TW201321518A - 微量核酸樣本的庫製備方法及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種微量核酸樣本庫製備方法，所述方法包括：用DOP(Degenerate Oligonucleotide Primed)引子對樣本中的DNA進行第一次擴增，DOP引子序列具有至少5'端非退化性核苷酸區和3'端退化性核苷酸區；用DOP-Amp引子對第一PCR產物進行第二次擴增，獲得第二PCR擴增產物；對第二PCR擴增產物進行接頭連接PCR(adaptor-ligation PCR)，獲得第三PCR產物，兩端帶有測序接頭的第三PCR產物即為核酸庫。所述庫可以進行片段大小選擇和高通量測序，得到樣本中疾病相關的基因訊息。本發明還提供一種試劑盒及其在所述微量核酸樣本庫製備的用途。

Description

微量核酸樣本的庫製備方法及其應用
本發明屬於基因工程技術領域，具體地涉及一種微量核酸庫的製備方法及其應用。
新一代測序技術(NGS)改變了以往對DNA/RNA樣本的分析模式，幾乎成為所有研究領域中必不可少的研究工具。新一代測序技術是通過對上百萬條DNA短片段的同時的平行測序，使得在短時間內就能夠完成每個鹼基的測序，且成本大幅度降低。NGS技術在很多方面得到應用，如基因體學、轉錄體學、表觀基因(epigenomic)體學、臨床診斷等。
目前市場上新一代測序技術NGS平臺有好幾種，包括Illumina公司的Genome Analyzer、Hiseq、Miseq系列測序平臺，Roche公司的454測序平臺，Life Technologies公司的SOLID測序平臺、Ion Torrent測序平臺等。
但是無論何種NGS平臺，在測序前都需對DNA/RNA樣本進行處理，製備成DNA庫(DNA library)。通常情況下，分子庫的製備需要微克(micro gram)級的起始DNA/RNA量，雖然經改良後可以將建庫起始量降低，但對於單細胞或極微量的核酸樣本，仍無法直接進 行分子庫的製備，因此嚴重阻礙了對單細胞和微量核酸測序的應用。
因此本領域迫切需要開發針對單細胞和微量核酸樣本的分子庫構建方法。
本發明的目的是提供一種對微量核酸樣本進行庫製備的方法和用途。
本發明的另一目的是提供一種使用上述方法的試劑盒及其用途。
在本發明的第一方面，提供了一種製備核酸庫的方法，包括步驟：a.提供一待測樣本，所述樣本含有的核酸總量為2皮克~1微克；b.對待測樣本進行DOP-PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR)擴增，獲得第一PCR擴增產物；c.用DOP-Amp引子對第一PCR擴增產物進行第二次PCR擴增，獲得第二PCR擴增產物；d.對獲得的第二PCR擴增產物進行接頭連接PCR(adaptor-ligation PCR)，獲得第三PCR擴增產物，即為核酸庫。
在另一較佳實施例中，所述的第三PCR擴增產物的5'端具有接頭，且3'端具有接頭。
在另一較佳實施例中，還包括步驟(e)：對第三PCR擴增產物依據片段大小進行選擇。
在另一較佳實施例中，步驟(a)中所述的樣本選自下組：1-200個單細胞構成的樣本，或含有1-200個單細胞的核酸樣本，或核酸總含量為2皮克~1微克的核酸樣本。
在另一較佳實施例中，所述樣本選自下組：微量基因體DNA、免疫共沉澱產物DNA、游離DNA、cDNA、或其組合。
在另一較佳實施例中，所述DNA來自環境，更佳地，來自土壤和/或水體。
在另一較佳實施例中，所述DNA來自體液或排泄物，更佳地，來自血漿和/或尿液。
在另一較佳實施例中，所述的DNA經化學或物理方法處理，更佳地，經亞硫酸氫鹽處理。
在另一較佳實施例中，步驟(b)使用帶有退化性寡核苷酸區的DOP引子對樣本DNA進行隨機擴增。
在另一較佳實施例中，所述的DOP引子具有位於5'端的非退化性寡核苷酸區和位於中部的退化性寡核苷酸區和3'端的錨定區；或者位於5'端的非退化性寡核苷酸區和位於中部和3'端的退化性寡核苷酸區。
在另一較佳實施例中，所述DOP引子的3'端錨定區的序列長度為2-12個核苷酸，較佳地4-8個核苷酸。
在另一較佳實施例中，所述DOP引子的3'端錨定區任選自下組：TG、ATGTGG、TGTGG，或GTCT。
在另一較佳實施例中，所述DOP引子的5'端非退化性寡核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或與SEQ ID NO：2所示序列的同源性50%。
在另一較佳實施例中，所述的DOP引子的5'端非退化性寡核苷酸長度為5-30bp，較佳地5-20bp，更佳地6-13bp。
