장애가 될 수 있다고 사료되었다. 그러나, 상기 문제는 고도로 정확한 판단을 돌출시키는 본 발명의 방법에 따라 해결된다.

본 발명을 실시예에 따라 더욱 구체적으로 설명하며, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

통합된 레트로바이러스를 갖는 293 세포 및 CD34-양성 세포 분석(폴리클론 분석)

(1) 레트로바이러스 상등액

293 세포 (ATCC CRL-1573) 또는 PG13 세포 (ATCC CRL-10686)를 5% CO₂ 존재하에 37℃에서 10% 우태아 혈청 (JRH), 50μg/㎖의 페니실린 (Gibco) 및 50μg/㎖의 스트렙토마이신 (Gibco)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM, Sigma)에서 배양하였다. 하기 방법에서 사용되는 DMEM은 모든 경우에서 50μg/㎖의 페니실린 및 50μg/㎖의 스트렙토마이신을 포함한다.

양생 레트로바이러스 벡터를 하기와 같이 제조하였다. 간단하게, 플라스미드 pQBI25에 삽입된 레트-쉬프트 그린 형광 단백질(GFP로 언급함)을 코딩하는 유전자(Quantum Biotechnologies Inc.) (서열번호: 1)을 플라스미드 pDON-AI (Takara Bio)내로 삽입하여 pDON-GFP를 작제하였다.

레트로바이러스 Packaging Kit Ampho (Takara Bio)를 사용하여 플라스미드 pDON-GFP를 293 세포내로 도입시키고 키트에 첨부된 설명서에 따라 배양 상등액을 회수하였다. 0.45-마이크론 필터 (Millipore)를 사용하여 배양 상등액을 여과하여 amphoGFP 바이러스 상등액 저장액을 제조하고, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다. NIH/3T3 세포에 대한 amphoGFP 바이러스 상등액의 감염 역가는 4 x 10⁶ 감염성 바이러스 입자/ml였다.

GALV 슈도-타입(pseudo-type) 레트로바이러스 벡터를 하기와 같이 제조하였다. 간단하게, 앞서 제조된 200㎕의 amphoGFP 바이러스 상등액 저장액을 사용하여 RetroNectin 방법(J. Biochem., 130:331-334 (2001))에 따라 2 x 10⁴의 PG13 세포로 유전자 도입을 2회 수행하였다. 2회동안 500 μg/㎖의 G418 및 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 세포를 선택적으로 배양하였다. GALV 슈도-타입 레트로바이러스-생산 세포로서 생성된 세포를 사용하였다. 생산 세포를 10cm 디쉬에서 반융합까지 배양하였다. 배지를 10% FBS를 포함하는 후레쉬 DMEM 7 ml으로 교환하였다. 5% CO₂의 존재하에 37℃에서 24시간동안 계속하여 배양하였다. 상등액을 0.45-마이크론 필터 (Millipore)을 통해 여과하여 galvGFP 바이러스 상등액 저장액을 제조하고, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다. HT1080 세포에 대한 galvGFP 바이러스 상등액의 감염 역가는 6 x 10⁵ 감염성 바이러스 입자/ml였다.

(2) 레트로바이러스 벡터의 293 세포 및 CD34-양성 세포로의 도입

바이러스 감염을 위해 실시예 1(1)에서 제조된 2ml의 galvGFP 바이러스 상등액과 혼합된 1 x 10⁷ 의 293 세포를 2개의 10-cm RetroNectin-코팅된 플레이트(Takara Bio)에 시딩하였다. 세포를 5% CO₂ 존재하에 37℃에서 24시간동안 배양하고 트립신을 사용하여 분리시키고 6개의 10-cm 조직 배양 플레이트에 분배하고 추가로 5% CO₂ 존재하에 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 트립신화하여 세포를 회수하고 원심분리 튜브로 이동시키고 PBS로 2회 세척하고 -80℃에서 저장하였다. 도입 세포 그룹을 293R1로 명명하였다. 형광표지세포분리기(FACS)를 사용하여 293R1을 분석하여 유전자 도입율은 59%이었다.

하기와 같이 인간 CD34-양성 조혈 줄기 세포로 유전자를 도입하였다. 제 1 바이러스 감염을 위해 24시간동안 사이토카인으로 자극시키고 1ml의 amphoGFP 바이러스 상등액과 혼합된 CD34-양성 세포 (BioWhittaker)를 6-cm RetroNectin-코팅된 플레이트(Takara Bio)를 가하였다. 감염 시 전체 세포수는 1.14 x 10⁶이었다. 세포를 5% CO₂ 존재하에 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 상등액을 원심분리하여 제거 하였다. 2ml의 사이토카인 배지(300ng/ml의 줄기세포인자(Genzyme), 100ng/ml의 트롬보포이에틴 (PeproTech House), 60ng/ml의 인간 인터루킨-3 (Genzyme), 300ng/ml의 인간 flt-3/flk-2 리간드 (R&D Systems) 및 4% 우태아 혈청 (BioWhittaker)) 및 1ml의 amphoGFP 바이러스 상등액을 가하고 세포를 5% CO₂ 존재하에 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 상등액을 원심분리하여 제거하였다. 2ml의 사이토카인 배지 및 1ml의 amphoGFP 바이러스 상등액을 가한 후, 세포를 5% CO₂ 존재하에 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 배양한 후, 세포를 트립신화하여 회수하고 -80℃에서 저장하였다. 도입 세포 그룹을 CD+R1으로 명명하였다. FACS을 사용하여 CD+R1의 분석하여 유전자 도입율은 20.3%이었다.

(3) 염색체 DNA 제조

-80℃에서 저장된 냉동 세포(293R1 또는 CD+R1, 약 2.0 x 10⁶ 세포)를 5ml의 현탁액 (10 mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.0), 10 mM EDTA, 150 mM 염화나트륨)에 현탁시켰다. 1㎕의 RNase A 용액(10 mg/ml), 50㎕의 10% SDS 용액, 및 25㎕의 단백질분해효소 K (20 mg/ml, Takara Bio)를 가하였다. 역전시켜 혼합물을 혼합하고 3시간동안 50℃에서 가열하였다. 동량의 페놀 용액을 가하고 15분동안 역전시켜 혼합물을 혼합하였다. 실온에서 원심분리하여 상등액을 회수하고 동량의 페놀 : 클로로포름: 이소아밀알코올 용액을 가하고 15분동안 역전시켜 혼합물을 혼합하였다. 1/25 용량의 5 M 염화나트륨을 가하고 원심분리하여 회수한 상등액과 혼합하였다. 2.5용량의 에탄올을 추가로 가하였다. 혼합물을 실온에 방치하고, 생성된 침전물을 회수하였다. 침전물을 70% 에탄올에서 세척하고 10분동안 대기건조시켰다. TE 완충액(10 mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액 (pH 8.0), 1 mM EDTA) 을 가하고 24시간동안 냉방에 방치시켜 침전물을 용해시켰다. 상기 언급한 공정의 결과로서 염색체 DNA 샘플을 293R1 및 CD+R1로부터 수득하였다.

