CN104357918B - 血浆游离dna文库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种“少量DNA文库的构建方法”，首先对血浆游离DNA或片段化DNA进行末端修复，并同时对5’端进行磷酸化修饰，得到修复后DNA；之后直接与人工接头进行平末端连接，经纯化后得到较纯净的连接处带有缺口的含接头DNA；然后在PCR扩增之前使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA；再进行PCR扩增反应，产物纯化后得到最终高通量测序文库。本方法不仅简便、高效，减少了纯化步骤，降低了文库构建过程中DNA的损失，而且使用特定的接头及平末端的连接方式，有效地解决微量DNA文库构建过程中容易出现接头自连的问题；同时，扩增前修补缺口，保证扩增前有足够的完整的模板进行扩增反应。

Description

血浆游离DNA文库的构建方法

技术领域

本发明涉及扩增前修补缺口的血浆DNA文库构建方法，特别是涉及可应用于无创产前诊断的孕妇血浆中游离DNA文库构建方法。

背景技术

根据医学统计，每年出生的新生儿中，约有2～3％罹患先天性疾病或出生缺陷，造成了婴幼儿长期卧病、残障，甚至夭折，给社会和家庭带来巨大的负担。导致先天性疾病或出生缺陷的原因主要有染色体异常、单基因遗传病、多基因遗传病、致畸胎因素等，其中染色体异常占较大比例。在讲求优生保健的现代社会，如何防治先天性疾病或出生缺陷，成为十分重要的课题。而产前诊断、及时发现、及时终止妊娠是预防遗传缺陷患儿出生的重要手段。传统的产前诊断方法是通过羊水穿刺、绒毛活检以及胎儿脐带血检查直接获取胎儿遗传物质来进行诊断，这些产前诊断技术都是侵入性的，有一定的风险，可能会造成胎儿损伤、母体流产或宫内感染，甚至胎死宫内等，难以被广大孕妇和家庭所接受。

1997年Lo等研究报道了孕妇血浆中有胎儿游离DNA的存在，后来有研究也报道发现孕妇血浆中存在胎儿RNA，这些重大发现为无创产前诊断提供了新的可能。在孕妇外周血中胎儿游离DNA占孕妇血浆总DNA的3％～30％，无创产前诊断就是指抽取孕妇外周血，通过对孕妇外周血中游离胎儿DNA进行高通量测序，通过生物信息学分析来检测胎儿是否患有21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕陶氏综合征)等染色体数目异常疾病，是产前诊断领域的一项新兴技术。与侵入性产前诊断相比较，无创产前诊断具有安全性高、灵敏度高、特异性好、检测时间早、快速等特点。

目前，无创产前诊断过程中血浆游离DNA的文库构建一般是在提取孕妇血浆中的游离DNA后，通过末端修复→纯化→加A→纯化→连接头→纯化→扩增→纯化等步骤来完成。文库构建过程中，步骤繁琐，需经过多次纯化过程，会造成DNA的损失，同时在接头连接的过程中会出现接头自连现象，致使文库构建效率低、质量差。或者通过末端修复并加A后纯化、连接头后纯化、扩增、纯化等步骤来完成。虽然减少了纯化步骤，降低了DNA的损耗，但是仍然有接头自连的问题难以解决。

发明内容

本发明旨在提供一种高通量测序文库的构建方法，以解决现有的少量DNA样本建库，尤其是血浆游离DNA建库过程中DNA损耗及容易出现接头自连等问题。本方法不仅简便、高效，减少了纯化步骤，降低了文库构建过程中DNA的损失，而且使用特定的接头及平末端的连接方式，有效地解决微量DNA文库构建过程中容易出现接头自连的问题。同时，使用特殊的文库扩增聚合酶，扩增前修补缺口，保证扩增前有足够的完整的模板进行扩增反应。

一种少量DNA文库构建方法，采用下述顺序、方法步骤：

(1)对DNA片段进行末端修复成平端及5’端磷酸化，得到修复后DNA，

(2)修复后DNA直接与接头进行平末端连接，纯化，得到连接处带有缺口的含接头DNA；

(3)使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA，

(4)PCR扩增，纯化，最终获得高通量测序文库。

所述步骤(2)中的接头为接头A和接头B，接头A由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2等摩尔量退火组合而成，所述接头B由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4等摩尔量退火组合而成，