在另一較佳實施例中，所述的退化性寡核苷酸序列如(N)m所示，其中每個鹼基位置上的N包括A、T、G和C，m為3-20的正 整數。
在另一較佳實施例中，步驟(c)所述的DOP-Amp引子與步驟(b)所述的5’端非退化性寡核苷酸互補或基本上互補。
在另一較佳實施例中，DOP-Amp引子序列結合於DOP引子5’端非退化性寡核苷酸區。
在另一較佳實施例中，DOP-Amp引子序列如SEQ ID NO：2所示。
在另一較佳實施例中，步驟(d)用接頭引子進行接頭連接PCR擴增。
在另一較佳實施例中，所述的接頭引子為P5和P7，且P5和P7的3’端都具有可結合於DOP-Amp引子序列的非退化性寡核苷酸區，所述的非退化性寡核苷酸區的序列與SEQ ID NO：2所示序列相同或完全互補，或者與SEQ ID NO：2所示序列有80%的同源性。
在另一較佳實施例中，所述的接頭引子P7還具有標簽(barcode或index)序列。
在另一較佳實施例中，步驟(e)中所述的依據片段大小進行選擇為：在第三PCR擴增產物中選擇100-1000bp長度的片段。
在另一較佳實施例中，所述的依據片段大小進行選擇為：在第三PCR擴增產物中選擇200-500bp長度的片段。
在本發明的第二方面，提供了一種檢測微量核酸樣本中核苷酸序列的方法，包括步驟：(i)對於所提供的單細胞及微量核酸樣本，用本發明第一方面任一所述的方法製備所述樣本的核酸庫；(ii)對所述核酸庫中的片段進行測序和數據分析。
在另一較佳實施例中，所述的測序為第二代高通量測序法，所述第二代高通量測序法可選擇但不限於在Roche454 FLX、Illumina Solexa或ABI SOLID測序平臺上進行。
在另一較佳實施例中，所述的測序包括步驟：將需要測序的核酸庫與測序晶片(flow cell)上固定的測序探針進行雜交，並進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用「邊合成-邊測序」法進行測序，獲得樣本中核苷酸序列訊息。
在本發明的第三方面，提供了一種可用於本發明第一方面和第二方面任一方法的試劑盒，所述試劑盒包括： (1)第一容器以及位於容器內的用於進行第一PCR擴增的DOP引子；(2)第二容器以及位於容器內的用於進行第二PCR擴增的DOP-Amp引子；(3)第三容器以及位於容器內的用於進行第三PCR擴增的接頭連接引子；(4)說明書。
在另一較佳實施例中，所述試劑盒還包括：用於進行PCR擴增所需的試劑、用於核酸純化的試劑、用於進行高通量測序的測序晶片(flow cell)、或其組合。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次建立了一種對微量核酸樣本進行庫製備的方法。用DOP引子對樣本中的DNA進行第一次擴增，DOP引子序列具有至少5'端的非退化性的核苷酸區和退化性核苷酸區；用DOP-Amp引子對第一PCR產物進行第二次擴增，獲得第二PCR擴增產物；對第二PCR擴增產物進行接頭連接PCR，獲得第三PCR擴增產物，第三PCR擴增產物的兩端帶有測序接頭， 即為核酸庫。對庫進行片段大小選擇和高通量測序，能得到樣本中疾病相關的基因訊息。
術語
如本文所用，術語「含有」包括「具有(comprise)」、「基本上由...構成」和「由...構成」。
如本文所用，術語「以上」和「以下」包括本數，例如「80%以上」指80%，「2%以下」指2%。
DOP-PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR)
DOP-PCR退化性寡核苷酸引子PCR(DOP-PCR)是一種對微量DNA或單細胞進行擴增的方法，包括(但不限於)：低嚴謹度預擴增和高嚴謹度擴增兩個步驟。低嚴謹度擴增基於退化性寡核苷酸引子進行，目的是在DNA片段加上了一段固定序列作為PCR引子結合區；再用DOP-Amp引子對低嚴謹度擴增產物進行高嚴謹度擴增。
所述的退化性寡核苷酸引子至少包括兩部分，從5’到3’分別為：5’端非退化性核苷酸區及其下游的退化性引子區。在另一較佳實施例中，DOP引子序列如SEQ ID NO：1所示GCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN，其中，GCTCTTCCGATCT為5’端的非退化性核苷酸區，NNNNNNNNNN為退化性序列區，退 化性序列可記為：(N)m，m為任選自3-20的正整數，N獨立地任選自A、T、G和C。在一個較佳實施例中，DOP引子序列還包括3’端錨定序列，如「TG」，「ATGTGG」，「TGTGG」，「GTCT」等。用退化性寡核苷酸引子對樣本進行擴增，獲得第一PCR產物。