(4) 유전자 통합 부위 분석

25㎕의 x2 PCR 완충액 (100 mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액 (pH 9.2), 28 mM 암모늄 설페이트, 20 mM 염화칼륨, 5.0 mM 염화마그네슘, 0.02%(w/v) BSA, 10%(v/v) DMSO, 0.5 M 베타인(트리메틸글리신)), 5㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 그의 5' 말단에 첨가된 바이오틴을 갖는 0.1 pmol의 프라이머 LTR I(LTR I은 레트로바이러스 벡터의 LTR에 상보적인 서열을 갖는다; 서열번호:2), 0.25㎕의 Ex Taq (5 U/㎕, Takara Bio) 및 용량이 50㎕이 되도록 멸균수를 실시예 1-(3)에서 293R1 또는 CD34+R1로부터 제조된 100 ng의 게놈 DNA에 가하였다. 혼합물을 자동화된 유전자 증폭시 열 싸이클러(Takara Bio)에 놓고 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 95℃에서 5분간 변성; 95℃에서 60 초동안 (변성), 58℃에서 45 초동안 (프라이머 어닐링) 및 72℃에서 90 초동안 (합성 반응) 50회 싸이클; 72℃에서 10분간 인큐베이션.

반응 후 비반응 프라이머를 하기와 같이 제거하였다. 300㎕의 TE 용액을 50㎕의 PCR 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 Suprec02 (Takara Bio)에 가하고 5,000 rpm에서 약 7분간 원심분리하였다. 350㎕의 TE 용액을 추가로 가하고 유사한 방식으로 원심분리하여 필터를 세척하였다. TE 용액을 40㎕의 용량으로 필터에 가 하여 프라이머가 제거된 DNA 용액으로부터 회수하였다.

고정화된 스트렙타비딘 (MPG 스트렙타비딘, Takara Bio)를 갖는 자기 비드(40㎕, 200μg에 상응)을 용액에 가하였다. 가끔씩 혼합하면서 실온에서 1시간동안 혼합물을 방치하였다. 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 자기 스탠드(Magnetight Separation Stand, Takara Bio)상에 1분동안 놓았다. 상등액을 버리고 비드를 회수하였다. 100㎕의 BW 완충액 (5 mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액 (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 1.0 M 염화나트륨)와 비드를 서서히 혼합하였다. 자기 스탠드상에 방치한 후, 상등액을 유사한 방식으로 버렸다. 100㎕의 멸균수를 사용하여 유사한 방식으로 수행하여 비드를 회수하였다(이 방법을 비드 세척 방법이라 명명한다).

세척된 비드를 14.1㎕의 멸균수에 서서히 현탁시켰다. 2㎕의 x 10 Klenow 완충액 (이하 Klenow 단편에 부착), 2.4㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 1㎕의 랜덤 프라이머 (랜덤 6mer, 100 pmol/㎕, Takara Bio) 및 0.5㎕의 Klenow 단편 (Takara Bio)을 비드에 가하여 20㎕의 혼합물을 제조하였다. 가끔씩 혼합하면서 37℃에서 1시간동안 혼합물을 반응시켜 상보적 스트랜드를 합성하였다. 반응 후, 비드를 세척하였다. 회수한 비드를 17.5㎕의 멸균수에 현탁시켰다. 2㎕의 x10 NE 완충액 1 (이하 Tsp509I에 부착) 및 0.5㎕의 제한 효소 Tsp509I (10 U/㎕, New England Biolabs)를 가하였다. 혼합물을 가끔씩 혼합하면서 65℃에서 1시간동안 반응시켰다. 비드 세척 공정 후, 2㎕의 링커 카세트 A (50 pmol/㎕) (링커 카세트 A를 구성하는 2개의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 3 및 4에 나타낸다), 16㎕의 용액 A (Takar결찰 kit ver. 1, Takara Bio) 및 2㎕의 용액 B (Takar 결찰 키트 버전 1, Takara Bio)를 비드에 가하였다. 가끔씩 혼합하면서 혼합물을 16 ℃에서 1시간동안 반응시켰다.

멸균수로 비드를 1회 세척한 후 비드를 회수하고 5㎕의 0.1 N 수산화나트륨에 현탁시키고, 10분동안 실온에 방치하였다. 상등액 (약 5㎕)을 자기 스탠드에서 회수하고 하기와 같은 PCR 반응을 위해 1㎕의 상등액을 사용하였다. 25㎕의 x2 PCR 완충액, 5㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), LTR에 상보적인 서열을 갖는 1㎕의 각 프라이머 LTR II(서열번호:5, 25 pmol/㎕) 및 링커 카세트에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 LC1(서열번호:6, 25 pmol/㎕), 0.25㎕의 Ex Taq 및 멸균수를 용량 50㎕까지 1㎕의 용액에 가하였다. 자동화된 유전자 증폭시 열 싸이클러에 반응 혼합물을 놓고 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 5분간 95℃에서에서 변성; 95℃에서 60 초동안 (변성), 58℃에서 45 초동안 (프라이머 어닐링) 및 72℃에서 90 초동안 (합성 반응) 30 싸이클; 72℃에서 10분간 인큐베이션(1라운드). 주형으로서의 제 1 라운드 PCR의 1㎕의 반응 혼합물 및 프라이머 LTR III (서열번호:7, 25 pmol/㎕) 및 프라이머 LC2 (서열번호:8, 25 pmol/㎕)을 사용하여 제 2 라운드 PCR을 수행하였다. 프라이머 LTR III는 LTRII가 어닐링하는 서열의 LTR 하류 부위에 상보적인 서열을 갖고 프라이머 LC2는 LC1가 어닐링하는 서열의 링커 카세트 하류 부위에 상보적인 서열을 갖는다. 제 2 라운드 PCR에 사용되는 조건은 제 1 라운드 PCR에 사용되는 것과 동일하였다.

5㎕의 반응 혼합물 (50㎕)을 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켜 수득한 반응 혼합물에서 증폭 산물을 확인하였다. 결과, 293R1 또는 CD+R1으로부터 유 래된 염색체 DNA를 주형으로서 사용하였을 때 약 500 bp 이하의 다양한 증폭된 단편을 이동시켜 광범위한 밴드를 형성하는 것을 확인하였다. 이 결과는 주형으로서 사용된 염색체 DNA는 레트로바이러스 벡터가 염색체상의 다양한 위치에서 통합된 세포로 구성되어 있는 폴리클로날 군집으로부터 제조되었다는 사실을 반영하는 것이다. 또한, 특정 클론으로부터 유래된 단편에 대한 비편향적 증폭도 상기-언급한 방법에 따라 가능하였다는 것을 나타낸다.

주형으로서 CD34+R1으로부터 유래된 게놈 DNA를 사용하여 증폭된 단편을 융점이 낮은 3.0% 아가로스 겔로부터 회수하고 pT7BlueT 벡터 (Takara Bio)에 결찰시켰다. 결찰 산물을 사용하여 Escherichia coli JM109을 형질전환시켰다. 결찰되는 삽입 단편을 포함하는 벡터를 수반(harboring)하는 각 68개의 클론 캔디데이트 균주를 X-gal 및 IPTG (모두 Takara Bio)를 포함하는 고체 배양 플레이트상에서 배양된 백색 콜로니로부터 회수하였다. 프라이머 LTR III 및 LC2, 및 Ex Taq (Takara Bio)를 사용하여 PCR에 의한 콜로니에 대하여 인서트 크기를 측정하였다. Ex Taq에 첨부된 설명서에 따라 반응 혼합물을 제조하였다. 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 95℃에서 5 분간 변성; 95℃에서 60 초동안, 58℃에서 45 초동안 및 72℃에서 90 초동안 30 싸이클. 증폭시킨 후, 반응 혼합물 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 다양한 길이의 증폭 단편이 관찰되었다. 따라서, 다양한 클론으로부터 유래된 통합 부위의 영역이 본 발명의 방법에 따라 증폭되었음이 제시되었다.