SEQ ID NO1：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

SEQ ID NO2：

5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3’，

SEQ ID NO3：

5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3’，

SEQ ID NO4：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，所述序列3中的六个碱基“IIIIII”表示测序平台多样品混合文库中的标签序列。

所述测序平台为为illumina测序平台，所述“IIIIII”可以为任意六个碱基的随机组合。

所述碱基序列在illumina测序平台中可以为“ATCACG”,或者为“CGATGT”,或者为“TTAGGC”，或者为“TGACCA”,或者为“ACAGTG”,或者为“GCCAAT”,或者为“CAGATC”,或者为“ACTTGA”,或者为“GATCAG”,或者为“TAGCTT”,或者为“GGCTAC”,或者为“CTTGTA”。

所述步骤(1)使用T4 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶Ⅰ大片段使DNA修复成平末端。

所述步骤(1)使用T4多核苷酸激酶使DNA平末端5’端磷酸化。

所述DNA片段为血浆游离DNA，大小为100-250bp；或者为基因组DNA经超声破碎为100-250bp。

本发明的文库构建方法，首先对血浆游离DNA或片段化DNA进行末端修复成平端，并同时对5’端进行磷酸化修饰，得到修复后DNA；之后直接与人工接头进行平末端连接，得到连接处带有缺口的含接头DNA；经纯化后得到较纯净的连接处带有缺口的含接头DNA；然后在PCR扩增之前使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA；再进行PCR扩增反应，得到扩增产物；纯化后得到最终高通量测序文库。

本发明的文库构建方法，在进行DNA末端修复后不需进行纯化，利用修复体系直接进行接头的连接，减少了纯化步骤造成的DNA损失；本发明的文库构建方法，使用的接头只有一端是平末端，保证了与目的DNA连接的方向正确；使用的接头平末端未经过磷酸化修饰，保证了连接反应时不会生成接头自连产物；本发明的文库构建方法，使用特殊的DNA聚合酶进行连接处缺口的修补，保证PCR扩增前对连接处缺口进行完美修复。

在高通量测序领域，文库构建好后，通常需要对文库进行质检。质检内容包括琼脂糖凝胶电泳评估文库片段大小；采用实时荧光定量PCR评估文库浓度、是否有接头自连污染。当文库浓度较低时，无法进行后续的高通量测序。当文库中含有自连的接头时，同样无法进行高通量测序。以Hiseq2000为例，其要求文库浓度不低于2nM，且文库中没有自连的接头污染。

本发明的技术方案，通过采用修复末端后直接连接接头，减少了纯化步骤从而减少了DNA损失。本发明中所使用的单向平末端接头不进行磷酸化修饰，从而避免了文库构建过程中产生的接头自连现象以及保证接头连接方向的正确。本发明中所使用的PCR聚合酶在PCR反应前进行修补缺口的反应，保证了足够的完整的模板进行后续的PCR扩增反应。

附图说明

图1示明了本发明的文库构建流程；

图2示明了本发明实施例与对照例文库构建结果的电泳图；

图3示明了本发明实施例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线图；

图4示明了本发明对照例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线图；

图5示明了本发明实施例与对照例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

按照图1所示的文库构建流程进行构建的。所使用的接头序列为上述权利要求7中所列序列。其中序列1与序列2等摩尔量退火组合成接头A，序列3与序列4等摩尔量退火组合成接头B。

SEQ ID NO1：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

SEQ ID NO2：

5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3’，

SEQ ID NO3：

5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3’，

SEQ ID NO4：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，所述序列3中的六个碱基“IIIIII”表示测序平台多样品混合文库中的标签序列。