所述的DOP-Amp引子序列與DOP引子的5’端非退化性核苷酸區基本上互補，在一個較佳實施例中，DOP-Amp引子序列與5’端非退化性核苷酸區相同或完全互補或至少覆蓋了5’端特定核苷酸序列的50%區域或/與5’端特定核苷酸序列有80%同源性。在另一較佳實施例中，DOP-Amp引子序列如SEQ ID NO：2所示：5’-GCTCTTCCGATCT-3’。用DOP-Amp引子對第一PCR產物進行擴增，獲得第二PCR產物。
將擴增獲得的第二PCR產物直接進行電泳或檢測濃度，也可以製備成質體(plasmid)進行Sanger法測序，也可以用來進行後續建庫。
引子
如本文所用，術語「引子(primer)」指的是能與模板(template)互補配對，在DNA聚合酶的作用合成與模板互補的DNA鏈的寡聚核苷酸的總稱。引子可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引子甚至可以是非天然的核苷酸如鎖核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)或zip nucleic acids(ZNA)等。
引子「大致上」(或「基本上」)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引子必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引子的序列不必與模板的序列完全互補。比如，在一個3’端與模板互補的引子的5’端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引子仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引子能與模板充分的結合，非完全互補的引子也可以與模板形成引子-模板複合物，從而進行擴增。
在本發明中，引子包括(但不限於)：退化性引子、DOP-Amp引子、接頭引子。退化性引子為(N)m，m為任選自3-20的正整數，N任選自A、T、G和C，能夠通過鹼基互補配對與樣本隨機結合，對樣本進行隨機片段化的擴增。DOP-Amp引子能與退化性寡核苷酸引子的特定核苷酸序列基本上互補，對退化性引子擴增的產物進一步擴增。接頭引子特異性識別DOP-Amp引子擴增產物的兩端，得到5’端和3’端分別為特異接頭的、可用於進一步測序的產物。
接頭連接PCR(Adaptor-Ligation PCR)
接頭連接PCR(Adaptor-Ligation PCR)是指在PCR同時將接頭(adaptor)加到模板DNA片段兩端，此處的「接頭」為高通量測序庫的接頭序列。接頭引子是接頭連接PCR的重要組成部分。
在一個較佳實施例中，接頭引子包括(但不限於)：P5接頭引子和P7接頭引子。所述的P5接頭引子具有如SEQ ID NO：3所示的序 列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；P7具有SEQ ID NO：4-7所示的任一序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中XXXXXX為標簽(barcode)序列，標簽(barcode)用於區分不同的樣本。
P5接頭和P7接頭具有結合測序平臺Flow cell，用於測序的序列。
高通量測序
基因體的「再測序」使得人類能夠儘早地發現與疾病相關基因的異常變化，有助於對個體疾病的診斷和治療進行深入的研究。本領域通常知識者通常可以採用三種第二代測序平臺進行高通量測序：454 FLX(Roche公司)、Solexa Genome Analyzer(Illumina公司)和Applied Biosystems公司的SOLID等。這些平臺共同的特點是極高的測序通量，相對於傳統測序的96道毛細管測序，高通量測序一次實驗可以讀取40萬到400萬條序列，根據平臺的不同，讀取長度從25bp到450bp不等，因此不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取1G到14G不等的鹼基數。
其中，Solexa高通量測序包括DNA簇形成和上機測序兩個步 驟：PCR擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，並進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用「邊合成-邊測序法」進行測序，從而得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