추가의 384개의 백색 콜로니를 선택하고 서열화를 위한 주형 DNAs를 하기와 같이 제조하였다. 각 콜로니를 앰피실린을 포함하는 40㎕의 LB 브로쓰 (1 g 트립 톤, 0.5 g 효모 추출물, 1 g 염화나트륨/100 ml)에 접종하고 37℃에서 18시간동안 배양하였다. 20㎕의 60% 글리세롤 용액을 배양액에 가하여 글리세롤 저장액 (최종 농도 20%)을 제조하였다. 키트에 첨부된 설명서에 따라 서열화를 위한 샘플을 TempliPhi DNA Sequencing Template 증폭 Kit (Amersham Biosciences)를 사용하여 0.5㎕의 각 글리세롤 저장액으로부터 제조하였다. Sequencer MegaBACE 4000 (Amersham Biosciences)를 사용하여 반응 혼합물을 뉴클레오티드 서열 분석화하였다. 결과, 상이한 통합 부위를 나타내는 115 인간-유도 서열이 관찰되었다. 이 결과는 또한 다양한 클론으로부터 유래된 증폭 단편 또한 본 발명의 방법에 따라 관찰되었음을 나타낸다.

실시예 2

샘플(1)로서 모노클로날-유래 염색체 및 폴리클론-유래 염색체 DNA의 혼합물을 사용한 분석

(1) 도입 레트로바이러스 293 세포 클론 분리

감염을 위해 실시예 1(1)에서 제조된 amphoGFP 바이러스 상등액의 10²-배 희석된 저장액 100㎕을 8 μg/ml의 농돌 폴리브렌을 포함하는 1ml의 DMEM 배지중 293 세포 (5 x 10⁴ 세포)에 가하였다. 배지를 2시간 후 교체하고 세포를 37℃에서 24시간동안 5% CO₂에서 배양하였다. 다음날, 세포를 500 μg/ml의 농도로 G418을 포함하는 배지우 1세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트 웰에 재플레이팅하고, 37℃에서 5% CO₂에서 배양하였다. G418에 대하여 내성을 나타내는 2개의 세포 (클론)을 분리하고, 증식시켜 각 클론당 2 x 10⁶ 세포를 수득하였다. 2개의 클론을 클론 1 및 클론 2로 명명하고 실시예 1(3)에 기술된 방법에 따라 각 클론으로부터 염색체 DNAs를 제조하였다.

(2) 주형으로서 모노클론-유래 염색체 DNA를 사용한 증폭

실시예 2(1)에서 제조된 클론 1 또는 클론 2로부터의 0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100 ng의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하여, 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 레트로바이러스 벡터가 클론의 게놈내 통합된 부위를 검출하였다. 최종 반응 혼합물의 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 증폭 산물을 관찰하기 위하여 에티디움 브로마이드로 겔을 염색하였다. 결과, 클론 1으로부터 증폭된 단편을 1 ng의 염색체 DNA을 사용하여 관찰하고 클론 2로부터 증폭된 단편은 10 ng의 염색체 DNA을 사용하여 관찰하였다. 따라서, 특정 클론으로부터 유래된 증폭된 단편을 고감도로 검출할 수 있음을 제시한다.

(3) 폴리클론-유래 염색체 DNA와 혼합된 클론-유래 염색체 DNA를 포함하는 샘플 분석

0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100%(w/w)의 농도로 클론 1 또는 클론 2 로부터의 염색체 DNA(실시예 2(1)에서 제조)와 293R1로부터의 염색체 DNA(실시예 1에서 사용)를 혼합하여 각각 총 100 ng의 염색체 DNAs를 포함하는 샘플을 제조하였다. 주형으로서 샘플을 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 293R1-유래 염색체 DNA와 혼합된 클론-유래 DNA를 검출하였다. 증폭 산물을 관찰하기 위하여 최종 반응 혼합물의 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 결과, 293R1-유래 염색체 DNA가 10% 이하의 농도로 포함된 경우에도 클론 1로부터 증폭된 단편이 관찰되었고, 293R1-유래 염색체 DNA가 50이하의 농도로 포함된 경우에도 클론 2로부터 증폭된 단편이 관찰되었다. 293R1-유래 염색체 DNA를 포함하는 샘플을 사용하여 실시예 1에서 관찰된 바와 같이 광범위한 밴드를 형성하는 증폭 단편이 관찰되었다.

상기외에도, 주형으로서 첨가되는 일정량 (100 ng)의 293R1-유래 염색체 DNA 및 클론 1 또는 클론 2로부터 유래된 0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100 ng의 염색체 DNA을 사용하여 클론-유래 DNA로부터 증폭된 단편을 검출하였다. 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 검출하였다. 결과, 각 반응 샘플에 대하여 광범위한 밴드를 형성하는 증폭 단편이 관찰되었다. 클론 1로부터 유래된 10ng 이하의 염색체 DNA , 및 클론 2로부터 유래된 50ng 이하의 염색체 DNA를 사용하여 각각 증폭 단편을 검출하였다. 따라서, 폴리크로날 샘플과 혼합된 특정 클론으로부터 유래된 증폭 단편은 고감도로 검출될 수 있다는 것을 제시하였다.

실시예 3

샘플(2)로서 모노클로날-유래 염색체 및 폴리클론-유래 염색체 DNA의 혼합물을 사용한 분석

(1) 주형으로서 2개의 클론-유래 염색체 DNAs 혼합물을 사용한 증폭

동량의(각각 0, 1, 10, 50 또는 100 ng) 클론 1 and 클론 2 prepared in 실 시예 2(1)에서 제조된 클론 1 및 클론 2로부터의 염색체 DNAs의 혼합물을 주형으로서 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 2개의 게놈중 통합 부위로부터 유래된 단편의 검출을 조사하였다. 증폭 산물을 관찰하기 위하여 최종 반응 혼합물의 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 결과, 1 ng의 각 염색체 DNAs의 혼합물을 사용하여 클론 1로부터 증폭된 단편을 관찰하고, 10 ng의 각 염색체 DNAs의 혼합물을 사용하여 클론 2로부터 증폭된 단편을 관찰하였다. 따라서, 2개의 클론으포부터 유래된 증폭 단편이 고감도로 검출될 수 있다는 것이 제시되었다.

(2) 주형으로서 폴리클론-유래된 것과 혼합된 2개의 클론-유래 염색체 DNAs의 혼합물을 사용한 증폭

0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100%(w/w)의 농도로 클론 1 및 클론 2 로부터의 염색체 DNA(실시예 2(1)에서 제조)의 동량의 혼합물과 293R1로부터의 염색체 DNA(실시예 1에서 사용)를 혼합하여 각각 총 100 ng의 염색체 DNAs를 포함하는 샘플을 제조하였다. 주형으로서 샘플을 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 293R1-유래 염색체 DNA와 혼합된 2개의 클론-유래 DNAs를 검출하였다.

증폭 산물을 관찰하기 위하여 최종 반응 혼합물의 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 결과, 10% 농도의 염색체 DNAs 혼합물을 포함하는 샘플을 사용하여 클론 1로부터 증폭된 단편이 관찰되었고, 50% 농도의 염색체 DNAs 혼합물을 포함하는 샘플을 사용하여 클론 2로부터 증폭된 단편이 관찰되었다. 293R1-유래 염색체 DNA를 포함하는 샘플을 사용하여 실시예 1에서 관찰된 바와 같이 광범위한 밴드를 형성하는 증폭 단편이 관찰되었다.