下面实施例所使用样品为正常人血浆游离DNA。使用市售试剂盒进行血浆游离DNA抽提。DNA使用Qubit荧光计进行定量。

1、对照例：血浆DNA文库构建

1)样本及试剂

取Qubit定量后的血浆游离DNA 5ng，使用市售高通量测序文库构建试剂盒进行文库构建。

2)对血浆游离DNA进行末端修复及加dATP

反应体系如下：

反应条件：混匀后20℃孵育30分钟。65℃孵育30分钟。

3)接头连接

反应体系如下：

反应条件：混匀后20℃孵育15分钟。

在上述3)的体系中加入3ul市售试剂盒中酶进行酶切。

反应条件：混匀后37℃孵育15分钟。

对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照Ampure XP Beads纯化说明书进行。

4)PCR扩增

反应体系如下：

反应条件：98℃预变性30秒；然后98℃变性10秒，65℃30秒，72℃30秒，共10个循环；最后72℃延伸5分钟。

对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照Ampure XP Beads纯化说明书进行。

对步骤4)中的PCR纯化产物进行Qubit定量。

2、实施例：血浆DNA文库构建

1)样本及试剂

取Qubit定量后的血浆游离DNA 5ng，使用市售相关试剂进行文库构建。

2)对血浆游离DNA进行末端修复及5’端磷酸化修饰

反应体系如下：

DNA 25ul

市售末端修复反应混合物 10ul

总体积35ul

反应条件：混匀后20℃孵育30分钟。70℃孵育15分钟使酶失活。

3)接头连接

反应体系如下：

反应条件：混匀后20℃孵育15分钟。65℃20分钟使酶失活。

对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照Ampure XP Beads纯化说明书进行。

4)修复缺口及PCR扩增

反应体系如下：

反应条件：72℃孵育15分钟，修补缺口；95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸30秒，共10个循环；最后72℃延伸1分钟。

对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照Ampure XP Beads纯化说明书进行。

对步骤4)中的PCR纯化产物进行Qubit定量。

3、检测：文库质检

1)配制2％琼脂糖胶。对对照例和实施例中的两个文库各取100ng进行琼脂糖胶电泳鉴定。DNA marker使用TAKARA DL1000 marker 5ul。鉴定结果如图2所示，图2从左至右依次为TAKARA DL1000 marker、实施例文库、对照例文库。从图2可知，本发明的实施例文库与对照例文库主带(300bp左右)均较明显。

2)通过实时荧光定量PCR进一步检测对照文库与实验文库是否有接头污染。对照例和实施例中的两个文库各取1ul，使用KAPA BIOSYSTEMS公司的高通量测序文库定量试剂盒进行检测。检测结果如图3-图5所示，图4显示对照例文库有少许自连接头污染(熔解曲线温度82℃处)，而本发明的实施例文库无任何自连接头污染。

从以上描述中可以看出，上述实施例通过使用本发明的方法构建的血浆游离DNA文库，从根本上避免了高通量测序文库构建容易出现自连接头污染的现象，提高了文库质量。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种血浆游离DNA文库构建方法，采用下述顺序、方法步骤：

(1)对DNA片段进行末端修复成平端及5’端磷酸化，得到修复后DNA，

(2)修复后DNA直接与接头进行平末端连接，纯化，得到连接处带有缺口的含接头DNA；

(3)使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA，

(4)PCR扩增，纯化，最终获得高通量测序文库；所述步骤(2)中的接头为接头A和接头B，所述接头A由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2等摩尔量退火组合而成，所述接头B由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4等摩尔量退火组合而成，

SEQ ID NO1：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

SEQ ID NO2：

5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3’，

SEQ ID NO3：

5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3’，

SEQ ID NO4：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，所述序列3中的六个碱基“IIIIII”为测序平台多样品混合文库中的标签序列。

2.根据权利要求1所述的构建方法，所述测序平台为illumina测序平台，所述“IIIIII”可以为任意六个碱基的随机组合。

3.根据权利要求2所述的构建方法，所述六个碱基序列在illumina测序平台中为“ATCACG”,或者为“CGATGT”,或者为“TTAGGC”，或者为“TGACCA”,或者为“ACAGTG”,或者为“GCCAAT”,或者为“CAGATC”,或者为“ACTTGA”,或者为“GATCAG”,或者为“TAGCTT”,或者为“GGCTAC”,或者为“CTTGTA”。

4.根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤(1)使用T4DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶Ⅰ大片段使DNA修复成平末端。

5.根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤(1)使用T4多核苷酸激酶使DNA平末端5’端磷酸化。

6.根据权利要求1所述的构建方法，所述PCR聚合酶为市售DNA聚合酶。

7.根据权利要求1所述的构建方法，所述DNA片段为血浆游离DNA，大小为100-250bp；或者为基因组DNA经超声破碎为100-250bp。