DNA簇的形成是使用表面連有一層單鏈引子(primer)的測序晶片(flow cell)，單鏈狀態的DNA片段通過接頭序列與晶片表面的引子通過鹼基互補配對的原理被固定在晶片的表面，通過擴增反應，固定的單鏈DNA變為雙鏈DNA，雙鏈再次變性成為單鏈，其一端錨定在測序晶片上，另一端隨機和附近的另一個引子互補從而被錨定，形成「橋」；在測序晶片上同時有上千萬個DNA單分子發生以上的反應；形成的單鏈橋，以周圍的引子為擴增引子，在擴增晶片的表面再次擴增，形成雙鏈，雙鏈經變性成單鏈，再次成為橋，稱為下一輪擴增的模板繼續擴增；反復進行了30輪擴增後，每個單分子得到1000倍擴增，稱為單克隆的DNA簇。
DNA簇在Solexa測序儀上進行邊合成邊測序，測序反應中，四種鹼基分別標記不同的螢光，每個鹼基末端被保護鹼基封閉，單次反應只能加入一個鹼基，經過掃描，讀取該次反應的顏色後，該保護集團被除去，下一個反應可以繼續進行，如此反復，即得到鹼基的精確序列。在Solexa多重測序(Multiplexed Sequencing)過程中會使用Index(標簽or barcode)來區分樣品，並在常規測序完成後，針對Index部分額外進行7個循環的測序，通過Index的識別，最多 可以在1條測序甬道中區分12種不同的樣品。
本發明提供了一種製備單細胞及微量核酸的庫的方法，所述方法包括(但不限於)下述步驟：1.獲得樣本；2.對樣本DNA進行DOP-PCR；3.對DOP-PCR擴增產物進行Adaptor-Ligation PCR；PCR產物經片段大小選擇和純化，片段大小選擇及純化是指選取一定大小範圍的DNA片段，並進行純化，片段大小選擇的方法可以是在瓊脂糖凝膠電泳後切取一定大小範圍的DNA片段膠塊，進行回收純化，純化後即得到由單細胞及微量核酸製備的庫。
在另一較佳實施例中，還可以對所述庫進行測序，較佳地使用高通量測序。
本發明一個典型的流程示意圖見第1圖。
試劑盒
本發明還提供了一種用於微量核酸樣本的庫製備的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)第一容器以及位於容器內的用於進行第一PCR的DOP引子；(2)第二容器以及位於容器內的用於進行第二PCR的DOP-Amp 引子；(3)第三容器以及位於容器內的用於進行第三PCR的接頭連接引子；(4)說明書。
在本發明的一個較佳實施例中，試劑盒還包括：用於進行PCR擴增所需的試劑、用於核酸純化的試劑、用於進行高通量測序的測序晶片(flow cell)、或其組合。
本發明的主要優點包括：1.通過DOP引子對樣本中的DNA進行第一次擴增，能夠全面覆蓋樣本的DNA片段；2. DOP引子序列具有至少5'端的非退化性核苷酸區及其下游的退化性寡核苷酸區，獲得的擴增產物帶有特定的核苷酸序列，加入DOP-Amp引子，能夠對預擴增產物進行第二次擴增，且第二次擴增為高嚴謹性擴增，大大提高靈敏度；3.第三次PCR中使用接頭連接引子在片段兩端加入接頭，可以直接用於下一步測序；4.可以同時對多個樣品建庫和檢測，且沒有螢光背景的干擾；5.不受物種的限制，人、動物、微生物、植物等都可以進行個體式建庫和檢測；6.試驗費用低，靈敏度高、精確度高、重複性好。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 DOP-PCR方法製備單細胞基因體DNA庫
本實施例以血液中的單個淋巴細胞為例，經由DOP-PCR的方法製備單細胞基因體DNA庫。
1.樣本來源：
血液單細胞樣本分別來自於一個正常人(YH，炎黃計劃樣本)和一個唐氏綜合症患者(T21)的外周血。
2.單細胞分離：
用口吸管方法共分離出3個YH和1個T21外周血單個淋巴細胞，置於含2μl鹼性細胞裂解液(200mM KOH，50mM DTT)的PCR管中，-80℃凍存30分鐘以上。
3.第一次PCR(低嚴謹度擴增，DOP預擴增)：
DOP預擴增將含單細胞的PCR管於65℃處理15分鐘，之後加入DOP反應液進行DOP預擴增反應。本實施例以pfx DNA聚合酶 進行擴增。
DOP反應體系見表1。
混合上述各組分，覆蓋適量的礦物油。蓋上管蓋，瞬時離心。在反應體系中，DOP引子序列(SEQ ID NO：1)為GCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN。其中，5’特定序列為GCTCTTCCGATCT，3’退化性序列為NNNNNNNNNN，N可以任意為A、T、G和C。