상기외에도, 주형으로서 일정량 (100 ng)의 293R1-유래 염색체 DNA 및 클론 1 또는 클론 2로부터 유래된 동량의(각각 0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100 ng) 염색체 DNAs 혼합물을 사용하여 클론으로부터 증폭된 단편을 검출하였다. 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 검출하였다. 결과, 각 반응 샘플에 대하여 전기영동 후 아가로스겔에서 광범위한 밴드를 형성하는 증폭 단편이 관찰되었다. 클론 1로부터 증폭된 단편은 10ng의 각 염색체 DNAs 혼합물을 포함하는 샘플을 사용하여 검출하고, 클론 2로부터 증폭된 단편은 50ng의 각 염색체 DNAs 혼합물을 포함하는 샘플을 사용하여 검출하였다. 따라서, 폴리클로날 샘플과 혼합된 2개의 클론으로부터 유래된 증폭 단편은 고감도로 검출될 수 있다는 것을 제시하였다.

(3) 주형으로서 다양한 비의 2개의 클론-유래 염색체 DNA 혼합물의 사용

1:0, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4 또는 0:1의 중량비(클론 1 : 클론 2, w:w)로 클론 1 및 클론 2로부터의 염색체 DNAs(실시예 2(1)에서 제조)를 혼합하여 총 100 ng의 염색체 DNAs를 포함하는 샘플을 제조하였다. 추가로, 상기 언급한 혼합물외에 100 ng의 293R1-유래 염색체 DNA(실시예 1에서 사용)을 포함하는 샘플을 제조하였다. 주형으로서 샘플을 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 클론 1 및 클론 2로부터 증폭된 단편을 검출하였다.

증폭 산물을 관찰하기 위하여 최종 반응 혼합물의 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 결과, 클론 1 및 클론 2의 혼합물인 경우 클론으로부터 증폭된 단편은 원(original) 혼합물의 것과 거의 동일한 비로 관찰되었다. 첨가된 293R1-유래 염색체 DNA를 포함하는 샘플의 경우 클론 1 및 클론 2로부터 유래된 DNA 단편은 광범위한 밴드를 형성하는 증폭 단편사이에서 관찰되었다. 또한 이 경우 클론 1 및 클론 2로부터 증폭된 단편의 양은 다양하게 관찰되었다. 따라서, 폴리클로날 샘플과 혼합된 2개의 클론은 비에 따라 고감도로 검출될 수 있음을 나타내었다.

실시예 4

샘플로서 4개의 클론으로부터 유래된 염색체 DNAs 혼합물을 사용하는 분석

(1) 도입 레트로바이러스를 갖는 HL60 세포 클론의 분리

플라스미드 pDON-GFP을 패킹 세포 GP+E-86로 도입하고, 실시예 1(1)에 기술된 방법에 따라 생성된 바이러스-생산자 세포로부터 amphoGFP 바이러스 상등액 저장액을 제조하였다.

감염시키기 위하여 8 μg/ml 농도의 폴리브렌을 포함하는 1ml의 DMEM 배지중 HL60 세포 (BioWhittaker, 5 x 10⁴ 세포)에 100㎕의 amphoGFP 바이러스 상등액의 10²-배 희석된 저장액을 가하였다. 2시간 후 배지를 교환하고 5% CO₂ 존재하에 24시간동안 37℃에서 세포를 배양하였다. 세포를 트립신을 사용하여 분리하고, 6개의 10-cm 조직 배양 플레이트에 분배하고 추가로 48시간동안 37℃에서 5% CO₂ 존재하에 배양하였다. 다음날, 500 μg/ml의 농도로 G418를 포함하는 배지중 웰당 1개의 세포를 갖는 밀도로 96-웰 플레이트의 웰에 세포를 다시 플레이팅하고, 37℃에서 5% CO₂ 존재하에 배양하였다. 세포 (클론)를 24-웰 플레이트에 다시 플레이팅하고 4일 간 배양하고 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하고 4일간 배양하였다. 이어서 G418에 내성을 나타내는 4개의 클론을 분리하고 확장시켜 각 클론마다 1 x 10⁷ 세포를 수득하였다. 4개의 클론을 클론 a, 클론 b, 클론 c 및 클론 d로 명명하고, 염색체 DNAs를 실시예 1(3)에 기술된 방법에 따라 각 클론으로부터 제조하였다.

(2) 주형으로서 4개의 클론으로부터 유래된 염색체 DNAs 혼합물을 사용하는 반응

각각 100 ng의 실시예 4(1)에서 클론 a-d로부터 제조된 염색체 DNAs중 하나를를 포함하거나, 동량의(각각 0, 0.1, 1, 10, 25, 50 또는 100 ng) 4개의 염색체 DNAs 혼합물을 포함하는 샘플을 제조하였다. 주형으로서 샘플을 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 각 클론의 증폭으로부터 형성된 밴드 또는 4개의 염색체로부터 유래된 밴드 혼합물의 검출을 검사하였다.

증폭 산물을 관찰하기 위하여 최종 반응 혼합물 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 결과, 그로부터 유래된 단 하나의 염색 DNAs만을 포함하는 각 샘플을 사용하여 클론 a, b, c 및 d로부터 증폭된 단편을 관찰하였다. 추가로, 4개의 염색체 DNAs 혼합물을 사용하여 4개의 증폭된 단편을 검출하였다. 감도와 관련하여 그를 각 약 1 ng씩 포함하는 포함하는 혼합물을 사용하여 검출을 수행할 수 있다. 따라서, 4개의 클론 (올리고클론)으로부터 유래된 증폭된 단편을 고감도로 검출할 수 있음을 제시하였다.

실시예 5

검출감도의 상승

0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100%(w/w)의 농도로 클론 2로부터의 염색체 DNA (실시예 2(1)에서 제조)와 293R1로부터의 염색체 DNA(실시예 1(3)에서 제조)를 혼합하여 각각 총 100 ng의 염색체 DNAs를 포함하는 샘플을 제조하였다. 0.5㎕의 x10 NE 완충액, 0.5㎕의 제한 효소 Tsp509I (10 U/㎕) 및 5㎕의 용량으로 멸균수를 가하였다. 혼합물을 65℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 25㎕의 x 2 PCR 완충액, 5㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 그의 5' 말단에 바이오틴이 첨가된 1㎕의 프라이머 LTR I (0.1 pmol/㎕), 0.25㎕의 Ex Taq 및 5㎕의 용량으로 멸균수를 반응 혼합물에 가하였다. 반응 혼합물을 자동화된 유전자 증폭시 열 싸이클러에 놓고 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 95℃에서 5 분간 변성; 95℃에서 60 초동안, 58℃에서 45 초동안 및 72℃에서 90 초동안 50 싸이클. 이어서 반응하지 않은 프라이머는 실시예 1(4)에 기술된 바와 같이 제거하여 40㎕의 DNA 용액을 수득하였다.

스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 (40㎕, MPG 스트렙타비딘)를 용액에 가하였다. 가끔씩 혼합하면서 혼합물을 실온에서 1시간동안 방치시켰다. 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 자기 스탠드상에 1분간 놓고, 상등액을 버리고 비드를 수득하고 비드를 세척하였다. 세척시킨 비드를 14.1㎕의 멸균수에 서서히 현탁시켰다. 2㎕의 x10 Klenow 완충액, 2.4㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 1㎕의 랜덤 프라이머 (6mer, 100 pmol/㎕) 및 0.5㎕의 Klenow 단편을 비드에 가하여 20㎕의 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간동안 반응시켰다.