按照表2的反應條件進行預擴增。
表2
由於DOP引子含5’特定序列和3’退化性序列，預擴增即可將引子5’特定序列加在所有產物DNA片段的兩端。
4.高嚴謹度擴增
預擴增結束後，將與這段5’特定序列結合的DOP-Amp引子加入預擴增體系中，終濃度為2μM。
DOP-Amp引子序列為SEQ ID NO：2 GCTCTTCCGATCT(即：DOP-Amp引子序列為DOP引子的5’端特定寡核苷酸序列部分)。
之後按照表3的反應條件進行PCR反應。
將上述DOP-PCR擴增終產物進行電泳及濃度檢測。
5.接頭連接PCR
將步驟(4)獲得的DOP-PCR產物直接用於下一步接頭連接PCR(Adaptor-Ligation PCR)反應。
在本實施例中，Adaptor-Ligation PCR採用耐熱的DNA聚合酶pfx酶，其反應體系見表4。
表4中的P5接頭引子和P7接頭引子的序列分別為：P5接頭引子SEQ ID NO：3 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
各個庫中，P5序列是一樣的，均為Illumina Hiseq2000庫構建中的接頭序列，包括結合Flowcell和測序的接頭。
P7接頭具有標簽(barcode)序列，且在不同的庫中，標簽(barcode)不同，但具有下列的總序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中XXXXXX為barcode序列。
P5和P7接頭序列的最後13bp均與DOP-Amp引子序列一致。
本實施例中，4個庫的P7序列如下：YH1庫SEQ ID NO：4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT AAGCTA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT； YH2庫SEQ ID NO：5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT ACATCG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；YH3庫SEQ ID NO：6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT GCCTAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；T21庫SEQ ID NO：7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT TGGTCA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
在SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：7中，加粗斜體的6個序列為barcode序列。
Adaptor-Ligation PCR反應條件見表5。
Adaptor-Ligation PCR的反應產物即為DNA片段兩端為Illumina接頭序列的庫，電泳膠圖見第2圖，泳道從左到右為Marker(D2000)、YH1、YH2、YH3、T21和陰性對照。
6. PCR產物選擇和純化
上述庫為PCR產物，含引子二聚體等雜質，且片段大小分布較分散，因此進行片段大小選擇和純化。切取300bp-500bp大小範圍的膠塊，用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit進行DNA片段回收和純化。具體操作參見試劑盒說明書。
上述庫經片段選擇和純化後，進行Agilent 2100 bioanalyzer檢測，檢測結果見第3圖，第3A圖為樣本YH1檢測結果，需要的主帶位於377bp；第3B圖為樣本YH2檢測結果，需要的主帶位於326bp；第3C圖為樣本YH3檢測結果，需要的主帶位於339bp；第3D圖為樣本T21檢測結果，需要的主帶位於360bp。
結果表明，選擇和純化的片段合格。至此，DOP-PCR方法製備血液淋巴單細胞基因體DNA庫的流程已完成。
7. Illumina Hiseq2000測序
採用Single-End測序，讀長50bp，由於每個庫已含有不同 barcode標簽，因此混合於一個測序通道進行測序。測序數據統計結果見表6。
表6為用本實施例中DOP-PCR的方法製備血液淋巴單細胞基因體DNA庫的測序數據統計結果。
對這4個庫，進一步統計每條常染色體的數據量占常染色體總數據量的比例，以read數進行統計，統計結果見表7。
表7表示本實施例中DOP-PCR方法製備血液淋巴單細胞基因體DNA庫的測序結果中，每條常染色體數據量比例的統計結果，其中21三體單細胞(T21)的21號染色體數據量比例明顯高於YH單 細胞(YH1，YH2，YH3，均為核型正常)，且T21：YH接近3：2的比率。說明DOP-PCR方法製備單細胞基因體DNA庫可以用於染色體數目異常的檢測。
實施例2
重複實施例1，不同點在於DOP預擴增反應條件，樣本以及其他實驗條件相同。DOP預擴增反應條件見表8。
結果表明，用本實施例的DOP預擴增反應條件也能夠達到構建庫並用於下一步檢測的目的。
實施例3 DOP-PCR方法製備微量DNA/cDNA樣本的庫
本實施例的樣本為微量DNA/cDNA樣本，包括微量的基因體DNA，免疫共沉澱(IP)產物DNA，血漿游離DNA(Plasma DNA)，以及RNA反轉錄的cDNA產物。
IP產物DNA、血漿游離DNA(Plasma DNA)、基因體DNA(gDNA)樣本均進行5倍梯度稀釋，分別以200pg、40pg、8pg的量起始進行庫製備。
cDNA樣本則是由1μg的小鼠總RNA用六核苷酸隨機引子經Superscript II反轉錄酶進行反轉錄而獲得，經過5倍梯度稀釋，分別以原濃度、5-1、5-2、5-3濃度起始進行庫製備。
微量DNA/cDNA樣本直接加入反應液進行DOP預擴增反應，本實施例仍以pfx聚合酶為例來說明。
按照說明書配製反應體系，見表9。
表9
混合上述各組分，適當覆蓋礦物油。蓋上管蓋，瞬時離心。之後按照下表10的反應條件進行DOP預擴增。
預擴增結束後，將DOP-Amp引子加入預擴增體系中，使其終濃度為0.4μM。
之後按照表11的反應條件進行PCR反應。
上述PCR產物進行電泳及濃度檢測，直接用於下一步Adaptor-Ligation PCR。Adaptor-Ligation PCR採用耐熱DNA聚合酶pfx酶。
配製反應體系見表12。
表12中的P5接頭引子與實施例1相同。
P7接頭引子為：IP產物DNA樣本SEQ ID NO：4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT AAGCT AGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；Plasma DNA樣本SEQ ID NO：5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT ACATCG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；cDNA樣本SEQ ID NO：6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT GCCTAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；gDNA樣本SEQ ID NO：7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT TGGTCA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
Adaptor-Ligation PCR反應條件見表13。
Adaptor-Ligation PCR產物即DNA片段兩端為Illumina接頭序列的庫，電泳膠圖見第4圖，第4圖表明，在本事實例成功地對四種樣本進行了擴增。
對上述PCR產物進行片段大小選擇和純化。切取200bp-500bp大小範圍的膠塊，用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit進行DNA片段回收和純化。具體操作見試劑盒說明書。
上述庫經片段選擇和純化後，進行Agilent 2100 bioanalyzer檢測，檢測結果見第5圖。第5A圖為微量基因體DNA-200pg檢測結果，第5B圖為微量基因體DNA-40pg檢測結果，第5C圖為免疫沉 澱(IP)DNA-200pg檢測結果，第5D圖為免疫沉澱(IP)DNA-40pg檢測結果，第5E圖為cDNA-原濃度檢測結果，第5F圖為cDNA-5-1檢測結果，第5G圖為血漿游離DNA-200pg檢測結果。
至此，本事實例用DOP-PCR方法製備微量DNA/cDNA樣本庫的流程已完成。