반응 후, 비드를 세척하고 2㎕의 링커 카세트 B (50 pmol/㎕)(링커 카세트 B를 포함하는 2개의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 서열번호:9 및 10으로 나타냄), 16㎕의 용액 A (Takara 결찰 kit ver. 1) 및 2㎕의 용액 B (Takara 결찰 kit ver. 1)을 비드에 가하였다. 가끔씩 혼합하면서 혼합물을 16℃에서 1시간동안 반응시켰다. 멸균수를 사용하여 비드를 1회 세척한 후 비드를 회수하고 5㎕의 0.1 N 수산화나트륨에 현탁시키고 10분동안 실온에 방치시켰다. 자기 스탠드상에서 상등액 (약 5㎕)을 회수하고 1㎕의 상등액을 실시예 1(4)에 기술한 바와 같이 PCR 반응에 사용하였다. 제 2 라운드의 PCR (50㎕) 반응 혼합물 5㎕을 .0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켜 증폭된 단편을 확인하였다.

대조군으로서 동일한 주형을 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 방법을 수행하였다. 결과, 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 50%의 농도로 클론 2로부터의 염색체 DNA를 포함하는 샘플을 사용하여 클론 2로부터 증폭된 밴드를 관찰하였다. 한편, 이 방법을 통해 10%의 농도로 동일의 것을 포함하는 샘플을 사용하여 밴드를 관찰하였다. 따라서, 혼합 클론으로부터 유래된 증폭 산물의 검출 감도는 상승시킬 수 있었다.

실시예 6

통상의 LAM PCR 방법(1) 비교

(1) pDON-GFP이 도입된 HL60 세포 군집 제조

실시예 4(1)에서 제조된 플라스미드 pDON-GFP를 패킹 세포 GP+E-86으로 도입시켜 AmphoGFP 바이러스-생산 세포를 작제하고 바이러스 입자를 회수하였다.

감염시키기 위하여 8 μg/ml 농도로 폴리브렌를 포함하는 1ml의 DMEM 배지중 HL60 세포 (5 x 10⁴ 세포)에 실시예 4(1)에서 제조된 amphoGFP 바이러스 상등액의 10²-배 희석된 저장액 100㎕을 가하였다. 2시간 후 배지를 교환하고 세포를 37℃에서 24시간동안 5% CO₂ 존재하에서 배양하였다. 세포를 트립신을 사용하여 분리하고,6개의 10-cm 조직 배양 플레이트에 분배하고 추가로 48시간동안 37℃에서 5% CO₂ 존재하에 배양하였다.

세포를 트립신으로 처리하고 원심분리 튜브에서 회수하고 PBS로 2회 세척하고 -80℃에서 저장하였다. 도입된 세포 그룹을 HL60R1로 명명하였다. FACS를 사용하여 HL60R1을 분석하여 유전자 도입율은 약 20%임을 밝혀냈다. 실시예 1(3)에 기술된 방법에 따라 염색체 DNA를 HL60R1 (약 2.0 x 10⁶ 세포)로부터 제조하였다.

(2) 유전자 통합 부위 DNA 증폭

[Blood, 100:2737-2743 (2002)]에 기술된 방법에 따라 통상의 LAM PCR 방법을 수행하였다. 10㎕의 x10 PCR 완충액 (Qiagen), 8㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM ), 그의 5' 말단에 첨가된 바이오틴을 갖는 0.25 pmol의 프라이머 LTR I, 0.5㎕의 Taq 폴리머라제 (5 U/㎕, Qiagen) 및 100㎕의 용량으로 멸균수를 1, 10 또는 100 ng의 실시예 6-(1)의 HL60R1으로부터 제조된 게놈 DNA에 가하였다. 자동화된 유전자 증폭시 열 싸이클러(Takara Bio)에 놓고 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 95℃에서 5 분간 변성; 95℃에서 60 초동안, 60℃에서 45 초동안 및 72℃에서 60 초동안 100 싸이클; 10분 72℃에서 인큐베이션. 최초 50 싸이클 후 동량의 Taq 폴리머라제 를 가하고, 이후 50 싸이클을 수행하였다(총 100 싸이클).

고정화된 스트렙타비딘 (MPG 스트렙타비딘)를 갖는 자기 비드 (100㎕, 200 μg에 상응)를 반응 혼합물에 가하였다. 가끔식 혼합하면서 혼합물을 1시간동안 실온에 방치하였다. 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 자기 스탠드상에 1분간 놓고, 상등액을 버리고 비드를 회수하였다. 비드를 100㎕의 BW 완충액 (5 mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액 (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 1.0 M 염화나트륨)과 서서히 혼합하였다. 자기 스탠드상 방치한 후 유사한 방식으로 상등액을 버렸다. 100㎕의 멸균수를 사용하여 유사한 공정을 수행하여 비드를 회수하였다(이 공정을 비드 세척 공정이라 명명한다).

세척시킨 비드를 14.1㎕의 멸균수에 서서히 현탁시켰다. 2㎕의 x10 Klenow 완충액, 2.4㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 1㎕의 랜덤 프라이머 (6mer, 100 pmol/㎕, Takara Bio) 및 0.5㎕의 Klenow 단편을 비드에 가하여 20㎕의 혼합물을 제조하였다. 가끔씩 혼합하면서 혼합물을 37℃에서 1시간동안 반응시켜 상보적인 스트랜드를 합성하였다.

반응 후, 비드를 세척하였다. 회수한 비드를 17.5㎕의 멸균수에 현탁시켰다. 2㎕의 x10 NE 완충액 및 0.5㎕의 제한 효소 Tsp509I (10 U/㎕)를 가하였다. 가끔씩 혼합하면서 65℃에서 1시간동안 혼합물을 인큐베이션시켰다. 비드 세척 공정 후 2㎕의 링커 카세트 A (50 pmol/㎕), 16㎕의 용액 A (Takara 결찰 kit ver. 1) 및 2㎕의 용액 B (Takara 결찰 kit ver. 1)를 비드에 가하였다. 가끔씩 혼합하면서 혼합물을 16 ℃에서 1시간동안 반응시켰다.

반응시키고 멸균수로 1회 세척한 후 비드를 회수하고, 5㎕의 0.1 N 수산화나트륨에 현탁시키고 실오넹서 10분간 방치시켰다. 상등액 (약 5㎕)를 자기 비드상에서 회수하고 1㎕의 상등액을 사용하여 하기와 같이 PCR 반응을 수행하였다. 10㎕의 x10 Taq 완충액, 8㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 1㎕의 각각의 프라이머 LTR II (25 pmol/㎕) 및 프라이머 LC1 (25 pmol/㎕), 0.5㎕의 Taq 폴리머라제 (Qiagen) 및 100㎕의 용량으로 멸균수를 1㎕의 용액에 가하였다. 혼합물을 자동화된 유전자 증폭시 열 싸이클러(Takara Bio)에 놓고 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 95℃에서 5 분간 변성; 95℃에서 60 초동안, 60℃에서 45 초동안 및 72℃에서 60 초동안 35 싸이클; 10분 72℃에서 인큐베이션(제 1 라운드). 주형으로서 0.2㎕의 제 1 라운드의 PCR 반응 혼합물, 및 프라이머 LTR III (25 pmol/㎕) 및 프라이머 LC2 (25 pmol/㎕)을 사용하여 제 2 라운드를 수행하였다. 제 2 라운드 PCR에 사용된 조건은 제 1 라운드 PCR에 사용된 것과 동일하였다.