用本實施例的方法對製備的庫進行測序，結果表明，製備的庫可以用來進行疾病的檢測和確診。
實施例4 試劑盒
一種用於製備單細胞及微量核酸的庫的試劑盒，包括以下組分：(1)第一容器以及位於容器內的DOP引子；(2)第二容器以及位於容器內的DOP-Amp引子；(3)第三容器以及位於容器內的接頭引子；(4)第四容器以及位於容器內的用於進行DOP-PCR擴增所需的試劑；(5)第五容器以及位於容器內的用於核酸純化的試劑；(6)第六容器以及位於容器內的用於進行高通量測序的測序晶片(flow cell)；(7)說明書。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同 每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域具有通常知識者可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由申請專利範圍所界定的本發明範圍。
第1圖顯示一個典型的構建庫及測序的流程示意圖。
第2圖顯示用DOP-PCR方法製備單細胞基因體DNA庫接頭連接PCR產物的電泳圖。
第3圖顯示四個樣本(YH1，YH2，YH3，T21)的接頭連接PCR產物經片段選擇和純化後，進行片段檢測的結果。
第3A圖為樣本YH1檢測結果，需要的主帶位於377bp；第3B圖為樣本YH2檢測結果，需要的主帶位於326bp；第3C圖為樣本YH3檢測結果，需要的主帶位於339bp；第3D圖為樣本T21檢測結果，需要的主帶位於360bp。
第4圖顯示用DOP-PCR方法製備微量核酸樣本(IP產物DNA，Plasma DNA，cDNA，gDNA)的接頭連接PCR產物電泳膠圖。
第5圖顯示用DOP-PCR方法製備微量DNA/cDNA樣本的庫， 經片段選擇和純化後片段檢測的結果。
第5A圖為微量基因體DNA-200pg檢測結果，第5B圖為微量基因體DNA-40pg檢測結果，第5C圖為免疫沉澱(IP)DNA-200pg檢測結果，第5D圖為免疫沉澱(IP)DNA-40pg檢測結果，第5E圖為cDNA-原濃度檢測結果，第5F圖為cDNA-5-1檢測結果，第5G圖為血漿游離DNA-200pg檢測結果。
<110> 深圳華大基因科技有限公司 深圳華大基因研究院
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<130> P2011-0464
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> DOP引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(23)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 1
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> DOP-Amp引物
<400> 2
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> P5接頭引物
<400> 3
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
<210> 7
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7

Claims (22)

  1. 一種製備核酸庫的方法，包含以下步驟：a.提供一待測樣本，該待側樣本含有的核酸總量為2皮克~1微克；b.對該待測樣本進行DOP-PCR擴增，獲得第一PCR擴增產物；c.用DOP-Amp引子對該第一PCR擴增產物進行一第二次PCR擴增，獲得一第二PCR擴增產物；以及d.對獲得的該第二PCR擴增產物進行一接頭連接PCR，獲得一第三PCR擴增產物，即為一核酸庫。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，還包括步驟e：對該第三PCR擴增產物依據片段大小進行選擇。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟a的該待側樣本中的DNA經亞硫酸氫鹽處理。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟b使用帶有一退化性寡核苷酸區的DOP引子對樣本DNA進行隨機擴增，其中所述的DOP引子具有位於5'端的非退化性寡核苷酸區和位於中部的退化性寡核苷酸區和3'端的錨定區。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中所述DOP引子的3'端錨定區的序列長度為2-12個核苷酸。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中所述DOP引子的3'端錨定區任選自下組：TG、ATGTGG、TGTGG，或GTCT。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中所述的DOP引子的5'端非退化性寡核苷酸長度為5-30bp。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中所述DOP引子的5'端非退化性寡核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中所述的退化性寡核苷酸序列如(N)m所示，其中每個鹼基位置上的N包括A、T、G和C，m為3-20的正整數。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟b使用帶有一退化性寡核苷酸區的DOP引子對樣本DNA進行隨機擴增，且所述的DOP引子具有位於5'端的非退化性寡核苷酸區和位於中部和3'端的退化性寡核苷酸區。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中所述DOP引子的5'端非退化性寡核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中所述DOP引子的5' 端非退化性寡核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中所述的退化性寡核苷酸序列如(N)m所示，其中每個鹼基位置上的N包括A、T、G和C，m為3-20的正整數。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟c所述的DOP-Amp引子與步驟b所述的5’端非退化性寡核苷酸互補，且DOP-Amp引子序列結合於DOP引子5’端非退化性寡核苷酸區。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中DOP-Amp引子序列如SEQ ID NO：2所示。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟d用接頭引子進行接頭連接PCR擴增；所述的接頭引子為P5和P7，且P5和P7的3’端都具有可結合於DOP-Amp引子序列的非退化性寡核苷酸區，所述的非退化性寡核苷酸區的序列與SEQ ID NO：2所示序列相同或完全互補，或者與SEQ ID NO：2所示序列有80%的同源性。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中所述的接頭引子P7具有標簽序列。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟e中所述的依據片 段大小進行選擇為：在第三PCR擴增產物中選擇100-1000bp長度的片段。
  19. 一種檢測微量核酸樣本中核苷酸序列的方法，包含：(i)用申請專利範圍第1-7中任一項所述的方法所製備的一核酸庫；以及(ii)對該核酸庫中的片段進行一測序和數據分析。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該測序包括步驟：將需要測序的核酸庫與測序晶片上固定的測序探針進行雜交，並進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用「邊合成-邊測序」法進行測序，獲得樣本中核苷酸序列訊息。
  21. 一種可用於申請專利範圍第1-20項中任一項方法的試劑盒，其中，所述試劑盒包括：(1)第一容器以及位於容器內的用於進行第一PCR擴增的DOP引子；(2)第二容器以及位於容器內的用於進行第二PCR擴增的DOP-Amp引子；以及(3)第三容器以及位於容器內的用於進行第三PCR擴增的接頭連接引子。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之試劑盒，其中，所述試劑盒還包 括：用於進行PCR擴增所需的試劑、用於核酸純化的試劑、用於進行高通量測序的測序晶片、或其組合。
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