1, 10 또는 100 ng의 HL60R1 염색체 DNA를 주형으로서 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 레트로바이러스 벡터 통합 부위 측면에 위치하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켜 증폭 산물을 확인하였다. 결과, 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 100 또는 10 ng의 염색체 DNA를 사용할 경우 광범위한 밴드를 형성하는 약 500 bp 미만의 증폭 단편이 관찰되었다. 한편, [Blood]에 기술된 통상의 LAM PCR 방법에 따라 10ng의 염색체 DNA를 사용하여 편향된 방식으로 특정 클론으로부터의 증폭을 나타내는 밴드가 관찰되었다. 이 결과에 기초하여, 주형의 양이 거의 없거 나 유전자가 도입된 염색체의 비가 거의 없는 경우에도 통상의 LAM PCR 방법과 비교하여 실시예 1(4)에 기술된 본 발명의 방법에 따라 특정 클론으로부터 증폭에 대하여 편향되지 않고 다양한 유전자가 도입된 세포로부터 유래된 DNA 단편이 증폭될 수 있다는 것이 나타났다.

추가로 동일한 공적을 반복하였다. 결과, 이전 실험에서 관찰된 바와 같이 100 또는 10 ng의 염색체 DNA를 실시예 1(4)에 기술된 본 발명의 방법에 따라 사용할 경우 광범위한 밴드를 형성하는 약 500 bp 미만의 증폭 단편이 관찰되었다. 한편, [Blood]에 기술된 통상의 LAM PCR 방법에 따라 10ng 및 100ng의 염색체 DNA를 사용하였을 때 편향된 방식으로 특정 클론으로부터의 증폭을 나타내는 밴드가 관찰되었다. 이 결과는 통해 통상의 LAM PCR 방법과 비교하여 본 발명의 방법에 따라 재현성을 갖고 레트로바이러스 통합 부위를 분석할 수 있음을 제시한다.

실시예 7

통상의 LAM PCR 방법(2) 비교

실시예 6(2)에 기술된 방법 및 하기 4개의 주형을 사용하여 통상의 LAM PCR 방법에 따라 레트로바이러스 통합 부위의 DNA 단편을 증폭시켰다: (A) 실시예 2(1)에서 제조된 클론 1로부터 유래된 0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100 ng의 염색체 DNA; (B) 클론 1로부터 유래된 0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100 ng의 염색체 DNA와 혼합된 293R1로부터 유래된 100 ng 염색체 DNA(실시예 1에서 사용됨, 폴리클로날 DNA); (C) 클론 1로부터 유래된 0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100 ng의 염색체 DNA와 293R1로부터 유래된 100 ng 염색체 DNA(실시예 1에서 사용됨)를 혼합하여 제조된 총 100 ng의 염색체 DNAs를 포함하는 각 샘플; 및 (D) 클론 1로부터 유래된 0, 0.1, 1, 10, 50 또는 100 ng의 염색체 DNA와 도입 유전자 없이 293 세포로부터 제조된 염색체 DNA와 혼합하여 제조된 총 100 ng의 염색체 DNAs를 포함하는 각 샘플. 추가로 서로 비교하기 위하여 동일한 주형을 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 DNA를 증폭시켰다.

증폭 산물을 관찰하기 위하여 최종 반응 혼합물 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 증폭된 단편을 관찰하기 위하여 사용되는 반응 혼합물에 사용되는 클론 1로부터 유래된 DNA의 양을 표 1에 나타내었다.

표 1

	통상의 것	본 발명
(A)	≥10 ng	≥ 1 ng
(B)	≥ 50 ng	≥10 ng
(C)	≥ 50 ng	≥10 ng
(D)	≥ 10 ng	≥ 1 ng

본 결과에 기초하여, 다양한 상황하에(도입된 유전자를 갖는 폴리클로날 DNA 또는 도입된 유전자가 없는 염색체 DNA가 반응 혼합물에 공존하는 경우) 우세하게 존재하는 클론을 검출할 때 본 발명의 방법의 감도는 통상의 방법의 것보다 5- 내지 10-배 우수하다는 것을 나타낸다.

실시예 8

샘플로서 5개의 클론으로부터 유래된 염색체 DNAs 혼합물을 사용하는 통상의 LAM PCR 방법과의 비교

실시예 4(1)에서 제조된 유전자-도입 세포로부터 5개의 클론을 선별하였다. 본 발명의 방법에 따라 레트로바이러스 통합 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 때 이들 클론으로부터 길이가 상이한 증폭 단편을 형성하였다. 5개의 클론으로부터 유래된 염색체 DNA 혼합물을 하기와 같이 주형으로서 사용하였다.

5개의 클론으로부터 유래된 동량(1, 25 또는 100 ng)의 염색체 DNAs 혼합물 또는 추가로 HL60R1로부터의 100ng의 염색체 DNA(실시예 6-(1)에서 제조, 폴리클로날 DNA)를 추가로 포함하는 혼합물을 사용하여 실시예 6(2)에 기술된 통상의 LAM PCR 방법을 실시예 1(4)에 기술된 본 발명의 방법과 비교하였다.

증폭 산물을 관찰하기 위하여 최종 반응 혼합물 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 5개의 클론으로부터 유래된 염색체 DNA 혼합물만을 주형으로서 사용할 때 100 또는 25ng의 주형을 사용하여 본 발명의 방법 및 통상의 방법에 따라 5개의 클론 모두로부터 증폭된 단편이 관찰되었다. 1 ng의 주형을 사용할 때 본 발명의 방법에 따라 4개의 클론으로부터 증폭된 단편이 관찰된 반면, 통상의 LAM PCR 방법에 따라서는 어떤 DNA 증폭도 관찰되지 않았다.

주형으로 폴리클로날 DNA가 공존하는 경우 25 ng의 주형을 사용하여 본 발명의 방법에 따라 5개의 클론으로부터 증폭된 단편이 관찰되었다. 한편, 25 ng의 주형을 사용하여 통상의 LAM PCR 방법에 따라서는 단 하나의 클론(나머지 4개의 클론은 아님)으로부터만 증폭된 단편이 관찰되었다.

이 결과에 기초하여, 폴리클론중 우세하게 존재하는 여러개의 클론을 검출하고자 하는 경우, 통상의 방법과 비교할 때 본 발명의 방법에 따라 더욱 우수한 검 출(즉, 존재하는 클론의 상태를 더욱 가능하게 반영하는 증폭)을 수행할 수 있음이 판명되었다.

실시예 9

샘플로서 골수-재구성된 마우스로부터의 말초 혈액 클론으로부터 유래된 염색체 DNA를 사용하여 통상의 LAM PCR 방법

(1) 레트로바이러스 제조

동종숙주역 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 레트로바이러스 Packaging Kit Eco (Takara Bio)에 포함된 pGP 및 pE-eco 및 실시예 1(1)에서 제조된 플라스미드 pDON-GFP를 키트에 첨부된 설명서에 따라 293 세포로 도입하고, 세포를 배양하고, 배양 상등액을 회수하였다. 배양 상등액을 0.45-마이크론 필터 (Millipore)을 통해 여과하여 ecoGFP 바이러스 상등액 저장액을 제조하고 사용시까지 -80℃에 저장하였다. NIH/3T3 세포에 대한 ecoGFP 바이러스 상등액의 감염 역가는 1.6 x 10⁶ 감염성 바이러스 입자/ml였다.

(2) 마우스 골수 세포의 제조

150 mg/kg의 5-플루오로우라실 (5-FU, Sigma)을 7주령된 C3H/He 마우스 (암컷, Japan SLC)에 복강 투여하였다. 7일 후 적출된 대퇴골 및 경골로부터 골수를 채취하였다. 림프구 M상에 오버레이된 수득한 골수 세포액을 원심분리하여 제조된 분획중 단핵 세포(Daiichi Pure Chemicals)를 마우스 골수 세포로서 사용하였다.

마우스 골수 세포를 50ng/ml의 트롬보포이에틴, 100ng/ml의 flt-3/flk-2 리 간드, 100ng/ml의 줄기세포인자, 5 μM 2-머캅토에탄올, 50 유니트/ml의 페니실린 및 50μg/㎖의 스트렙토마이신을 포함하는 StemPro-34 SFM 배지 (Gibco)에 1.45 x 10⁶ 세포/ml의 세포 밀도로 가하고 예비자극시키기 위하여 37℃에서 48시간동안 5% CO₂ 존재하에서 인큐베이션시켰다. 베쓸에 부착된 것을 포함하는 예비자극시킨 세포를 피펫을 사용하여 흡인에 의해 채집하였다.

(3) 형질 전환된 골수 세포 제조

실시예 9(1)에서 제조된 ecoGFP 바이러스 상등액을 RetroNectin (Takara Bio)으로 코팅된 플레이트(Takara Bio)에 가하고 플레이트를 32℃에서 인큐베이션시켰다. 4시간 후, 흡인시켜 상등액을 제거하고 마우스 골수 세포 (세포수, 배지)를 가하고 37℃에서 22시간동안 5% CO₂ 존재하에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 피펫팅하여 세포를 회수하고 염수로 1회 세척하고 염수(Otsuka Pharmaceutical)에 세척하고 유전자-도입 골수 세포로 사용하였다.

(4) 형질전환된 세포의 마우스내로의 이식

치사량의 X 레이 (900 Rad)로 처리된 8주령된 C3H/He 마우스 (암컷)에 유전자-도입 골수 세포 (0.2 ml/마우스, 5 x 10⁴ 세포에 상응)를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 세포 이식 후 21주째 2마리의 마우스로부터 말초 혈액을 채취하였다. 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 염색체 DNAs를 제조하고 Sample I 및 Sample II로 명명하였다.

(5) 유전자 통합 부위 분석

주형으로서 100 ng의 Sample I 또는 Sample II을 사용하여 실시예 1(4)에 기술된 본 발명의 방법과 실시예 6(2)에서 기술된 바와 같은 통상의 LAM PCR 방법을 비교하였다. 2명의 실시자에 의해 독립적으로 양 샘플 모두에 대하여 조작을 수행하였다.

증폭 산물을 관찰하기 위하여 최종 반응 혼합물 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켰다. 결과, Sample I을 사용하여 통상의 LAM PCR 방법에 따라 증폭된 단편으로서 단일 주요 산물을 2명중 1명의 실시자에 의해 관찰한 반면, 다른 한 실시자는 주요 산물을 관찰하지 못했다. Sample II를 사용한 경우 2명의 실시자 모두 뚜렷한 증폭 단편을 관찰하지 못했다. 반면, 본 발명의 방법에서 2개의 샘플 모두를 사용할 때 주요 산물로서 증폭된 단편이 뚜렷하게 관찰되었다. 또한 소수 산물도 검출되었다. 실시자에 따른 증폭 단편 패턴에 대한 차이는 관찰되지 않았다.

이 결과에 기초하여 동물-유래 샘플을 사용하는 본 발명에 따라 고감도로 증폭(즉, 현 클론 상황과 일치)시킬 수 있다는 것을 제시하였다. 추가로 본 발명의 재현성도 실시자 차이에 따라 파괴되지 않았다.

(6) 소수 산물로서의 증폭 단편의 분석

실시예 9(5)의 본 발명의 방법에 따라 증폭된 소수 산물로서의 증폭 단편이 하기와 같이 레트로바이러스를 사용하여 도입된 유전자를 갖는 세포로부터 유래되었다는 것을 확인하게 되었다. Sample I을 사용하여 본 발명의 방법에 따라 증폭된 300-bp 소수 밴드를 겔로부터 회수하고 실시예 1에 기술된 방법에 따라 pT7BlueT 벡터에 결찰시켰다. 클론을 재조합 플라스미드로 형질전환된 Escherichia coli 세포로부터 선택하고 클론에 의해 수반되는 플라스미드에 삽입된 단편의 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 결과, 서열 모두 마우스 염색체 DNA로부터의 것임을 확인하게 되었다.

이 결과에 기초하여 본 발명의 방법에 따라 재구성된 마우스 혈액 세포로부터 증폭된 소수 산물이 유전자-도입 세포 클론로부터 증폭된 단편인 것으로 입증되었다. 소수 산물은 통상의 방법에 따라 관찰되지 않기 때문에, 본 발명의 방법은 통상의 방법보다 고감도로 유전자-도입 세포 클론을 검출하기 위하여 사용될 수 있음을 제시하였다.

실시예 10

디메틸 설폭시드 또는 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC)을 포함하는 반응 혼합물을 사용하는 증폭

화합물을 반응 완충액에 첨가하는 것에 대한 효과를 조사하였다.

293R1로부터 제조된 34, 17 또는 8.5ng의 염색체 DNA(실시예 1에서 제조된 293R1의 유전자 도입율이 59%인 것에 기초하여 20, 10 또는 5 ng의 유전자-도입 DNA에 상응함)를 도입 유전자를 포함하지 않는 도입 유전자로부터 제조된 염색체 DNA와 혼합하여 각각 주형으로서 염색체 DNAs의 혼합물 총 100ng을 포함하는 샘플을 제조하였다. 실시예 1(4)에 기술된 방법에 따라 DNA 증폭을 수행하였다. 실시예 1(4)에 기술된 반응 혼합물외에도 최종 농도가 6%인 디메틸 설폭시드 (DMSO), 최종 농도가 6%인 DMSO 및 최종 농도가 10 mM인 TMAC, 또는 DMSO 대신 최종 농도가 10 mM인 TMAC 및 베타인을 포함하는 반응 혼합물을 제조하고 반응을 위해 사용하였다.

최종 반응 혼합물중 일부를 3.0%(w/v) 아가로스 겔상에 전기영동시켜 증폭 산물을 관찰하였다. 결과, 실시예 1(4)에 기술된 바와 같이 완충액을 사용하여 관찰된 것과 유사한 광범위한 밴드를 형성하는 약 500 bp 미만의 증폭 단편이 6% DMSO를 포함하는 반응 혼합물을 사용하였을 때 관찰되었다. 10 mM TMAC를 포함하는 반응 혼합물을 사용하였을 때, DMSO의 존재와는 상관없이 실시예 1(4)에 기술된 바와 같은 반응 혼합물과 비교하여 증폭율이 증가되었음이 관찰되었다. 유전자-도입 DNA의 양이 소량일 경우라도 광범위한 밴드를 형성하는 증폭 단편이 관찰되었다. 완충액중 DMSO을 제외하고 10 mM TMAC을 포함하는 반응 혼합물을 사용하였을 때 가장 우수한 결과가 관찰되었다.

추가로, 프라이머 LTR II 및 LC1을 사용하는 PCR 단계 또는 프라이머 LTR III 및 LC2를 사용하는 PCR 단계에서 단지 10mM의 TMAC를 포함하는 상기-언급된 반응 혼합물중 동일한 농도의 TMAC를 대신하여 테트라메틸암모늄 아세테이트를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이 경우, TMAC를 사용하여 관찰된 것과 거의 동량으로 증폭이 관찰되었다.

산업성 이용가능성

본 발명에 따라 다양한 통합 부위를 갖는 생물학적 샘플을 사용하여 군집내 특정 세포의 비, 또는 군집 (폴리클로날, 올리고클로날 또는 모노클로날)에서 통합된 유전자를 갖는 세포의 함량을 정확하고 고감도로 재현성을 갖고 모니터할 수 있 다. 레트로바이러스 벡터 (모노클로날, 올리고클로날, 폴리클로날)를 사용하여 유전자가 도입된 세포내 통합 부위에 대한 통상 방법의 효과는 그의 한계에 기인하여 제한되었다. 본 발명을 상기 분석에 적용시킬 수 있고, 이로써 유전자 요법의 분야에서 고도로 정확한 모니터링을 기대할 수 있기 때문에 이는 매우 유용하다.

서열 리스트 프리 텍스트

서열번호:1; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자

서열번호:2; LTR 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 LTR I

서열번호:3; 링커 카세트 A를 구성하는 올리고뉴클레오티드

서열번호:4; 링커 카세트 A를 구성하는 올리고뉴클레오티드

서열번호:5; LTR 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 LTR II

서열번호:6; 링커 카세트 A를 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 LC1

서열번호:7; LTR 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 LTR III

서열번호:8; 링커 카세트 A를 갖는 DNA 단편을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 LC2

서열번호:9; 링커 카세트 B를 구성하는 올리고뉴클레오티드

서열번호:10; 링커 카세트 B를 구성하는 올리고뉴클레오티드

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Method for analyzing sites at which genes are introduced <130> 664514 <150> JP 2003-129558 <151> 2003-05-07 <150> JP 2003-192719 <151> 2003-07-07 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 1 atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60 ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120 ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180 ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240 cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300 ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360 gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac 420 aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660 cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer LTR I to amplify a DNA fragment having LTR sequence. <400> 2 agctgttcca tctgttcttg gccct 25 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide constituting linker-cassette A. <400> 3 gacccgggag atctgaattc agtggcacag cagttagg 38 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide constituting linker-cassette A. <400> 4 aattcctaac tgctgtgcca ctgaattcag atctcccggg tc 42 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer LTR II to amplify a DNA fragment having LTR sequence. <400> 5 gaccttgatc tgaacttctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer LC1 to amplify a DNA fragment having linker-cassette A. <400> 6 gacccgggag atctgaattc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer LTR III to amplify a DNA fragment having LTR sequence. <400> 7 tccatgcctt gcaaaatggc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer LC2 to amplify a DNA fragment having linker-cassette A. <400> 8 gatctgaatt cagtggcaca g 21 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide constituting linker-cassette B. <400> 9 gacccgggag atctgaattc agtggcacag cagttagg 38 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide constituting linker-cassette B. <400> 10 cctaactgct gtgccactga attcagatct cccgggtc 38 ６６４５１４ 6/6

Claims (25)

1. (1) 레트로바이러스 벡터의 LTR의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 및 주형으로서 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA를 사용하는 프라이머 신장 반응을 수행하여 프라이머 신장 산물을 수득하고;

   (2) 단계 (1)에서 수득한 프라이머 신장 산물을 회수하고 프라이머 신장 산물에 상보적인 DNA를 합성하여 더블-스트랜드 DNA를 수득하고;

   (3) 더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드를 단계 (2)에서 수득한 더블-스트랜드 DNA 말단에 가하고;

   (4) 주형으로서 단계 (3)에서 수득한 첨가된 올리고뉴클레오티드를 갖는 더블-스트랜드 DNA, 및 레트로바이러스 벡터의 LTR의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 및 더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 반응을 수행하여 증폭 산물을 수득하는 것을 포함하며,

   여기에서, 단계 (1)의 프라이머 신장 반응 및 단계 (4)의 핵산 증폭 반응을 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물의 존재하에서 수행하는,

   통합된 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA 영역을 분석하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 단계 (1)에서 프라이머 신장 반응을 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 수행하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 단계 (4)에서 핵산 증폭 반응을 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 수행하는 방법.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물인 DNA 폴리머라제 조성물을 중합효소 연쇄 반응을 위해 사용하는 방법.
5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단계 (1) 또는 (4)에서 사용되는 중합효소 연쇄 반응의 온도 싸이클이 95℃에서 60 초; 58℃에서 45 초; 및 72℃에서 90 초로 구성되는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물이 베타인, 포름아미드, 디메틸 설폭시드 및 테트라메틸암모늄 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질인 방법.
7. 제 6항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물이 트리메틸글리신인 방법.
8. 제 1항에 있어서, 2-단계 중합효소 연쇄 반응을 단계 (4)에서 사용하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 단계 (3)에서, 단계 (2)에서 수득한 더블-스트랜드 DNA를 제한 효소로 분해하고 더블-스트랜드 올리고뉴클레오티드를 더블-스트랜드 DNA의 형성된 말단에 가하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 단계 (1)의 염색체 DNA를 미리 제한 효소로 분해시키는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 단계 (1)에서 라벨을 갖는 프라이머를 사용하고 단계 (2)에서 라벨을 이용하여 프라이머 신장 산물을 회수하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 바이오틴-표지된 프라이머를 사용하는 방법.
13. 제 1항에 있어서, 추가로 단계 (4)에서 수득한 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 단계 (4)에서 수득한 산물이 벡터내로 도입된 재조합 DNA를 주형으로서 사용하여 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법.
15. (a) 레트로바이러스의 LTR 부분에 어닐링할 수 있는 프라이머;

    (b) 링커 카세트;

    (c) (b)의 링커 카세트에 어닐링할 수 있는 프라이머;

    (d) DNA 폴리머라제;

    (e) 제한 효소; 및

    (f) 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함하는 프라이머 신장 반응을 위한 완충액을 포함하는, 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 키트.
16. 제 15항에 있어서, DNA 폴리머라제가 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 혼합물인 DNA 폴리머라제 조성물인 키트.
17. 제 15항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물은 베타인, 포름아미드, 디메틸 설폭시드 및 테트라메틸암모늄 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질인 키트.
18. 제 17항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물이 트리 메틸글리신인 키트.
19. 제 15항에 있어서, (a)의 프라이머는 프라이머 신장 산물을 회수하기 위한 라벨을 갖는 키트.
20. 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물을 포함하는, 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA 영역을 분석하는 방법에 사용하기 위한 프라이머 신장 반응용 완충액.
21. 제 20항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물은 베타인, 포름아미드, 디메틸 설폭시드 및 테트라메틸암모늄 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질인 완충액.
22. 제 21항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물이 트리메틸글리신인 완충액.
23. 통합되는 레트로바이러스 벡터를 갖는 염색체 DNA중 레트로바이러스 벡터 측면에 위치하는 염색체-유도된 DNA 영역을 분석하는 방법에 사용하기 위한 프라이머 신장 반응용 완충액을 제조하기 위한 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화 합물의 용도.
24. 제 23항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물은 베타인, 포름아미드, 디메틸 설폭시드 및 테트라메틸암모늄 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질인 용도.
25. 제 24항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산의 Tm 값을 저하시키는 화합물이 트리메틸글리신인 용도.